（遗传学专业论文）昆虫细胞人生长激素表达系统的分子遗传学研究.pdf

昆虫细胞一人生长激素表达系统的 分子遗传学研究 摘要 卜然 人 生 长 激 素 己 在 昆 虫 细 胞 一 杆 状 病 毒( a u to g r a p h a c a lif o r n ic a n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s , a e n p v )系统中得到了表达，但如何提高表 达 产 物 的 、产 量 仍 是 一 个 需 要 进 一 步 研 究 的 问 题 苏文 中 对 昆 虫 细 胞 一 人 生长激 素表达 系统的分子遗传学研究为解决 以上问题提供 了一定的基 础。首先建立了一个 p c r 的方法，用来监测重组病毒的纯度。通过点 杂交可以觉察到重组病毒 d n a 中的 h g h 基因，这一方法可应用于重 组病毒的筛选和纯化。通过 n o r t h e r n - - b l o t t i n g ， 从被重组病毒感染的细 胞中，检测出 h g h 基因的转录产物 m r n a存在以及它的含量随感染时 间延长的时序性变化。为收获时间的确定打下了基础。本文还就无血清 培养基中细胞培养和 h g h的表达情况进行了研究。 关键词:a c n p v ; h g h基因、p c r ; n o r t h e r n 杂交、无血清培养 mo l e c u l a r g e n e t i c i n v e s t i g a t i o n o n i n s e c t c e l l - hu ma n g r o w t h ho r mo n e e x p r e s s i o n s y s t e m ab s t r a c t a l t h o u g h h g h h a d b e e n e x p r e s s e d i n i n s e c t c e l l -b a c u l o v i r u s ( a u l o g r a p h a c a l if o r n i c a n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s a e n p v ) e x p r e s s i o n s y s t e m. b u t h o w t o ma x i mu m t h e a m o u n t o f e x p r e s s i o n p r o d u c t i s s t i l l a p r o b l e m. i n t h i s p a p e r , a me t h o d w a s f o u n d e d t o c h e c k u p t h e p u r i t y o f t h e r e c o m b i n a n t v i r u s w h i c h i s a n i m p o r t a n t e l e m e n t t o e x p r e s s i o n l e v e r . a d o t - b l o tt i n g t e s t a l s o d e t e c t e d t h e e x i s t o f h g h g e n e i n t h e r e c o m b i n a n t v i r u s d n a . t h i s t e s t c a n b e u s e d i n t h e p r o c e s s o f s e l e c t i o n o f r e c o m b in a n t v i r u s . a n d m o r e i m p o r t a n t , a n o r t h e r n - b l o t t i n g d e t e c t e d t h e t r a n s c r i p t i o n a l p r o d u c t o f h g h g e n e i n t h e i n s e c t c e l l s i n f e c t e d b y r e c o m b i n a n t v i r u s , a n d t e s t e d t h e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f t h e m r n a a c c o r d i n g t o t i me a f t e r i n f e c t i o n . t h u s b u i l t a n i n d i s p e n s a b l e f o u n d a t i o n f o r d e t e r m i n a t i o n o f h a r v e s t i n g t i m e w h i c h i s a l s o a n e l e m e n t a b o u t e x p r e s s i o n l e v e r . t h e c e l l c u l t u r e a n d h g h e x p r e s s i o n i n t h e me d i u m f r e e o f s e rum w e r e a l s o i n v e s t i g a t e d . k e y w o r d s : a c n p 叭h g h g e n e ; p c r ; n o r t h e r n - b l o t t i n g ; s e r u m - f r e e c u l t u r e 前 侣 岁 l 习 一昆虫细胞一杆状病毒表达系统 1 . 昆虫杆状病毒的某些特点 这里主要描述有关它作为表达系统的特点。 l . 1 杆状病毒的宿主范围 杆状病毒仅能从无脊椎动物中分离，大部分种系发现于昆虫，也有一些杆 状病毒是甲壳纲动物的病原体。强调这一点很重要，杆状病毒感染从米被发现于 人类，哺乳动物和其它的脊椎和非脊推动物种类。而且，它不感染植物。因此， 可以考虑在实验室中用它们作表达系统。到目 前为止，杆状病毒被认为是最安全 的表达系统之一。 1 . 2杆状病毒的结构与类型 杆状病毒 d n a是双链共价闭合、环状 d n a ，其大小处于 8 8 -2 0 0 k b 之间。和一 个 6 . 5 k d的高度碱性的蛋白结合，并被包含在一个由 3 9 k d的核衣壳蛋白组成的 杆状的核衣壳体中。几个核衣壳体被一层脂蛋白外被包围构成病毒颗粒。它的长 度由病毒基因组大小决定， 约2 0 0 -4 0 0 n m ，宽度大约 3 6 n m 左右。而多角体包含 体是一个更大的复合结构， 它形成于被感染细胞核中，一种晶 状基质即多角体包 含着一些病毒颗粒的结构。多角体包含体直径范围在 1 - - - 1 5 u m ，外面还有一层 多糖外壳，可起到抗压和保护的作用，并增加了折光率 ，光镜下可清楚观察 t t t a c t g t t t t c g t a a c a g r l t t g c a a c a a c g c a c a g a a t c t a g c 3 + a c c a g tt c t t c a a a c t g g a a t g ttgf r a a a a a t a a c a g c c a ttg t a a t t a g a c c d . a c a a a a a t g t ci a t c a a t a t a t a c t t g c t g a t a t c a i g g a g a t a a c t .a a t a a t c a - 1 5 0 tt a a a a t g a t - 7 0 a a c c a f c t c g c a a a t aa a i a a g t a i i na c伟日t i l g t a a c a g r i t 9 g t a .a t a a a a a a a 1 0 c c t a t a a a t a a c t g g t c c g g c g i a t t a a a a c a c g a ta c a f a ga c a a tt a t t g t t a t t a g tt g t a c c t a t a a g c g c t a g a t t c t g i g c g t t g t t g a t tt x 7 9 8 3 比 丹 祀t a a c 丹 c 剐】 a 二 月 盛 c 内 月 c 8 4 曰 i a a t a a t t i : a t t a a a tt ta t a a t c t tt a g c g t g c . t a t a a a t c a a a i g .a i t t t c a g c g 图5 . a c n p v多角体基因部分序列以及周围序列 ( 引物设计参考序列) 2 .扩增带大小的估测: 1 )如 有 野生 病 毒 存 在 ， 扩 增带 大 小 应为4 4 + 了 9 4 = 8 3 8 6 p 2 )转移载体p v l 1 3 9 3 h g 11 存在，如下页图6 5 7 转移载体是把多角体基因中的从+3 5 一 + 1 7 7 的1 4 2 b y 用b a m l切去。换 成一个4 5 b y 的多克隆位点区，并在其中 插入了h g h 基因 ( 约8 0 0 b p ) 所以扩充带为4 4+3 5+8 0 0+( 7 9 4一1 7 7 ) =1 4 9 6 b y 3 )因为重组病毒是野生病毒和转移载体同源重组而成，基本上是转移载体的多 角体与 h g h结合基因区域代替了 野生病毒中多角体基因区域，所以重组病毒 的扩增带应与转移载体扩增带应该几乎一致。 .一嫌 一二介二 o ez x 5压 =-口口 p y l 1 3 9 2 5 - g a t c a g a t c t g c a ig c g g c c g c p c c a g a a t t c t a g a a g g t a c c c g g t ct a ga c gt c gcc ggc ga ggt c t t a a ga 丁 c t t c ca t gg gc c ct a g -托 1一一袱补 .一洲 一器 -工任口口 p v l 1 3 9 3 5 - g a t c 瞿 赓 乞 醉 吕 畏 礁 碧悬 羚 玉 监 晃 甜g c g g c c g c t g c a g a t c t - 3 c g c c g g c g a c g t c t a g a c t a g 一 7+1 m sf r u a - tj. p f t- wi i d typ e t a t a a a t a t gc c gg a t t a t 申 5申1 刀+刀 +发 叫j p v l 9 4 1c c g g a t t a t t c a t a c c g 丁 c c c a c c a t c g g g c g mg a . t t t c c t . . . t a a 人4 t a a -3 已a m 日 1 5 a l i s a l i 2 . 8 7 % h ol 1以 kb , p v u l l 1 . 3 5 k b a t fl i 0.9 6kb 0 o ly a . 9 5 k b i 1 ! 一 5 0 3 kh 日i n d i i i o kb r e f e r e n c e : we b b a n d s u mme r s ( 1 9 9 0 ) t e c h n iq u e in p r e s s 图6 .转移载休质粒 f i g 6 . b a c u l o v i r u s t r a n s f e r p l a s m i d -p v l 1 3 9 3 2 7 图9 . 点杂交结果 f i g 9 r e s u l t o f d o t - b l o t t i 门 9 。 .杂交后信号 b .点样位置; 1 . h g l l 2 . p v 1 . 1 3 9 3 h g h 3 . 野生型病毒 d n a 4 . 重组型病毒 d n a 以上 结果表明，h g l l 基因自 身与探钊 一 杂交有信号 p v l 1 3 9 3 h g h质粒和重组病毒 d n a与探针结合有信号， 说明己成功检定了样品中h g h 基因。 进一步说明探针标记成功。 野生病毒 d n a没有信号， 3此方法进 一 步应用于重组病毒筛选: 来自 共转染后的病毒原液稀释， 感染微孔板中的细胞，提孔中的细胞 d n a , 与h g h 放射性探针杂交，阳性孔中的病毒，再去感染微孔板中的细胞，进行下一 轮杂交选择。从而一轮 轮纯化重组病毒。 还可结合 p c r检验纯化结果。这一方 法的优点在于筛选不依靠肉眼的主观观察，而依靠客观的杂交测试。 四.n o r t h e r n 杂交鉴定h g h 基因的 转录产物及含量的时序性 变化: 1 .关于 m a r k e r : 2 . 1 0 0 0 m 1 无血清悬浮培养细胞和h g h的表达 经观察和统计，1 0 0 0 m 1无血清悬浮培养细胞的生长动态与同样体积含 1 0 % f b s培养 的细胞也无明显差异 ( 见图) :当细胞密度达 1 . 2 x 1 0 6时，用重 组病毒感染细胞( m o i 4 - 5 ) h g h 表达情况如图: i n f e c t i o n -一 aol 一讨 口细胞密度 h g h 含量 一任锄n工它上 一三/明11:uo尸，尸尸u山勺u。 匕 t i m e ( d a y ) 图 1 3 . k i n e t i c s o f c e l l g r o w t h a n d h g h e x p r e s s i o n i n a s e r u m - f r e e s u s p e n s i o n c u l t u r e f i g 1 3 . 无血清悬浮培养的细胞的生长动态 和h g h表达情况 观察此过程中的细胞形态， 感染前，细胞生长良 好，形态与加 1 0 % f b s培养 时一致:细胞小而排列紧密，折光率高，细胞分裂正常，说明此时细胞已经完全 适应了无血清培养。感染后，细胞变大变圆，内容物颜色变深，从感染后 4 8小 时开始，许多细胞破裂，以后破裂细胞数增多。观察h g h 的表达情况，从感染第 一天至第六天，生长激素表达量持续上升，最高可达 4 0 u g / m l ，这与 有血清培养 中的情况也是一致的。 值得一提的是， 在这次1 0 0 0 m 1 无血清悬浮培养实验中，培养基中加入了表 面活性剂p l u r o n i c f - 6 8 ， 可以防止悬浮细胞成团，有利与细胞生长分裂和感染。 而且并不影响细胞的生长动态和生长激素的表达。随着将来培养体积的扩 一 大，表 面活性剂p l u r o n i c f - 6 8 的加入更是必要。另外，有许多其他的因素比如细胞接 种量，感染时机，感染复数 m 0 1 ) ，培养基中补充葡萄糖，抗体等，都能影响异 源蛋白的表达。这方面的情况还要作进一步系统的研究。 讨论 本文中的实验对昆虫细胞一 人生长激素表达系统作了分子遗传学的检测。这 不仅是建立一个系统后，必要的鉴定工作，而且对表达水平的提高也很有意义。 用杆状病毒载体表达系统表达外源基因的关键之一，是能否简单方便，准确可靠 地筛选出所需的带有目的基因的重组病毒。a c n p v感染细胞后，在细胞内形成大 量的多角体包含体 ( o c c l u s i o n b o d y )， 即核多角体，在显微镜下较易辩认。当 多角体蛋白基因启动子下游插入外源基因后，所形成的重组病毒在受染细胞内不 形成核多角体，为重组病毒的筛选提供一个简单的识别标志。 然而，在实际实验 操作中， 在显微镜下识别无核多角体的噬斑还是有相当的困难。 本文所建立的p c r 和点杂交的方法都可用于重组病毒的筛选和纯化，它们依据客观的实验 结果来 选择，而不是主观上肉眼的选择。 p c r可用于快速检测重组病毒的纯 度;而点 杂交适于大量份数的样品的同时检测。将来还可尝试构建带有 l a c z 基因的转 移载体， 转染细胞后，在x - g a l 存在下，以 蓝色噬斑作为选择标志， 这样更为准 确和方便。 在无血清培养中，只分析了培养上清中 h g h的含量。而胞内的表达却未进 一步研究。h g h的表达与分泌都十分重要，表达产物是否分泌完全，胞内h g h 有 否收取价值，可否促进h g h 分泌至胞外等，这些问题都有待进一步探讨。 参考文献 1 . v l a k , j . m. , e t a l . 1 9 8 8 , f u n c t i o n a l s t u d i e s o n t h e p 1 0 g e n e o f a c n p v u s i n g a r e c o m b i n a n t e x p r e s s i n g a p 1 0 - 0 - g a l a c t o s i d a s e . j o u r n a l o f g e n e r a l vi r o l o g y , 6 9 , 7 6 5 - 7 7 6 2 . v a i l , p . v . , e t a l . 1 9 7 1 , r e c i p r o c a l i n f e c t i v i t y o f n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s o f t h e c a b b a g e l o o p e r a n d a l f a l f a l o o p e r , j o u r n a l o f i n v e r t e b r a t e p a t h o l o g y , 1 7 , 3 8 3 - 3 8 8 3 . g u a r i n o l . a . , e t a l . 1 9 8 6 , c o mp l e t e s e q u e n c e a n d e n h a n c e f u n c t i o n o f t h e h o mo l o g o u s d n a r e g i o n o f a u t o g r a p h a c a l if o r n i c a n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s . j v i r a l 6 0 , 2 2 4 - 2 2 9 4 . h e i mp e l ,a .m. a n d a d a m s ,j . r . 1 9 9 6 , a n e w n u c le a r p o l y h e d r o s i s o f t h e c a b b a g e l o o p e r , t r i c h o p l u s i a n i . j o u r n a l o f l n v e r t e b r a t e p a t h o l o g y , 8 , 3 4 0 - 3 4 6 5 . ma e d a s a n d ma k i m a l , 1 9 8 8 , mo l e c u l a r c l o n i n g a n d p h y s i c a l m a p p i n g o f t h e g e n o me o f b o mb y x m o r i n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s , j f e n t i r o l , 1 9 9 0 , 1 8 5 1 - 1 8 5 5 6 . g u a r i n o l . a . a n d s u mme r s m d , j fi o l o g y6 2 ， 4 3 7 . g u a r i n o l . a . a n d s u m me r s m d 1 9 8 6 , f u n c t i o n a l ma p p i n g o f a t r a n s - a c t i v a t i n g g e n e r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n o f a b a c u l o v i r u s d e l a y e d - e a r l y g e n e . j . k r a l . , 5 7 , 5 6 3 - 5 7 1 8 . g u a r i n o l .a . s u m m e r s m d , 1 9 8 6 , i n t e r s p e r s e d h o m o l o g o u s d n a o f a u t o g r a p h a c a l if o r n i c a m u l t i p l e n u c l e c a p s i d n u c l e a r p o ly h e d r o s i s v i r u s e n h a n c e s d e l a y e d - e a r l y g e n e e x p r e s s i o n . j . vi r o l . 6 0 2 1 5 - 2 2 3 9 . ma t s u u r a y , p o s s e e , r . d , e t a l . , 1 9 8 7 , b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n v e c t o r s : t h e r e q u i r e m e n t f o r h i g h l e v e r e x p r e s s io n o f p r o t e i n , i n c l u d i n g g l y c o p r o t e i n , j g e n rt r o l o g y , 6 8 , 1 2 3 3 - 1 2 5 0 1 0 . r a n k i n , c . o o i ,b . g . a n d mi ll e r , l . k . , 1 9 8 8 , e i g h t b a s e p a i r s e n c o m p a s s i n g t h e t r a n s c r i p t io n a l s t a t e p o i n t a r e t h e m a j o r d e t e r mi n a n t f o r b a c u l o v i r u s p o l y h e d r i n 3 6 g e n e e x p r e s s i o n . g e n e , 7 0 , 3 9 - 4 9 . . 1 1 . g e a r in g , k . l . a n d p o s s e e , r . d . , 1 9 9 0 , f u n c t i o n a l a n a l y s i s o f a 6 0 3 n u c l e o t i d e o p e n r e a d i n g f r a m e u p s t r e a m o f t h e p o ly h e d r i n g e n e o f a u t o g r a p h a c a l i f o rni c a n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s j g e n t r r o l o g y , 7 1 , 2 5 1 - 2 6 2 . 1 2 . p o s s e e , r . d . a n d h o w a r d , s . c . , 1 9 8 7 , a n a l y s i s o f p o l y h e d r i n g e n e p r o m o t e r o f t h e a u t o g r a p h a c a l if o r n i c a m u l t i p l e n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s n u c l e a r a c i d s r e s 1 5 , 1 0 2 3 3 - 1 0 2 4 8 - 1 3 . 周耐明， 吴样甫等， 1 9 9 5 ， 乙 肝病毒s 基因 在家蚕细胞及蚕体内 高效表达，全 勿工理罕湘.1 1 ( 3 ) , 2 1 1 - 2 1 6 1 4 . k i n g , l .a a n d p o s s e e r . d， t h e b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m , a l a b o r a t o r y g u i d e , c h a p ma n &h a l l 1 5 ma t s u u r a y , e t a l , 1 9 8 6 , e x p r e s s i o n o f t h e s - c o d e d g e n e s o f l y m p h o c y t i c c h o r i o m e n i n g i t i s a r e n a v i r u s u s i n g a b a c u l o v i r u s v e c t o r , j g e n . ir r o l . , 6 7 , 1 5 1 5 - 1 5 2 9 1 6 . s m i t h , g . e . , e t a l . 1 9 8 3 , p r o d u c t i o n o f 0 i n t e r f e r o n i n i n s e c t c e l l s i n f e c t e d w i t h a b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n v e c t o r , mo l . c e l l . vi o l , ， 2 1 5 6 - 2 1 6 5 1 7 . n o t e b o r n , m. h . m. , e t a l 1 9 9 0 , e x p r e s s i o n o f a v i a n l e u k a e mi a v i r u s e n v - g p 8 5 i n s p o d o p t e r a f r u g ip e r d a c e l l s b y u s e o f a b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n v e c t o r . j g e n ri r o 1 , 7 1 , 2 6 4 1 - 2 6 4 1 - 2 6 4 8 1 8 . y o o , d . e t a l , 1 9 9 1 s t o u c t w a l a n a l y s i s o f t h e c o n f o r m a t i o n a l d o m a i n s i n v o l v e d i n n e u t r a l iz a t i o n o f b o v i n e c o r o n a v i r u s u s i n g d e l e t i o n mu t a n t s o f t h e s p i k e g l y c o p r o t e i n s l s u b u n i t e x p r e s s e d b y r e c o mb i n a n t b a c u l o v i r u s . vi o l o g y , 1 8 39 1 - 9 8 1 9 . k a n g , c - y , e t a l , 1 9 8 7 s e c r e t i o n o f p a r t i c l e s o f h e p a t i t i s b s u r f a c e a n t i g e n f r o m i n s e c t c e l l s u s i n g a b a c u l o v i r u s v e c t o r . j g e n . vi r o l . 6 8 , 2 6 0 7 - 2 6 1 3 2 0 . k r i s h n a , s . e t a l , 1 9 8 9 , e x p r e s s i o n o f g ly c o p r o t e i n d o f h e r p e s s i m p l e r v i r u s 竹p e i i n a r e c o m b i n a n t b a c u l o v i r u s : p r o t e c t iv e r e s p o n s e a n d t c e l l r e c o g n i t i o n o f t h e r e c o mb i n a n t -i n f e c t e d c e l l e x t r a c t s , j g e n . fi r o l . 7 0 , 1 8 0 5 - 1 4 2 1 . h e r r e r a , r , e t a l . 1 9 8 8 , s y n t h e s i s , p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o p l a s mi c d o m a i n o f t h e h u m a ni n s u l i n r e c e p t o r u s i n g a b a c u l o v i r u s 3 7 e x p r e s s i o n s y s t e m . j o u r n a l o f b i o l o g i c a l c h e m i s t r y , 2 6 3 , 5 5 6 0 - 5 5 6 8 2 2 . d a v i d s o n , d . j e t a l 1 9 9 0 , o l i g o s a c c h a r i d e p r o c e s s i n g i n t h e e x p r e s s i o n o f h u m a n p l a s m i n o g e n c d n a b y l e p i d o p t e r a n i n s e c t 叼u t o g r a p h a c a l if o r n i c a ) c e l ls . b i o c h e mi s t r y , 2 9 , 5 5 8 4 - 9 0 . 2 3 . k i n g , l . a . e t a l. 1 9 9 1 , s e c r e t i o n o f s i n g le c h a i n u r o k i n a s e - ty p e p l a s mi n o g e n a c t i v a t o r f r o m i n s e c t c e l l s . g e n e , 1 0 6 , 1 5 1 一 1 5 7 2 4 . j o h n s o n , p . w. e t a l . s y n t h e s i s o f s o l u b l e m y e l i n - a s s o c i a t e d g l y c o p r o t e i n i n i n s e c t a n d ma mma l i a n c e l l s , g e n e , 7 7 , 2 8 7 - 2 9 6 2 5 . l a n f o r d r . e . e t a l . 1 9 9 0 , e x p r e s s i o n o f h e p a t i t i s b v i r u s c o r e a n d p r e c o r e a n t i g e n s fir o l o g y i n i n s e c t c e l l s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c o r e - a s s o c i a t e d k i n a s e a c t i v i t y , 1 7 6 , 2 2 2 - 2 3 3 2 6 . 李亦平等，1 9 9 0 ，人转化生长因子一 a 1 $ 一 半乳糖普酶融合基因在昆虫 s f 细胞 中的表达， 2 2 ( 6 ) . 5 6 3 - 5 6 9 2 7 . mi l l s , h . r . e t a l . 1 9 9 0 , e x p r e s s i o n a n d p u r if i c a t i o n o f p 2 4 , t h e c o r e p r o t e i n o f h i v . u s i n g a b a c u l o v i r u s -i n s e c t c e l l e x p r e s s i o n s y s t e m, a i d s , 4 , 3 5 5 - 3 6 1 杨冠珍， 李载平等，1 9 9 0 ， 人a 一 干扰素基因 在昆 虫细胞中 的 表达. 2 2 ( 4 ) 3 5 5 - 3 6 1 。 28l， 2 9 . l a z a t e ,j .e , a n d t o s i e e o a l , 1 9 9 2 , o p t i m iz a t i o n o f t h e p r o d u c t i o n o f f u ll - l e n g t h r c d 4 i n b a c u l o v i r u s - i n f e c t e d s f 9 c e l l s , 4 0 , 2 1 4 - 2 1 7 . 3 0 . b e n t l e y , w. e . , mi n y i n g wa n g e t a l . 1 9 9 4 , p u r i f i c a t i o n o f a r e c o mb i n a n t p r o t e i n p r o d u c e d i n a b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m b y i mmo b i l i z e d me t a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , b i o t e c h b i o e n g i n e e r i n g 4 3 ,3 4 9 - 3 5 6 3 1 . 李晓平， 吴昊等，1 9 9 5 ，人a 型 肿瘤坏死基因 在昆 虫细胞中的 表达，全裁z 理李粥 i t ( 1 ) . 7 3 - 7 6 3 2 . j e n g - d a r y a n g , v e c i k p , e t a l , 1 9 9 6 ,r a t i o n a l s c a l e - u p o f a b a c u l o v i r u s i n s e c t c e l l b a t h p r o c e s s b a s e d o n m e d i u m n u t r i t i o n a l d e p t h , b i o t e c h 5 2 , 6 9 6 - 7 0 6 3 3 .y o n g k .y a n g a n d mo r i k a w a m,e t a l . , 1 9 9 6 ,ma x i m u m v i r g i n i a m y c i n p r o d u c t i o n b y o p t i mi z a t i o n o f c u l t i v a t i o n c o n d i t i o n s i n b a t c h c u l t u r e w i t h a u t o r e g u l a t o r a d d i t i o n , b i o t e c h 4 9 , 4 3 7 - 4 4 4 3 4 . c h u r g a y l . m. ,mi l l i c a n r . l . e t a l , 1 9 9 7 ,p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r iz a t i o n o f 3 8 s e c r e t e d h u ma n l e p t i n p r o d u c e d i n b a c u l o v i r u s i n f e c t e d i n s e c t c e l l s , g e n e 1 9 0 , 1 3 1 - 1 3 7 . 3 5 . k o s t t . a . a n d o e r t o n l . , e t a l . , 1 9 9 7 , p r o d u c t i o n o f a u r o k i n n a s e p l a s mi n o g e n a c t i v a t o r - i g g f u s i o n p r o t e i n ( u p a - i g g ) i n t h e b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m. g e n e , 1 9 0 , 1 3 9 - 1 4 4 3 6李迎秋， 庞义等， 1 9 9 7 ，乙 型肝炎 病毒 p r e c / c基因 在杆状病毒载体系统中 的表达，病萦笋蒲，1 3 ( 4 ) 3 2 5 - 3 3 1 3 7 . e r i c l. t s c r o , e t a l , 1 9 9 6 , p r o d u c t i o n o f p a r v o v i r u s b 1 9 v a c i n e i n i n s e c t c e l l s c o - i n f e c t e d w i t h d o u b l e b a c u l o v i r u s , b i o t e c h n o l o g y a n d b i o e n g i n e e r i n g , 4 9 , 1 3 0 - 1 3 8 3 8 . 谢云， 董明，张 鹏飞， 1 9 9 7 , h i v - 1核蛋白p 2 4在昆 虫细胞中的 表达， 病毒 李那，1 3 ( 3 ) 2 0 2 - 2 0 7 3 9 .杨安道等，1 9 9 1 ，应用杆状病毒载体在昆 虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表 面抗原基因，病毒笋粥， 7 ( 4 ) 3 1 5 - 3 2 2 4 0 .林广云等，1 9 9 7 ，利用杆状病毒表达系统表达金鱼生长激素 i 基因，全匆工 覆肇蒲，1 3 ( 2 ) , 1 4 9 - 1 5 3 4 1 . l i n d s a y , d . a . a n d b e t e n b a u g h ,m.j ., 1 9 9 2 ,q u a n t i f i c a t i o n o f c e l l c u l t u re f a c t o r s a f f e c t i n g r e c o mb i n a n t p r o t e i n y i e l d s i n b a c u l o v i r u s i n f e c t e d i n s e c t c e l l s 声i o t e c h , 3 9 , 6 1 4 - 6 1 8 4 2 . t a t i c e k , r . a . a n d s h u l e r m. l . , 1 9 9 7 , e f f e c t o f e l e v a t e d o x y g e n a n d g l u t a m i n e l e v e r s o n f o r e i g n p r o t e i n p r o d u c t i o n a t h i g h c e l l d e n s i t i e s u s in g t h e i n s e c t c e l l - b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m 声i o t e c h , 5 4 , 1 4 2 - 1 5 2 4 3 . l i c a r i a n d b a i l e y j . e . , f a c t o r s i n fl u e n c i n g r e c o mb i n a n t p r o t e i n y i e l d s i n a n i n s e c t c e l l - b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o