（外科学专业论文）人骨髓间充质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：李九叫 签字日期：妙( 年二月c 嘲 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌史学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：薹九矿 签字日期：v 绛月f ，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名 7 李竹南 签字日期。i 一6 年0 月抄日 电话： 邮编： 人骨髓间充质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究 研究生：李刚 导师：陈伟高 摘要 目的：研究体外培养的成人骨髓问充质干细胞( 删s c s ) 在特定条件下定向诱 导分化为成骨细胞，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。 方法：抽取无血液系统疾患的骨折病人的骨髓，在含2 0 胎牛血清的高糖d m e m 培养基中采用全骨髓培养法，培养传代后改用含2 n m o l lb 一甘油磷酸钠、 5 0 u g m l 维生素c 、l o n m o l l 地塞米松的条件培养基培养，在相差显微镜下观 察细胞形态，g o m o r i 钙钴法进行碱性磷酸酶( a l p ) 染色，v o nk o s s a 法进行 钙结节染色，同时测定细胞内a l p ( 碱性磷酸酶) 含量变化，并进行统计学分 析。 结果：原代培养和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力，诱导培养3 - 4 周后 a l p 染色及钙结节染色等均为强阳性：a l p 活性明显增强( 尸 0 0 5 ) 。 结论：b m s c s 取材安全方便，易于诱导分化为成骨细胞，有望成为理想的骨组 织工程种子细胞来源，本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方 法之一。 关键词：间充质干细胞成骨细胞细胞培养骨组织工程 ln d u c e dd i f f e r e n t i a t i o n m e s e n c h y m a is t e mo e iis i o fh u m a nb o n em a rr o wd e ri v e d nv i t r ot o w a r do s t e o b i a s t s p o s t g r a d u a t e l ig a n g t u t o rp r o f c h e nw e i g a o a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ef e a s i b i l i t yo fi n d u c i n g i n m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s( h m s c s ) d e r i v e df r o mh u m a nb o n e d i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s t sa n d h u s c sa st h es e e dc e l l si nt i s s u ee n p o t e n t i a la p p l i c a b i l i t y g i n e e r i n g v 1 t r o m a r r o w o ft h e m e t h o d s ：h u m a nb o n em a r r o ww a sc 0 1 l e c t e df r o mt h ef r a c t u r e dp a t i e n t w i t h o u tb l o o dd i s e a s e st oo b t a i nt h eh m s c s ，w h i c h ，a f t e ri nv i t r oc u l t u r e i nd m e ms u p p l e m e n t e dw i t h2 0 f e t a lb o v i n es e r u ma n di n c u b a t i o nu n d e r s t a n d a r dc o n d i t i o n w e r ei n d u c e dt od i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s t si n d m e m c o n t a i n i n gb e t a 9 1 y c e r o p h o s p h a t e( 2 n m o l l ) ，a s c o r b i c ( 5 0 u g m 1 )a n d d e x a m e t h a s o n e ( 1 0 n m o l l ) p r o li f e r a t i o n a c i d a n d d i f f e r e n t i a t i o no ft h eb m s c sw e r eo b s e r v e dc o n t i n u a l l yu n d e ri n v e r t e d p h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p e a l k a li n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) i nt h eb m s c sb y g o m o r i ，t h ec a l c i f i e dn o d u l e sw e r es t a i n e db yyonk o s s am e t h o d ，a n dt h e c h a n g e si nt h ec o n t e n to fa l pw e r em e a s u r e d r e s u l t s ：t h eb m s c sp r o l i f e r a t e dr a p i d l yi ni nv i t r oc u l t u r ea n da f t e r a3 一t o4 - w e e ki n d u c t i o n ，s t r o n gr e a c t i o nf o ra l pa n dc a l c i f i e dn o d u l e s w e r eo b s e r v e d i n c r e a si n ga l ps e c r e ti o nb yt h eb m s c sw a s s e e na st h e t i m e o fi n d u c t i o np r o l o n g e d ( 尸 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：h u m a nb o n em a r r o w - d e r i v e dh m s c sc a nb ei n d u c e dt o d i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s t s t h r o u g hr e l a t i v e l y p r o c e d u r e s ，w h i c hp r o v i d ei d e a la u t o g e n o u ss o u r c eo fs e e dc e l l s t i s s u ee n g i n e e r i n g t h em e t h o da d o p t e di nt h i se x p e r i m e n tm a y f o rb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g s i m p l e f o rb o n e b eu s e d k e yw o r d s ：m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s o s t e o b l a s t sc e l lc u t u r eb o n e 3 t i s s u ee n g i f i e e r i n g 4 前言 由疾病，创伤所导致的骨缺损是临床常见的问题，b m s c s 既然能分化为成 骨细胞，应该可以用于骨缺损的修复。近年来，组织工程中选择种子细胞的 研究方兴未艾，由于b m s c s 取材方便容易，扩增方法可靠，应用范围广泛及 成骨确定且避免了免疫排斥问题，已成为最有前途的骨组织工程种子细胞。 在培养和诱导分化技术成熟之后，下一步是设法尽可能快地将足够多的细胞 输送到创伤部位，以便迅速形成相当大小的间充质胚基而实现创伤修复。直 接注射细胞是一种方法，但细胞往往定位不好，容易流失，难以在创伤部位 较长时间维持一定数量。将细胞与支架材料复合后移植到创伤部位是较好的 方法。由于脉管系统可能为成骨细胞的分泌活动提供定向性，选择的支架材 料必须提供足够的条件让毛细血管长入，而且支架材料最好是一种类似骨的 物质，这样的环境可能有助于成骨细胞分泌产物的定向分布。为了证实用 b m s c s 进行骨再生治疗的临床实用性，国外有人设计比较了细胞来源从啮齿类 动物逐渐升级到大动物直至人的效能和有效剂量。他们将培养扩增后的b m s c s 与多孔羟基磷灰石? 一磷酸三钙( h a t c p ) 结合后用于股骨缺损的修复，研 究显示了b m s c s 修复成段骨缺损的能力，而且发现影响骨修复所需的细胞剂 量在不同种间是一致的，骨修复的过程也相同，这无疑增加了人们对以b m s c s 为基础的骨修复治疗法可有效治疗人类疾病的信心。 。材料与方法 1 1 材料 无血液系统疾患的骨折病人，男，2 4 岁。征得患者同意，无菌条件下， 用1 2 号骨髓穿刺针在髋骨粗隆部穿刺得骨髓2 m l ，置于加有肝素钠的含2 0 胎 牛血清的d m e m 培养液中，反复抽吸吹打，2 0 0 0 r m i n 离心5 - l o m i n ，制成细 胞悬液。 i 2 主要试剂和仪器 d m e m 培养液( g i b c o ) ， 胎牛血清( 杭州四季青生物有限公司) ， p e r c o l1 分离液， 胰蛋白酶( s i g m a ) ； d 一甘油磷酸钠( s i g m a ) ； 地塞米松( s i g m a ) ； 维生素c ( s i g m a ) ； 钙染色试剂( s i g m a ) ； 碱性磷酸酶( a l p ) 试剂盒( 南京建成生物制品公司) ； 酶联免疫检测仪( 奥地利) ； 超净工作台( 苏州净化设备厂) ； 二氧化碳培养箱( 美国) ； 倒置显微镜( o l y m p u s ) 。 1 3 原代培养 取上述细胞悬液2 m 1 分别接种于2 5 m i 培养瓶中，再加入d m e m 培养液2 m l ， 置3 7 。c 、5 c 0 ：及饱和湿度条件下静置培养。第5 天换全液，以后每隔4 d 换 液。 1 4 传代培养 待细胞长满培养瓶8 0 - 9 0 时，p e r c o l l 分离液洗2 次，2 5 9 l 胰酶消化 5 - l o m i n ，2 0 0 0 r m i n 离心5 - l o m i n ，分别接种于二个培养瓶中传代培养，每 消化一次计为一代。 1 5 成骨诱导 取第4 代细胞，胰酶消化，接种在2 5 m i 培养瓶中，用矿化液( 含2 0 胎 牛血清、2 n m o l lb 一甘油磷酸钠、5 0 u g m l 维生素c 、l o n m o l l 地塞米松) 连 续培养3 0 天，在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。 i 6 细胞增殖测定( m t t 法) 将传代至第1 、5 、7 代培养的细胞各以1 1 0 4 孔细胞数接种于9 6 孔板 中，次日起每d 选择6 孔细胞，每孔加入m t t 溶液2 0 u l ，3 7 。c 孵育4 h 后终止 培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入1 5 0 u l 二甲基亚砜，振荡i s m i n 裂解细胞，使沉淀物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值 ( o d 。，。) ，以时间为横轴，0 d 。，。值为纵轴绘制细胞生长曲线。 i 7a l p 染色和钙结节染色 取经连续培养3 0 天的标本，9 5 酒精固定后行o o m o r i 钙钴法进行细胞内 a l p 染色和v o n k o s s a 染色，观察矿化结节形成情况。对照组用未诱导的l 埘s c s 。 i 8 细胞内a l p 含量检测 取生长状态良好的第4 代细胞，接种于两个9 6 孔板内，每孔5 xi 0 3 个细 胞，分别采用普通培养基和条件培养基诱导培养，分别于第2 、4 、6 、8 d 各 取5 孔细胞裂解后，按a l p 检测试剂盒的说明进行加样操作，用分光光度计 检测各管d ( 5 2 0 r a m ) ，然后计算出a l p 的含量。 i 8 统计学方法 使用s p s s 9 0 统计软件对数据进行配对t 检验。 结果 z ，1 倒置相差显微镜观察 h m s c s 接种后，因混有少量血细胞呈混浊状态，无法分辨成分。静置培养 5 天后全量换液，骨髓中的造血干细胞随换液被清除，可见大量圆形、未完全 贴壁的单核细胞( 图1 ) ；7 天后可见个别单核细胞贴壁，变成梭形或多角形 ( 图2 ) ；9 天后变形细胞逐渐增多并连接成片，形成多个成纤维细胞集落； 1 6 天后细胞集落间互相融合成单层，胰酶消化传代后细胞均匀生长，呈长梭 形( 图3 ) 。 在传代培养中使用条件培养基，细胞增殖速度略低于使用普通培养基组。 传代培养时3 4 h 开始贴壁，6 - 8 h 贴壁完全，有数个突起，突起的个数及形态 各不相同。传代培养6 8 d 后细胞汇合成单层，细胞突起互相连接，并可重叠 生长而不发生细胞间的接触抑制现象，重叠生长的细胞逐渐形成结节状。随 后胶原堆积及钙盐沉积，最后形成不透光矿化结节。在传代培养中采用普通 培养基，细胞开始生长较快，但汇合成单层后重叠生长速度明显减慢。连续 传代培养六代以上的细胞可见胞体增大，胞质稀薄，相差显微镜下折光性减 弱等退行性改变，传至第9 1 0 代，细胞增殖速度明显减慢，并逐渐衰老死亡。 z 2m t t 法检测传代培养h m s c s 的增殖情况 图( 4 ) 2 3a l p 钙一钴染色 可见胞浆中有大量浅棕色至橡黑色细小颗粒，细胞着色程度不一，阳性 细胞平均占细胞总数的8 5 ( 图5 ) 。 2 4y o nk o s s a 染色 8 h m s c s 经诱导培养，可形成钙结节，v o nk o s s a 染色可见细胞聚集的部位 出现黑色结节( 图6 ) 。 2 5 细胞内a l p 含量检测 随着培养时间的延长，细胞内a l p 含量提高，采用条件培养基诱导组和 普通培养基未诱导组细胞的a l p 含量在不同时间点经t 检验分析( p o 0 5 ) ， 统计学差异显著( 表1 ) 。 表l 各组a l p 含量测定值( u g 蛋白，x s ) 户 0 0 5 表1 讨论 上世纪七十年代中期f r i e d e n s t e i n “1 描述了一群来自骨髓的非吞噬细胞 性粘附细胞，呈纤维样细胞外观，无论全骨髓低密度培养还是经密度梯度离 心培养均能形成源于单一祖细胞的典型集落，称为成纤维样细胞集落形成单 位( c o l o n yf o r m i n gu n i t f i b r o b l a s t ，c f u f ) 。骨髓包括造血系统和基质 系统，所以骨髓组织除含有血系细胞外，还含有骨髓基质细胞( b o n em a r r o w s t r o m a lc e l l s ，b m s c s ) 。基质细胞表现多系分化能力，可以形成多种定向分 化潜能的祖细胞，包括成纤维细胞，成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞祖细胞出。4 3 ， 所以又将其称为“间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ) ”或“骨源性干 细胞”。近来发现b m s c s 还可以分化为星形胶质细胞，少突胶质细胞与神经元。 因此，又称其为多潜能成体干细胞( m u l t i p o t e n ta d u l tp r o g e n i t o r c e l l s ，m a p c s ) 。b m s c s 还存在于骨膜和肌肉结缔组织踊“1 ，胚胎骨髓，肝脏和 血液中口1 ，但这些来源的b m s c s 比率极低，不易分离培养。不仅在新生儿并且 在成人的骨髓中存在b m s c s ，有证据表明其比例随年龄的增长而降低。实验研 究证实，人类b m s c s 的成骨能力并不因年龄的增加而降低随1 。从目前研究状况 来看，组织工程成骨要求体外支架材料上必须接种相当量的成骨细胞，一般 量要达到1 0 ”数量级。1 。因此，必须将h m s c s 体外分离培养并诱导扩增，满足 骨组织工程对种子细胞数量的要求。 目前用于分离骨髓间充质细胞的方法主要有3 种，即密度梯度离心法、 贴壁筛选法和流式细胞仪分离法。密度梯度离心法是根据骨髓中细胞的密度 不同，利用淋巴细胞分离液提取单个核细胞再进行培养。贴壁筛选法是根据 b m s c s 在培养时贴壁生长而造血细胞呈悬浮生长的特性对二者进行分离。该法 可以简化操作步骤，减少细胞损伤和污染的可能，便于今后临床应用，且细 胞贴壁增殖较离心法培养快，可能是去除造血干细胞后，影响贴壁细胞粘附 和增殖所致。另外，有研究利用流式细胞仪分离b m s c s ，分选的细胞可分化为 成骨细胞，表达碱性磷酸酶( a l p ) ，但有很多不能粘附于培养瓶，且在培养 2 4 小时后死亡，推测可能是分选操作抑制了细胞外基质蛋白及粘附分子的合 成和分选操作中的剪切力所致“。最近，e n c i n a 等“”应用免疫磁性分离法成 功地从b m s c s 中直接分离出成骨细胞，从而为b m s c s 培养开辟了一条新途径。 磁珠分选法虽然获得的细胞纯，但费用昂贵，操作复杂。b m s c s 的培养方法有 二维培养( 极低密度传代培养、低氧张力下培养) 、三维培养、静止性细胞培 养和动力性细胞培养等。三维培养具有三维立体空间结构，有利于b m s c s 的 生长，且在材料孔隙中的各个面上均能生长，更适合骨组织工程的要求。近 年发展起来的转瓶微载体培养法在细胞的大规模扩增方面有更高的应用价 值。 b m s c s 表达多种标记物，其中一些用于从众多骨髓基质粘附细胞中提取 b m s c s ，如用s t r o 一1 抗体完成c f u f 的浓缩“。免疫表型性只出现在培养扩 增的b m s c s 而不是原代细胞。b m s c s 不表达c d 3 4 、c d 4 5 和h l a d r ，强表达c d 4 4 和c d 2 9 ，扩增后的b m s c s 特征性标记物被认为是s h 一2 ，s h 一3 和s h - 4 。人b m s c s 的s h 一2 抗体识别e n d o g l i n ( c d l 0 5 ) 抗原决定簇，s h 名和s h 一4 抗体识别独特 的c d 7 3 抗原决定簇，它参与激活b 淋巴细胞“。然而，这些标记物并无决对 特异性，对分离提纯b m s c s 无影响。 1 9 8 8 年，m a n i a t o p o u l o s “们等首次报道了b m s c s 在体外可形成钙化的骨样 组织，从而证实了b m s c s 在体外可向成骨细胞分化。b m s c s 中存在两种类型的 骨祖细胞，一种不需要外源性诱导物，在体外可自动分化成骨，也被称为定 向性骨祖细胞( d e t e r m i n e do s t e o g e n i cp r e c u r s o rc e l l ，d o p c ) ；另一种是 诱导性骨祖细胞( i n d u c i b l eo s t e o g e n i cp r e c u r s o rc e l l ，i o p c ) ，需要外源 性诱导物诱导才能成骨。维生素c 、地塞米松和d 一甘油磷酸钠是最常用的成 骨诱导剂。a l l a m p a l l 等的实验证实维生素c 具有调控碱性磷酸酶活性和蛋白 合成的作用“。地塞米松可以促使b m s c s 向成骨细胞分化，具体作用机制目 前仍不清楚，有研究认为地塞米松通过增强其受体与基因组中靶序列的亲和 性从而调控分化细胞中的基因表达。但高浓度地塞米松却抑制b m s c s 增殖， 并可诱导其向脂肪细胞分化。一般认为培养基中地塞米松浓度取i 0 1 m l l 为 宜。b 一甘油磷酸钠能提供磷酸离子作为a l p 作用的底物，诱导和激活a l p ， 促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着，而且可破坏钙化抑制剂，从而启 动钙化。维生素c 、b 一甘油磷酸钠、地塞米松对b m s c s 分化为成骨细胞是十 分必要的。在地塞米松与维生素c 中培养，纯化的b m s c s 经历以碱性磷酸酶 暂时诱导、骨基质蛋白m r n a s e s 表达和钙沉积为特征的过程“。 本实验所培养的h m s c s 在相差显微镜下观察，呈梭形或多角形，具有多 个突起，并呈克隆簇样生长。a l p 是成骨细胞分化的重要标志酶之一，a l p 活 性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显，骨组织是通过骨基质 钙化而形成，而骨基质由成骨细胞所合成、分泌。在基质开始钙化时，成骨 细胞的a l p 活性最高，在钙化接近结束时，活性则最低，其活力在一定程度 上反映成骨细胞的分化程度和功能状态。从m t t 法所描绘的生长曲线表明 h m s c s 经过一段潜伏期一对数生长期一平台期后，随着细胞数量的改变，细胞的 活性则开始下降，可能是细胞发生了接触抑制的原因。本实验诱导培养的第4 代细胞在不同时间点细胞内a l p 含量较普通培养组显著增高( p 0 0 1 ) ，表 明培养的细胞具有旺盛的合成和分泌能力，对骨的钙化起着重要作用，经v o n k o s s a 染色阳性，表现出典型的成骨细胞特性。 结论 总之，在本实验条件下培养的h m s c s 具有典型成骨细胞的形态学特征和 较强的生物学活性，向成骨细胞方向分化率较高，细胞数量可以满足骨组织 工程研究的要求。目前对b m s c s 经诱导向成骨分化的机制，以及各诱导因子 发挥作用的机制仍未完全阐明“”。如何使b m s c s 既快又多向成骨细胞分化又 能控制其增殖，避免形成肿瘤，b m s c s 免疫表型及功能之间的关系是什么， b m s c s 是否来源不同功能相似，培养扩增的细胞是否保持自我更新和多系分化 潜能，解答这些问题需要对b m s c s 做更深入的研究。 参考文献 1f r i e d e n s t e i na j ，d e r i g l a s o v au f ，k u l a g i n an n ，e ta 1 p r e c u r s o r sf o r f i b r o b l a s t si nd i f f e r e n tp o p u l a t i o n so fh e m a t o p o i e t i cc e l l sa s d e t e c t e db yt h ei nv i t r oc o l o n ya s s a ym e t h o d j e x ph e m a t o l ，1 9 7 4 ， 2 ：8 3 9 2 2 c a p l a na l t h em e s e n g e n i cp r o c e s s c 1 i np l a s ts u r g ，1 9 9 4 ，2 1 ：4 2 9 3 5 3p i t l e n g e rm f ，m a c k a ya m ，b e c ks ce ta 1 m u l t i l i n e a g ep o t e n t i a lo f a d u l th u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc a l l s s c i e n c e ，1 9 9 9 ，2 8 4 ：1 4 3 7 4d e a n sr j ，m o s e l e ya b m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：b i o l o g ya n dp o t e n t i a l c l i n i c a lu s e s e x ph e m a t o l2 0 0 0 ，2 8 ：8 7 5 8 4 5n a t h a n s o nm a b o n em a t r i x d i r e c t e dc h o n d r o g e n e s i so fm u s c l ei n v i t r o c 1 i no r t h o p1 9 8 5 ，2 0 0 ：1 4 2 5 8 6n a k a h a r ah ，d e n n i sj e ，b r u d e rs p ，e ta 1 i nv i t r od i f f e r e n t i a t i o n o fb o n ea n dh y p e r t r o p h i cc a r t i l a g ef r o mp e r i o s t e a l d e r i v e dc e l i s e x pc e l lr e s ，1 9 9 1 ，1 9 5 ：4 9 2 5 0 3 7 c a m p a g n o l ic ，r o b e r t si a ，k u m a rs ，e t a 1 i d e n t i f i c a t i o no f m e s e n c h y m a ls t e m b l o o d ，1i v e r ，a n d p r o g b o n e e n i t o tc e l l si nh u m a nf i r s t t r i m e s t e rf e t a l m a r r o w b l o o d ，2 0 0 1 ，9 8 ：2 3 9 6 4 0 2 8l e s k e l ah v ，r i s t e l ij ，n i s k a n e ns ，e ta 1 o s t e o b l a s tr e c r u i t m e n tf r o m s t e mc e l l sd o e sn o td e c r e a s eb ya g ea tl a t e a d u l t h o o d b i o c h e m b i o p h y sr e sc o m m u n ，2 0 0 3 ，3 1 1 ( 4 ) ：1 0 0 8 1 3 9h a s e g a w ay ，o h g u s h ih ，i s h i m u r am ，h a b a t az ，t a m a is ，t o m i t an ，i k a d a y m a r r o wc e l l sc u l t u r eo np o l y l l a c t i ca c i df a b r i c s j c 1 i n o r t h o p ，1 9 9 9 ，3 5 8 ：2 3 5 2 4 3 l ov l a s s e l a e rp v ，f a l l an ，s n o e c k h ，e t a 1 c h a r a c t e r i z a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fo s t e o g e n i c c e l l sf r o mm u r i n eb o n em a r r o w b y t w o c o l o rc e l ls o r t i n gu s i n ga n t i s c a 一1m o n o c l o n a la n t i b o d ya n d w h e a tg e r ms g g l u t i n i n j b l o o d ，1 9 9 4 ，8 4 ( 3 ) ：7 5 3 7 6 3 1 le n c i n an r ，b i l l o t ew g ，h o f m a n nm g l a bi n v e s t ，1 9 9 9 ，7 9 ( 4 ) ：4 4 9 4 5 7 1 4 1 2g r o n t h o ss ，s i m m o n sp j t h eb i o l o g ya n da p p li c a ti o no fh u m a nb o n e m a r r o ws t r o m a lc e llp r e c u r s o r s j jh e m a t o t h e r ，1 9 9 6 ，5 ：1 5 2 3 1 3 b a r r yf p ，b o y n t o nr ，m u r p h ym ，z a i aj t h e s h 一3a n ds h 一4a n ti h o d i e s r e c o g n i z ed i s t i n c te i t o p e so n c d 7 3f r o mh u m a nm e s e n c h y m a ls t e m c e l l s j b i o p h y sr e sc o m m u n ，2 0 0 1 ，2 8 9 ：5 1 9 5 2 4 1 4 m a n i a t o p o u l o sc ，s o d e kj ，m e l c h e ra h b o n e f o r m a t i o ni nv f t r ob y s t r o m a lc e l l so b s t a i n e df r o mb o n em a r r o wo fy o u n ga d u l tr a t s j c e l l t i s s u er e s ，1 9 8 8 ，2 5 4 ( 2 ) ：3 1 7 3 3 0 1 5a l l a m p a l lk ，e ta 1 e f f e c to fa s c o r b i ca c i da n dg r o w t hf a c t o r so n c o l l a g e nm e t a b o l i s mo ff l e x o rv e t i n a c u l u mc e l l sf r o mi n d i v i d u a l s w i t ha n dw i t h o u t c a r p a l t u n n e ls y n d r o m e j jo c c u p e n v i r o n m e d ，2 0 0 0 ，4 2 ( 3 ) ：2 5 1 1 6p i t l e n g e rm f ，m a c k a ya m ，b e c ks ce ta 1 m u l t i l i n e a g ep o t e n t i a lo f a d u lth u m a nm e s e n c h y m a ls t e me e l1s j s c ie n c e1 9 9 9 ，2 8 4 ：1 4 3 1 4 7 1 7t r e m a i nn ，k o r k k oj ，i b b e r s o nd ，e ta 1 m i c r o s a g ea n a l y s i so f2 ，3 5 3 e x p r e s s e dg e n e si nas i n g l ec e l l d e r i v e dc o l o n yo fu n d i f f e r e n t i a t e d h u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sr e v e a l sm r n a s o f m u l t i p l e c e l l 1 i n e a g e s j s t e mc e l l s ，2 0 0 1 ，1 9 ( 5 ) ：4 0 8 4 1 8 附图 图1 ( 原代未贴壁h m s c s ，2 0 0 ) 图2 ( 原代贴壁h m s c s ，2 0 0 ) 图3 ( 传代h m s c s ，2 0 0 ) 图5 ( a l p 钙一钻染色，1 0 0 ) 1 7 图6 ( y o nk o s s a 染色法，4 0 0 ) 1 8 致谢 三年来，导师陈伟高教授在学习上、工作上和生活上都给与我很大的支 持，使我顺利完成了研究生学业，从一名普通的外科医生成长为一名具有高 学历的骨科医生。特别要感谢吴凯副主任医生临床上的言传身教，使我受益 匪浅。同时还要感谢二附院骨科殷明教授、廖琦教授和廖道生教授的关心与 帮助以及各科室老师、研究生部领导的关怀。感谢我的家人及同学三年来对 我的无私关心和帮助。 综述 骨髓基质细胞及诱导成骨的研究进展 研究生：李刚 导师：陈伟高 【摘要】骨髓基质细胞在体外经一定的诱导物诱导后可向成骨细胞分化，且 分离培养简单，扩增容易，成为骨组织工程种子细胞研究的热点。 【关键词】骨髓基质细胞成骨细胞 骨髓基质细胞( b m s c s ) 具有多分化潜能，近年来，组织工程中选择种子 细胞的研究方兴未艾，由于b m s c s 取材方便容易，扩增方法可靠，应用范围 广泛及成骨确定且避免了免疫排斥问题，已成为最有前途的骨组织工程种子 细胞。 1b m s c s 的生物学特性 不仅在新生儿并且在成人的骨髓中存在m s c s ，有证据表明其比例随年龄 的增长而降低。在新生儿是1 1 0 4 ，8 0 岁的老年人减至1 2 1 0 6 。实验研究 证实，人类m s c s 的成骨能力并不因年龄的增加而降低“1 。从目前研究状况来 看，组织工程成骨要求体外支架材料上必须接种相当量的成骨细胞，一般量 要达到1 0 6 。数量级乜3 。因此，必须将骨髓m s c s 体外分离培养并诱导扩增，满 足骨组织工程对种子细胞数量的要求。 1 1 b m s c s 的基本概念 上世纪七十年代中期f r i e d e n s t e i n 。1 描述了一群来自骨髓的非吞噬细胞 性粘附细胞，呈成纤维样细胞外观，无论全骨髓低密度培养还是经密度梯度 离心培养均能形成源于单一祖细胞的典型集落，称为成纤维样细胞集落形成 单位( c o l o n yf o r m i n gu n i t f i b r o b l a s t ，c f u f ) 。骨髓包括造血系统和基质 系统，所以骨髓组织除含有血系细胞外，还含有骨髓基质细胞( b o n em a r r o w s t r o m a lc e i l s ，b m s c s ) 。基质细胞表现多系分化能力，可以形成多种定向分 化潜能的祖细胞，包括成纤维细胞，成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞祖细胞“ - 6 1 。所以又将其称为“间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ) ”或“骨源 性干细胞”。近来发现b m s c s 还可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞与神 经元。因此，又称其为多潜能成体干细胞( m u l t i p o t e n ta d u l tp r o g e n i t o r c e l l s ，m a p c s ) 。b m s c s 还存在骨膜和肌肉结缔组织”“1 ，胚胎骨髓，肝脏和血 液中田1 ，但这些来源的b m s c s 比率极低，不易分离培养。 1 2 b m s c s 的分离培养方法 目前用于分离骨髓基质细胞的方法主要有3 种，即密度梯度离心法、贴 壁筛选法和流式细胞仪分离法。密度梯度离心法是根据骨髓中细胞的密度不 同，利用淋巴细胞分离液提取单个核细胞再进行培养。贴壁筛选法是根据 b m s c s 在培养时贴壁生长而造血细胞呈悬浮生长的特性对二者进行分离。该法 可以简化操作步骤，减少细胞损伤和污染的可能，便于今后临床应用，且细 胞贴壁增殖较离心法培养快，可能是去除造血干细胞后，影响贴壁细胞粘附 和增殖所致“。另外，有研究利用流式细胞仪法分离b m s c s ；分选的细胞可分 化为成骨细胞，表达碱性磷酸酶( a l p ) ，但有很多不能粘附于培养瓶，且在 培养2 4 h 后死亡，推测可能是分选操作抑制了细胞外基质蛋白及粘附分子的 合成和分选操作中的剪切力所致“。最近，e n c i n a 等“”应用免疫磁性分离法 成功地从h b m s c s 中直接分离出成骨细胞，从而为b m s c s 培养开辟了一条新途 径。磁珠分选法虽然获得的细胞纯，但费用昂贵，操作复杂。b m s c s 的培养 方法有二维培养( 极低密度传代培养、低氧张力下培养) 、三维培养、静止性 细胞培养、动力性细胞培养等。三维培养具有三维立体空间结构，有利于b m s c s 的生长，且在材料孔隙中的各个面上均能生长，更适合骨组织工程的要求。 近年发展起来的转瓶微载体培养法在细胞的大规模扩增方面有更高的应用价 值。 1 3b m s c s 的免疫表型 b m s c s 表达多种标记物，其中一些用于从众多骨髓基质粘附细胞中提取 b m s c s ，如用s t r o 一1 抗体完成c f u f 的浓缩”。免疫表型性只出现在培养扩 增的b m s c s 而不是原代细胞。b m s c s 不表达c d 3 4 、c d 4 5 和h l a d r 强表达c d 4 4 和c d 2 9 ，扩增后的b m s c s 特征性标记物被认为是s h 一2 ，s h 一3 和s h 一4 。人b m s c s 的s h 一2 抗体识别e n d o g l i n ( c d l 0 5 ) 抗原决定簇，s h 一3 和s h 一4 抗体识别独特 的c d 7 3 抗原决定簇，它参与激活b 淋巴细胞“。然而，这些标记物并无决对 特异性，对分离提纯b m s c s 无影响。 2b m s c s 向成骨细胞诱导分化 1 9 8 8 年，m a n i a t o p o u l o s 等“印首次报道了b m s c s 在体外可形成钙化的骨 样组织，从而证实了b m s c s 在体外可向成骨细胞分化。b m s c s 中存在两种类型 的骨祖细胞，一种不需要外源性诱导物，在体外可自动分化成骨，也被称为 定向性骨祖细胞( d e t e r m i n e do s t e o g e n i cp r e c u r s o rc e l l ，d o p c ) ；另一种 是诱导性骨祖细胞( i n d u c i b l eo s t e o g e n i cp r e c u r s o rc e l l ，i o p c ) ，需要外 源性诱导物诱导才能成骨。笔者就骨髓问充质干细胞向成骨细胞诱导分化有 关影响因素的研究进展作一综述。 2 1 维生素c 、地塞米松与b 一甘油磷酸钠 a l l a m p a l l 等的实验证实维生素c 具有调控碱性磷酸酶活性和蛋白合成的 作用“。地塞米松可以促使b m s c s 向成骨细胞分化，具体作用机制目前仍不 清楚，有研究认为地塞米松通过增强其受体与基因组中靶序列的亲和性从而 调控分化细胞中的基因表达。但高浓度地塞米松却抑制b m s c s 增殖，并可诱 导其向脂肪细胞分化。一般认为培养基中地塞米松浓度取1 0 8 m o l l 为宜。b 一甘油磷酸钠能提供磷酸离子作为a l p 作用的底物，诱导和激活a l p ，促进有 机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着，而且可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。 维生素c 、1 3 一磷酸甘油、地塞米松( d e x a m e t h a s o n e ，d e x ) 对b m s c s 分化为成骨 细胞是十分必要的。在地塞米松与抗坏血酸中培养，纯化的b m s c s 经历以碱 性磷酸酶暂时诱导、骨基质蛋白m r n a s e s 表达和钙沉积为特征的过程畸1 。 2 2 转化生长因子b ( t g f 一1 3 ) t g f b 是一族具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成 的生长因子。在体外培养状态下，t g f - p 对乳鼠成骨细胞作用是双向的， c e n t r a l l a 等报道在低剂量下，在细胞密度达到近于汇合或高密度培养时， t g f b 明显地促进d n a 合成，促进成骨细胞增殖；而当浓度高于1 5 n g m l 时或 细胞在低密度培养时则成骨细胞的d n a 合成受到抑制。在无血清培养条件下， t g f b 促使b m s c s 向软骨细胞转化。 2 3 碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 由成骨细胞产生，贮存在骨基质中，象自分泌旁分泌因子一样起作用。 在特定的培养条件下，b f g f 能促进骨细胞及骨样细胞增殖。有研究发现b f g f 能促使细胞内基质产生和成骨细胞的特征性基因表达。可见，b f g f 参与了局 部的骨形成。b f g f 潜在的促进细胞增殖、促进血清形成及调节成骨细胞基因 表达的作用提示b f g