（土壤学专业论文）几种改性矿物和碳纳米管对Ecoli的抑制和内毒素的吸附.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文题目：几秆彼f 乇动钩辱巳碳钔禾笼 学位级别 砀z 对互新仇抑制和呐禹彖饧唆时 所在学院 獬争谬饶 ( 系) 学科专业 舷易秘雪 导师姓名 覆伤办 学生姓名 荔、蔹锭 学位论文 是否保密磊 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：钙。头唆 时问：伽多年月孑日 签名日期：彬多月陟日签名日期：1 铭年莎爹 华中农业大学二零零六届硕十学位论文徐英贤 2 0 0 6 年6 月 摘要 致病性大肠杆菌是引起动物和人类腹泻的主要原因之一，如何治疗腹泻、减少 肠道中致病菌和其产生的毒素一直是人们关注的问题。 本文以蒙脱石、沸石和碳纳米管为载体，以非抗生素类抗菌剂氯化十六烷基吡 啶( c p c ) 为被加载物质，制备出集吸附和抗菌于一身的颗粒性材料c p c 蒙脱 石、c p c 沸石和c p c 碳纳米管实验结果表明，碳纳米管加载c p c 的量远远大于 蒙脱石和沸石；c p c 在碳纳米管上的加载主要是物理吸附，在蒙脱石和沸石上的加 载既包括物理吸附也包括化学吸附。 本文首先模拟动物肠道环境( p h 为7 左右，温度3 7 ) 考察了c p c 蒙脱石、 c p c 沸石和c p c 碳纳米管对e c o l i 的抑制效果。结果得出：相同质量的三种材料 c p c 碳纳米管的杀菌能力最高；c p c 蒙脱石、c p c 沸石和c p c 碳纳米管的杀菌能 力强弱与加入量呈正比。同时数据表明，c p c - 碳纳米管的杀菌速率最快，其次是 c p c 蒙脱石和c p c 沸石；p h 对各材料杀菌效率影响不大；各材料的杀菌率随温度 升高而增高，其中c p c 碳纳米管的杀菌率受温度影响最大；营养物质赖氨酸的存 在降低了c p c 蒙脱石、c p c 沸石和c p c 碳纳米管对e c o l i 的杀菌效率，降低程度 随赖氨酸浓度的增高而增大。 抗菌剂c p c 虽能有效杀灭细菌，但细菌的死亡引起了内毒素的产生，大量内毒 素存在时将对动物机体产生很大的负面影响。本文研究了蒙脱石、沸石、碳纳米管、 c p c 蒙脱石、c p c 沸石、c p c 碳纳米管对细菌内毒素的吸附作用。经拟合l a n g m i u r 方程计算得到各材料对内毒素的最大吸附量：c p c 碳纳米管( 3 5 7 0e u m g ) 碳纳 米管( 2 6 8 6e u m g ) c p c 蒙脱石( 1 1 6 3e u m g ) 蒙脱石( 9 6 9e u m g ) c p c 一 沸石( 8 6 3e u m g ) 沸石( 7 6 8e u m g ) 。营养物质赖氨酸的存在明显降低了各材 料对内毒素的吸附量，降低程度随赖氨酸浓度的增高而增高。 加载c p c 后的各材料不仅具有杀菌能力，同时对内毒素的吸附能力也大大提 高，其中c p c 碳纳米管是杀菌能力最高，吸附内毒素量最大的一种材料，且其受 环境不利条件影响最小，有望成为新型的饲料添加剂用于饲料制备行业中。 关键诩：大肠杆菌；蒙脱石；沸石；碳纳米管；氯化十六烷基吡啶；内毒素；抑制： 吸附；肠炎 几种改性矿物和碳纳米管对e c o l i 的抑制和内毒索的吸附 a b s t r a c t t h ep a t h o g e n i cec o l ii st h em a i nr e a s o nt h a tc a u s e st h ea n i m a la n dm a n k i n d s d i a r r h e a h o wt oc u r ed i a r r h e a , r e d u c et h eq u a n t i t yo fp a t h o g e n i cg e r m sa n di t st o x i n si n i n t e s t i n e si sa l w a y st h ec o n c e r n e dp r o b l e m c o m b i n e dw i t ht h en o n - a n t i b i o t i cs u b s t a n c e s - - c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ( c p c ) c p c m o n t m o r i l l o n i t e ( c p c m ) ，c p c - z e o l i t e ( c p c - z ) a n dc p c c a r b o nn o n o t u b e s ( c p c ow a s m a d ea st h em a t e r i a l sw h i c hc a l ln o to n l yi n h i b i te c o l ib u ta l s oa d s o r b e n d o t o x i n a st h er e s u l t ss h o w e d ，t h eq u a n t i t yo fc p cl o a d e do nc a r b o nn a n o t u b ci s m u c hh i g h e rt h a nt h a to nm o n t m o r i l l o n i t ea n dz e o l i t e c a r b o nn a n o t u b e sc o m b i n e dw i t h c p cm a i n l yb yp h y s i c a la d s o r p t i o n m o n t m o r i l l o n i t ea n dz e o l i t ec o m b i n e dw i t hc p cb y b o t hp h y s i c a la n dc h e m i c a la d s o r p t i o n 。 t h ei n h i b i t i v ee f f e c t so fc p c - m ，c p c za n dc p c co ne c o l iw a sr e s e a r c h e db y s i m u l a t i n gt h ei n t e s t i n ec i r c u m s t a n c e ( p h ：a b o u t7 ，t ：a b o u t3 7 ) c p c cs h o w e dt h e h i g h e s ti n h i b i t i v ee f f e c to ne c o l i t h ei n h i b i t i v ee f f e c t so ft h et h r e ek i n do fm a t e r i a l so n e c o l ic h a n g e dw i mt h e i rq u a n t i t i e si nd i r e c tr a t i o t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h e i n h i b i t i v es p e e do fc p c ci st h eh i g h e s to n e ，f o l l o w e db ym o n t m o r i l l o n i t ea n dz e o l i t e t h ep hv a l u ea f f e c t ss l i g h t l yt ot h e i ri n h i b i t i v ea b i l i t y ，w h e r e a st h ec h a n g eo f t e m p e r a t u r e a f f e c t st h e i ri n h i b i t i v ea b i l i t yh i g h l y a l lm a t e r i a l s s t e r i l i z e da b i l i t yh e i g h t e n e dw i t ht h e h i g h e rt e m p e r a t u r e ，a n dt h ec p c c sw a sa p p r o v e dt ob ea f f e c t e db yt e m p e r a t u r eh i g h l y t h ei n h i b i t i v ee f f e c t so fc p c - m ，c p c - za n dc p c - co ne c o l iw a sr e d u c e db yl y s t h e d e g r e eo f r e d u c t i o na c c r e t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f l y si n c r e a s e d t h ea n t i - v i r u sc a nk i l lg e r me f f e c t i v e l y ，b u te n d o t o x i nw a s c o m ei n t ob e i n gb yt h e d e a t ho fg e r m ，a n dt h ee x i s t a n c eo fag r e a td e a lo fe n d o t o x i nw i l lb r i n ga b o u tn e g a t i v e i n f l u e n c eo nt h ea n i m a lb o d y s o ，t h ea d s o r p t i o no fm o n t m o r i l l o n i t e ，z a o l i t e ，c a r b o n n a n o t u b e ，c p c m ，c p c za n dc p c co ne n d o t o x i nw a ss t u d i e d t h r o u g hm a t c h i n g l a n g m i u re q u a t i o n ，t h eb i g g e s ta d s o r bq u a n t i t yo fe a c hm a t e r i a lt oe n d o t o x i nw a s c a l c u l a t e d ：c p c - c ( 3 5 7 0e u m g ) c ( 2 6 8 6e u m g ) c p c m ( 1 1 6 3e u m g ) m ( 9 6 9e u m g ) c p c z ( 8 6 3e u m g ) z ( 7 6 8e u m g ) t h ee x i s t e n c eo fl y sd e c r e a s e s t h ea d s o r bq u a n t i t yo fe a c hm a t e r i a lo ne n d o t o x i no b v i o u s l y , a n dt h el o w e r i n gd e g r e e i n c r e a s e sw i t ht h eh i g h e rl y sc o n c e n t r a t i o n t h em a t e r i a l sc o m b i n e dw i t hc p ch a sn o to n l ys t e r i l i z e da b i l i t y , b u ta l s oah i i g h e r a d s o r p t i o na b i l i t yt oe n d o t o x i ni nt h em e a n t i m e a m o n gt h e m ，t h ec p c cw a sp r o v e dt o b et h em a t e r i a lt h a th a st h eh i g h e s ts t e r i l i z e da n da d s o r p t i v ea b i l i t yt oe n d o t o x i n t h e i n f l u e n c es u b j e c t e dt od i s a d v a n t a g e o u se n v i r o n m e n tc o n d i t i o n so fc p c cw a sp r o v e dt o 2 华中农业大学二零零六届硕十学位论文徐英贤2 0 0 6 年6 月 b et h em i n i m u m c p c - ci sh o p e dt ob e c o m ean e wa n i m a lf e e da d d i t i v et ou s e di nt h e a n i m a lf e e d k e yw o r d s ：e c o l i ，m o n t m o r i l l o n i t e ，z e o l i t e ，c a r b o nn a n o t u b e ，c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ， e n d o t o x i n , i n h i b i t i o n , a d s o r p t i o n , e n t e r i t i s 3 几种改性矿物和碳纳米管对e c o h 的抑制和内毒索的吸附 缩略语表： c 或c n t ：碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e s ) ： c p c ：氯化十六烷基吡啶( c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ) ： c p c 蒙脱石( c p c m ) ：加载c p c 后的蒙脱石； c p c 沸石( c p c z ) ：加载c p c 后的沸石； c p c - 碳纳米管( c p c c ) ；加载c p c 后的碳纳米管； e t ：细菌内毒素( e n d o t o x i n ) f ；沸石( z e o l i t e ) ： m ：蒙脱石( m o n t m o r i l l o n i t e ) ： 4 华中农业大学二零零六届硕七学位论文徐荚贤 2 0 0 6 年6 月 1 前言 迄今为止，国内外大量研究结果表明：蒙脱石、沸石和活性炭等材料可被用作 饲料添加剂吸附饲料或动物肠道内的真菌毒素、细菌致病菌、病毒等，而且蒙脱石 和活性炭自古以来就作为人类消化道粘膜保护剂用于临床治疗腹泻、消化道炎症及 溃疡。新型材料碳纳米管虽然还没被用于动物肠道内各种有害物质的去除，但由于 其强大的吸附能力逐渐得到人们的重视而被用于环境中污染物的去除。这些材料不 仅吸附能力强，而且由于其颗粒较小，易黏附于肠粘膜表面，形成一层保护膜，可 阻止细菌、毒素及各种病毒的入侵。 1 1 研究目的及意义 动物肠道内致病菌和致病菌产生的毒素是引起动物腹泻的重要影响因子，本文 从蒙脱石、沸石和碳纳米管的物理化学特征入手，结合有机阳离子氯化十六烷基吡 啶( c p c ) 的杀菌功能和内毒素表面的疏水、亲水基团及带负电性，分析加载c p c 后的蒙脱石、沸石和碳纳米管对大肠杆菌e c o i l 的抑制作用及对因细菌死亡而释放 的细菌内毒素的吸附作用，在此基础上模拟动物肠道环境考察各种环境条件对杀菌 和吸附细菌内毒素的影响，比较各材料对e c o l i 抑制能力和对细菌内毒素吸附能力 的强弱，挑选出一种杀菌能力最强、吸附内毒素量最大的材料用作动物细菌性肠炎 治疗的辅助性药物，以期达到肠炎患畜肠道内“菌毒共治”的目的，具有一定的实用 价值。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 蒙脱石、沸石、活性炭和碳纳米管在饲料及医药中的应用 蒙脱石届层状结构的铝硅酸盐矿物，由两层s j 。o 四面体片央一层a l ，o 八面体 片组成2 ：1 型结构，在电子显微镜下观察，晶体属单斜晶系，一般呈不规则片状。 蒙脱石不仅具有巨大的外表面积，也有巨大的内表面积，其比表面积可达 6 0 0 8 0 0 m 2 g 。在蒙脱石形成过程中，蒙脱石的硅氧四面体中的s i + 可被a 1 3 + 替换， 铝氧八面体片中的a 1 3 + 可被m 9 2 + 或f e 2 + 替换( 姜桂兰等，2 0 0 5 ) 。因此，使晶层闻 产生永久性负电荷，此负电荷可由进入层问的k + ，n a + ，c a + 等来平衡。遇水后具 有膨胀，吸附、带电等特性和很强的离子交换能力。 几种改性矿物和碳纳米管对e c o l t 的抑制和内毒素的吸附 沸石足一种含水架状结构的多孔铝硅酸盐矿物，其基本结构是硅氧四面体。硅 氧四面体中的四价硅离子可被三价铝离子取代形成铝氧四面体，并带一个单位负电 衙，具有巨大的比表面积；同时。沸石具有良好的选择性吸附、阳离_ f 交换、催化 激活、耐酸和热稳定等性能( 余振宝等，2 0 0 5 ) 。 蒙脱石和沸石等铝硅酸盐矿物被用作饲料添加剂的历史非常悠久，它们都具有 较大的比表面积及亲水性的负电荷表面，能够在动物消化道环境中通过螫合作用、 分子间作用力、阳离子交换作用等与霉菌毒素分子的某些基团发生作用，适于吸附 带有极性基团的霉菌毒素，或者在吸附过程中使毒素结构发生改变( 可逆或不可逆) ， 使其毒性降低或消失。如黄曲霉素b , ( r a m o s ，e ta 1 ，1 9 9 6 ；l e m k e ，e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，玉米 烯酮( r a m o s ，e ta 1 1 9 9 6 ) ，赭髓霉素a ( a l e k s a n d r ad ，e ta 1 2 0 0 3 ) ，环盐酸吗甲吡嗪酸 ( d w y e r , e t a l 。1 9 9 7 ) 等。同时为改善矿物与不同霉菌毒素之间的选择性吸附能力，各 种改性方法应运而生。如无机改性方法( 载c u 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 的蒙脱石和沸石对黄曲 霉素b i 的吸附( m a g d a l e n a , 2 0 0 1 ) 等) 、有机改性方法( 十六烷基三甲胺交换蒙脱石对 玉米烯酮的吸附( l e m k e ，e ta 1 。2 0 0 1 ) 、八癸基二甲基苄胺交换沸石对黄曲霉素b l 、 玉米烯酮、赭曲霉素等的吸附( m a g d a l e n a , e ta 1 ，2 0 0 3 ) 、c x 季铵盐改性蒙脱石对黄 曲霉素b l 的吸附( 齐德生等，2 0 0 3 ) ) ，且都取得了良好的效果。 蒙脱石和沸石除了能吸附饲料及动物肠道内的霉菌毒素之外，也可吸附致病菌 ( h e r r e r a , e ta 1 。2 0 0 4 ；w i g h t m a n , e ta 1 。2 0 0 4 ) 、病毒( c l a r k ，e ta 1 ，1 9 9 8 ) 等。另外它们在 肠道内能与营养成分混合使肠粘膜厚度增加、肠腺发达、消化功能增强，同时还可 以增加胃肠道腺体分泌的消化液的数量，便于饲料营养成分的充分吸收( 郭松林等， 2 0 0 4 ) 。由于它们颗粒细小，能迅速分散并覆盖于消化道溃疡面的牯膜表面，形成稳 定的粘膜屏障，减少和阻止致病因子对胃粘膜的损伤f 汤庆国等，2 0 0 5 ) 。 蒙脱石作为药用矿物始载于本草纲目拾遗，现在临床上已广泛用于治疗急慢 性腹泻、溃疡性结肠炎、消化性溃疡、糜烂性胃炎、肠易激综合征等( 付桂风等，2 0 0 2 ) 。 它可通过与粘液糖蛋白识别、结合、定位，在消化道形成胶体保护膜，加强、修复、 保护消化道粘膜屏障，提高黏液质量，使黏液韧性增加，加强肠道黏膜的屏障作用， 因此能有效地阻止各种病毒、细菌及其所产生的毒素等致病因子的侵袭。如苏海涛、 李宗瑜等研究了蒙脱石对烧伤后肠源性内毒素移位的防治机理，指出天然蒙脱石对 严重烧伤大鼠肠黏膜屏障具有明显的保护作用，并能有效防治烧伤后肠道的细菌移 位蒙脱石由于其所带电荷的特殊性和电荷分布的不均匀性，可吸附轮状病毒、致 病大肠杆菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌等，并对毒素有固定作用，然后随肠蠕动排出 体外；可维持和促进肠黏膜细胞的正常吸收分泌功能，。减少肠黏膜细胞因运动失调 导致的水和电解质丢失：可平衡正常肠道菌群的微生态，促进消化道s i g a 的聚集量 增高，提高消化道局部免疫作用；也可增长药物在血液中的有效浓度，如服用蒙脱 石安非他明硫酸盐制剂时，尿液中排出的药物浓度大幅降低，血液中药物浓度则能 维持1 4 h ( m c g i n i t y , c ta 1 ，1 9 7 7 ) 。在治疗腹泻方面。伍晓雄等报道，蒙脱石治疗仔猪 6 华中农业大学二零零六届硕+ 学位论文徐英贤2 0 0 6 年6 月 白痢和早期断奶腹泻综合症，其总有效率高于抗菌药物。腹泻儿童服用思密达( 主要 成分为蒙脱石) 5 d 后，双歧杆菌数较治疗前增加1 5 8 倍，患儿失调的肠道菌群趋向正 常，重建了肠道菌群微生态平衡，阻止了外袭菌的定植，达到了治愈腹泻的目的( 工 俊侠等，1 9 9 5 ) 。同时夏枚生等通过实验指出，载铜蒙脱石对大肠杆菌k 8 8 有较强的 杀菌能力，可有效降低仔猪的腹泻率，提高仔猪的日增重量。x i a 等研究了蒙脱石和 载铜蒙脱石对肉鸡生长性能，消化酶活性、肠道微菌群和肠粘膜形态的影响，发现 二者均能增强肉鸡小肠内总蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，改善肠粘膜的屏障作 用，载铜蒙脱石与蒙脱石相比能明显降低肉鸡小肠和盲肠内大肠杆菌和梭菌总量， 增加肉鸡的平均日净重量 活性炭由于其强大的吸附能力、无毒、无气味、无味道等特点，目前在药物制 剂中主要用来吸附药品中的杂质、热原以提高产品质量；临床上主要用于止泻和防 止毒物吸收。活性炭既不被胃肠道吸收，也不参与机体代谢，而是随粪便排出体外 ( m c e v o y , e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。同样，活性炭在胃肠道中也可强烈地吸附药物，减少其一次 吸收量和对机体的毒性。药物和活性炭结合后，其在消化道中的降解速度降低，药 物的稳定性和利用率都会提高。这是由于活性炭的吸附和交换性能，使药物在单位 时间内的释放量减少，虽然降低了血液中药物的峰值浓度，却提高并延长了血液中 药物的有效浓度，成为长效缓释药物。活性炭的有效性决定于摄取后的时间和摄取 量，活性炭：药物应量1 0 ：1 ( g i l m a n , e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。活性炭的吸附能力具广谱性和快 速性，是某些有毒物质中毒的最佳吸附剂( g i l m a n ，e ta 1 ，1 9 8 0 ) 。美国医药协会指出： 在误服有毒物质或服用呕吐性药物呕吐停止之后应尽快服用活性炭。口服：成人： 5 0 - - 1 0 0 9 ，儿童：2 5 5 0 9 ( 大约l g & g ) ，一般采用冲服或沈胃后用胃管灌服。活性炭 无毒，所以在服用时没有最大剂量的限制。对经过肝循环的有毒物质( 如洋地黄毒苷、 茶碱、毒伞毒素等) 或滞留于肠胃的有毒药物( 如苯环己哌啶( p h e n c y c l i d i n e ) 、苯巴比 妥( p h e n o b a r b i t a l ) 、三环抗郁剂( t r i c y c l i ca n t i d e p r e s s a n t s ) 等) 可用 6 肚7 0 时 e c o i lk 1 2 和s a u r e u s 在s u p e r q 上的吸附量较p h 2 5 0 之间的多。但足这些材料 并没有杀菌能力，如书莉萍等( 2 0 0 4 ) 探讨了纳米蒙脱石对金黄色葡萄球菌的吸附 作用，结果表明蒙脱石和纳米蒙脱石均无杀菌和抑菌作用，蒙脱石对金黄色葡萄球 菌的吸附率为6 1 4 ，用p e g 4 0 0 和p e g 6 0 0 0 插层方法制得的纳米蒙脱石对金黄色 葡萄球菌的吸附率分别为9 0 3 和7 3 8 。实验结果表明这些材料虽可吸附细菌， 但均无杀菌能力，即吸附于其上的细菌仍保持生物活性( 胡秀荣等，2 0 0 2 ) 。 为了达到抗菌目的，国内外研究都致力于将抗菌性物质加载到各种吸附材料上， 如利用硅酸盐矿物的阳离子交换性能，将重金属离子a g + 、c u 2 + 、c p 、c 0 2 + 、z n 2 + 等或十六烷基三甲胺、八癸基二甲基苄胺等四铵盐类有机阳离子通过阳离子交换反 应加载至膨润土、蒙脱石、沸石、高岭石等硅酸盐矿物上，这样不仅使矿物带正电， 加强了其与带负电荷细菌之间的静电引力，而且使矿物具有了抗菌功能。国内外研 究表明：天然非金属矿物可用作抗菌剂的载体用于环境及肠道内致病菌的去除。如 r i v e r a - g a r z a 等( 2 0 0 0 ) 分别以沸石和蒙脱石为载体，搭载银离子用作抗菌剂，取 得了较好的效果。叶瑛等( 2 0 0 3 ) 研究了载铜蒙脱石和载铜沸石对e c o l i 和s f a e c a l i s 的抑制作用，指出载铜蒙脱石的抗菌能力大大优于载铜沸石。这些重金属离子虽然 可以杀菌，但其从载体上解吸下来后容易在机体内沉积且不易排出，故其应用受到 了局限。 c p c 一蒙脱石、c p c 沸石和c p c 碳纳米管能有效杀灭e c o l i ，但因为e c o i l 为革 兰氏阴性菌，其死亡或破裂的时候会将细胞壁中的脂多糖( 内毒素的主要成分) 释 放出来，脂多糖中的类脂a 具有生物毒性，能引起机体产生发热等一系列病理特征， 因而本文在研究c p c 蒙脱石、c p c 沸石和c p c 碳纳米管杀菌能力的同时，分析了 加载c p c 前后蒙脱石、沸石和碳纳米管对细菌内毒素的吸附能力和各种环境条件 对吸附的影响，以期选择出一种杀菌能力强且能有效去除细菌内毒素的材料，为动 物肠炎治理提供一种更合适的饲料添加药物。 华中农业大学二零零六届硕士学位论文徐英贤2 0 0 6 年6 月 2 实验材料与研究方法 2 1 材料和仪器 2 1 1 实验材料 蒙脱石( 提取于天然膨润土) ，沸石( 过1 0 0 日筛的天然沸石粉) ，多壁碳纳米 管( 直径 o 9 8 0 ，阴性对照管反应时 间 3 6 0 0s ，判断其标准曲线成立 回收实验：分别称一定量各材料于灭热源离心管中，加入l m l 细菌内毒素检查 1 7 几种改性矿物和碳纳米管对e c o i l 堕抑制和内毒素的吸附 用水，在恒温振荡器上振荡一定时问，离心，转移上清液。用标准曲线中点浓度作 为内毒素标准将其加至各上清液中，摇匀，吸o 1 m l 于含o 1 m l 鲎试剂的反应管内， 在内毒素检测仪上测定反应时间，计算内毒素浓度，计算回收率，每种吸附材料均 做3 个平行( 具体方法参照药典) 。回收率( r ) 按下式计算： r = ( e s e t ) ) a n x1 0 0 e s 和e t 分别表示供试品溶液和添加内毒素标准溶液的供试品的内毒素含量， 九m 为加入的标准内毒素量。 2 2 7 各材料对内毒素的等温吸附 分别称取各供试材料l o m g 于无热源试管中，加入l o m l 细菌内毒素检查用水， 在旋涡振荡器上混匀，用移液枪吸取o 5 m l 于一系列1 5 m l 离心管中，即每个离心 管中含0 5 m g m l 供试材料。将细菌内毒素国家标准品稀释至不同浓度，用移液管精 确吸取0 5 m l 到上述离心管中，使其最终浓度为：0 ，l ，5 ，l o 。2 5 ，5 0 ，7 5 ，1 0 0 e u m l 。 然后放于3 7 c 恒温振荡器上振荡2 h ，1 5 0 0 0 r p m 下离心，转移上清液，吸附后的内 毒素浓度用动态浊度法在b e t - 3 2 细菌内毒素检测仪上自动检测。按下式计算吸附 量： 姗( e u 时幽塑墼需鬻学幽燮型 2 2 8 赖氨酸对各材料吸附内毒素的影响 分别称1 0 m g 蒙脱石、沸石、碳纳米管、c p c 蒙脱石、c p c - 沸石和c p c - 碳纳 米管于灭热源试管中，加入5 m l 细菌内毒素检测用水，在振荡器上混匀，使吸附材 料浓度为2 m g m l ；各吸取0 2 5 m l 于一系列1 5 m l 硅化离心管中，再依次加入0 5 m l 1 0 0 e u m l 的内毒素标准溶液和0 2 5 m l8 m g m l ( 或2 0 m g m 1 ) 的赖氨酸溶液，即每 个离心管中含o 5 m g m l 吸附材料5 0 e u 施l 内毒素和2 0 m g m l ( 或5 o m g m 1 ) 赖氨 酸，总体积为i m l 。将加样后的各离心管鼍于3 7 c 恒温振荡器上振荡2 h ，离心，转 移上清液，用鲎试剂动态浊度法在b e t - 3 2 细菌内毒素检测仪上检测内毒素浓度。 华中农业大学二零零六届硕士学位论文徐英贤 2 0 0 6 年6 月 3 结果与分析 3 1c p c 杀菌实验结果 氯化十六烷基吡啶( c p c ) 为阳离子季铵盐类化合物，是一种表面活性剂，可 通过降低表面张力而抑制和杀灭细菌。c p c 带正电荷，e c o l i 带负电荷，二者可通 过静电引力而相互吸引。c p c 可破坏细菌的细胞壁而停止细菌细胞的呼吸功能，或 通过渗透扩散作用，穿过细菌细胞表面进入细胞膜，完成半渗透作用，再进一步进 入细胞内部。使细胞内酶钝化，抑制蛋白质核酶的产生，使蛋白质改性，借此杀死 细菌。 1 0 0 8 0 姆6 0 通 髅4 0 2 0 0 、_ ol 2 3 4567 图3 c p c 对e c o l i 的杀菌效果 c p c 浓度 ( p g m d f i g 3s t e r i l i z e de f f e c to fc p c o ne c o l i 实验结果表明，c p c 对e c o l i 的抑制效率随c p c 浓度增加而迅速上升，c p c 浓 度为3 o g g r n l 时，杀菌率即达到9 6 o ( 见图3 ) 。 3 2 蒙脱石、沸石和碳纳米管加载c p c 的量 吸悯鹏g ) = 型塑堕篇篙产巡燮型 载体上剩余c p c ( r a g g ) = 载体对c p c 的吸附量( m g ，g ) 一解吸量( m g 幢) 1 9 几种改选贮塑塑碳纳米管对e c o i l 的抑制和内毒素的吸附 表1 蒙脱石、沸石和碳纳米管加载c p c 的量 t a b l e1q u a n t i t yo fc p ca d s o r b e do nm o n t m o r i l l o n i t e ，z a o l i t eo rc a r b o nn a n o t u b e 从实验结果可以看出，c p c 在三种载体上的加载量为：碳纳米管 蒙脱石 沸 石( 见表1 ) 。这主要由三者的结构所决定，碳纳米管主要成分为碳原子，其比表面 积远大于蒙脱石和沸石；沸石的阳离子交换量虽然大于蒙脱石，但由于其比表面积 较小( 见表2 ) ，故可加载的c p c 量仍小于蒙脱石。从结构上分析，碳纳米管通常 集结成束，内腔和管与管之间形成的通道都是很强的吸附位( 朱宏伟等，2 0 0 2 ) ， c p c 通过物理吸附作用吸附于碳纳米管内外表面，结合力较弱，故很容易被解吸下 来，蒙脱石和沸石对c p c 的加载不仅包括物理吸附，还包含有阳离子交换的化学 吸附，结合力相对较高，实验数掘表明：c p c 在碳纳米管上的解吸量大于蒙脱石和 沸石，但在解吸反应后三种材料上剩余c p c 的量仍为：碳纳米管 蒙脱石 沸石。 蒙脱石和沸石对c p c 的吸附量与比表面积显著相关，而与阳离子交换量c e c 关系 不大，说明蒙脱石和沸石对c p c 的加载也以物理吸附为主。 3 3 加载c p c 前后蒙脱石、沸石和碳纳米管的物理化学特征 表2 各吸附材料加载c p c 前的基本物理性质 t a b l e2b a s i cp h y s i c a lp r o p e r t i e so fa l lm a t e r i a l sb e f o r ec o m b i n e dw i t hc p c 本文蒙脱石系用虹吸沉降法制得，故平均颗粒均电“m ；沸石粉过3 5 0 目湿筛， 平均颗粒均 3 6 0 0 s ，说明标准曲 线成立；回收试验结果表明各材料上清液内毒素回收率均在5 0 2 0 0 之间，说明 离心后各材料上清液对内毒素检测不存在干扰，离心效果理想。同种材料均重复2 管测定，变异系数( c v ) 均1 0 ，说明各管重现性好。 分析数据结果得各材料对内毒素的等温吸附曲线。由图1 3 可见，随着平衡液 内毒素浓度的增加，各材料对内毒素的吸附量迅速上升。蒙脱石、沸石、c p c 蒙脱 石和c p c - 沸石的等温吸附曲线相似，说明它们对内毒素的吸附机制是相同的。在 内毒素浓度小于1 0 e u m l 时，该四种材料对内毒素的吸附量上升很快，而在内毒素 浓度大于1 0 e u m l 之后，吸附量上升速度减慢，曲线趋于平缓，吸附逐渐达到饱和。 碳纳米管和c p c 碳纳米管对内毒素的等温吸附曲线形状与蒙脱石、沸石、c p c 蒙 脱石和c p c - 沸石的差别很大，其吸附量随内毒素浓度的增加而持续上升，但上升 速度较为缓慢。 o2 04 06 08 01 0 01 2 01 4 0 e q u d l b n u mc o n c e n t r a t i o no fe n d o t o x l n ( e u m 1 ) 图1 3 各材料对内毒素的吸附等温曲线 f i 舀1 3a d s o r p t i o nl s o t h e m so fe n d o t o x i no i ld i f f e r e n ta d s o r b e n t s ( 注：代表蒙脱石，o 代表c p c 一蒙脱石，丫代表沸石。v 代表c p c = 沸石， 一代表碳纳米管，口代表c p c - 碳纳米管) 蒙脱石、沸石、碳纳米管、c p c 蒙脱石、c p c 。沸石和c p c 碳纳米管对内毒素 的等温吸附均符合l a n g m i u r 方程( 相关系数r 均大于0 9 8 ) ，即j ，= b m a x k x ，y | 兰 薹暑 姗 伽 伽 。 一o|)9qj8口c|)8lo口c 华中农业大学二零零六届硕士学位论文徐英贤2 0 0 6 年6 月 表示单位材料对内毒素的吸附量( e u m g ) ，b m a x 表示内毒素的理论最大吸附量 ( e u m g ) ，k 代表内毒素与吸附结合能有关的常数，x 表示溶液中内毒素的平衡浓 度( e u r n l ) 。经拟合l a n g m i u r 方程计算的各材料对内毒素的最大吸附量( 见表1 4 ) 顺序为：c p c 碳纳米管( 3 5 7 0e u m g ) 碳纳米管( 2 6 8 6e u m g ) c p c 蒙脱石 ( 1 1 6 3e u m g ) 蒙脱石( 9 6 9e u m g ) c p c 沸石( 8 6 3e u m g ) 沸石( 7 6 8 e u m g ) 。 表7 各材料对内毒素等温吸附曲线的相关参数( l a n g m i u r 方程) t a b l e7l a n g m u i rp a r a m e t e r sf o ra d s o r p t i o no fe n d o t o x i no na l lm a t e r i a l s 以往研究表明，l a n g m i u r 方程中的k 值越大，则吸附剂与吸附质的亲和力越 大，吸附反应越容易进行( 赵振华等，2 0 0 2 ) 。由表7 可知加载c p c 前后的碳纳米 管对内毒素的亲和力远远大于加载c p cj ；i 后的蒙脱石和沸石，加载c p c 前后的沸 石对内毒素的亲和力大于加载c p c 前后的蒙脱石，这可能与蒙脱石和沸石的阳离 子交换量有关，沸石的阳离子交换量大于蒙脱石，内毒素由于带负电，静电引力使 得其与沸石的亲和力大于蒙脱石。 比较表2 和表7 可以发现，比表面积是影响吸附量的最主要因素，比表面积越 大吸附量就越大碳纳米管的比表面积是蒙脱石和沸石的6 倍左右，其对内毒素的 最大吸附量为蒙脱石和沸石的2 3 倍：加载c p c 后三者对内毒素的吸附量都明显 增加，但碳纳米管上升的幅度最大，c p c 碳纳米管对内毒素的最大吸附量上升为 c p c 蒙脱石和c p c 沸石的3 4 倍。 3 7 赖氨酸对各材料吸附内毒素的影响 本实验分析了0 ，2 0 ，5 0 m g m l 赖氨酸对各材料吸附能力的影响。由实验数据 得出内毒素浓度与预定浊度达限时间之间的标准曲线为：l 酊= 2 7 2 4 3 - 0 2 3 7 1 1 9 c ，标 准曲线的相关系数的绝对值lr | - o 9 9 7 3 0 9 8 0 ，各材料空白对照达限时间均 3 6 0 0 s ，说明标准曲线成立；回收试验结果表明各材料上清液内毒素回收率均在 几种改性矿物和碳纳米管对e c o l t 的抑制和内毒索的吸附 5 0 , - - 2 0 0 之间，说明离心后各材料上清液对内毒素检测不存在干扰，离心效果理 想。同种材料均重复2 管测定，变异系数( c v ) 均1 0 ，说明各管重现性好( 原 始数掘略) 。 由图1 4 可以看出，随着赖氨酸浓度的增高，各材料对内毒素的吸附量均明显降 低。c p c 碳纳米管、碳纳米管、c p c 蒙脱石、蒙脱石、c p c 沸石和沸石对内毒素 的吸附量在赖氨酸浓度为o 时分别为；1 7 5 6 ，1 6 3 ，1 0 1 3 ，9 6 4 ，7 3 6 ，3 2 1 e u m g ； 当赖氨酸浓度为2 0 m g m l 时，各材料对内毒素的吸附量分别降至1 6 1 2 ，8 5 4 ，6 8 9 ， 4 2 1 ，1 4 6 ，2 0e u m g ；当赖氨酸浓度为5 0 m g m l 时，各材料对内毒素的吸附量比 赖氨酸浓度为2 0 m g m l 时的更低，分别为1 1 9 7 ，7 2 3 ，2 5 6 ，7 3 ，2 3 ，3 6 e u m g 。 1 5 0 旨 昌 。1 0 0 删 釜 鍪 0 赖氡酸浓度( m g m 1 ) 图1 4 不同浓度赖氨酸对各材料吸附内毒素的影响 f i g 1 4e f f e c t so fd i f f e r e n tl y sc o n c e n t r a t i o n so nt h ea d s o r p t i o no fe n d o t o x i nb y a d s o r b e n t s 赖氨酸的存在降低了各材料对内毒素的吸附量，而且随着赖氨酸浓度的增高吸 附量明显降低，这说明了赖氨酸与内毒索之间存在着竞争吸附 华中农业大学二零零六届硕+ 学位论文徐英贤2 0 0 6 年6 月 4 讨论 4 1 各材料杀菌能力比较及不同环境条件对杀菌能力的影响 细菌细胞壁是细菌细胞最外面的一层坚韧并富有弹性的外被，主要成分为肽聚 糖，它赋予细菌细胞以强度和形状，起着保护细胞形态的作用。细胞壁一旦被破坏， 细菌形态随之发生改变。大肠杆菌为革兰氏阴性杆状细菌。它们的细胞壁被破坏后， 会逐渐变为圆球状，对渗透压特别敏感，最后破裂而死亡。 c p c 为阳离子季铵盐类化合物，在药理方面的应用主要作为表面活性剂通过降低 表面张力而抑制和杀灭细菌。大肠杆菌k s 8 表面带负电荷( j a m e s ，1 9 9 1 ) ，其可通过静 电吸引作用与有机阳离子c p c 在细胞质膜结合，通过细胞膜孔道的开闭，c p c 易穿 透细胞膜并进入细胞内，与细胞内蛋白质中的s h 等有机官能团结合，使蛋白质变性， 从而使细菌死亡。 通过上述研究表明，c p c 在不同材料上加载的量不同，其杀菌能力就不同。各 材料杀菌能力的高低与其加载c p c 的量呈正相关。碳纳米管由于具有比表面积大、 微孔含量丰富等特点，吸附的c p c 含量远远高于蒙脱石和沸石，导致其杀菌能力 为c p c 蒙脱石和c p c 沸石的1 0 0 倍以上由于体系中时浓度的高低对c p c 的结 构不产生影响，故各材料的杀菌能力受p h 值影响不大。温度的升高和时间的增长 增加了c p c 的解吸量，使各材料的杀菌能力升高。当营养物质赖氨酸存在时，赖 氨酸的促生长作用降低了各材科的杀菌能力 4 2 各材料对内毒素的吸附及赖氨酸对吸附的影响 实验结果指出，各材料对内毒素的吸附量大小依次为：c p c 碳纳米管( 3 5 7 0 e u m g ) 碳纳米管( 2 6 8 6e u m g ) c p c 蒙脱