常见免疫方法分析及三项 PPT课件.pptVIP

常见免疫方法分析及三项（丙肝、艾滋、梅毒）检测,1,.,总述,第一节免疫学简介第二节免疫学检测方法第三节艾滋病及检测第四节丙型肝炎及检测第五节梅毒及检测,2,一、免疫（Immune）的定义,免疫的最初概念：免除瘟疫免疫的传统概念：抗感染免疫现代免疫的概念：是机体识别“自身”与“非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生理功能。,第一节免疫的基本概念,3,浆细胞,粒细胞,单核细胞,巨噬细胞,T细胞,B细胞,免疫球蛋白,补体,细胞因子,-真菌-细菌-支原衣原体立克次体-病毒-蠕虫-原虫,胃小肠呼吸道皮肤,4,二、免疫的功能,免疫功能是免疫系统在识别和清除“非己”抗原的过程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括：1.免疫防御（Immunologicdefence)：是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反应，过弱则表现为免疫缺陷。,5,2.免疫自稳(immunologichomeostasis)：是免疫系统维持机体内环境相对稳定的生理功能。正常：可及时清除体内损伤、衰老、变性的血细胞和抗原抗体复合物，而对自身成份保持免疫耐受；异常：可发生生理功能紊乱、自身免疫病等。,6,3.免疫监视(immunologicsurveillance)：是机体免疫系统识别、清除体内突变、畸变细胞以及被病毒感染细胞的生理性保护作用。丧失：机体突变细胞失控，可能导致肿瘤发生或出现病毒的持续感染。,7,8,第二节免疫学检测技术,免疫检验可分为两部分：一部分为利用免疫检测原理与技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质；另一部分是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。,9,发展进程的主要阶段,10,免疫球蛋白,11,12,凝集反应,13,目前常用的ELISA（酶联免疫吸附试验）,14,15,化学发光免疫分析,待测样品,标记抗体或抗原,洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,包被抗体或抗原的反应管,反应30-60分钟,反应0-5分钟,16,固相抗原,待测抗体,金标记抗原,针对金标记抗原的抗体,快速检测（层析法）原理,17,18,放射免疫技术化学发光免疫技术荧光免疫技术流式细胞免疫技术酶联免疫技术免疫印迹技术速率散射免疫技术单克隆抗体技术电化学发光免疫技术,免疫检验涉及的主要技术,19,20,第三节艾滋病,1.HIV病毒体呈球形，直径约100120nm。2.电镜下成熟的HIV-1呈现一致密的圆柱状核心和一个病毒包膜。3.病毒核心由病毒RNA、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类组成。4.HIV的RNA为两条相同拷贝（完全同源）的正股RNA链。,21,一.HIV病原学基础,病毒分类与分型：HIV分为HIV-1和HIV-2二个型别。HIV-1分M组（主要亚型组）、O亚型组（外亚型）和N亚型组。M组又分为A、B、C、D、F1、F2、G、H、J、K共10个非重组亚型，另外还有14个流行重组亚型（circulatingrecombinantform,CRFs），包括CRF01-CRF14。HIV-2型至少有A-G7个亚型。,（一）形态与结构,22,HIV基因组:两条正股RNA链,在5端通过部分碱基互补配对而成双聚体。病毒基因全长约9.7kb，含有gag、pol、env3个结构基因和6个调节基因，分别称为tat(反式激活因子)、rev(毒粒蛋白表达调节子)、nef(负调控因子)、vpr(病毒r蛋白)、vpu(病毒u蛋白，仅存在于HIV-1，在HIV-2为vpx)和vif(毒粒感染性因子)。由于HIV基因结构复杂而被称为复杂逆转录病毒。,基因结构,23,HIV-1的基因结构,.,24,HIV的结构蛋白gag基因：先编码一个55KD的前体蛋白（P55），在蛋白酶作用下裂解形成内膜蛋白（P17）衣壳蛋白（P24）和P15蛋白。P15蛋白再进一步裂解成与病毒结合的核壳蛋白P9和P7。env基因：编码包膜糖蛋白，先编码一个88KD的蛋白，经糖基化后分子量增至160KD，即包膜糖蛋白的前体gp160。在蛋白酶作用下，切割成gp120和gp41。pol基因：编码酶蛋白，包括逆转录酶（p66/p51）、蛋白水解酶（p10）和整合酶(p32)，与病毒复制有密切的关系。,25,gp120暴露于病毒包膜之外，称外膜糖蛋白，感染细胞时是病毒与宿主细胞表面的CD4受体结合的部位。gp41是跨膜糖蛋白，具有介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的作用。当gp120与受体结合后即与gp41分离，暴露出gp41，在辅助受体协同作用下通过膜融合使病毒核心导入细胞。,26,（二）病毒在体内的动态分期,病毒进入体内在2天内到达局部淋巴结，5天内进入血液循环。其结果是导致全身性播散，到达脑部和淋巴组织。,1、体内播散期,27,从暴露于HIV到出现急性症状的时间一般是2-4周（1个月），少数病例可长达10个月。在急性感染的数天内，淋巴结内被激活的淋巴细胞中出现高水平的病毒复制，在很短的几天内出现P24抗原血症和高滴度病毒血症，病毒快速高水平复制，血浆中可检出107/ml个病毒RNA分子。CD8+细胞数上升，伴有短暂的CD4+细胞计数下降。,2、HIV感染急性期,28,特异性体液免疫应答出现后，血浆中HIVRNA的滴度下降到病毒载量定点（setpoint）水平，急性HIV感染的症状消失.病毒载量定点水平和预后有很大关系。早期治疗的目标之一是重新设定定点水平，使其保持较低水平。急性期HIV传播的效率最高，56-92%的HIV感染是由处在这个时期的HIV感染者传播的。从HIV感染到产生抗体（或血清抗体阳转）称为“窗口期”，一般为2-3月，最长6个月。,29,病人无临床症状，体检时无异常，少数可查到“持续性全身性淋巴腺病”（PGL），定义为肿大的淋巴结至少发生在两处且不是腹股沟淋巴结。由于细胞外的病毒被滤泡树突状细胞（FDC）扑捉而进入生发中心，细胞内的病毒大部分处于潜伏状态，所以淋巴结中病毒浓度很高。淋巴组织是病毒的主要藏身处，外周血中的病毒载量相对不高。随着疾病的进程，淋巴结结构被破坏，更多的病毒被释放。,3、无症状感染期,30,艾滋病前期症状包括鹅口疮、口腔毛状黏膜白斑病、发热、体重减轻等，但还不是艾滋病的典型症状。,4、艾滋病前期,5、艾滋病期,当患者出现典型症状(ARC)时，CD4+细胞计数通常降至200/ul以下，血和淋巴结中的HIV又上升到相当高的水平，同时细胞免疫水平降低。,31,指CD4计数2个月2重组或多肽间接3-4周3重组+多肽夹心4-7天4抗原+抗体夹心抗原5pg,43,HIV抗体筛查实验流程图,44,筛查检测要点,-严格按照说明书操作-严格遵守实验室操作规程-严格防止交叉污染，吸管、枪头单独使用-严格执行实验室生物安全制度,45,筛查结果及复检,-筛查（-）出具“HIV抗体非反应性”报告筛查（+）出具“HIV抗体待复查”，不能出阳性报告-复检：原有试剂另外一种不同原理或不同厂家试剂（进口试剂：生物酶里埃（AKZO），可只用原试剂复检）两种均阴性：报告“HIV抗体阴性”一阴一阳或两种均阳性：出具“HIV抗体待复查”，送确证实验室。-复检可在筛查中心实验室；也可在本实验室,46,（二）HIV抗体检测：确认,免疫印迹实验（WesternBlot）的原理,47,HIV抗体确认实验检测程序,48,结果判断（一）,HIV-1阳性技术规范：至少有2条env带：（gp41+gp160）/（gp41+gp120）至少有1个env（gp41、gp160、gp120）p24试剂盒提供的阳性判定标准,49,结果判断（二）,HIV抗体阴性（-）：无HIV抗体特异带出现，或仅有p17。HIV抗体不确定（）：出现HIV特异性抗体带，但带型不足以确认阳性者。,50,图211例窗口期感染者样本的WB条带带型。,51,造成WB假阳性或不确定的原因,1.18个月以内的抗体阳性婴幼儿2.HIV感染急性期3.晚期AIDS病人4.HIV疫苗接种5.自身免疫病6.肾衰竭和血透析7.遗传性胰腺囊肿8.多次怀孕或输血9.肝病10.注射用药11.乙肝、狂犬等疫苗注射12.其他人类逆转录病毒13.线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体14.高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮）15.正常人类核糖核蛋白,52,假阴性结果,指EIA+WB的假阴性原因急性感染后的抗体迟反应不同HIV毒株型发病晚期抗体消失窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关HIV亚型实验室操作,53,有研究证明：即使在无高危行为的普通人群中，WB不确定率10-15%，甚至高达32.P24条带最常见。统计学分析表明：在S/CO比值6时，抗体筛查实验阳性样本中，确认“可疑”和“阴性”的两组样本之间无显著性差异。参考文献：黑发欣，张启云，孙伟东，等.HIV抗体筛查实验阳性-确认实验“可疑”和“阴性”样本的对比分析.中国艾滋病性病,2006,12(1):4-6.,54,不确定标本的处理,按照全国艾滋病检测技术规范（2004年版）的要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复检1次，连续2次，共6个月。其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗体阳性判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月），只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的敏感性而出现条带。参考文献：黑发欣,张启云，孙伟东，等.病毒载量检测有助于排除人免疫缺陷病毒抗体可疑结果中的非感染者.中华预防医学杂志，2008，42（1）：4346.,55,18个月内HIV抗体呈阳性的婴幼儿，因可能携带母亲的抗体，不能确定是否感染，应于出生后18个月复查。不可轻易放弃婴幼儿的生命！,56,第四节丙型肝炎,HCV的生物学性状4060nm球形有包膜+ssRNA,57,HCV的基因结构：+ssRNA、9.5kb，有9个基因区组成,HCV的基因型有6种：型：欧美流行：亚洲，中国-型,HCV.swf,58,丙型肝炎的特点,我国丙肝病毒携带者的比例在2%5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染,59,HCV的致病性与免疫性,传播途径似HBV是引起输血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潜伏期：48周无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见肝外损伤：肾小球肾炎免疫力不牢固,60,HCV感染的预后,100位HCV急性感染,AdaptedfromAlterHF,SeeffLB.SeminLiverDis.2000;20:17-35.,61,检测程序,62,63,第五节梅毒螺旋体,又称苍白密螺旋体梅毒的病原体（STD之一）生物学性状菌体细长，两端尖直，8-14个螺旋，镀银染色呈褐色，运动活泼（暗视野）人工培氧不成功抵抗力极弱（温度、干燥），抗生素敏感,64,65,66,先天性梅毒流产、死胎梅毒儿（皮肤病变、锯齿形牙、角膜炎、先天耳聋）后天性梅毒分三期（潜伏期3W）一期梅毒：外生殖器无痛性硬下疳（丘疹硬结溃疡），病灶及渗出物中大量螺旋体传染性级强二期梅毒：全身皮肤、黏膜梅毒疹，周身淋巴结肿大（内有大量螺旋体），传染性强三期梅毒（晚期梅毒）：皮肤黏膜溃疡性坏死，侵犯内脏（心血管、神经系统），病灶中无螺旋体，传染性小，破坏性大,67,梅毒疹,68,梅毒的免疫性,感染梅毒后，首先产生IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出，早期梅毒抗梅治疗39个月后或晚期梅毒治疗2年后，大部分病人IgM可转阴性，再感染时又出现阳性，故IgM型抗体的存在是活动性梅毒的表现另一种具有抗体性质的物质叫反应素（reagin），是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机体所产生的抗体。反应素一般在感染后57周（或下疳出现后23周）产生经正规治疗后可逐渐消失。感染梅毒四周左右产生IgG型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间，IgG抗体仍可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血清中可测出,69,梅毒检测技术,梅毒的病原学检测非特异性梅毒血清学试验特异性梅毒血清学试验,70,暗视野显微镜检查法：目前国内主要的梅毒病原学诊断方法。是最特异的一期梅毒检测方法。取材部位以硬下疳为主，亦可从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。阳性可确诊，阴性不能排除梅毒（阴性结果须在不同的3天采样检测才能做出）。暗视野显微镜法诊断的准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数量及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素影响镀银染色法：与暗视野检查法的临床意义基本相同。利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察直接免疫荧光法（DFA)：是目前国外采用较多的方法，其特异性及敏感性均优于暗视野检查法。将特异性的抗梅毒螺旋体单克隆抗体用荧光素标记，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体,梅毒的病原学检测,71,非梅毒螺旋体抗原血清试验：是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。可以分为以下四种试验，原理基本相同：1、性病研究实验室玻片试验（VDRL)：由于试剂需现配现用，故而国内实验室很少采用。但VDRL是诊断神经性梅毒在最特异的血清学方法2、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)：在特制的纸片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果。3、甲苯胺红试验（TRUST)：在试剂中加入甲苯胺红代替炭粉颗粒，使结果更易于观察。4、不加热血清反应素试验（USR),非特异性梅毒血清学试验,72,非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷1、特异性：由于在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应2、敏感性：非梅毒螺旋体抗原血清试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的前带现象。12的二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒假阴性反应。此外，由于感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体抗体，晚期梅毒反应素又可能转阴，再加上这类试验对隐性梅毒也不敏感，因此用此类试验进行梅毒筛查时，存在着相当数量的漏检非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点1、非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性的患者往往是梅毒现症感染者，临床上即可开展治疗2、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标3、此类方法价格低廉,非特异性梅毒血清学试验（一）,73,用定量非梅毒螺旋体抗原血清试验进行疗效观察1、治疗成功：早期梅毒患者在治疗后6个月内症状消失且非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降。晚期梅毒或隐性梅毒患者在治疗后1224个月内非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降2、治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度反而上升了4倍或以上；非梅毒螺旋体抗原血清试验初始滴度较高（1:32或以上）但在六个月内没有达到4倍的下降。抗梅毒治疗失败的病人应考虑合并HIV感染及神经梅毒的可能性3、血清固定：经正规治疗后，梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验一般都会转为阴性，但有13%的病人即使经足量抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍持续呈低滴度阳性，这种现象称为血清固定，其原因尚不明了。血清固定患者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒,非特异性梅毒血清学试验（二）,74,梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试验，但不能用作疗效观察的指标。常用的有以下五种方法：1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA)4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT