（微生物学专业论文）木霉和曲霉混合发酵提高非淀粉多糖酶系活力的研究.pdf

摘要 目前，世界各国普遍开展微生物混合发酵的研究，使之得以迅速发展，尤其在纤 维素和半纤维素的分解方面具有广泛的应用。本文利用混合发酵方法对非淀粉多糖酶 系进行了研究。 首先研究了木霉和黑曲霉分别产非淀粉多糖酶系各酶的能力，然后研究了接种比 例、接种时间、碳源、氮源等因素对木霉和黑盐霉混合发酵产木聚糖酶、纤维素酶的 影响。实验结果表明，当木霉和黑曲霉按4 ：6 同时接种，以玉米芯3 7 5 9 、麸皮3 7 5 9 ， 葡萄糖3 7 5 m g 为混合碳源，m a n d e l s 营养盐1 1 5 m l 、添力i i n h 4 n 0 3 7 5 m g 为氮源，在8 4 h 产纤维素酶活力达至0 2 3 0 i u g q ：物质，木聚糖酶活力达至l j l 3 0 s l u g 干物质，与两菌纯 培养相比，纤维素酶活力提高1 6 3 ，木聚糖酶活力提高7 9 5 。 木聚糖酶和纤维素酶粗酶酶学性质研究结果显示，酶的最适反应p h 为5 0 ；在 p h 4 6 6 2 范围内稳定；木聚糖酶和纤维素酶的最适反应温度均为6 0 g 酶在4 0 及以下稳定性较好。 研究接种比例、接种时闻、碳源、氮源等因素对木霉和黑曲霉混合发酵产b 葡 聚糖酶和果胶酶的影响。当木霉和黑曲霉按7 ：3 接种，以玉米芯3 7 5 9 、麸皮3 7 5 9 、葡 萄糖3 7 5 m g 为混合碳源，m a n d e l s 营养盐1 1 5 m l 、添j j i i n h 4 n 0 3 7 5 m g 为氮源，桔皮粉 诱导物1 5 9 ，在7 2 h 产1 3 一葡聚糖酶活力为5 7 1 u g 干物质和果胶酶活力7 6 4 i u g 于物质， 与两菌单独发酵相比，葡聚糖酶活力提高1 5 ，果胶酶活力提高1 4 9 。 混合发酵产非淀粉多糖酶系各酶的动态曲线显示，当木霉和黑曲霉按4 ：6 同时接 种，以玉米芯3 7 5 9 、麸皮3 7 5 9 、葡萄糖3 7 5 m g 为混合碳源，m a n d e l s 营养盐i1 5 m l 、 添力i i n h 4 n 0 3 7 5 m g 为氮源，桔皮粉诱导物1 5 9 ，在8 1 h 产非淀粉多糖酶各酶达到产酶 高峰，本聚糖酶活力达到1 6 1 2 1 u g 干物质、纤维素酶活力达到2 6 3 i u ，g 干物质、e 葡 聚糖酶活力为7 8 i u 僖干物质、果胶酶活力7 7 8 8 i u g 干物质，与两菌纯培养相比，木聚 糖酶活力提高1 2 1 、纤维素酶活力提高1 9 9 8 、b 葡聚糖酶活力提高5 6 、果胶酶 活力提高2 0 。 在酶制剂的制备中，用6 ( p a 6 5 2 s 0 4 盐析，获得木聚糖酶和纤维素酶活 力较高。冻干酶粉木聚糖酶活力为11 6 9 i u g 干物质，得率为5 3 6 ，纤维素酶活力 为1 7 6 i o g 干物质，得率为5 3 2 ，4 0 c 干燥酶粉木聚糖酶活力为6 4 6 i u g 干物质， 得率为2 9 1 ，纤维素酶活力为7 9 i i j g 干物质，得率为2 1 3 。 关键词：混合发酵，木聚糖酶，c m c 纤维素酶，b 葡聚糖酶，果胶酶 a b s t r a c t a tp r e s e n t , t h em i x e df e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e d 、】l ，i d e l yi nt h ew o r l d ，t h i sm a d et h e m i x e df e r m e n t a t i o nr a p i d l yp r o g r e s s ，e s p e c i a l l yi nt h ed e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ea n d h e m i c e l l u l o s e t h ea r t i c l es t u d i e dt h ea c t i v i t i e so fn o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e se r t z y m e t h r o u g hm i x e df e r m e n t a t i o n f i r s t l y , t h ea r t i c l e s t u d i e dt h ep r o d u c t i v ec a p a c i t i e so fn o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s 姐z y m ef r o mt r i c h o d e r m av i r i d ea n da s p e r g i l l u sn i g e rf e r m e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y t h e n s t u d i e dt h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tf a c t o r s ，s u c h 嬲i n o c u l a t i o np r o p o r t i o n , i n c u b a t i o nt i m e ， c a r b o ns o u r c e sa n dn i t r o g e n $ o u r c e se r e ，o nt h ea c t i v i t i e so fx y l a n a s ea n dc e l l u l a s e p r o d u c e db ys o l i d - s t a t em i x e df e r m e n t a t i o no fa s p e r g i f l u sn i g e ra 3a n dt r i c h o d e r m a s p t 6 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rs o l i d - s t a t em i x e df e r m e n t a t i o no f t 6a n da 3w a sa sf o l l o w s ：t h em i x e di n o c u l a t i o no ft 6a n da 3i nt h er a t i oo f4 ：6 ，t h e m i x e dc a r b o ns o u r c e sc o n t a i n i n g3 7 5 9c o mc o b , 3 7 5 9w h e a tb r a na n d3 7 5 m gg l u c o s e a n d1 1 5 m lm a n d e l sn u t r i e n ts o l u t i o nc o n t a i n i n g3 7 5 m gn h 4 n 0 3 a t8 4h o u lm i x e d f e r m e n t a t i o nc m c a s ea c t i v i t yr e a c h e d2 3 0 i u gd r ym a t t e ra n di n c r e a s e db y16 3 ，a n d x y l a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d1 3 0 8 i u gd r ym a t t e ra n di n c r e a s e db y7 9 5 o v e rs o l i t a r y f e r m e n t a t i o no f t 6a n da 3 t h ez y m o l o g i c a lc h a r a c t e ro ft h ex y l a n a s ea n dc m c a s es h o w e dt h a tt h eo p t i m a l r e a c t i o np hw a s5 0a n dp h 4 6 6 2w a ss t e a d y ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s6 0 ，w h i l e t h eh e a ts t a b i l i t yw a sw e l lb e l o w4 0 c t h ei n f l u e n c e so f d i f f e r e mf a c t o r s s u c ha si n o c u l a t i o np r o p o r t i o n , c a r b o ns o u r c e sa n d n i t r o g e ns o u r c e sc t c ，o nt h ea c t i v i t i e so fp - g l u c a n a s ea n dp e c t i n a s ep r o d u c e db ys o l i d - s t a t e m i x e df e r m e n t a t i o no fa s p e r g i l l u sn i g e ra 3a n dt r i c h o d e r m as p t 6w e r es t u d i e d t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rs o l i d - s t a t em i x e df e r m e n t a t i o no ft 6a n da 3 w a sa sf o l l o w s ：m i x e di n o c u l a t i o no ft 6a n da 3i nt h er a t i oo f7 ：3 m i x e dc a r b o ns o u r c e s c o n t a i n i n g3 7 5 9c o r nc o b ，3 7 5 9w h e a tb r a na n d3 7 5 m gg l u c o s e ，a n d11 5 m lm a n d r e l s n u t r i e n ts o l u t i o nc o n l a i n i n g7 5 m gn h 4 n 0 3 ，1 5 9c i t r u sp e e li n d u c e r a t7 2h o u r , m i x e d f e r m e n t a t i o np - g l u c a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d5 7 i u gd r ym a t t e ra n di n c r e a s e db y1 5 ，a n d p e e t i n a s ea c t i v i t yr e a c h e d7 6 4 i u gd r ym a t t e ra n di n e r e a s e db y1 4 9 o v e rs o l i t a r y f e r m e n t a t i o no f t 6a n da 3 t h er e s u l to ft h ed y n a m i cc u r v es h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rs o l i d - s t a t e m i x e df e r m e n t a t i o no ft 6a n da 3w a s 船f o l l o w s ：m i x e di n o c u l a t i o no ft 6a n da 3i nt h e n r a t i oo f4 ：6 ，m i x e dc a r b o n8 0 u r c c $ c o n t a i n i n g3 7 5 9c o mc o b ，3 7 5 9w h e a tb r a na n d 3 7 5 m gg l u c o s e ，a n d1 1 5 m lm a n d r e l sn u t r i e n ts o l u t i o nc o n t a i n i n g7 5 m gn h 4 n 0 3 ，1 5 9 c i t r u sp e e li n d u c e r a t8 1h o u r s ，m i x e df e r m e n t a t i o nc m c a s ea c t i v i t yr e a c h e d2 6 3 i u gd r y m a t t e ra n di n c r e a s e db y1 9 9 8 x y l a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d1 6 1 2 i u gd r ym a t t e ra n d i n c r e a s e db y1 2 ，毋- g l u c a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d7 8 i u gd r ym a t t e ra n di n c r e a s e db y5 6 ， a n dp e c t i n a s ea c t i v i t yr e a c h e d7 7 8 8 i u gd r ym a t t e ra n di n c r e a s e db y2 0 o v a s o l i t a r y f e r m e n t a t i o no f t 6a n da 3 as a t u r a t i o nc o n d i t i o no fa m m o n i u ms u l f a t ea t6 0 6 5 r e s u l t e di nt h eh i g h e s t r e c o v e r yo f e n z y m e t w ok i n d so f e n z y m e sp o w e rw e r eo b t a i n e db yb o t hf r e , c z d y i n ga n d h e a t i n gd r y i n ga t4 0 ，t h ex y l a n a s er a t eo fr e c o v e r i e sa n da c t i v i t yw e r e5 3 ，戳，1 1 6 9 i u g d r ym a t t e ri nf r e e z e - d r yz y m i n a n d2 9 1 ，6 4 6 i u gd r ym a t t e ri nd r yz y m i n e ，t h ec m c a s e r a t eo fr e c o v e r i e sa n da c t i v i t yw e r e5 3 2 1 7 6 i u gd r ym a t t e ri nf r e e z e d r yz y m i n ea n d 2 1 3 7 9 i u gd r ym a t t e ri nd r yz y m i n e k e yw o r d s ：m i x e df e r m e n t a t i o n , x y l a n a s e ，c m c a s e ，p - g l u c a n a s e ，p e c t i n a s e i i i 附表和插图清单 附表清单 表2 - i 试验用仪器1 5 表3 - i 不同接种时间对固态混合发酵的影响2 5 表3 - 2 不同氮源对产酶的影响2 7 表3 - 3 不同氮源对产酶的影响3 4 表3 1 添加物对混合发酵产酶的影响3 6 表3 - 5c a c 0 3 的添加量对发酵产酶的影响3 6 表3 - 6 金属离子对产酶酶活的影响3 7 表3 - 7 木聚糖酶和c m c 纤维素酶制剂的得率和酶活力3 8 插图清单 图2 一l 半纤维素制备流程1 5 图2 - 2 木糖标准曲线1 7 图2 - 3 葡萄糖标准曲线1 8 图2 - 4 半乳糖醛酸标准曲线1 8 图3 - ia 3 在查氏培养基生长2 0 图3 - 2a 3 在坂口培养基生长2 0 图3 - 3 木霉t 6 和黑曲霉a 3 产木聚糖酶曲线2 1 图3 - 4 木霉t 6 和黑曲霉a 3 产c m c 纤维素酶曲线2 1 图3 - 5 木霉t 6 和黑曲霉a 3 产b 一葡聚糖酶曲线2 2 图3 6 木霉t 6 和黑曲霉a 3 产果胶酶曲线2 3 图3 7 接种比例对固态混合发酵产木聚糖酶和c m c 纤维素酶的影响2 4 图3 - 8 不同碳源对固态混合发酵产木聚糖酶的影响2 6 图3 啕不同碳源对固态混合发酵产c 艟c 纤维素酶的影响2 6 图3 - 1 0 优化条件下固态混合发酵产酶过程2 8 图3 - 1 1 不同p h 对混合发酵产木聚糖酶和c m c 纤维素酶活力的影响2 9 图3 - 1 z2 8 时p h 值对木聚糖酶和c m c 纤维素酶稳定性的影响2 9 图3 1 3 混合发酵木聚糖酶和c m c 纤维素酶最适反应温度3 0 图3 - 1 4 温度对木聚糖酶和c m c 纤维索酶稳定性的影响3 1 图3 - 1 5 液态酶制剂的稳定性3 2 图3 一1 6 接种比例对固态混合发酵产p 一葡聚糖酶和果胶酶的影响3 2 图3 1 7 不同碳源对固态混合发酵产b 一葡聚糖酶和果胶酶的影响3 3 图3 - 1 8 不同诱导物对产果胶酶的影响卟3 4 图3 - 1 9 固态混合发酵产酶的动态过程3 5 图3 - 2 0 不同饱和度的硫酸铵下木聚糖酶、c m c 纤维素酶和蛋白质的回收率3 8 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽 农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：塑鲻 签字日期：p 昨月 日 l i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件， 允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名：鱼垒组 签字日期：劲d 7 年- 月叩口 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：趣 签字日期：弘叼年月f 孑曰 电话：一一一一 邮编： 综述 l 非淀粉多糖的研究概况 非淀粉多糖( n o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s n s p ) 是植物组织中由多种单糖和糖 醛酸经糖苷键连接而成，大多为有分支的链状结构，常与无机离子和蛋白质结合在一 起，是细胞壁的主要成分，般难于被单胃动物分泌的消化酶所水解【i j 。目前，因n s p 结构的复杂性和命名的混淆使其没有确切的分类标准。然而，n s p 仍可分为如下三大 类：纤维素、半纤维性聚合物( 如木聚糖、1 3 一葡聚糖等) 和果胶性多糖。这些多糖存 在饲料中，严重影响了动物对的消化和利用。它们可以造成消化道食糜粘度过高和产 气过多等不利于营养物质利用的负面影响。 1 1 纤维素的结构 纤维素是植物的主要成分，占植物( 秸秆) 总干重的3 0 5 0 。纤维素分子是 由葡萄糖苷通过1 3 1 ，4 一糖苷键连接起来的链状高分子。纤维素具( c 6 h 1 0 0 5 ) 。的结构 式，其中n 为葡萄糖基的数量，称为聚合度( d p ) ，它的数值为几百至几千甚至一万以 上。植物纤维素结构复杂，基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而成，原纤维是由 1 5 4 0 根由结晶区域和无定形区域构成的纤维分子长链。纤维素的结晶区域是由纤维 素分子进行非常整齐规则的折叠排列而成的。在结晶区域里，葡萄糖分子的羟基或在 分子内部或与分子外部的氢离子相结合，没有游离的羟基存在，所以纤维素分子具有 牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入到内部中。因此，纤维素的结晶部分比无 定形部分难降解。 o c h o h f - c h ，o f 母俺。 匿l 纤维景分子结构示意圈 f - g 1t h es h m c t u r o o f c z l l u l o s c i n o l c c u i e 1 2 木聚糖结构 木聚糖是半纤维素的主要成分，它以d 木糖为糖单位，以8 1 ，4 糖苷键连接起 来并带有多种取代基的多聚木糖f 2 】。侧链上有0 一乙酰基，a 一卜呋喃阿拉伯糖，a - 1 ，2 连接的葡萄糖醛酸或者4 - 0 一甲基葡糖醛酸【3 】，其含量相当丰富，是一类可再生的重 要生物资源。自然界中的木聚糖多为异质多糖，主链和侧链糖基上有多种取代基团， 主要是乙酰基、葡萄糖醛酰基和阿拉伯糖酰基( 可进一步与香豆酸、阿魏酸等酚酸相 连) 等，同时常与纤维素结合在一起。一般木聚糖具有以下结构f 4 】： j 一“，一o l t l o ，t r h d ，e h k a g 田2 术聚话分子结构示意图 f i 辱2n e 晰i l c c i l r co f x y l a nm o l c c u l e 完全降解木聚糖需要多种酶的共同参与，其中最主要的是木聚糖酶和木糖苷酶。 木聚糖酶主要是切断木聚糖的主链生产木寡糖，丽木糖苷酶( o x y l o s i d a s o s ) 则是将 木寡糖水解成木糖。除此之外，还有一些其它酶帮助降解木聚糖的支链。 1 38 葡聚糖结构 大部分谷物都含有1 3 - 葡聚糖，大麦和燕麦中含量最高1 5 】。常见结构是由许多葡萄 糖单位通过b 一1 ，3 和1 3 1 ，4 键形成的直线结构。大麦中，1 3 葡聚糖约含有7 0 的b 1 ，4 键和3 0 的且1 ，3 键，间隔2 3 个连续的1 3 1 ，4 键就插有一个b 1 ，3 键。水溶 性p 葡聚糖通过超离心法测定的分子量范围是2 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 ，聚合度为1 2 0 0 1 8 5 0 单体。尽管混合链b 葡聚糖和纤维素都是由b 葡聚糖单位组成，但其物理特性不大 相同。1 3 - 1 ，3 键的存在改变了b 1 ，4 键主链的结构，阻止主链间的相互接近，提高了 溶解度。因此常采用永提取后再用硫酸铵沉淀的方法分离b 葡聚糖。b 葡聚糖的性 质常受提取条件的影响，高温提取的p 葡聚糖比在4 0 时提取的粘度更高。 1 4 果胶结构 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以叶1 ，4 糖苷键聚合而成的多糖键，常带 有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游历羧基部分 或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起【6 】。它存在于所有的高等植 物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、 木质素的微纤维以及某些伸展蛋白1 7 1 ，相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出 固有的形态。果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同， 2 其大致的结构如图，可分为光滑区和须状区两部分，主要由h c 遗、r g i 和l 砸一i i 三个 结构区域构成，其中r g i i 常以二聚体的形式存在，同其它植物多糖一样，果胶也是多 圈3 果胶的缩构衙围 f i g 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ep r i m a r y s t r u c t u r eo f p e d i m s 1 5 非淀粉多糖在饲料原料中的含量 常见饲料中的非淀粉多糖主要是阿拉伯木聚糖、1 3 一葡聚糖和纤维素。谷物中含 有少量果胶多糖，除大米外，其他植物中均未发现。玉米和高粱中含有少量的非淀粉 多糖，燕麦和大麦中的水溶性非淀粉多糖主要是1 3 一葡聚糖。谷物副产品含有大量的 细胞壁成分，如米糠含有大约2 0 2 5 的非淀粉多糖，主要是等量的阿拉伯木聚糖和 纤维素。 襄1n s p 在常用饲料原料中的含量恤9 1 “1 1 t a b 1c o n t e n to f n s pi nc o l n f i o l lf e e d s m i t s 2 非淀粉多糖酶的种类及其作用机理 2 1 种类 非淀粉多糖酶主要包括纤维素酶、木聚糖酶、p 一葡聚糖酶、果胶酶等。 2 2 各种酶的概况及其作用机理 2 2 1 纤维素酶 纤维素酶是降解纤维素1 3 1 4 糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素 复合物之称。通常包括c l 酶、c x 酶和p 葡萄糖苷酶。一般规律，c 1 酶主要作用于天然 纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素，对结晶纤维素( 如棉花和微晶纤维素) 无活性， 但可水解非结晶纤维素和可溶性底物( 如羧甲基纤维素钠) ，纤维低聚糖也是其底物， 其水解速率随链的加长而加快。c x 酶又可分为c x i 酶和c 采2 酶，c x l 酶从水合非结晶纤 维索分子内部作用于d 1 ，4 糖苷键，生成纤维索糊精和纤维二糖；c x 2 酶从水合非结 晶纤维素分子的非还原性末端作用于b 1 ，4 葡萄糖苷键，每次切下一个纤维二糖分 子。b 葡萄糖营酶，又称纤维二糖酶，它作用于纤维二糖，生成葡萄糖【l2 1 。这些酶协 同作用可将纤维素彻底降解为还原糖葡萄糖。纤维索酶的多形式、分子量差异的主 4 要原因是多数真菌和少数细菌的纤维素酶都有糖基化1 1 3 。糖基与蛋白质之间以共价键 结合，或星可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解。 纤维素酶由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间有差异。尽管不同来 源纤维素酶分子量差别很大，但其催化区的大小却基本一致，活性位点的三级结构都 是保守的【1 4 1 。其酶催化效率高，比一般酶高1 0 6 1 0 7 倍；酶的催化反应具高度专一性， 酶对其作用底物有严格选择性，催化反应条件温和，酶催化活力可被调节控制，无毒 性。 2 2 2 木聚糖酶 木聚糖酶类是专一降解木聚糖的一种复合酶，主要是由1 3 - l ，4 - d 内切木聚糖酶 ( e c3 , 2 ，1 ，8 ) 、p 1 , 4 * d 一外切木聚糖酶和p - 木糖苷酶( e c3 , 2 ，1 ，3 7 ) 组成【”j ，此外还有一 些脱支链酶，如a - b 呋哺型阿拉伯糖苷酶、a - d 葡萄糖醛酸酶、乙酰基酶和阿魏酸 基酶、香豆基酶等参与降解木聚糖的支链。其中内切争l ，4 木聚糖酶和外切p 木糖 苷酶是降解木聚糖的主要参与者，在这两种酶的共同参与下促进木聚糖的降解。一般 来说，前者从木聚糖的主链内部作用于木糖苷键，将大分子的木聚糖降解成寡聚木糖、 木二糖及少量的木糖：而后者作用于木二糖或者木寡糖的末端释放出木糖残基【1 6 】。木 聚糖酶主要产物为木二糖【l 7 】以及木二糖以上的寡糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖，该 酶可以由细菌 t 8 , 1 9 , 2 0 ，2 1 , 2 3 1 、霉菌 2 4 , 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 j 1 1 、放线菌 3 2 , 3 3 , 3 4 】和酵母菌3 5 】产生。 木聚糖酶与纤维素酶同属于诱导酶，研究结果表明，这两种酶的诱导调控机制存 在着一定的差别【3 6 1 。到目前为止，还没有文献明确木聚糖酶的合成机制。b i e l y 等【3 ”， 1 9 9 5 年提出真菌木聚糖酶合成的调控机制与纤维素酶的相似，通过木聚糖酶合成的 专一性诱导，可以合成不含纤维素酶的木聚糖酶。木聚糖酶生物合成需要诱导物，这 些诱导物可以是木聚糖、木聚糖的水解物和人工合成物质( b 一甲基木糖苷等) 。当这 些物质低量加入到培养基中，就会促进微生物木聚糖酶的生物合成。但是，天然的木 聚糖水解产物可以被进一步水解成终产物木糖，木糖对微生物木聚糖酶的合成有阻遏 作用。这种酶的诱导物和阻遏物的相互作用，为木聚糖酶的诱导作用阐明增加了一定 的难度。 2 2 3b 葡聚糖酶 p 葡聚糖酶属于水解酶类，它主要包括四种酶，即内p 1 ，3 葡聚糖酶 c 3 2 1 3 9 ) ，内b 1 ，4 葡聚糖酶c 3 2 1 7 3 ) ，外1 3 1 ，3 葡聚糖酶( e c 3 2 1 5 8 ) ， 外p 1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 4 ) ，对水解谷物中的p 葡聚糖具有重要的作用【3 s 】。啤 酒生产过程中，添加p 葡聚糖酶制剂，可使p 葡聚糖分解，降低糖化醪的粘度，使麦 芽的内溶物迅速浸出，同时加快麦汁过滤速度，缩短麦汁澄清时间，提高麦汁收得率 和生产效率，改善麦汁的合理组成，增加啤酒产量并改善啤酒的质量 3 9 , 4 0 , 4 1 。b 葡 聚糖是谷物饲料的一种普遍存在的抗营养因子，饲料中添加b 葡聚糖酶，降低消化道 5 内容物粘度，有效地改善单胃动物对营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，而且饲 料消化彻底也可以减少排泄物对环境的污染，有利于环境控制和疫病防治【4 2 , 4 3 , 4 4 l 。 2 2 4 果胶酶 果胶酶是分解果胶的酶的通称，也是一个多酶复合物，它通常包括原果胶酶、果 胶甲酯水解酶、果胶酸酶三种酶。这三种酶的联合作用可使果胶质得以完全分解。天 然的果胶质在原果胶酶作用下，被转化成水可溶性的果胶：果胶被果胶甲酯水解酶催 化去掉甲酯基因，生成果胶酶；果胶酸酶切断果胶酸中的a 1 ，4 糖苷键，生成半乳糖 醛酸，半乳糖醛酸进入糖代谢途径被分解放出能量。工业生产果胶酶的菌种主要是霉 菌，常用菌种有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、自腐核菌、米曲霉、酵母等，此外木 质壳霉、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、葡萄孢霉、镰刀霉也能产生果胶酶。果胶酶被广 泛应用于工业生产，以黑曲霉最具代表性，因为黑曲霉是公认的安全菌株( o r a s ： c r e n e r a l l yr e g a r d e d a ss a f e ) 。其代谢产物是安全的，并且黑曲霉分泌的酶系比较全【4 5 】。 目前，饲料工业中果胶酶多用于提高青贮饲料的品质。 2 3 非淀粉多糖酶的作用机理 2 3 1 降解n s p ，降低小肠内容物的牯度 n s p 的高粘稠性是影响单胃动物肠道功能的主要因素。研究表明，添加n s p 酶制 剂后，可降解臼粮中的n s p ，使之失去粘稠性，从而使食糜在消化道内更易于转运， 加速了排空速度和营养物质的吸收利用，结果使动物采食量增加，表现代谢能提高， 养分从粪便中的浪费减少，日增重提高，料重比下降。 2 3 2 提高内源性消化酶活性 在富含n s p 的饲粮中相应地添加一定量的n s p 酶，能激活内源酶的分泌，提高内 源性消化酶的活性，也能克服幼年动物由于内源酶产生不足所引起的消化不良。王振 来m 】在对仔猪的试验发现。酶制剂提高肠内容物中的总蛋白水解酶、淀粉酶和脂肪酶 的活力。高宁国等1 4 7 报道，在以大麦为主的肉鸭日粮中，添加b 葡聚糖酶为主的酶制 剂，2 1 日龄时，使食糜上清液的淀粉酶活力提高7 5 。 2 3 3 减少有害菌的繁殖 n s p 酶制剂的添加可以降低养分在肠道的蓄积，从而改变肠道微生物菌群生长繁 殖的环境，减少有害菌的繁殖，并能使肠壁变薄，改善营养物质的吸收，同时可降低 胆汁盐的早期解离，有助于脂肪的消化。另外，肠道内有害微生物的减少可以降低畜 禽的腹泻率，减少疾病的发生，有利于畜禽的健康生长。 2 3 4 破坏细胞壁结构 通过在日粮中添加相应的n s p 酶制剂，分解破坏细胞壁结构，从而使细胞中的养 分更有效地被消化利用。另外，多糖的降解可以使与之相结合的蛋白质、淀粉和脂肪 游离出来，有利于营养物质的消化，从而提高养分的可利用率。 6 2 4 非淀粉多糖酶制剂的应用效果 国内外的研究表明，在饲料中添加一定量的非淀粉多糖酶制剂能够提高营养物质 的生物利用率，进而提高动物的生产性能，减少废物的排出；同时也可改善胴体品质， 减少胴体脂肪，并能提高动物的抗病力，降低腹泻的发生。据报道【4 8 9 5 0 1 ，含高活性 纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的复合酶制剂已经用于提高饲料的营养价值，汪敬等 【5 l 】报道，对2 3 3 8k g 和3 8 5 7 k g 生长肥育猪添加木聚糖酶试验，加酶组试验全期日 增提高8 1 。饲料转化率提高4 3 。每公斤增重饲料成本降低了3 2 。王健鹏【5 2 】等 报道，饲用酶制剂可改善肌肉的品质，增加蛋白质含量。但是这方面的报道并不一致 【5 3 , 5 4 5 5 , 5 6 。也有人尝试克隆纤维素酶和木聚糖酶基因，从而获得转基因动物，这样就 可以将所需酶类分泌到胃肠道，促进饲料的消化率口7 堋。添加n s p 酶制剂是改善小麦、 大麦、黑麦、次粉、麸皮等饲用价值，提高其利用率，对饲料资源的开发利用有重要 的意义。 3 混合发酵的研究概况 3 1 混合发酵简介 混合发酵( m i x e df e r m e n t a t i o n ) - - 般是指两种或两种以上的微生物发酵，如最常见 的利用纤维素进行发酵，又叫做同时糖化一发酵法( s s f ，s i m u l t a n e o u ss a c e h a r i f i e a t i o n a n df e r m e n t a t i o n ) 或水解一发酵并行法( c h f ，c o m b i n e dh y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o n ) 。 其底物常采用自然界中存在的纤维素类物质，如玉米秸杆、糠类、酒糟等废弃物，产 物则一般是饲料蛋白、食品和一些化合物( 如乙醇、氨基酸等) 。两种或两种以上的微 生物发酵作用常在发酵期间发生微生物之间的相互关系改变【5 9 1 ，有可能从互惠共生作 用转变为相互竞争嘲】，也有可能优势互补，相辅相成起到单一菌株起不到的作用t 6 1 1 。 3 2 影响混合发酵的因素 微生物发酵的生产水平不仅取决于菌种本身的性能，还取决于营养物质的组成和 合适的环境条件，这样才能使其生产能力充分表达出来。为此，我们需要了解目标菌 种对营养和环境条件的要求，如p s 值、温度、接种顺序、接种量比例、c 、n 源、氧 的需求、搅拌器等。以下对混合发酵中较重要的几个影响因素作一综述。 3 2 1 混合系统中各微生物之闻的相互关系 混合发酵区别于一般微生物发酵的主要不同之处在于该体系由两种或多种微生 物组成，其中一种微生物为另一微生物提供营养来源或互相提供营养，有的情况下后 者还可以通过利用这些产物为前者解除了降解物造成的抑制，从而组成一个使体系中 的各微生物和谐共生的微环境，这对于微生物在利用一些比较难于利用的底物时尤其 有利。m u r r a y 6 2 等对混合培养肋c t e r o i d e sc e l l u l o s o v e l 和c l o s t r i d i u ms a c c h a r o l y t i c u m 分解纤维素进行研究发现，前者分解纤维素为后者提供碳源，后者则可以通过利用前 者产生的有毒中间产物来解除对前者的反馈抑制。 7 3 2 2 温度 在混合发酵中，有时过程中所需酶的最佳温度和产生终产物的温度不一致，这就 需要确定二者的折衷温度。比如在混合菌发酵乙醇时，纤维素酶的最佳温度是5 0 ， 而乙醇发酵的最佳温度是3 0 c ，有人确定在t r i c h o d e r m as p 和s c e r e v i s i a e 的乙醇混 合发酵体系中最佳温度为4 0 * ( 2 6 3 1 。不同酶制剂的最适反应温度不同，但畜禽消化道 温度通常在4 0 ( 2 左右，因而在测定n s p 酶活力时，大多数学者选择4 0 5 0 为测定温 度。 3 2 3 p h 值 混合发酵中有时可以通过间接但方便的途径来控制p h 值，而且由于一些x r j p h 值 有影响的中间产物维持在一个较低的浓度水平，p h 值会比较恒定。s h i m i z u 等1 6 4 1 用乳 酸乳球菌和克鲁维酵母混合培养系统生产乳链菌肽，前者的加入就是为这种特殊的 p h 值控制提供途径。因为培养基的p h 值可被克鲁维酵母的乳酸消耗控制，而克鲁维 酵母的特殊乳酸消耗又可通过改变溶解氧( d o ) 浓度来控制，这样p h 值的级联控制就 与溶解氧( d 0 ) 的控制相联系。而且因为乳酸水平保持低浓度，该法保持p h 值恒定， 同时培养基中积累的乳链菌肽保持高水平。此外，f a n g 和l j u l 6 5 】还研究了在一混合发 酵细菌培养物中p h 对葡萄糖到氢的转化过程中的影响。该体系中9 0 以上的葡萄糖 在p h 4 0 7 0 的范围内被降解，随着p h 的升高，细菌群落中的种类增多。有报道m j 认为，由于小肠是营养物质消化吸收的主要部位，食糜停留的时间也较长，因此p h 值在选择时应尽可能地接近小肠的p h 值。 3 2 4 接种顺序 与其它普通的发酵不同，微生物的混合发酵中需要注意不同菌的接菌次序，如前 所述，这关系到微生物之间利用代谢产物的问题。徐坚平等【6 7 】发现，在纤维素上接种 绿色木霉9 6h 后再接种产朊假丝酵母，混合培养后，产物中蛋白的含量达5 3 以上， 胡纯铿等1 6 8 】混合培养发酵l 苹果酸也有固定的接菌顺序，即先接无根根霉a - 2 3 ，3 d 后再接普通变形杆菌v 8 l 培养2 d ，产酸水平最高，达7 3 3g l - 1 。 3 2 5 接种量比例 混合发酵中不同菌株的接种量比例关系到在共生系统中每一种微生物的生长密 度和速度，从而影响整个混合发酵的产物组成。王克明【删报道多菌种混合发酵糯米生 产稠酒的根霉：酿酒酵母：产香酵母：红曲霉配比量为3 ：1 ：2 ：l 。王德培掣7 0 i 报道了酵母 菌和里氏木霉混合发酵秸杆提高其粗蛋白含量的最优接种量比例为l ：4 。尹光琳等( 7 l 】 在生产2 k l g 时也强调掌握好两株菌的比例是获得最佳产物的关键之一。 3 3 混合发酵的微生物组成 混合发酵中涉及到的微生物组成种类繁多，可以分为细菌与细菌、细菌与真菌、 真菌与真菌等几种方式。这几种组成的应用方向大致相同，主要有利用纤维素、降解 8 环境污染物、生产单细胞蛋白等方面，具体组成和应用见表2 。 囊2 混合发酵中涉及到的微生物种类组成和应用嗍 t a b2m i c r o b i o l o g ys p e c i e sc o m p o s i t i o na n d a p p l i c a t i o ni nt h em i x e df e n n e n t a t l o n 微生物组成应用 a r t h r o b a c t e r s t r e p l o m y e e s p s e u d o m o n a s 3 l l t e r l ，p e e u d a n o n a s a 州n a s a p e n e c l l l i u m p i a c a r f u m , g e o t r i c h u mc a b d i d u m p s e u d o m i n a s s p , a l e a l i g e n e s 甲 t h d o b a c i u u 5 ，t h i o b a e i l l u si n t e r m e d i u a , a n h r o m a e rs p p s e u d o m o n a ss p a z o t o b o as p x a n t h r o n v a n a ，a p ，p l e s i o m o n e a a p b a e t e r o i d e sc e l l u l o s o l v e n a ，c i o s t r i d t u m s a e c h a r a l y a e u m c