（遗传学专业论文）scap超表达对细胞脂代谢的影响及其相关可能机制研究.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 1 ) 1 1 11 1i l l l11i ii i ij ) l l y 17 310 4 1 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：主堡要l 日期：2 丛生二_ 牟 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 目录 英汉缩略语名词对照1 中文摘要4 英文摘要6 论文正文：s c a p 超表达对细胞脂代谢的影响及其相关可能机制研究。9 前言”9 第一部分s m 2 2 启动s c a p 真核表达质粒的构建及鉴定”1 3 1 实验材料”1 4 2 试验方法。1 7 3 试验结果”2 9 4 对论3 4 第二部分s c a p 超表达对脂代谢的影响及其机制研究3 5 1 实验材料”3 6 2 试验方法4 0 3 试验结果5 1 4 讨论6 1 参考文献“6 3 文献综述6 7 致谢7 7 攻读学位期间发表论文目录一7 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 一 英文缩写 a 2 6 0 a 2 8 0 a 咿 a s b p b s a c d n a c h o d m s o d n a e d l a e c l e r f b s h m g c o a h r p h m c s i n s i g k b k d a 英汉缩略语名词对照 英文全称 中文全称 a b s o r b a n c ea t2 6 0 n ma 2 6 0 处吸光度 a b s o r b a n c ea t2 8 0 n m a m p i c i l i n a t h e r o s c l e o s i s b a s ep a i r b o v i n es c r t l ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y n u c l e i c a c i d c h i n e s eh a m s t e ro v a r y d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y n u c l e i ca c i d e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m f e t a lb o v i n es e r u m 3 - h y d r o x y 3 m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m ea r e d u c t a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h u m a n m e s a n g i a lc e l l s i n s u l i ni n d u c e dg e n e k i l o b a s e k il o b a s e a 2 8 0 处吸光度 氨苄青霉素 动脉粥样硬化 碱基对 牛血清白蛋白 互补脱氧核糖核酸 中国仓鼠卵巢( 细胞) 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 乙二胺四乙酸 电化学发光 内质网 胎牛血清 羟甲基戊二酸单酰辅 酶a 辣根过氧化物酶 人肾小球系膜细胞 胰岛素诱导基因 千碱基 千道尔顿 l b l u c l d l r m g m l n m l m i 斟a m m n g o d p b s p b s t p c r p a g e r n a r p m r t s c a p s r e b p s l 迮 l u r i a b e r a n i ( m e d i u m ) i u c i f e r a s e 养基 l b 培养基 荧光素酶 l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r 低密度脂蛋白受体 m i l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r 毫克 分钟 毫升 m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 信使核糖核酸 m m o l l n a n o g r a m o p t i c a ld e n s i t y 毫摩尔升 纳克 光密度 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ew i t h 0 0 5 t w e e n 一2 0 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s r i b o n u c l e i ca c i d r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n s r e b pc l e a v a g ea c t i v a t i n g p r o t e i n s t e r o l r e g u l a t o r ye l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n s t e r o l r e g u l a t o r ye l e m e n t 2 磷酸盐吐温缓冲液 聚合酶链反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 核糖核酸 每分钟转速 逆转录 s r e b p 裂解激活蛋白 固醇调节元件激活蛋 白 固醇调节元件 重庆医科大学硕士研究生学位论文 s s d s t a e t a q s e c o n d 秒 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 t r i s a c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i s b u f f e r t h e r m u s - a q u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e 3 t r i s 乙酸电泳缓冲液 耐热d n a 聚合酶 重庆医科大学硕士研究生学位论文 s c a p 超表达对细胞脂代谢的影响及其相关 可能机制研究 摘要 细胞内胆固醇主要来源有两种途径，包括外源性胆固醇摄入和内 源性胆固醇合成，它们均通过一个依赖于细胞内胆固醇水平的反馈调 节系统的严密控制来保证胆固醇的内稳态平衡，即主要通过 s c a p s r e b p 2 l d l 棚m g c o ar e d u c t a s e 通路实现对细胞内脂质稳态 平衡的调节。s r e b p 2 是一个绑定在内质网膜和核膜的含三区域的蛋 白。s r e b p 2 的n h 2 末端是一个转录因子，它与一个多基因编码酶的 启动予区域内的胆固醇调节元件相结合，而这一多基因编码酶在胆固 醇合成和胆固醇摄取中起着决定作用。s r e b p s 的n h 2 末端区域的蛋 白水解是相继进行的，蛋白酶裂解s r e b p s 是由s r e b p 裂解激活蛋白 ( s c a p ) 所激活的。s c a p s r e b p 复合物在细胞内胆固醇下降时会 产生。s c a p 有一个胆固醇敏感区域，在细胞内胆固醇水平增加的时 候，能抑制复合物的形成，从而形成一个负反馈环。 目的为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白( s i 垣b p ) 的 裂解激活蛋白( s c a p ) 超表达转基因小鼠，深入探讨s c a p 的功能， 本实验构建了由平滑肌特异蛋白s m 2 2 启动子( p s m 2 2 ) 启动仓鼠 s c a p4 4 3 位点突变体s c a p ( d 4 4 3 n ) 的真核表达质粒，并在仓 鼠卵巢细胞( c h o ) 、肾系膜细胞( h m c l ) 、血管平滑肌细胞( v s m c s ) 上验证其表达及功能。 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 方法1 利用巢式p c r 从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得 到p s m 2 2 基因，利用p c r 从p t k h s v - s c a p ( d 4 4 3 n ) 质粒中扩增 出s c a p ( d 4 4 3 n ) 后构建真核表达质粒p c d n a - s m 2 2 - s c a p ( d 4 4 3 n ) 。 2 采用两周龄胎鼠制备原代培养的v s m c s 。 3 转染p c d n a s m 2 2 - s c a p ( d 4 4 3 n ) 真核表达质粒分别至c h o 细胞、h m c l 细胞、v s m c s 细胞，验证质粒的表达及功能。用酶学 法分别检测细胞内总胆固醇( t c ) 水平；油红o 染色观察细胞内脂质 积聚情况；提取细胞总r n a ，应用实时荧光定量p c r 技术( r e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep c r ) 检测l d l r 、s r e b p 2 、s c a p 、h m g c o a 水平；用 w e s t e r nb l o t t i n g 法检测l d l r 、s r e b p 2 和s c a p 、h m g c o a 蛋白表达 水平。 结果1 成功构建了真核表达质粒p t k h s v - s c a p ( d 4 4 3 n ) 。 2 原代v s m c s 制备成功。 3 s c a p 过表达能够增加细胞s r e b p 2 、l d l r 及h m g c o a 的 m r n a 的表达及蛋白表达。即使在高浓度胆固醇水平下，上述基因的 合成仍然增加。通过油红o 和胆固醇测定发现s c a p 过表达能增加细 胞内的脂质积聚。这一现象打破了l d l r 的生理性负反馈调节，进而 促使了泡沫细胞的形成。 关键词：启动子，s r e b p 裂解激活蛋白，质粒构建，过表达，低 密度脂蛋白受体 c o n s t r u c t l o no fp c d n a s m 2 2 一s c a p ( d 4 4 3 n ) e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r a n di t s l n v e s t i g a t l o no ff u n c t i o n a b s t r a c t c h o l e s t e r o li sd e r i v e df r o mt w op a t h w a y s ，o n ei st h eu p t a k eo fp l a s m a v i al d lr e c e p t o r ( l d l r ) m e d i a t e de n d o c y t o s i s ，a n dt h e o t h e r i sf r o m c e l l u l a rs y n t h e s i s i nt h ep a t h w a yo fc h o l e s t e r o ls y n t h e s i s ，h m g c o a r e d u c t a s ei st h ei m p o r t a n tr a t e 1 i m i t i n ge n z y m e e i t h e rh m g c o a r e d u c t a s e o rl d l ra c t i v i t yi su n d e rc o n t r o lv i aaf e e d b a c ks y s t e mt h a t i sd e p e n d e n to n i i l t r a c e l l u l a rc h o l e s t e r o lc o n c e n t r a t i o n s r e b p 2i s at h r e e - d o m a i np r o t e i n t h a ti sb o 咖dt om e m b r a n e so ft h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u ma n dt h en u c l e a r e n v e l o p e t h en h 2 t e r m i n a ld o m a i no fs r e b p 2 i sat r a n s c r i p t i o nf a c t o r t h a tb i n d st os t e r 0 1 r e g u l a t o r ye l e m e n tf o u n di np r o m o t e r so fm u l t i p l e g e n e se n c o d i n ge n z y m e sc r u c i a li n s t e r o lb i o s y n t h e s i sa n d s t e r o lu p t a k e p r o t e o l y r i c r e l e a s eo ft h en h 2 t e r m i n a ld o m a i no ft h e s r e b p si s p r o c e s s e db ys e q u e n t i a lc l e a v a g e s t h ep r o t e a s e s c l e a v i n gt h es r e b p s a r e a c t i v a t e db ys r e b p c l e a c a g e a c t i v a t i n gp r o t e i n ( s c a p ) s c a p - s r e b p c o m p l e x e sa leg e n e r a t e dw h e ni n t r a c e l l u a r s t e r o l l e v e l sa r ed e c r e a s e d s c a ph a r b o u r sas t e r 0 1 s e n s i n gd o m a i nt h a t ，u p o ni n c r e a s e dl e v e l so f c e l l u l a rc h o l e s t e r o l ，i n h i b i t sc o m p l e xf o r m a t i o n ，t h u sc r e a t i n gan e g a t i v e f e e d b a c kl o o p o b j e c t i v e ：t h ee x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o n o fs r e b pc l e a v a g e a c t i v a t i n gp r o t e i n ( s c a p ) m u m n t ( d 4 4 3 n ) b y c o n s t r u c t i n ga ne u k a r y o t i ce x p r e s s i v e v e c t o ru s i n gas m o o t h m u s c l e 6 0i_rilfi j 墅型坠堂堡主堡壅竺兰篁丝兰 s p e c i f i cp r o m o t e r s m 2 2 ( p g l 3 一s m 2 2 s c a p ( d 4 4 3 n ) ) t h ee 脆c to f s c a pg e n e o v e r e x p r e s s i o no nl i p i dm e t a b o l i s mw e r ei n v e s t i g a t e d i j l c h o ，h m c la n dv s m c s m e t h o d s ：1 s m 2 2p r o m o t e r ( p s m 2 2 ) a m p l i f i e df r o mg e n o m ed n a o fm i c eb yn e s t e dp c r ，a n ds c a p ( d 4 4 3 ) m u t a n t a m p l i f i e df r o mp l a s m i d p t k - h s v - s c a p ( d 4 4 3 n ) w e r ec l o n e di n t o p c d n a 3 1t oc o n s t l l l d p c d n a s m 2 2 一s c a p ( d 4 4 3 n ) 2 p r i m a r yc u l t u r ev s m c sw a sp r o d u c t e db yt w ow e e k sm i c e 3 w ed e t e c t e dt h ee x p r e s s i o na n df u n c t i o no f p l a s m i db yt r a n s f e c t e d i ti n t oc h o ，h m c la n dv s m c s i n t r a c e l l u l a rc h o l e s t e r o lc o n t e n t m r n a a n dp r o t e i ne x p r e s s i o no f s c a p ，s r e b p 2 ，l d l ra n dh m g c o ar e d u c t a s e mt h et r e a t e dh m c sw e r ea s s e s s e db yo i lr e do s t a i n i n g ，c h o l e s t e m l e n z y m a t ma s s a y ，r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i n i e a c t i o n w e s t e r nb l o t i n ga n a l y s i s ，i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e s t r e s u l t s ：1 r e c o m b i n a n tp c d n a s m 2 2 - s c a p ( d 4 4 3 n ) w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d 2 p r i m a r yc u l t u r eo fv s m c sw a sc o m p l e t e d 3 w e d e m o n s t r a t e d t h a ts c a p o v e r e x p r e s s i o n e n h a n c e d t r a n s f o r m a t i o no fh m c si n t o f o a mc e l l s b yi n c r e a s i n g u p t a k eo f u n m o d i f i e dl d lv i al d l ra se v i d e n c e d b yo i lr e do s t a i n i n ga n dd i r e c t a s s a yo fi n t r a c e l l u l a rc h o l e s t e r 0 1 l d l d e c r e a s e d l d l r , s r e b p 2 ， h m g c o am r n aa n dp r o t e i n e x p r e s s i o na tp h y s i o l o g i c a lc o n d i 缸o n h o w e v e r , s c a po v e r e x p r e s s i o ne n h a n c e dl d l re x p r e s s i o n ，o v 嘶d i n g t h es u p p r e s s i o no fl d l ri n d u c e db yl d l a n d i n a p p r o p r i a t e l yi n c r e a s i n g l d lu p t a k e s c a po v e r - e x p r e s s i o no fm r n a a n dp r o t e i no fh m g c o a a n ds r e b p 2 t h e s eo b s e r v a t i o n s i n d i c a t et h a ts c a po v e r e x p r e s s i o n d i s r u p t sc h o l e s t e r o l - m e d i a t e dl d l rf e e d b a c k r e g u l a t i o n ，p e r m i t t i n g 7 i n t r a c e l l u l a ra c c u m u l a t i o no fu n m o d i f i e dl d la n dc a u s i n gf o a mc e l l f o r m a t i o n c o n c l u s i o n ：t h ep g l 3 一s m 2 2 一s c a p ( d 4 4 3 n ) e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o rw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n dt h er e c o m b i n a n tv e c t o rp r o v i d e sa p o w e r f u la p p r o a c hi ni n v e s t i g a t i n gt h ef u n c t i o na n dr e g u l a t i o no fs c a p a n da l s oi np r o d u c i n gv a s c u l a rs m o o t hm u s c l es p e c i f i cs c a pt r a n s g e n i c m i c e t h e i m p l i c a t i o no ft h ep l a s m i d f u n c t i o n f i n d i n g si s t h a tl i p i d a c c u m u l a t i o ni nc e l l sm a yb ec a u s e db ys c a po v e r e x p r e s s i o n k e yw o r d s ：p r o m o t e r , s r e b pc l e a v a g e - a c t i v a t i n gp r o t e i n ，p l a s m i d c o n s t r u c t i o n ，o v e r e s p r e s s i o n ，l o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r 8 -r 重庆医科大学硕士研究生学位论文 s c a p 超表达对细胞脂代谢的影响及其相关 可能机制研究 前言 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是心脑血管疾病的基础病理学改变， 也是严重影响人类健康的重大疾病之一。血脂代谢紊乱，特别是血浆胆固醇水平 异常增高，是目前公认的导致动脉硬化、心血管疾病发病率明显增加的最危险的 原因之一。 人们对血脂代谢异常与动脉硬化相关性的认识主要来源于对高脂血症动物 模型以及高脂血症人群的研究。大量的病理学和循证医学的证据表明：胆固醇能 促进富含脂质的泡沫细胞的形成，并沉积在动脉血管壁从而形成动脉粥样硬化斑 块；降低血胆固醇能有效的降低动脉硬化的风险，这些研究充分地让人们相信： 血胆固醇水平的高低能充分的反映出动脉硬化发生的危险度，血胆固醇浓度越高， 病人心血管疾病的风险也就越高。然而，这些研究都忽视了一个事实：所有的临 床研究在病例选择上存在有明显的局限性，比如：将正常血脂者排斥在研究对象 以外，而实际上临床有许多动脉硬化患者并没有明显的高脂血症；而且几乎所有 用于动脉硬化研究的模式动物均是使用高脂血症模型。 目前已有大量的证据表明：虽然胆固醇在动脉硬化的发生发展中起重要作用， 但血胆固醇水平并不与动脉粥样硬化的程度成正相关性1 一，另外，患有其它慢性 炎症性疾病人群，比如慢性肾脏疾病，糖尿病，自身免疫性疾病等，这些患者血 胆固醇水平也不高，但心血管疾病的风险比正常人群要高3 0 - 5 0 倍5 ，说明血胆 固醇水平与主动脉和冠状动脉组织内的胆固醇浓度没有明确的相关性。再者，在 动脉硬化的发生中，存在着多种危险因素，比如炎症反应，高血压，吸烟等等， 然而，目前的高脂血症小动物( 鼠) 模型，在病理生理研究上，不能有效的用于评 估独立于高胆固醇血症之外的危险因子。在诊断上，由于单纯的血胆固醇水平( 尤 其在慢性炎症状态下) ，并不与动脉硬化的程度成正相关，因此血脂的水平不能作 为评估心血管疾病动脉硬化的风险的指标，也不能用来有效的评估抗动脉硬化药 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 物的临床疗效。因此，需要一种新的模式动物来研究动脉硬化的发病机理和研发 一种新的比单纯血脂测量更准确的检测方法来进行独立于高胆固醇血症之外的危 险因子的评估。 更为重要的是，新的模式动物也是新型抗动脉硬化药物的研发的需要。虽然 目前他汀类药物在一般人群中，能降低血浆中胆固醇达3 0 - 5 0 ，并能有效的降低 2 7 的心血管的发病率，然而在患有慢性炎症性疾病如糖尿病，慢性肾脏疾病的患 者中，他汀类药物的心血管保护作用却受到质疑。最近一个名为4 d 的一个大规模， 多中心前瞻性临床研究表明，a t o r v a s t a t i n ( 2 0m g d a y ) 虽然能有效的降低血脂 的水平，并不能有效的降低糖尿病、血液透析病人心血管疾病的风险。我们的 研究表明，在这类并发有慢性炎症性疾病的人群中，胆固醇的稳态分布被打破， 更多的胆固醇被“陷 在外周细胞上，所以虽然他汀类药物能有效的降低血胆固 醇的水平，但不能降低外周细胞( 如血管平滑肌细胞( v s m c s ) ) 内胆固醇水平7 。 这就提示我们：在血脂的治疗过程中，不能只考虑降低血脂，还要考虑如何调节 体内胆固醇的分布，从而提出调脂治疗的概念。 如何建立一种新型的不需要高胆固醇饮食诱导、血胆固醇水平不高的自发动 脉硬化的动物模型? 并且这种新的动物模型可以用来评估独立于高胆固醇血症 以外的动脉硬化危险因子的评估，同时还可以用于一种新型抗动脉粥样硬化的新 药( 如调脂治疗) 的研制，从而加快寻找到真正有效的能防治动脉粥样硬化的药 物。如果这种模型能成功建立，这将是首个非高脂血症背景下自发致动脉粥样硬 化的动物模型，是对现有的心血管疾病的动物模型研究的必要补充和发展，将有 利于更新临床对心血管疾病的预防和治疗认识，更为重要的是：它将为创新药物 研究开发，尤其是调血脂药物( 有别于传统的降血脂药物) 的开发和筛查具有深 远意义。 为什么临床上有的个体血胆固醇水平不高，但确有严重的动脉硬化发生? 有 的血胆固醇水平高，但动脉硬化的危险度也不一定与血液中胆固醇含量成正比? 再加上这样一个事实：不管血胆固醇是否增高，动脉粥样硬化斑块内均有大量泡 沫细胞形成和胆固醇的沉积。这也提示我们有独立于血胆圆醇水平之外的因素起 着决定作用。 l o 重庆医科大学硕士研究生学位论文 根据我们多年的前期工作，我们提出：可能不同的个体对胆固醇毒性敏感性 的差异是决定胆固醇是否沉积在组织细胞内的决定因素。正常生理情况下，细胞 内胆固醇无论是外源性摄入还是内源性合成，均通过一个依赖于胞内胆固醇水平 的反馈调节系统的严密控制来保证胆固醇内稳态平衡，即主要通过 s c a p s r e b p 2 一l d l r h m g c o ar e d u e t a s e 蛋白之间的相互作用实现对细胞内脂质稳 态平衡的调节。s r e b p 2 即固醇调节元件结合蛋白( s t e r o lr e g u l a t o r ye l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n s ，s r e b p s ) ，为膜结合转录因子，参与脂质自稳态的多方面( 如 胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂的合成摄取) 调节，是类能与固醇调节元件 l ( s r e 1 ) 发生特异性结合的蛋白，而l d l r 基因、i n g c o a 还原酶基因启动子中 均含有s r e i 。 最近，已发现s r e b p s 的3 种亚型： s r e b p ia ，s r e b p l c ，s r e b p 2 ，其中 s r e b p 2 的作用是促进胆固醇摄入和合成。同时有研究表明：s r e b p s 裂解激活蛋 白( s r e b p sc l e a v a g e a c t i v a t i n gp r o t e i n ，s c a p ) 用来控制s r e b p s 的激活。s c a p 是处于内质网( e r ) 的一种膜蛋白，同时s c a p 能与s r e b p s 在内质网内结合成 复合物，运载s r e b p s 至高尔基体，且s c a p 第2 - 6 跨膜区有一个固醇敏感区( s s d ， s t e r o ls e n s i n gd o m a i n ) ，所以s c a p 也被认为是一个胆固醇敏感器存在于细胞内。 当s c a p 感受到细胞内胆固醇浓度降低时，s c a p 运载s r e b p 2 从内质网到高尔 基体，s r e b p 2 在高尔基体内被两个蛋白酶( s i p ，s 2 p ) 水解，释放出具有活性 的n 末端转录因子片断【8 一i ，并进入细胞核与靶基因启动子上的固醇调节元件 s r e 1 结合，从而激活靶基因( 包括l d l r 、h m g c o a 还原酶) 的转录【l o ，1 1 】。当 细胞内胆固醇水平升高时，s c a p s r e b p 2 复合物滞留在内质网，l d l r h m g c o a 还原酶基因的转录就会停f l ：t 1 2 - 1 4 1 。 正常状态下，细胞是通过依赖于上述s c a p s r e b p 2 l d l r h m g c o a m d u c t a s e 内稳调节系统的控制，使l d l r 和h m g c o a 还原酶的表达或活性始终 处于一个正常状态，从而保证细胞对胆固醇摄入与合成的平衡。 然而，在炎症状态下，这个细胞内稳态调节系统的平衡会被打破。炎性细胞 因子n 盯1 0 l 和i l 1 d 可以明显促进s r e b p 2 的m r n a 和蛋白表达，同时还可以增 强s c a p 的表达。即使在细胞内胆固醇浓度较高的情况下，s c a p 仍能从内质网 逃逸，运载s r e b p 2 到高尔基体加工为具有转录活性的n 末端片断s r e b p 2 - n ， 一垩壅墨型奎堂堡主塑壅生兰篁笙兰 一 _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ - _ _ 一一 s r e b p 2 n 进入细胞核内，促进l d l r 表达，导致细胞大量摄入脂质形成泡沫样 刁喀i 1 5 l6 】 x o 本课题以制备转基因小鼠为目的，从两个方面来进行研究探讨来保证实验目 的的实现： 1 s m 2 2 启动s c a p 真核表达质粒的构建。 2 质粒i d n a s m 2 2 s c a p 在c h o 、h m c l 、v s m c s 上超表达后的功能机 匍l 研究。 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分s m 2 2 启动s c a p 真核表达质粒的构建及鉴定 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白( s c a p ) 是存在于内质网的细胞内胆固 醇敏感器，也是固醇调节元件结合蛋白( s r e b p ) 的锚定蛋白，在调节细胞内胆 固醇水平中起着非常关键的作用f l5 1 。当细胞内胆固醇缺乏时，它可以将s r e b p 从内质网运送至高尔基体发生裂解，裂解的活性片段进入细胞核，引起在启动子 区域含有胆固醇调节元件( s r e ) 的下游靶基因转录激活，从而导致细胞对胆固 醇的合成和摄取增加。相反，在细胞内胆固醇过负荷时，s c a p 与内质网上的固 定蛋白胰岛素诱导基因( i n s i g 1 ，2 ) 结合，将s r e b p 锚定在内质网而不发生往高 尔基体的转运，从而停止对下游靶基因( 如l d l 受体和h m gc o a 还原酶) 转录 激活。本研究室大量的前期研究表明，当肝细胞内过度表达s c a p ，可以导致肝 细胞内脂质摄取与合成增加及脂肪肝发生i l q ；当血管平滑肌细胞s c a p 过度表达 时，亦会导致胆固醇异常积聚，形成泡沫细胞【1 7 1 。虽然野生型s c a p 过表达时会 引起胆固醇对l d l 受体负反馈调节失调，但当s c a p 基因位于胆固醇敏感区的第 4 4 3 个密码子存在点突变时，s c a p 将不再受细胞内胆固醇水平的反馈调节，这样 会彻底打破细胞内胆固醇对靶基因的负反馈调节f 】s j 。同时，平滑肌特异蛋白s m 2 2 启动子在体外能够广泛表达，而在体内却具有在动脉平滑肌上的表达特异性【l9 1 。 因此，本实验选定s c a p ( d 4 4 3 n ) 突变体与s m 2 2 启动子( p s m 2 2 ) ，首次构建 了p c d n a s m 2 2 s c a p ( d 4 4 3 n ) 真核表达质粒，为今后建立血管平滑肌特异的 s c a p 超表达转基因小鼠，在体内深入探讨s c a p 的功能及动脉粥样硬化发生的 新机制奠定了基础。 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 实验材料 1 1 菌株 j m l 0 9 、b l 2 1 ( d e 3 ) 大肠杆菌由本实验室保存 1 2 细胞系 人原代冠状动脉平滑肌细胞( v s m c s ) 购于t c se e l1w o r k s ( b u e k i n g h a m s h i r e ， u k ) 。 1 3 细胞培养试剂 1 3 1 细胞生长培养基：d m e m - f 1 2 ( h y c l o n e ，b e i j i n g ) ，1 0 f c s ( f e t a lc a l f s e r u m ) ，1 0 0u m 1p e n i c i l l i n ，2m m o l 1g l u t a m i n e ，1 0 0ug m ls t r e p t o m y c i n 。 1 3 2 实验用培养基( 无血清培养基) ：d m e m - f 1 2 ，0 2 b s a ( s i g m a ) ，2 衄o l 1 g l u t a m i n e ，1 0 0pg m ls t r e p t o m y c i n ，1 0 0u m lp e n i c i ll i n ，1 0 0um o l le d t a 。 1 3 3 细胞冻存液：d 娅m _ f 1 2 完全培养基7m l ，d m s o1m l ，f c s2m l 。 1 3 4 其他细胞培养用试剂：链霉素、青霉素、e d t a 、l p s 和d m s o 均购于s i g m a ， f c s 购于h y c l o n e ( b e i j i n g ) ：低密度脂蛋白( l d l ) ：采用密度梯度超速离心方法， 用新鲜的液体血浆制各。 1 4 质粒 质粒p t k - h s v s c a p t 7 ( d 4 4 3 n ) 由英国u c l 大学皇家自由医学院肾脏病研究中 心馈赠，购于a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ) 公司。载体质粒p i d d l 8 - t ， 购于大连宝生物工程有限公司。载体质粒p g l 3 一c o n t r o l 、p g l 3 - e n h a n c e r 、 p e g f p - n l 、p c d n a 3 1 购于美国p r o m e g a 公司。 1 5 工具酶 d n a 聚合酶、t 4d n a 连接酶及限制性内切酶b g li i 、x b ai 、b a m l li 、k p n i 、h i n d i i i 、s a li 购于大连宝生物工程有限公司。 1 6 主要试剂盒及试剂 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 低熔点琼脂糖购于上海生物技术有限公司 d n am a r k e r 购于大连宝生物有限公司 质粒小量提取试剂盒购于大连华舜生物工程有限公司 质粒大量提取试剂盒购于美国p r o m e g a 公司 胶回收试剂盒购于大连华舜生物工程有限公司 d n a 连接试剂盒购于大连宝生物公司 基因组d n a 提取试剂盒购于购于美国o l a g e n 公司 1 7 主要溶液配制 ( 1 ) l b 培养基：加胰化蛋白胨( b a c t o t r y p t o n e ) 5 9 入4 5 0 r a l 的去离子水中， n a c l5 9 ，酵母提取物( b a c t o - y e a s te x t r a c t ) 2 5 9 ，磁力搅拌至完全溶解，用 n a o t 调节p h 值至7 0 ，加水至总体积5 0 0 r a l ，高压( 1 0 3 4 1 0 5 ) 蒸汽灭菌2 0 r a i n 后4 c 保存备用。l b 液体培养基中加入琼脂糖粉( t 5 9 l ) ，高压灭菌后取出，即 可铺制l b 固体平板培养基。 ( 2 ) l a 培养液，l a 固体培养基：加l o o m m 1 的氨苄青霉素1 0 0 ul 至l o o m ll b 培养液或固体培养基中 ( 3 ) l o t b e 缓冲液：t r i s l 0 8 9 ，e d t a 9 3 9 ，硼酸5 5 9 ，加d d h 。0 至 1 0 0 0 m l ，p h ( 8 0 - 8 2 ) 。 ( 4 ) p b s ：在8 0 0 m l 蒸馏水中溶解0 2 9k c i 、8 9n a c l 、1 4 4 9n a ：k h 。p 0 4 ，调节p h