（遗传学专业论文）植物细胞核仁动态结构的研究.pdf

摘要 核仁是真核生物细胞的r r n a 合成加工和核糖体装配的场所。核 仁的超微结构主要有三种基本结构组分：f c 、d f c 和g c 。核仁内r d n a 的分布、转录定位、r r n a 前体的加工及核糖体的装配和核仁的蛋白质 组学等都是细胞研究中的重要问题和方面。关于r r n a 基因的转录位 点是在f c 还是d f c ，到目前为止还存在争议。本文通过采用常规电 子显微镜方法和柠檬酸铽单链r n a 特异性染色法，以洋葱为材料对核 仁周期中核仁的形态结构变化规律和核仁中的单链r n a 的分布进行 了研究。由于新合成的r n a 短链可能还没有形成二级结构，一些单链 r n a 的分布区，代表了新合成的r n a 的分布区，这有利于转录位点 争议的解决。 本研究得出如下结论： 一、从洋葱分生组织可以得出如下规律： 1 在细胞周期中，核仁在有丝分裂末期开始出现，在g 1 期 的较早阶段核仁很小，还没有形成f c 和d f c 结构，随着 细胞的发育，核仁逐渐变大，f c 和d f c 结构开始明显， 后来核仁开始合并，在g 1 期的中后期阶段一个细胞中一 般为1 2 个核仁；核仁的大小在g 1 期的中后期、s 期和 g 2 期无明显变化，在s 期和g 2 期，d n a 的加倍，可能 对核仁的体积无明显影响。 2 在s 期、s 与g 2 的过渡时期，核仁的边缘出现了毛边现 象，在形态学上可见核仁与其周边染色质的联系增多。在 g 1 期、( 3 2 期的典型阶段和前期的早期阶段则无此现象。 3 核仁f c 、d f c 的变化及分布与细胞周期变化不是同步的。 在g 1 期、s 期和g 2 期都存在较大的f c 和较小的f c ， 一般具较大的f c 的细胞，f c 的数量较少；f c 较小的细 胞，核仁内f c 的数量较多；但也有一些细胞的一个核仁 中同时存在大的和小的两种f c 。d f c 从g 1 期的中后期开 始清晰，直至有丝分裂的前期的较早阶段为止都在核仁中 清晰可见，其大小和比例在此一段区间内无明显的变化。 核仁中存在的是较大的f c 还是较小的f c 及其分布状态与 单个细胞有关，而与细胞的核仁周期可能无相关性。f c 是异质性的还是同质性的与环绕其的d f c 的大小和比例 可能无必然的联系。在一些细胞中核仁内f c s 呈区域性集 中分布，这反映了r d n a 的串联性，同时也反映了多个n o r 在组织同一个核仁时，各自组装f c 和d f c 的区域性。 4 核仁在有丝分裂前期开始消失，这是一个过程。早期阶段 核仁内的f c 和d f c 结构无明显变化，后来核仁开始解体 为几个小核仁，此时f c 和d f c 结构仍然存在，随后f c 和d f c 结构逐渐消失，在核仁转变成n o r 前已没有f c 和d f c 结构。 5 核仁如果有核仁腔隙，该结构可能发生于s 期，其发生可 能是多位点的。 二、在洋葱核仁中单链r n a 分布于d f c 及其周围区域，涉及到 g c 区，在s 期和( 3 2 期细胞中没有发现f c 中存在单链r n a ，因 此核仁r d n a 进行转录时新合成的r n a 应定位于d f c ，r r n a 基 因的转录发生于d f c 中。在核仁的d f c 中单链r n a 的分布有区 域性，这可能反映了在d f c 中r d n a 的分布是呈区域性的。 关键词：核仁d f cf cr r n a 单链r n a i i a b s t r a c t n u c l e o l ia r et h ed o m a m si nw h i c ht r a n s c r i p t i o na n dp r o c e s s i n go fr r n a a n da s s e m b l yo fr i b o s o m e st a k e p l a c e t h en u c l e o l u sh a st h r e eb a s i c u l t r a s t r u c t u r a l s u b c o m p a r t m e n t s ：f i b r i l l a rc e n t e r s ( f c s ) d e n s e f i b r i l l a r c o m p o n e n t s ( d f c s ) ，a n dg r a n u l a rc o m p o n e n t s ( g c s ) t h es t u d i e s o n n u c l e o l u sf o c u so nt 1 1 es i t e so ft r a n s c r i p t i o na n dd i s t r i b u t i o no fr d n a a s s e m b l yo fr i b o s o m e s ，a n dp r o t e o m i c so fn u c l e o l u s u pt on o w , t h e r e a r e s i l l lc o n t r o v e r s i a ld o c u m e n t so nw h e t h e rt h et r a n s c r i p t i o no fr d n at a k e s p l a c ei ne i t h e rf c so rd f c s b yu s i n gr o u t i n ee m a n dt e r b i u mc i t r a t e s i n g l e s t r a n d e dr n a ( s s r n a ) s p e c i a ls t a l 。n i n g w ei n v e s t i g a t e d t h e m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h en u c l e o l u sa n d 恤ed i s t r i b u t i o no f s s r n a si n i t i nt l l en u c l e o l u sc y c l e d u et on e w l ys y n t h e s i z e dr r n a sc a n n o tf o 珊a s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，t h e d i s t r i b u t i o no fs o m es s r n a sr e p r e s e n t st h e d i s t r i b u t i o no fn e w l ys y n t h e s i z e ds s r n a s w h i c hi sb e n e f i c i a lf o rs o l v i n g t h ec o n t r o v e r s ya b o u tw h e r ea r e 廿l et r a n s c r i p t i o ns i t e so f r d n a s t h er e s u l t sf r o mt h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： f i r s t ，b yc o n v e n t i o n a le m ，w ef o a n dt h a t ： 1 i nt h ec e l lc y c l e m en u e l e o l ib e g i nt oe m e r g ea tt h ee n do fm i t o t i c t e l o p h a s e a tt h ee a r l i e rs t a g eo fg 1 t h en u c l e o l ia r ev e r ys m a l l a n d t h e yd o n tf o r mf c sa n dd f c s w i t l lt h ec e l lg r o wu p t h en u c l e o l i b e c o m eb i g g e rg r a d u a l l y , a n dt h es t r u c t u r e so ff c sa n dd f c st u r n o b v i o u sa n dt h e nt h en u c l e o l ib e g i nt of u s e i nt h em i d - a n di a t e g 1 t h ec e l lu s u a l l yh a so n eo rt w on u c l e o l i i nt h et i m eo ft h em i d a n d l a t e g 1 sa n dg 2 。t h es i z eo f n u c l e o l u sh a sn oo b v i o u sc h a n g e d n a d o u b l i n gi nsa n dg 2p h a s e sh a sn oo b v i o u se f f e c t s o nn u c l e o l u s v o l u m e 2 i nsa n dst og 2 t h en u c l e o l u sr i ms h o w sh a i r ya n dt h u sm o r el i n k i n g o ft h en u c l e o l u sr i mt ot h ep e r i p h e r a lc h r o m a t i n sb e c o m ea d p a r e n t i n t h et y p i c a lg 1o rg 2 ，t h em o r p h o l o g y c h a n g e s o ft h en u c l e o l u sr i ma n d t h ei n c r e a s e dl i n k i n gt ot h e p e r i p h e r a lc m o m a t i n s f i r en o to b s e r v e d 3 t h ec h a n g e sa n dt h ed i s t r i b u t i o n so ff c sa n dd f c si nn u c l e o l ia r en o t s y n c h r o n o u s t ot h ec h a n g e so f t h ee e l lc y c l e s i nt h ep h a s eo f g l ，sa n d g 2 t h e r ee x i s tb o t hb i g g e rf c sa n ds m a l l e rf c si nt h en u c l e o l i g e n e r a l l y , c e l l sw h o s en u c l e o l ih a v eb i g g e rf c sb n ti nl o w e rn u m b e r a n dc e l l sw h o s en u c l e o l ih a v es m a l l e rf c sb u ti nh i 曲e rn u m b e rb u ti n i i i s o m ec e l l s ，w ec a nf i n dt h a to n en u c t e o l u sh a sb o t hb i g g e ra n ds n l a l l e r f c s d f c sb e c o m ec l e a ra tt h em i d g 1a n de x i s ti nt h en u c l e o l u su n t i l t h ee a r l ym i t o t i cp r o p h a s e w h e t h e rt h en u l c e o l o u sh a sb i g g e ro rs m a l l e r f c sa n dt h ef c s d i s t r i b u t i o n sm a yb er e l a t e dt oas i n g l ec e l l ，b u tn o tt o t h en u c l e o l u sc y c l eo ft h ec e l l w h e t h e rf c sa r eh e t e r o g e n e o u so r h o m o g e n e o u sc a n n o tb en e c e s s a r i l yr e l a t e dt o t h es i z e sa n dr a t i o so f d f c sa r o u n di t i ns o m ec e l l s ，f c ss h o wr e g i o n a l i z e da n dc e n t r a l i z e d d i s t r i b u t i o n s u g g e s t i n gt h et a n d e mc h a r a c t e r so f r 【) n a sa n dr e f l e c t i n g t h er e g i o n a l i s mo ff c sa n dd f c sw h e nm a n yn o r so r g a n i z i n go n e n u c l e o l u s 4 i ti sap r o c e s st h a tt h en u c l e o l ib e g i nt od i s a p p e a ra tp r o p h a s e a tt h e e a r l ys t a g e ，t h es t r u c t u r e so f f c s a n dd f c sa r en o t o b v i o u s l yc h a n g e d i n t h en u c l e o l i a n dt h e n t h en u c l e o l u sb e g i n st od i s i n t e g r a t ei nt os e v e r a l s m a l ln u c l e o l i a tt h i sm o m e n t s t r u c t u r e so ff c sa n dd f c ss t i ue x i s t l a t e r , t h es t r u c t u r e so f f c sa n dd f c s d i s a p p e a r b e f o r e t h en u c l e o l it u r n i n t on o r s t h e r eh a v eb e e nn os t r u c t u r e so f f c sa n dd f c s 5 i f n u c l e o l ih a v et h en u e l e o l u sl a c u n a e an u c l e o l u sh a sg e n e r n l yo n l yo n e t h el a c u n a es t r u c t u r e sa p p e a ri nsa n dt h e yo r i g i h a t ef r o mm u l t i p l e s i t e s s e c o n d ，i na l l i u mc e p a ，w i t ht h ei o nt e r b i u m ( 1 1 1 ) ，w ef o u n dt h a ts s r n a s m a i n l y d i s t r i b u t ei nd f c sa n dt h e i r p e r i p l h e r a lr e g i o n s ，a n d t h e s e d i s t r i b u t i o nf l u t h e re x t e n t si nt h er e g i o n so fg c s s s r n aa r en o tf o u n di n f c ssa n dg 2 s ow h e nn u c l e o l u sr d n a sa r e t r a n s c r i b e d ，n e w l y s y n t h e s i z e dr n a ss h o u l db e l o c a t e di nd f c s t h a tm e a n st h a tt h e t r a n s c r i p t i o ns i t e so fr d n a s t a k ep l a c ei nd f c s i i ld f c s d i s t r i b u t i o no f s s r n a ss h o w sr e g i o n a l r e f l e c t i n gt h ed i s t r i b u t i o no fr d n a si s a l s o r e g i o n a li nd f c s k e yw o r d s ：n u c l e o l u s ，d f c ，f c ，r r n a ，s s r n a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名日期：竺尘兰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签 日期 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导教师签名! 焦趟盔 期：删# 电话： 邮编： 第一部分引言( 核仁的发生和r r n a 的转录研究进展 与存在的问题) 在真核生物中，核仁是细胞核中一种明显的功能区域，是核糖 体合成的场所 2 8 , 1 0 4 】。在人细胞中现在已确定2 7 1 种核仁蛋白与r r n a 合成、加工和装配有关，核仁的蛋白质组学己成为当今的一个研究 热点 7 1 。核仁的功能不仅限于r r n a 的转录合成，现在已发现有其它 功能，包括几种小r n a 的核苷酸的修饰、信号识别颗粒的生物合成， 与基因沉默、衰老和细胞分裂有关蛋白的时期性的封存和释放【1 2 3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，2 2 ，2 7 。 核糖体形成的大多数步骤发生在核仁中，这一复杂过程包括： 核糖体基因的转录、核糖体r n a 前体的加工( 包括转录间隔区的切 除、大约2 0 0 b p 核苷酸的修饰) 和r r n a 与核糖体蛋白及5 sr r n a 的联系。目前大量的研究已集中于核仁的形态学特点与其功能的关 系上 2 8 1 。 核仁的形态学特点是与其生物学功能相适应的。核仁的三个基 本亚区已经被在超微结构上确定：纤维中心( f c s ) ，致密纤维成分 ( d f c s ) 和颗粒成分( g c s ) 1 8 9 1 们。通过不同方法，d f c s 作为积 累新合成r r n a 的最初结构区已经被肯定【1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 1 。 目前关于核仁的研究，主要可归纳为以下几个方面( 1 ) 核仁的 发生；( 2 ) r d n a 的定位；( 3 ) r r n a 的转录位点及其加工；( 4 ) 小 核仁r n a 与r r n a 的加工；( 5 ) 核仁蛋白。【2 1 2 2 1 本综述的重点是核仁的发生和r r n a 的转录及其加工。由于 核仁是一个功能结构，伴随着细胞周期的变化而变化，且随着物种 及细胞种类的不同核仁的形态也有差异，目前在此方面有关的研究 结果有差异甚至结论相反，存在很多争议f 2 2 1 2 3 9 9 1 。 一、核仁的发生 核仁的发生是与细胞分裂周期密切相关的，由于核仁是一功能 结构，真核细胞的增殖主要以有丝分裂为主，存在核仁的解体、装 配及重建和生理功能表达等事件，这本身就体现了核仁是一高度动 态结构卧2 2 1 。 核仁在分裂期( m 期) 去装配，在分裂末期重装配。最近的研 究显示在分裂期部分加工的核糖体r n a 前体( p r e r r n a ) 与加工 组分相关联贮存于染色体周边区( p r s ) ，并且在分裂期间存在于被 称为核仁衍生中心( n d f ) 的颗粒中口4 2 5 1 。d u n d r 用g f p 标记核 仁纤维蛋白( f i b r i l l a r i n ) 、核仁素( n u e l e o l i n ) 和b 2 3 研究了有丝分 裂后核仁的动态。在细胞分裂末期n d f 消失与核仁的重建物质出现 相一致。前核仁体( p n b s ) 在细胞分裂的末期的早期阶段出现在核 中，并且在核仁形成后逐渐消失，表明p n b s 的成分转移进新形成 的核仁中。由于他们控制组分的分布，细胞分裂时贮存的加工复合 物对重组装子细胞的核仁是必要的，母细胞的装配组分部分参与了 新核仁的装配【2 ”。 在细胞周期中核仁出现与消失的一个关键事件是r n a 聚合酶 i ( p o l yi ) 在早前期的抑制与分裂的后期的重新激活 3 0 3 2 1 。转 录的抑制和重激活的周期( 循环) 是在起始水平上控制的：( 1 ) r n a 聚合酶i 、转录因子s l l 和上游结合因子( 喁f ) ，由于被磷酸化而 失活【3 1 ”3 副；( 2 ) s l l 和u b f 去磷酸化，而且u b f 在不同的位点 磷酸化复活转录”“。在细胞分裂期，不同的核仁组分分布于细胞中 几个不同部分。在细胞分裂期间转录机器保持装配状态，r n ap o l i 及与其相关联的转录因子定位于染色体核仁组织者区( n o r s ) 眺 ”3 8 or r n a 前体的加工组分在至少两个区域被发现，第一个是p r s ( 染色体周边区) ，在此区这些组分在中期的前期阶段出现，围绕所 有染色体，并保留至末期的早期1 3 9 4 0 l ；第二个是n d f ( 核仁衍生中 心) ，r r n a 前体的加工组分首先出现于前期，大部分消失于末期， 最终消失于g - 期1 4 “4 0 1 。n d f 在分裂期不含列ap o li 转录机器，而 含有部分加工的r r n a ( 有4 5 s 和4 6 s 的混合物) ，这表明在分裂期 间r r n a 的转录和加工机器在空间上是分开的，加工和转录一样都被 2 抑制f 2 5 j 。 由酵母为材料得到了许多有关核仁装配的重要信息和证据。虽 然酵母是比较低等的真核生物，在有丝分裂期，其核仁并未完全消 失，酵母作为实验材料有许多优势，其中易于培养，便于进行各种 实验设计控制是重要的因素。从酵母得到的关于核仁发生的成果有 ( 1 ) 核仁形成需要r n ap o li 的活性，这直接在 s c h i z o s a c c h a r o 师y c e sp o m b 热敏感r n ap o li 突变中被例证 4 2 o 酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e f e v i s i a e ) 删除了基因组r 1 ) n a ，r r n a 由 人工导入的r d n a 质粒合成，因而允许研究核糖体基因串连组织的功 能【4 3 4 4 1 。由酵母突变株证实了核糖体可在缺乏正常的染色体联系时 发生：在突变株中发现了正常的r r n a 加工机器，但在r d n a 由d o l i 和p o l1 1 转录时，在核内形态学定位是不同的 4 5 ，4 “。t r u m t e l 等人用s h c 曲a r o m y c e sc e f e 订s r i a n 的突变菌株从电子显微镜水平 研究了核仁的装配和功能组织，例证了( 2 ) 在核仁的形成事件中 r i g a 的存在起决定( 主要) 作用，核仁的装配需r d n a 进行转录。 在突变株中发现在无纤维中心时，g c 也能产生【2 9 。 最近的观点是：在后期末或末期的早期当r n ap o li 转录被引 发时，核仁重建开始盼4 7 1 。与此同时出现在周边染色体区的特异 性核仁组分被从解集缩的染色体中释放并开始与子代细胞中前核仁 体( p n b s ) 相联系。p n b s 中含有大量的核仁蛋白和s n o r n a ( 小核 仁r n a ) ，这些成分被用于r r n a 前体的加工 4 8 4 9 50 1 。p n b s 不含任 何转录成分，也从未观察到在此有转录发生【5 1 r5 2 1 。 核仁的装配从以往的研究来看主要分为两步进行【3 2 ，5 3 1 。第一步 涉及转录机器的激活，这一步依赖c d kl c y c l i nb 的降低【5 “。在 细胞分裂期间r n a 聚合酶i 转录机器并未离位，而是保持与n o r s 的联系5 7 , 5 2 , 5 5 l 。第二步是通过前核仁体结构招募加工机器到核 仁。p n b s 被描述为可移动核体，参与在r i r q a 转录位点的加工机器 的分送，这一观点是以被固定细胞的免疫定位为基础的【5 8 ，5 9 , 4 9 , 4 7 , 6 0 1 。在n o r s 和p n b s 间的转运依赖转录活性，而不是p n b 自身的形 成【5 圳，但是也发现进入核仁位点的p n b s 的重聚集与r r n a 前体相联 系，转运可在缺乏活性r n ap o l yi 转录时发生1 6 1 ，6 2 l 。同样用放线菌 素d 抑制r n ap o l yi 转录并不能阻止在n o r s 招募核仁蛋白，这时 观察到p n b s 在核基质中是稳定的【6 3 】。已发现f i b r il l a r i n 在p n b s 中的下降与其在n o r 中的增加相伴随【2 5 。有人认为：p n b s 被移向 核仁组织者区( n o r s ) ，在n o r s 处p n b s 融合并变成新建核仁的d f c 1 3 2 1 。s a y i n o 等人用g f p 标记f i b r i1a r i n 和n o p 5 2 并未观察到p n b s 移进核仁。根据他们对有关数据的观察，s a v i n o 等提出了一个核仁 的装配模型即：与加工有关的蛋白质在和集缩的染色体相联系的 p n b s 中装配，并在p n b s 之间移动。不同类型的i ：l f n b s 共存于核基质 中，由于染色质的解集缩，一些p n b s 与新形成的 m s 相联系并分 送他们的蛋白成分，p n b s 之间蛋白分送也存在，随后几个核仁( 围 绕n o r s ) 形成，后来这些单独的核仁融合成一个大的核仁【2 6 】。 关于核仁的发生的研究主要证据来至荧光共聚焦显微镜附带使 用电子显微镜，主要是以免疫细胞化学手段标记核仁蛋白来完成 2 6 ， 2 5 1 。 关于由电子显微镜水平研究核仁发生的系统工作报道还很少。 其原因可能有以下几点：( 1 ) 细胞同步化困难；( 2 ) 做细胞超微结 构的连续切片困难；( 3 ) 电子显微镜的取材是需要固定的，不能在 同一细胞观察连续过程。但电子显微镜手段有优势：定位准确( 免 疫胶体金) ；分辨率高，可区分精细结构，形态学定位比荧光共聚 焦显微镜准确。因此关于核仁的发生的研究在电子显微镜水平( 从 亚显微水平出发) 有很多工作需要做。 二、在核仁中r r n a 的合成与加工 核糖体形成的许多步骤在核仁中发生。这一复合物的加工涉及 了核糖体基因的转录，核糖体r n a s 前体的加工( 包括转录间隔片段 的切除，大约2 0 0 个核苷酸的修饰，核糖体r n a 与核糖体蛋白和5 s r r n a 的联系) 。大量的研究已集中于在超微结构水平与功能相关的 核仁的形态学特征。三个基本核仁组分已经被在超微结构水平鉴定： 纤维中心( f c s ) 致密纤维成分( d f c s ) 和颗粒成分( g c s ) 8 ，9 ，10 1 。使用 不同的方法，d f c 已被确定为新转录的核糖体r n a 积累的最初场所【“ 1 2 ，1 3 ，1 5 ，1 6 ，1 7 ，1 8 ，1 9 ，2 0 1 。 许多研究已定位核仁的r r n a 转录位点于d f c s ，包括f c s 的边 界区盼悼2 3 + 6 4 , 6 5 , 6 6 。但是t h i r y 等( 2 0 0 0 ) 在人细胞、m a i s 和 s c h e e r ( 2 0 0 1 ) 在爪蟾将r r n a 的前体的合成定位于f c s 5 7 , 6 8 。 放射自显影研究已经确定r r n a 的连续性标记出现于d f c s 随后 出现于g c s 1 1 ，6 9 】。这些发现最近被c m a r k o 等( 2 0 0 0 ) 肯定。他们展 示了非放射性标记的r r n a 由d f c s 移向g c s 【2 0 j 。通过进一步的原位 ( i s h ) 杂交的研究也将p r e - r r n a 的加工起始步骤定位于d f c s 【7 0 7 l ，1 7 ，7 2 , 7 3 ，1 8 1 ，并且更后的加工定位于g c s 【7 4 ，7 5 , 1 7 , 7 2 , 7 3 j 。一些i s h 结 果已指示早期的加工步骤发生于d f c 的部分区域 7 5 1 , 但p r e r r n a 加工位置与转录位点的关系还未解决。 最近s t a n c k 等人用非放射性标记方法，通过原位标记掺入的 5 一b r u t p 和5 外间隔区的前导序列等在活细胞检查r r n a 的合成和 加工发现：r r n a 在d f c s 的特定区域合成并涉及f c s 的边界，并追 踪到r r n a 由转录位点通过d f c 移动到颗粒成分( g c ) 。5 转录外间 隔区的5 前导序列和转录标记的原位图显示转录和r r n a 的前体加 工的第一步在空间上是分开的，同时也显示新合成的r r n a 的前体转 录物是处于部分延展状态口8 1 。 关于转录位点的争议，可能是由于不能直接选择性标记正在转 录的r r n a 基因。原因 r r n a 序列被原位杂交定位，但不能提供转 录位置的信息。用原位杂交探针标记新合成转录物的转录间隔序 列，模板释放的r r n a 前体与加工产生的转录间隔序列同时存在，由 于反转率和加工废物的命运是未知的，它们在核仁中的积累及对原 位杂交的信号观察有不同的可能性。r n a 聚合酶i 的抗体不能区 5 分聚合酶是否处于活性状态。有实验证明r n a 聚合酶i 在核仁与核 基质之间往返的频率极高，而只有极少数p o l yi 是有效的7 6 l 。放 射性前体的代谢性掺入或其它标记r n a 前体( 如5 一b r u t p ) 标记具 有不可靠性。既使是短暂脉冲，新合成的和模板释放的转录物都会 被标记 b ru 【”j 。看到“c h r i s t m a st r e e ”被认为是可靠的确定转 录位点的方法，但是在大多数实验情况下现在还未看到圣诞树结构 【7 8 ，7 9 ，7 7 ，9 3 1 精确定位间期的n o r s ，特别是r d n a 在核仁内的表达定位是一 个长期争论的问题。在核仁四种成分中( d f c 、f c 、g c 、和染色质) ， n o r 染色质( 含有r d n a ) 是首先作为核仁的基础存在，d f c 和f c 是 核仁中在银染上与分裂期的后期n o r 染色质相似的组分，g c ( 含有 前核糖体颗粒，而无d n a ) 是在新形成的核仁中最后形成的。转录 应当发生于d f c 和f c 这二个含r d n a 的成分中，但在定位r d n a 时在 二者之间产生了矛盾的结果，一些数据提出核糖体基因在d f c 【s o ，8 1 , 8 2 ，8 3 1 ；另一些人主张在f c 【8 4 ，8 5 , 8 6 1 ；而另有人主张二者中都有 7 4 1 。 关于d f c 和f c 是否都存在r d n a 的问题，目前争论较少，已经 有几篇文献比较确凿地观察证实了二者都有r d n a 的存在。 b i g g o g e r a 等人在2 0 0 1 年发表的文章提供了核仁组织者区的证据。 他们用m o r i n p s l 5c e l l 先以h c l 处理去除r n a ，由锇铵染色和 a n t i - f i b r i l l a r i n 标金证明了n o r 有d n a 云的存在，f c 、d f c 皆含 有d n a ，由f c 和d f c 构成d n a 云，d f c 更松散，认为是活性d n a 进 行转录的区域，f c 为非活性d n a 。由于d f c 的d n a 丝的松散性，信 号弱，以前的实验很多人未观察到r d n a 的存在，因而认为转录不可 能发生于d f c 。用p o l yi 抗体标金只在d f c 发现金颗粒，f c 和g c 未见。 8 7 , 7 4 , 5 3 1 1 9 6 9 年m i l l e r 和b e a t t y 报道在两栖动物的卵母细胞中核糖体 转录是以一种叫圣诞树的形式进行的 8 8 1 ，同样的结构在其它的物种 中也有报导【8 9 ，蜘。但描述圣诞树的原位杂交系统只在最近十几年才 6 被发展。在植物( 2 0 0 1 ) 在豌豆的体细胞看到了圣诞树结构一1 】；在 动物细胞，s c h e e r 等( 1 9 9 7 ) 在蝗虫的卵母细胞中看到了圣诞树结 构 7 7 , 9 3 。k o b e r n a 等( 2 0 0 2 ) 在人的h a l a 细胞证明转录发生于d f c 与g o n z a l e z m e l e n d i 等( 2 0 0 1 ) 在豌豆上得出的结论相同。但与 t h i r y ( 2 0 0 0 ) 在h a l a 细胞中得到的结果相反阮9 1 , 9 矾。 s u ih u a n g 在j c b 上综述了关于转录位点的争议。现在已有 很多文章，也有很多证据证明转录位点在d f c ，使用的方法包括： 胶体金标记r n a 聚合酶i ，u b f ，f i b r i l l a t i n ，u 3 s n o r n a 等和 5 一b r u t p 脉冲。但突出的是：用5 一b r u t p 对哺乳动物细胞进行脉 冲标记的观察结果出现了分歧。d u n d r 和r a s k a ( 1 9 9 3 ) 、s t a n k e 等 ( 2 0 0 1 ) 、h o z a k 等( 1 9 9 4 ) c a r k o 等( 2 0 0 0 ) 认为短脉冲在d f c s 和d f c 边界出现，然后出现于g ce 1 3 ，2 8 , 9 4 , 9 5 1 。k o b e r n a 等( 2 0 0 2 ) 观 察到脉冲主要出现在d f c 并涉及d f c f c 边界，并认为转录位点应定 位于d f c 与m e l c a k 等( 1 9 9 6 ) 削：m e l e n d i 等( 2 0 0 1 ) 1 9 1 1 的结果一 致。但是m a x i s 和s c h e e r ( 2 0 0 1 ) 分析了p o l yi 转录因子、 f i b r i l l a r i n 及5 一b r u t p 脉冲标记，在爪蟾核仁( 这种核仁大，可 在光镜下区别f c 、d f c ) 中，他们发现5 一b r u t p 、u b f 和p o l yi 由 f i b i l l a r i n 围绕( f i b r i l l a r i n 与d f c 一致) ，因此提出转录发生于 f c 。t h i r y 等( 2 0 0 0 ) 主张转录发生于f c ，主要依据是看到b r u 从 f c s 到d f c s 再到g c s 的迁移 9 2 1 。c h a u t i n 等( 2 0 0 2 ) 观察到b r u t p 先在f c 掺入，然后迅速出现于d f c 。即转录在f c 起始，迅速进入 d f c 在d f c 延长1 9 町。矛盾产生的原因是复杂的，有人推测可能是 技术原因，其中包括样品的预处理和固定。大多数人主张转录发生 于d f c ，s u iu u a n g 提出是否是大家由于技术原因忽略或丢失了对 f c 的标记? 1 9 9 1 。 m o s g o e l l e r 等( 2 0 0 1 ) 对h e l a 细胞进行低渗处理后检测“圣 诞树”成分，将转录的起始定位于f c s 的周边并且提出了一个核仁 转录的结构模型1 0 4 1 。据说低渗处理可以提高在电子显微镜水平观察 的分辨力，但是，d f c s 对低渗敏感，用低渗处理，肯定会影响结构 的保存和观察。 毕晓辉用粘菌、陶伟用鼠肝进行超薄切片研究支持r r n a 转录发 生于d f c 和d f c 与f c 的边界。然而从蝗虫卵母细胞在f c 看到圣诞 树来看，似乎又无可辩驳地证实转录发生于f c 。但是蝗虫卵母细胞 的细胞类型及其核仁形态都比较特殊，其结果是否有普遍性还有待 于进一步研究。 1 0 1 ，l o o , 1 0 2 从前述的各文献来看，所用材料各不相同，从酵母、植物( 洋葱、 蒜、豌豆、矮牵牛等) 到蝗虫、两栖类、啮齿类、灵长类、人的h e l a 细胞和膀胱癌细胞等都有。是否不同类型的细胞及不同物种的核仁 的功能表达与其形态学特征的关系上存在差异? 这需要进一步研 究。 三、关于核仁发生和r r n a 转录加工的几点看法 综合核仁的发生和核仁的r r n a 转录和加工来看，核仁是处于动 态变化之中。由于细胞核是一立体功能结构，因而应当从整体上考 虑问题。关于核仁r r n a 转录位点的争论也许与立体结构有关。从发 表的论文来看，一般的三维、四维成像是指荧光共聚焦显微成像， 分辨超微结构的能力有限：而作为电子显微镜超薄切片观察一般是 二维的，三维立体成象分析很少，在选取分析的切片时是否存在选 取切面问题? 一般来说一个细胞可切的切片是很多的，是否存在观 察时不够全面的问题? 由此可见，做核仁电子显微镜的三维成像动 态研究有重要的意义。应该在电子显微镜水平上对核仁有关蛋白的 分布、r r n a 的定位等进行三维立体动态研究。也许这能对解决关于 转录位点等问题的争议有所帮助。 四、关于新合成r r n a 的分布的研究方法 b e r n h a r d 染色法应用较广泛，但此方法是基于e d t a 与铀离子 的络合，染的是核糖核蛋白结构组分，而不考虑这些组分是否含有 r n a ；铂喹啉可染r n a ，但需采用恒冷切片，且需迅速进行树脂包 埋，这限制了它的应用；吖啶黄一p t a 复合物、b r 乙锭一p t a 或锇铵 染色都可检测r n a ，但都需要使用酶来祛除d n a 。 1 0 3 1 r n a s e 一金复合物、抗r n a 抗体、或掺入被标记前体都被用于 r n a 的特异性观察 1 0 3 】。b 卜u r p 脉冲标记应用比较广泛，用来检 测新合成的r n a ，但对于植物细胞b r - u t p 的掺入比较困难。现在 一般都用非放射性方法进行原位杂交，一种比较典型的方法是：通 过r r n a 的5 e t s 前导序列与r n a 杂交检测新合成的r r n a 。 1 0 3 , 1 8 ，2 8 1 新合成的r n a 应该是单链的，关于转录位点的争议与如何检测 新合成的r r n a 有密切关系。根据b i g g i o g e r a 和f a k a n ( 1 9 9 8 ) 的 观点，柠檬酸铽染色是一种简单和可靠的检测单链r n a 的方法，其 优点是：( 1 ) 不需要对d n a 进行酶处理祛除，不用对切片进行r n a 酶或核酸酶处理，也不需要进行蛋白酶和d n a 酶处理；( 2 ) 柠檬 酸铽特异性染单链的r n a 【l ”j 。 该法不需要酶解祛除d n a ，有利于对超微结构的保存，因此使 用柠檬酸铽染色法有利于搞清新合成的r r n a 在核仁的分布。 9 第二部分材料和方法 一、实验材料 1 高等植物洋葱( a l l i u mc e p a ) ，取其根尖分生组织为实验材料( 上 午1 0 ：0 0 1 1 ：0 0 、中午1 2 ：0 0 1 3 ：0 0 、1 3 ：3 0 1 4 ：0 0 ) 二、实验方法 ( 一) 细胞周期( 核仁周期) 中核仁的动态变化研究方法 主要采用常规电子显微镜方法： 1 取材取生长旺盛的洋葱根尖( 1 5 r a m 左右包括根冠) 进行如下处 理： 2 固定2 5 戊二醛( 0 1 m p b s 缓冲液配制，p h = 7 2 ) 中3 - 4 小时， 0 1 m