（遗传学专业论文）黑腹果蝇种组doxa2和dsk基因的进化与分子系统学研究.pdf

摘要 黑腹果蝇种组( m e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ) 隶属于果蝇属( d r o s o p h i l ag e n u s ) 、水果 蝇亚属( s o p h o p h o r as u b g e n u s ) ，至少包括1 8 0 余种，按形态特征归为1 2 个种亚组。到 目前为止，已经有很多基于形态学，生物地理学和分子生物学的研究，对黑腹果蝇种组 的系统关系进行了广泛的探讨，但是由于缺少足够多的种的系统发育信息，它的分类和 系统发生关系仍然存在很多争议。 通过直接测序的方法，测定了黑腹果蝇种组2 0 个种的d o x - a 2 基因序列和2 3 个种 的d s k 基因序列，分子进化分析结果表明这两个基因的编码区段高度保守，明显表现 出受到纯化选择的痕迹，其超高的k s k a 比值及g c i i i 含量都充分显示如此。而d o x - a 2 基因的内含子区存在明显的插入和缺失，也包含有丰富的进化信息。 以拟暗果蝇( d r o s o p h i l a p s e u d o o b s c u r a ) 为外群，基于d o x - a 2 基因和d s k 基因的 序列，以及两个基因的联合序列，运用邻接法、最大似然法和贝叶斯法三种方法重建了 m e l a n o g a s t e r 种组的系统进化树，对其系统发育关系进行了分析，并利用b o o t s t r a p 对分 析结果进行了置信度检验。研究结果表明黑腹果蝇种组明显的聚集为三大系谱： ( 1 ) a n a n a s s a e 亚种组；( 2 ) m o n t i u m 亚种组( 3 ) m e l a n o g a s t e r 亚种组和所谓的东亚亚种组 s u z u k i i ，e l e g a n s ，f i c u s p h i l a ，e u g r a c i l i s 和t a k a h a s h i i 组成独立的第三枝。关于 m e l a n o g a s t e r 亚种组和东亚亚种组之间的进化关系，几种树的拓扑结构有所差异。另外 m e l a n o g a s t e r 复合种中，d s i m u l a n s 和d s e c h e l l i a 亲缘关系最近。 关键词：黑腹果蝇种组；d o x - a 2 基因；d s k 基因；系统发育 a b s t r a c t d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u ps u b j e c t s t og e n u sd r o s o p h i l a ，s u b g e n u s s o p h o p h o r a ，i n c l u d i n gm o r et h a n18 0s p e c i e s ，m o s to fw h i c hh a v eb e e nc l a s s i f i e di n t o l2 s u b g r o u p s b a s e do n m o r p h o l o g i c c h a r a c t e r s s e v e r a ls t u d i e sa b o u tt h e p h y l o g e n y r e l a t i o n s h i p so ft h em e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u ph a v eb e e n d o n eb a s e do nm o r p h o l o g y , b i o g e o g r a p h ya n dm o l e c u l a rb i o l o g yc h a r a c t e r sb yf a r , b u ti t st a x o n o m ya n dp h y l o g e n y r e m a i n sc o n t r o v e r s i a l ，d u et ot h el a c ko fk n o w l e d g eo ft h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so ft h e s p e c i e s n u c l e o t i d es e q u e n c e so f21s p e c i e so fd o x - a 2g e n ea n d2 4s p e c i e so fd s k g e n ew i t h i n t h e m e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u pw e r ed e t e r m i n e d ，u s i n gt h ed i r e c ts e q u e n c i n gm e t h o d m o l e c u l e re v o l u t i o nr e s u l t ss h o wt h a tt h ec o d i n gr e g i o n so ft h et w og e n e sa r eh i g h l y c o n s e r v e d t h ee v i d e n c e sf r o mh i g hr a t i o so fk s k aa n dg c i i ic o n t e n t ss h o wt h a tt h ec o d i n g r e g i o n su n d e r g op u r i f i c a t i o ns e l e c t i o n d e l e t i o n i n s e r t i o ns e g m e n t sa r e o b s e r v e di nt h e i n t r o no ft h ed o x - a 2g e n e ，t h i sr e g i o ni n c l u d e sa b u n d a n ti n f o r m a t i o n so ft h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p so ft h es p e c i e s d r o s o p h i l ap s e u d o o b s c u r aw a ss e l e c t e d a st h eo u t g r o u p ，p h y l o g e n e t i ct r e e sa r e r e c o n s t r u c t e db a s e do nt h es e q u e n c ed a t ao fd o x - a 2a n dd s kg e n e sw i t hn e i g h b o u r - j o i n i n g ( n j ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m l ) a n db a y e s i a nm e t h o d s u p p o r t i n gv a l u e sw e r ec a l c u l a t e db y b o o t s t r a p t h er e s u l ts h o w s t h a tt h em e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u pa r ec l u s t e r e di n t ot h r e em a i n l i n e a g e s ：( 1 ) a n a n a s s a es u b g r o u p ；( 2 ) m o n t i u ms u b g r o u p ；( 3 ) m e l a n g a s t e r - s u z u k i i - e l e g a n s - f i c u s p h i l a e u g r a c i l i s - t a k a h a s h i i t h er e l a t i o n s h i p so ft h e t h i r dl i n e a g ea r eu n c l e a r ；i nt h e m e l a n g a s t e rs u b g r o u p ，t h ep h y l o g e n yo fd s i m u l a n s a n dd s e c h e l l i aa r et h em o s tc l o s e l y r e l a t e ds p e c i e s k e yw o r d s ：m e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ；d o x - a 2g e n e ；d s kg e n e ；p h y l o g e n y i i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：年月日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务：学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 前言 月l j舌 黑腹果蝇种组( m e l a n o g a s t e rs p e c i e sg r o u p ) 隶属于果蝇属( d r o s o p h i l ag e n u s ) 、水 果果蝇亚属( s o p h o p h o r as u b g e n u s ) ，是果蝇科中最大的一个种组，分为1 2 个亚种组 ( s u b s p e c i e sg r o u p ) ，包括至少1 8 0 多个种( t o d amj , 1 9 9 1 ) 。多年以来，果蝇分类学家 和进化生物学家对它们的系统关系进行了广泛的研究，得到了一些共识，但由于该种组 种类繁多，系统关系复杂，还有诸多问题没有解决。第一个问题是起源问题：黑腹果蝇 种组内有些种是世界性分布种，如d m e l a n o g a s t e r ；有的种是地理局部性种，如a u r a r i a 复合种仅仅分布于东亚地区，d q u a d r a r i a 仅分布于中国的台湾，d y a k u b a 只分布于非 洲。但多数种呈现以亚洲为中心的趋势分布，因此有人认为黑腹果蝇种组起源于亚洲， 但是d y a k u b a 只分布于非洲的事实对此观点提出了疑问，即便是起源于亚洲后迁徙到 非洲也难解释它的特异分布。另外有人则认为黑腹果蝇种组起源于非洲后经亚欧大陆迁 徙到东南亚，如果该理论成立的话，又不能解释为什么a u r a r i a 复合种仅仅分布于东亚 地区。总而言之黑腹果蝇种组的起源问题是一个非常有趣的问题，也是一个有待于进一 步的研究的问题。第二个问题是系统进化关系问题：系统进化关系至今未成定论。即使 单个种的形态学特征，行为学特征描述得十分清楚，但想要真正地了解这些具有明显差 异的种之间的系统进化关系还是极其困难的。原因在于以下几个方面：黑腹果蝇种组 的成员数量大，对于任何学者而言同时拥有所有的种，进而分析它们之间的系统进化关 系是不现实的，他们只能是通过分析有限的一些种，揭示所分析的有限种的系统进化关 系；每个人采用不同的分子标记不同，所分析的种也不相同，因而不能机械的联合起 来产生联合树；不同的分子标记分析相同的种时，所得的系统进化关系也不相同，也 不能肯定哪一种进化关系树是最能揭示物种真实关系的树。以前通过生殖隔离，染色体 同源性，比较形态学的研究认为，黑腹果蝇种组的系统分化存在连续的变化范围 ( l e m e u n i e r , 1 9 8 6 ) 。g r i m a l d e ( 1 9 9 1 ) 以形态学特征综合地分析过果蝇系统发育关系。 但是，由于形态学其本身的特征复杂，进化模式不稳定，以及形态学特征上的极化现象 等都或多或少的降低了这种推导方法的可信度。因此，选择进化模式比形态学标记更为 简单的d n a 分子标记分析该种组的系统进化关系显得很有必要。( n e i ，1 9 9 1 ) 1d n a 分子标记技术简介 分子标记是随着分子遗传学、分子生物学的发展，分子克隆及d n a 重组技术的完 善而诞生的一类新的重要遗传标记。自诞生以来其发展日新月异，迄今已有十几种分子 湖j 匕人学硕士学位论文 标记技术相继问世，并在生命科学的各个研究领域取得了不同程度的应用。 1 1d n a 分子标记的概念 遗传标记是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离且易于识别的可遗传的等位 基因变异，是基因型特殊的易于识别的表现形式( 王永飞等，2 0 0 1 ) 。目前遗传标记主 要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记4 种类型。前3 种标记是对基因的间接 反映，而d n a 分子标记是d n a 遗传变异水平的直接反映。 1 2d n a 分子标记的类型 分子标记种类繁多，大致可分4 类：以s o u t h e r n 杂交技术为核心的分子标记技术， 如r f l p 和d n a 指纹谱( d n af i n g e rp r i n t i n g ) ，以p c r 技术为核心的分子标记技术， 如随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m e r - p h i cd n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多 态。1 生( a m p l i f i e df r a g - m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、单链构象多态性p c r ( s i n g l es t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s mp c r ，s s c p p c r ) ，以d n a 重复序列为核心的分子标记技术， 如简单重复序列即微卫星d n a 标记( s i m p l e ，s e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 。以m r n a 为基础的 分子标记技术，m r n a 差别显示p c r ( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，d d r t - p c r ) 。这四类分子标记的划分不是绝对的，有些分子标 记介于第1 、2 或第3 类之间，有些是4 种技术的结合，还有些把第3 、4 类归于l 、2 类中。 1 2 1 r f l p 标记技术 1 9 8 0 年，b o t s t e i n 提出了限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 可以作为分子标记，开创了直接应用d n a 多态性做分子标记的 新阶段。r f l p 是指用限制性内切酶( r e ) 消化不同个体的同源d n a 分子，经电泳分 离后表现的限制性片段长度差异。r f l p 是检测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特 定d n a 片段的大小，反映d n a 分子上不同酶切位点的分布情况，d n a 序列上的微小 变化也能引起限制性内切酶酶切位点的丢失或改变，导致酶切片段长度的变化。r f l p 标记的等位基因具有共显性特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适合构建遗传连锁图。 但是在进行r f l p 分析时，需要该位点的d n a 片段做探针，用放射性同位素及核酸杂 交技术，既不安全又不易自动化，且检测的多态性水平过分依赖于r e 的种类和数目。 另外，r f l p 对样品中靶序列拷贝数的纯度要求高，因而需样品很大。加拿大s p e r l i n g 等人通过r f l p 技术实现了对伏蝇、丝光绿蝇和亮绿蝇的鉴定。 2 日u磊 1 2 2r a p d 标记技术 为了克服r f l p 技术上的缺点，w i l l i a m s 等于1 9 9 0 年建立了随机扩增多态d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 技术，由于其独特的检测d n a 多态性 的方式使得r a p d 技术很快渗透于基因研究的各个领域。在p c r 反应中，不同物种的 基因组内与引物相匹配的碱基序列空间位置和数目都可能不同，所以扩增产物的大小和 数量也可能不同，这些差异可通过凝胶电泳显示出来。基于这种认识，w _ i l l i 锄s 等将通 常p c r 反应中使用的两个特定序列的引物改为单一的由1 0 个碱基构成的随机引物，并 运用大量的不同序列的随机引物进行扩增，使基因组d n a 多态性充分展现出来。对任 一特定引物而言，其在基因组d n a 序列上有特定的结合位点，一旦基因组在这些区域 发生d n a 片段插入、缺少或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化， 从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。与r f l p 相比，r a p d 技术 简单，检测速度快，d n a 用量少，实验设备简单，不需d n a 探针，设计引物也不需要 预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成的一套引物 可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要同位素， 安全性好。同时可以应用的引物种类( 长度和序列不同) 可无限多，目前美国o p e r o n 公司可提供8 0 0 种随机引物，中科院遗传研究所可提供5 0 0 多种随机引物。r a p d 技术 还受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差，首先是几乎所有的r a p d 都呈显性遗传， 所以无法区分杂合子和纯合子，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图 时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降。其次，r a p d 对反应条 件相当敏感，易受外源及污染d n a 的干扰，所以实验的重复性差。目前该法在引物长 度和序列及应用引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，因而不同方法获得 的结果之间无法比较。k a m b h a m p t i 等采用r a p d 技术对蚊虫的种和种群进行了鉴定和 区分，并对r a p d 的实验技术、统计分析及应用进行了探讨。其后，r a p d 在按蚊、寄 生蜂、舞毒蛾、蝗虫、果蝇等昆虫中均有应用。在这些研究中，r a p d 大多用于近缘种、 复合种和种内生物型的识别和鉴定，以及地理种群的遗传进化研究。r a p d 技术已广泛 应用于种群间系统亲缘关系、分类和系统发生等方面的研究( 陈永久等，1 9 9 8 ；丁波等， 1 9 9 9 ；常青，1 9 9 9 ) ，并表现了一定的优越性。k r e m e r ( 1 9 9 3 ) 用r a p d 对两种栎树( q u e r c u s r o b u r 和q p e t r a e a ) 进行了遗传变异分析，结果在4 5 个引物中有7 个在二者之间表现明 显的差异，这7 个引物所鉴别的3 6 条片段里，有1 4 个出现频率差异。 1 2 3a f l p 标记技术 湖北大学硕十学位论文 扩增片段长度多态性( a f l p ) ，又名限制片段选择扩增技术( s e l e c t i v er e s t r i c t i o n f r a g m e n ta m p l i f i c a t i o n ，s r f a ) 。1 9 9 3 年，由荷兰k e y g e n e 公司的z a b e a n 和v o s 等发明 并已申请专利。a f l p 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组d n a 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头( 与酶切位点互补) 连接起来，并通 过5 端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量d n a 片段，从而形成指纹图谱的分子 标记技术，a f l p 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具r a p d 与r f l p 的优点， 有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物 所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上，各染色体上a f l p 标记的 数目与染色体长度呈正相关，而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相 关。因此通过少量频率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组a f l p 标记。目前，a f l p 作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势( 黎裕等，1 9 9 9 ) 。但 a l e x a n d e r s ( 2 0 0 7 ) 等人研究认为，a f l p 对基因组纯度和反应条件要求，另外用于遗 传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入( 罗文永等，2 0 0 3 ) 。此外在r a p d 和r f l p 技术基础上建立了序列特异性扩增区域( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e d a m p l i f i e d r e g i o n s ，s c a r ) 、酶切扩增多态序列( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ，c a p s ) 和 d n a 扩增指纹( d n aa m p l i f i e df i n g e r p r i n t s ，d a f ) 等标记技术( z i e t k i e w i c zee ta l ，1 9 9 4 ) 。 这些技术的出现增加了人们对d n a 多态性的研究手段。 1 2 4s s r 标记技术 w a n gg ( w a n g ge ta l ，1 9 9 8 ) 等提出在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序 列，如重复单位长度在1 5 6 5 个核苷酸的小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ，重复单位长 度在2 6 个核苷酸的微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 。小卫星d n a 和微卫星d n a 分 布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构 成丰富的长度多态性。m o o r e 等于1 9 9 1 年结合p c r 技术创立了简单重复序列( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t 。s s r ) 标记技术，s s r 也称微卫星d n a ，是一类由几个( 多为1 5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的d n a 序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即( c a ) n 和( t g ) n ，每个微卫星d n a 的核心序列结构相同，重复单位数目l o 6 0 个，其高度 多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了s s r 长度的高 度变异性，这一变异性正是s s r 标记产生的基础。s s r 标记的基本原理：根据微卫星 重复序列两端的特定短序列设计引物，通过p c r 反应扩增微卫星片段。由于核心序列 重复数目不同，因而扩增出不同长度的p c r 产物，这是检测d n a 多态性的一种有效方 4 日o 再 法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好 的分子标记。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物 种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记己被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲 缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域( w e i s i n gk e ta l ，1 9 9 8 ) 。此外s s r 标 记不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更加可靠，方法简单，省时省力。利用微卫 星标记，科学工作者已经构建了人类( d i bc ，e ta l ，1 9 9 6 ) 、老鼠( d i e t r i c hwf , e ta l ，1 9 9 6 ) 、 狗( o s t r a n d e rea ，e ta l ，1 9 9 3 ) 、鸡( c r o o i j m a n sr pma ，e ta l ，1 9 9 6 ) 和多种植物( a k k a y am s ，e t a l ，1 9 9 5 ；b r o u ne , e ta l ，1 9 9 6 ) 的遗传连锁图谱。 1 2 5i s s r 标记技术 i s s r 即内部简单重复序列，是一种新兴的分子标记技术。1 9 9 4 年，z i e t k i e w i c z 等对 s s r 技术进行了发展，建立了加锚微卫星寡核苷酸( a n c h o r e dm i c r o s a t e l l i t e o l i g o n u c l e o t i d ) 技术。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在s s r 的5 端或3 端加上 2 4 个随机选择的核苷酸，这可引起特定位点退火，从而导致与锚定引物互补的间隔不 太大的重复序列间的基因组区域进行p c r 扩增。这类标记又被称为i s s r ( i n t e r s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ) 、a s s r ( a n c h o r e ds i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) ( c h oi l le ta l ，19 9 9 ) 或 a m p p c r 。如果一个是5 端加锚的a s s r 引物，另一个是随机引物，则被称为r a m p 技术。用于i s s r p c r 扩增的引物通常为1 6 1 8 个碱基序列，由1 - 4 个碱基组成的串联 重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组d n a 中s s r 的5 端或3 末端结合，通过p c r 反应扩增s s r 之间的d n a 片段。s s r 在真核生物中的分布是非 常普遍的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的i s s r p c r 可以检测基因组许多 位点的差异。与s s r p c r 相比，用于i s s r p c r 的引物不需要预先的d n a 测序，也正 因如此，有些i s s r 引物可能在特定基因组d n a 中没有配对区域而无扩增产物，通常为 显性标记，呈孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性和多态性。m ay 等利用i s s r 技术对 叉孢苏铁( c y c a ss e g m e n t i f i d a ) 遗传多样性进行了研究，从1 0 3 条引物中筛选出1 2 条用于 所有样品的扩增。结果表明：种级水平上叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平，且 各居群间有着很高的遗传分化度。g eyq ( 2 0 0 3 ) 等对2 个栽培和3 个野生银杏群体进 行了i s s r 检测，结果表明：银杏具有丰富的遗传变异。 1 2 6s n p 标记技术 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 是指同一位点的不同等位 湖北大学硕士学位论文 基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入( 骆蒙等，2 0 0 0 ) ， 常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基( a 与g ) 和嘧啶碱基( c 与t ) 之 间。s n p 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。 目前已有2 0 0 0 多个标记定位于人类染色体上，在拟南芥也已发展出2 3 6 个s n p 标记。 在这些s n p 标记中大约有3 0 包含限制性位点的多态性。检测s n p 的最佳方法是d n a 芯片技术，最新报道的微芯片电泳( m i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i s ) ，可以高速度地检测临床 样品的s n p ，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高1 0 和5 0 倍。s n p 与r f l p 及 s s r 标记的不同有两个方面：其一，s n p 不再以d n a 片段长度变化作为检测手段，而 直接以序列变异作为标记；其二，s n p 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最 新的d n a 芯片技术。在家畜遗传育种中利用s n p 标记双等位基因的特点，有可能在短 时间内检测出大量的样品，如对猪氟烷基因、e s r ( 雌激素受体) 基因的多态性检测将 更加简便( 屈彦纯等，2 0 0 1 ) 。s h i m a n u k is 等利用人类的雄性激素受体基因序列设计特 异性引物，扩增出家猪的雄性激素受体基因长约2 0 0 b p 的片段，利用r f l p 技术寻找该 片段上的s n p s ，找到了一个n a e e 酶切位点上g a 的s n p 多态性位点。 1 2 7e s t 标记技术 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g ，e s t ) 是美国国立卫生研究院( n a t i o n a l i n s t i t u t e so f h e a l t h ，n i h ) 生物学家v e n t e r 于1 9 9 1 年提出的。随着人类基因组计划的开 展，e s t 技术首先被广泛应用于寻找人类新基因，绘制人类基因组图谱，识别基因组序 列编码区研究领域，之后又被广泛应用于植物基因组研究中。e s t 是指在来源于不同组 织的e d n a 文库中随机挑选克隆、测序得到部分e d n a 序列，一个e s t 对应于某一种 m r n a 的c d n a 克隆的一段序列，长度为1 5 0 5 0 0 b p ，只含有基因编码区域。e s t 可代 表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，所以被称之为“表达序列标签 ，e s t 的 数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数，一个基因的表达次数越多，其相应的e d n a 克隆越多，所以通过对e d n a 克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度。吕小东等在对 8 1 0 周龄胎j l , , b 脏c d n a 文库大规模表达序列标签分析时发现了1 7 7 条新e s t s ，并对 胎儿心脏不同发育时期基因表达特点进行了分析。 1 3d n a 分子标记的优点 d n a 分子标记直接以d n a 的形式出现，在动物和植物的各个组织、各个发育时期 均可检测到，而且遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制；数量极多，遍及整个基 6 前言 因组；多态性高，自然存在着许多等位基因变异，不需专门创造特殊的遗传材料：表现 为“中性 ，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；有许多分子标记表现 为共显性，能够鉴定出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而成为遗传 标记中强有力的工具，在揭示物种的遗传变异性研究中发挥着独特的优势。 2d n a 分子标记技术在蝇类研究中的应用 d n a 分子标记技术在蝇类系统进化、近似种的区分、种群遗传结构及分化等方面 得到不同程度的应用。 2 1 系统进化 分子标记技术大大推进了蝇类系统进化的研究。徐书华等用r a p d 方法研究了中国 大陆3 8 个不同地理群体的拟果蝇( d s i m u l a n s ) 在d n a 水平上的遗传多样性，以4 0 种1 0 b p 长的寡核苷酸随机引物进行p c r 扩增，根据遗传距离利用u p g m a 法作出的相 关聚类图，初步讨论了拟果蝇在中国大陆的起源。戴灼华等以m t d n ar f l p 为分子标 记分析我国d t r i a u r a r i a 果蝇在线粒体d n a 体系中的遗传变异，认为金色果蝇复合种中 的d t r i 正处于一种非常活跃的进化状态之中，存在着进一步发生遗传分化的潜力。张 文霞等选用1 4 种限制性内切酶对中国大陆部分地区果蝇种群的线粒体d n a 进行了分 析，说明其果蝇的遗传组成均一程度高，遗传多态性低，遗传变异贫乏，推测中国大陆 的果蝇种群比分布在中国台湾、日本的种群原始。蒙世杰等应用r f l p 技术对我国大陆 部分地区黑腹果蝇的线粒体d n a 的多态性进行了分析，在5 6 个单雌系中发现了2 5 种 不同的限制类型，应用n e i 等的数学模型和u p m g a 法，构建了限制类型间和群体间的 系统进化树，为探讨我国大陆黑腹果蝇的起源和演化提供了重要的依据。 2 2 种群遗传分化 同一物种的不同地理种群可能发生遗传变异，在形态学上通常难以区分这种差异， 但在d n a 水平却容易找出明显的不同。陈燕茹等( 1 9 9 7 ) 利用r a p d 技术研究了中国 的d r o s o p h i l ai m m g r a n t s 种内7 个不同地理种群的果蝇，以d v i r i l i s 为对照，选取2 0 种 l o b p 长的寡核苷酸随机引物，进行随机扩增多态d n a 分析，利用u p g m a 法作聚类分 析，以遗传距离为尺度绘制了分子聚类图，得出g r a n s 与处在完全不同分类阶元的对照 种d v i r i l i s 的遗传距离最大，分布在较高海拔地区的d i m m i g r a n s 果蝇具有遗传相似性。 王文等( 1 9 9 4 ) 以8 种限制性内切酶为标记对8 个银额果蝇群体进行了m t d n a 的限制 性片段多态性r f l p 分析，发现生银额果蝇种群可以分成3 个相对独立的群体：东部、 7 湖北人学硕十学位论文 中部和西部群体，推测出银额果蝇可能起源于马来半岛南部和加里曼丹岛一带，起初分 成东西两支向北扩散，东支发展成现在的东部群体，西支则在中南半岛北部又分成两个 支系，从而形成了现在生银额果蝇群体的地理分布模式。赵中明( 2 0 0 1 ) 等以随机扩增 多态性d n a ( r a p d ) 技术分析了金色果蝇复合种的5 个姊妹种共1 2 个地理种群的遗 传变异。在4 0 种1 0 碱基随机引物中有3 0 种引物对每个种群都可获得令人满意的扩增 结果。在1 6 1 个r a p d 标记中有1 2 9 个呈多态性，以遗传距离为尺度用u p g m a 法构建 了该复合种的聚类关系图，聚类分析结果得出了5 个姊妹种遗传分化的早晚顺序。 总之，遗传标记从传统的形态性状分析跨入到以d n a 的核苷酸多态性为基础的分 子研究，实现了有关遗传研究的质的飞跃，分子标记与传统的遗传标记相比有很多优点， 能从d n a 水平上反映遗传基础的细微差异。随着分子生物学技术的发展，分子标记技 术也将日臻完善，在蝇类研究中发挥越来越重要的作用。 3 分子系统学概况 分子系统学是一门多学科相互交叉相互渗透而产生的一门新的学科。它以系统学、 分类学、遗传学、分子生物学和生物进化论等学科理论为基础，从分子水平解释生物多 样性、系统发育和进化规律的一门学科；通过检测生物大分子所携带的遗传信息，定量 描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化中的作用。二十世纪六十年代，m a y r 首 次提出了系统学( s y s t e m a t i c s ) 概念，此后蛋白质电泳技术和免疫学分析及d n a 杂交技 术开始用于系统分类和进化方面的研究。上个世纪8 0 年代末分子系统学开始应用于昆 虫分类及进化的研究中，通过研究昆虫核酸和蛋白质分子的结构来探求各类群之间的亲 缘和进化关系，从生命的本质上寻找昆虫各类群之间的内在联系，可以揭示自然居群中 遗传结构、基因流动、进化系统、选择作用和系统发育等问题。 4 分子系统学研究方法 随着分子生物学技术的快速发展，特别是近几年测序技术的应用，使昆虫分子系统 学研究向更深一步发展。从是否需要测序来分可将分子系统学研究方法分为间接测序法 和直接测序法两大类。目前间接测序法中，主要的研究方法有限制性片段长度多态性 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m d n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 、简单序列重复 区间扩增多态性( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a td n a ，i s s r ) 、核酸序列分析( d n a 前言 s e q u e n c ea n a l y s i s ) 。b o t s t e i n 等采用dn a 限制性片段多态性( r f l p ) 作为一种新的遗 传标记，构建人类基因遗传连锁图谱，建立了直接用dna 的多态性进行遗传标记的新 方法。l a n s m a nr a 等人指出，r f l p 技术可以用于研究特异而重复的d n a 序列，可以 开究m t d n a 变异。这种方法主要用于研究种群内和种群间变异、基因流水平、种群有 改大小、亲缘关系和相似程度。r a p d 技术是9 0 年代发展起来的建立在p c r 技术基础 t z 的一种分子标记手段。在分子系统学中，r a p d 方法已广泛应用于种群间系统亲缘关 系、分类和系统发生等方面的研究，并表现了一定的优越性。但有人认为r a p d 技术在 立用于种间乃至近缘属之间亲缘关系的研究时有一定的局限性。a f l p 结合了r f l p 和 c r 的优点，具有r f l p 的稳定性和p c r 的高效性，b c c k e rj 等人实验结果表明a f l p = 匕r f l p 技术要灵敏得多，在r f l p 多态性很差的大麦中进行a f l p 分析，只有1 6 个引 优定位出了1 1 8 个位点。a f l p 需要较高超的操作技能等，因而在应用上也有某些局限 生。s s r 标记又称微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) d n a 标记、s t r ( s i m p l et a n d e mr e p e a t ) 标 已，是近年发展起来的第2 代分子标记技术，具有共显性的特点，可以清晰的显现父本 阳母本双方的遗传特征，适合亲缘关系鉴定、品种鉴定、分子育种和遗传多态性分析等。 e a d y 等报道了家蚕基因组微卫星标记的相关工作，分离出2 8 个微卫星位点，用其中 内1 5 个微卫星标记对1 3 个家蚕品种进一步分析微卫星标记的多态性。i s s r 方法是 。i e t k i e w i c z 等1 9 9 4 年创建的，也是一种以p c r 技术为基础的分子标记技术，其引物是 侵据基因组内某一重复序列设计出一系列特异性引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核 旨酸等微卫星片段。i s s r 标记的原理与r a p d 非常相似，除具有r a p d 优点外，还具 茸稳定性和重复性较好的特点，且产物的多态性远比r f l p 、s s r 、r a p d 更加丰富， 玎以提供更多的关于基因组的信息。直接测序法即d n a 序列分析法，通过直接比较不 司类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，构建分子系统发育树，并推断类群间的系统演 七关系( 成跃新等，2 0 0 0 ) 。目前，用于测序的技术主要有两种：s a n g e r 发明的双脱氧 连末端终止法和m a x a m 与g i l b e r t 发明的化学降解法。这两种方法在原理上有较大差异， 旦都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生a ，t ， ：，g 四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变形的p a g e 胶上电泳检测，从而获 导d n a 序列。d n a 序列分析法进行系统发生学研究的关键在于选择适当的分子标记， 不同分类阶元选择的分子标记不同。种内阶元和近缘种类可通过测定快速进化的同功酶 塞因序列或m t d n a 序列而获得有效的研究数据；而远缘种的类群间的系统发育只能靠 呆守基因的序列分析，通常选择进化速率不同的几种序列来解决类群中不同年代分支系 9 湖北人学硕七学位论文 的系统发育关系( 徐宏法等，2 0 0 1 ) 。由于该方法是直接从研究对象的遗传信息入手， 因此，大多数研究者认为该方法是目前进行分子进化及系统发育研究最有效、最可靠的 方法。 5 黑腹果蝇种组的分子系统学研究进展 黑腹果蝇种组隶属于果蝇属( g e n u sd r o s o p h i l a ) 、水果果蝇亚属( s u b g e n u s s o p h o p h o r a ) ，目前认为至少有1 8 0 余种，按形