（遗传学专业论文）烟酸受体gpr109a信号转导机制的研究.pdf

o 一 ，。 4 0 目录 i i ii i ii ii i iii i ii i i1 1 1 ， y 17 4 5 4 8 2 中文摘要1 英文摘要3 引言5 材料和方法7 结果2 1 分析与讨论2 6 参考文献2 8 附录：3 0 致谢4 0 综述4 1 参考文献：4 9 独创性声明5 2 q i 0 温州医学院硕士学位论文 烟酸受体g p r l 0 9 a 信号转导机制的研究 中文摘要 目的 1 构建野生型烟酸受体g p r l 0 9 a 、c 末端4 个缺失体和c 末端的点突变体。 2 寻找对g p r l 0 9 a 受体内吞起关键作用的磷酸化位点。 3 分析突变体对受体胞内信号传导的影响。 方法 1 提取人基因组并p c r 扩增烟酸受体g p r l 0 9 a 基因，构建到载体p e g f p n 1 。 2 分别构建烟酸受体g p r l 0 9 a 的c 末端a2 9 5 3 1 4 ，a3 1 5 3 2 6 ，a3 2 7 3 4 3 ， 3 4 4 3 6 3 四个缺失体，并检测各缺失体的膜定位和内吞情况。 3 利用重叠p c r 技术构建烟酸受体g p r l 0 9 ac 末端点突变体g p r l 0 9 a ( t 3 1 8 a ) 、g p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) 、g p r l 0 9 a ( t 3 3 2 a ) 和 g p r l 0 9 a ( t 3 3 8 a ) 。 4 利用检测胞内第二信使c a m p 变化和蛋白免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 的方 法观察各突变体下游信号转导的变化情况。 结果 1 缺失体a 2 9 5 3 1 4 主要存在于细胞质内，不能定位到细胞膜上，主要是定位 于内质网。 2 缺失体a 3 1 5 3 2 6 和3 2 7 3 4 3 在配体刺激后不能够发生内吞。 3 点突变体g p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) 在配体刺激后不能够发生内 吞。 4 点突变体g p r l 0 9 a ( $ 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( s 3 2 7 a ) 不影响胞内第二信使c a m p 信号的改变。 5 缺失体a 3 1 5 3 2 6 和点突变体g p r l 0 9 a ( $ 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( s 3 2 7 a ) 不影 响胞内下游e r k l 2 磷酸化的水平。 温州医学院硕士学位论文 结论 1 烟酸受体g p r l 0 9 a 第2 9 5 3 1 4 位的氨基酸序列y f s s p s f p n f 影响了受体从 内质网装运至细胞膜的过程 2 烟酸受体g p r l 0 9 ac 末端第3 2 6 位丝氨酸和第3 2 7 位苏氨酸是g r k 2 磷酸化 受体的关键位点。 3 烟酸受体g p r l 0 9 ac 末端g r k 2 磷酸化位点的改变( 如点突变体g p r l 0 9 a ( $ 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( s 3 2 7 a ) ) 仅能构成细胞受体内吞和信号脱敏的改变， 并不影响受体所偶联的g i 蛋白介导的下游信号转导途径。 关键词：烟酸受体g p r l 0 9 a ；c 末端；定点突变；内吞 2 譬 温州医学院硕士学位论文 m o l e c u l a rm e c h a n i s mo f s i g n a lt r a n s d u c t i o no fn i c o t i n i c a c i dr e c e p t o r sg p r l0 9 a o b j e c t i v e 1 t oc o n s t r u c tt h ew i l dt y p eg p r l 0 9 a ，f o u rt r u n c a t i o nm u t a n t sa n ds i xs i t ed i r e c t e d m u t a n t s 2 t od e t e r m i n et h ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e si nt h ec y t o p l a s m i cc - t a i lo fg p r l 0 9 a ， w h i c hc o u l db er e l a t e dt ot h ei n t e r n a l i z a t i o no fg p r l 0 9 a 3 t oa n a l y z et h ee f f e c to fm u t a n t so nt h ec e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y m e t h o d s 1 m o l e c u l a r c l o n i n go fg p r l 0 9 af r o mh u m a ng e n o m eb yp c rm e t h o d a n d c o n s t r u c t i o no fp l a s m i dp e g f p - g p r l 0 9 a 2 t oc o n s t r u c tf o u rc t a i lt r u n c a t i o nm u t a n t so fg p r l 0 9 a ( a 2 9 5 3 1 4 ，a 3 1 5 - 3 2 6 ， a 3 2 7 - 3 4 3 ，a 3 4 4 3 6 3 ) a n da n a l y z et h ep l a s m am e m b r a n e l o c a l i z a t i o na n d i n t e r n a l i z a t i o no ft h e s et r u n c a t i o n 3 t oc o n s t r u c ts i xs i t e - d i r e c t e dm u t a n t sg p r1 0 9 a ( t 3 18 a ) ，g p r 1 0 9 a ( s 3 2 6 a ) ， g p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) ，g p r l 0 9 a ( t 3 3 2 a ) a n dg p r l 0 9 a ( t 3 3 8 a ) b yu s i n g t h e o v e r l a p p i n gp c rm e t h o d 4 t oa n a l y z et h ec a m pa c c u m u l a t i o na n dp h o s p h o r y l a t i o no fe r k l 2o ft h e s e m u t a n t sb yu s i n gl u c i f e r a s ea c t i v i t ya s s a ya n dw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s 1 t h et r u n c a t i o na 2 9 5 - 3 1 4w a sm o s t l yd e t e c t e di nc y t o p l a s m t h e r e f o r et r u n c a t i o n m u t a n t 2 9 5 31 4s e e m e dn o tt ob el o c a l i z e di n p l a s m am e m b r a n e ，b u ti n e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) 2 g p r l 0 9 ai n t e r n a l i z a t i o nw a sc o m p l e t e l yb l o c k e db yt r u n c a t i o n ( a 3 1 5 3 2 6a n d a 3 2 7 - 3 4 3 ) 3 g p r l 0 9 ai n t e r n a l i z a t i o nw a sb l o c k e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s $ 3 2 6 aa n d $ 3 2 7 aa f t e rt h ea c t i v a t i o n 4 s i t e d i r e c t e dm u t a n t sg p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) a n dg p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) d i dn o ta f f e c tt h e c e l l u l a rc a m p s i g n a l i n g 5 t r u n c a t i o nm u t a n t 3 1 5 3 2 6a n ds i t e - d i r e c t e dm u t a n t sg p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) a n d 3 温州医学院硕十学位论文 g p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) d i d n o ta f f e c tt h ep h o s p h o r y l a t i o no fe r k i 2 c o n c l u s i o n 1 r e s i d u e s2 9 5t o3 1 4 ( y f s s p s f p n f ) i ng p r l 0 9 ac t a i lw e r er e q u i r e df o rp r o t e i n t r a n s l o c a t i o np r o c e s sf r o me n d o p l a s m i cr e t i c u l u mt op l a s m am e m b r a n e 2 s e r 3 2 6a n dt h r 3 2 7i nt h ec y t o p l a s m i cc t a i lo fg p r10 9 aa r ek e ys i t e sf o rt h e p h o s p h o r y l a t i o no fg r k 2r e c e p t o r 3 s i t e d i r e c t e dm u t a n t sg p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) a n dg p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) c o u l do n l ya f f e c t i n t e r n a l i z a t i o na n dd e s e n s i t i z a t i o no ft h en i c o t i n i c r e c e p t o rg p r l 0 9 a ，w h e r e a sh a d n oe f f e c to nt h eg i - c o u p l e ds i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s k e yw o r d s ：g p r l 0 9 a ；c a r b o x y lt e r m i n u s ；s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ；i n t e r n a l i z a t i o n 4 - 温州医学院硕士学位论文 引言 g 蛋白偶联受体( gp r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s ，g p c r s ) 是最大的一类细胞膜表 面受体。当g 蛋白偶联受体被胞外信号分子刺激后可以激活细胞内的信号转导 通路，并最终诱导细胞反应( 例如：如神经传递、生长、发育、细胞分化、炎症、 免疫反应等) 。因此，这类受体与多种疾病的形成、发生息息相关，从而成为了 新药开发和研究的重要靶点【1 ，2 1 。 半个世纪以来，烟酸一直被作为效果显著的口服降脂药物在临床上广泛使 用，然而口服大剂量烟酸常会引起皮肤潮红、炙热、瘙痒等副作用，从而导致病 人的依从度降低【3 j 。由于当时烟酸降脂作用的机理一直不甚了解，因此，很难寻 找到合适的方法来降低烟酸所引起的副作用，并提高其药效。 2 0 0 3 年，3 个实验室分别发现烟酸是曾经的孤儿受体g p r l 0 9 a 和g p r l 0 9 b 的配体，为进一步研究烟酸降脂作用的潜在机理奠定了基础。其中，g p r l 0 9 a 对烟酸的亲和力要高于对g p r l 0 9 b 4 1 。小鼠中的g p r l 0 9 a g p r l 0 9 b 的同源蛋白 p u m a g ，也同样被发现对烟酸具有较高的亲和力【引。通过定量r t - p c r ，发现 烟酸受体主要在脂肪细胞表达，此外，脾和免疫细胞中也有不同程度的表达i 引。 烟酸受体g p r l 0 9 a 是g i 蛋白偶联的g 蛋白偶联受体，对百同咳毒素( p t x ) 敏剧州。研究发现脂肪细胞中，烟酸通过g p r l 0 9 a 介导，活化g i 蛋白。g i 蛋白 抑制腺苷酸环化酶的的活性，抑制脂解并减少游离脂肪酸的产生，导致血液中游 离脂肪酸水平的下降。而肝脏由于缺少底物游离脂肪酸而无法合成甘油三酸 脂( t g ) 和极低密度脂蛋白( v l d l ) ，从而降低血液极低密度脂蛋白( v l d l ) 和低密度脂蛋白含量( l d l ) ，提高高密度脂蛋白( h d l ) 在血液中的含量，调 节血脂代谢i7 。 引起皮肤潮红是烟酸的主要副作用，烟酸通过皮肤上皮l a n g e r h a n s 细胞表 达的g p r l 0 9 a 引起细胞质中磷脂酶a 2 ( p l 蛇) 的磷酸化和花生四烯酸( a 舢 的合成【8 1 ；而后，花生四烯酸被环氧合酶( c o x 1 ) 进一步代谢为前列腺素g 2 和h 2 ，最后通过前列腺d 2 和e 2 合成酶合成释放前列腺d 2 、e 2 ，作用皮下血 管，激活血管细胞前列腺受体。由于f j 列腺受体是g s 蛋白偶联的g 蛋白偶联受 体，因此可以介导腺苷酸环化酶的激活，增加胞内c a m p 水平，舒张血管平滑 肌，引起皮肤潮纠8 ，9 1 。 因此，研究和学习烟酸受体在细胞内的信号转导机制对于预防和解决烟酸所 引起的副作用具有积极的作用。 信号脱敏( 减敏) 和受体内吞是g 蛋白偶联受体( g p c r s ) 介导的信号途径调节 的重要机制。大部分的g 蛋白偶联受体活化后，在第二信使激酶( p k a 和p k c ) 5 温州医学院硕士学位论文 或g 蛋白偶联受体激酶( g r 心) 的作用下，受体特定域的丝氨酸和苏氨酸被快 速磷酸化【l u ，1 1 j ，而受体的磷酸化提高了其对p - a r r e s t i n 的亲和力，两者形成复合 体并促使受体与g 蛋白解偶联，同时与网格蛋白( c l a t h r i n ) 包裹小泡结合，并 在d y n a m i n 的水解作用下发生内吞【1 2 】，并隐设( s e q u e s t r a t i o n ) 于细胞内【1 3 1 5 1 ，例 如h i v 核受体c x c r 4 b | 1 6 】。内吞后的受体可能发生两种变化：二是在内涵体酸 性的环境内，发生去磷酸化，通过再循环回到胞膜表面，完成复敏 ( r e s e n s i t i z a t i o n ) ；二是受体被转运到溶酶体内，发生降解，受体信号下调【1 7 1 ( 图 1 ) 。 图1 酉c 体和受体结合后，受体内吞不惑图 在配体引起的受体磷酸化中，g 蛋白偶联受体激酶( g r k s ) 是调节g 蛋白偶 联受体介导的细胞信号传导系统中一类非常重要的激酶。g r k s 是丝氨酸苏氨 酸蛋白激酶，专一地磷酸化活化的g p c r s ，在由g 蛋白介导的信号传导系统的 快速减敏，以及进一步的受体内吞中起着重要的作用。哺乳动物中总共存在有7 种g r k l l 3 j 。据文献报道，g p c r s 的磷酸化位点一般位于细胞内的第三环或羧基 末端尾区的丝氨酸和苏氨酸残基。例如，突变p - 2 a r 羧基末端和m 2m a c h r 细 胞内第三环的丝氨酸、苏氨酸能够有效减少g r k s 介导的受体磷酸化，并影响 受体的内吞速率和数量1 1 8 j 。 据本实验室以往的研究发现，烟酸受体是通过g r k 2 来磷酸化受体的。烟 酸受体通过膜绑定的p y 亚基招募g r k 2 到膜上，催化受体c 末端磷酸化，招募 1 3 - a r r e s t i n2 ，进而通过网格蛋白包裹小泡结合并在d y n a m i n 的水解作用下发生内 吞。但是，到目前为止，我们仍然不清楚烟酸受体c 末端的关键磷酸化位点。 因此，通过对烟酸受体c 末端进行一系列突变，可能找出g r k 2 催化烟酸受体磷 酸化关键区域和作用位点。 6 温州医学院硕十学位论文 本论文通过在h e k 2 9 3 细胞表达烟酸受体g p r l 0 9 a 的c 末端4 个缺失体和丝 氨酸苏氨酸丙氨酸取代的点突变体，找到了该受体磷酸化的关键位点，并详细 研究了这些位点在受体内吞、胞内交通和信号转导方面的作用。 一、材料和仪器 ( 1 ) d n a 材料和方法 载体 来源 p d s r e d 2 - e r p c d n a 3 0 ， p m d 2 0 - t p e g f p n 1 。 本实验室保存 i n v i t r o g e n 本实验室自主改造构建保存 c l o n t e c h ( 2 ) 细胞株 细胞株 来源 c h o h e k 2 9 3 细胞 e c o l i d h 5 a 本实验室保存 本实验室保存 s u p e 4 4 1 a c u l 6 9 ( ( p 8 0i a c z a m l 5 ) h s d r l 7r e c a le n d a l 7 j 温州医学院硕士学位论文 ( 4 ) 培养基及缓冲液 l b 液体培养基完全溶解后，在1 0 5 k g c m 2 高压下蒸汽灭菌2 0 m i n ，冷却待用。 成分量 胰蛋白胨 n a c l 酵母提取物 水 1 0 9 1 0 9 5 9 补水至1 l l b 固体培养基：l b 液体培养基加入1 5 9 l 的琼脂，高压灭菌后冷却至6 0 c 8 温州医学院硕士学位论文 时，根据实验需要，加入适量抗生素，混匀后铺平板。 细胞培养液：d m e m 低糖培养基+ 1 0 f b s 胰蛋白酶、p b s ( 吉诺生物) 核酸电泳缓冲液t r i s 乙酸( t 矩) ： 5 0 x t a e 贮存液： 成分 且 里 t r i s b a s e 冰乙酸 0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) 蒸馏水 2 4 2 9 5 7 1 m l 1 0 0 m l 补水至1 l 1 琼脂糖凝胶：称取5 9 琼脂糖加至5 0 0 m l t a e 溶液中，混匀，取所需量加热 溶解，待冷却未凝前加入1 0 u le b ( 1 m g m 1 ) 混匀，铺胶。 ( 2 ) 5 x t r i s 甘氨酸电泳缓冲液： 转膜缓 t r i s b a s e 甘氨酸 1 0 s d s ，p h 8 3 ) 甲醇 蒸馏水 1 4 1 9 3 0 3 9 l m l 2 0 0 m l 补水至1 l t b s 缓冲液： 成分 且 里 n a c l 8 0 9 9 温州医学院硕士学位论文 t 1 3 s t 缓冲液：含0 0 5 t w e e n 2 0 的t b s 缓冲液。 ( 5 ) 试剂盒 试剂盒厂家 b 型质粒小样快速提取试剂盒博大泰克 r n i l l a 荧光素酶检测系统p r o m e g a d n a 片段快速胶回收试剂盒博大泰克 ( 6 ) 主要仪器及设备 主要仪器设备公司 a b i 2 7 2 0p c r 仪 核酸电泳仪、蛋白电泳仪 凝胶成像仪 台式冷冻离心机 细胞培养箱、高压灭菌锅、7 0 冰箱 d n p 9 0 8 2 型生化培养箱、恒温水浴锅 回转式摇床 生物净化工作台 离心机、移液器 电子天平 紫外可见光分光光度计 倒置显微镜、荧光显微镜 化学发光检测仪 a b l b i o r a d 复同科技 b e c k m a nc o u m r s a n y o 上海精宏 哈尔滨东联电子 上海博迅 e p p e n d o r f m e t t l e r - t o l e d og r o u p g e o l y m p u s b e r t h o l d ( 7 ) 所用数据库及数据分析软件 本实验所有基因序列均来自n c b i 数据库h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v n u c l e o t i d e 。基因厍序列比对于h ! 垃；地! 垒盟：旦业i ：望! 堡：坠i b ：艘丑旦! 堑! ：堡g i 完成。基因 1 0 温州医学院硕士学位论文 序列分析利用j e l l y f i s h 软件。实验结果数据分析由g r a p h p a dp r i s m4 软件完成。 二、实验方法 1 人基因组提取 参照d n a 抽提试剂盒的提取基因组的流程： 1 1 在培养有人胚肾2 9 3 细胞的1 0 c m 培养皿，加入l m l 样品裂解液( 包含5 微 升蛋白酶k ) ，混匀。颠倒混匀数次，充分裂解组织或细胞。 1 2 用1 5 m l 的微量移液器吹打后，转移入1 5 m l 的e p 管。5 0 水浴消化过夜。 1 3 加入5 0 0 微升t r i s 平衡苯酚抽提样品。吸出酚相及中间相( 可以吸除少量靠近 中间相的水相液体) ，剩余的水相用等体积t r i s 平衡酚再抽提一次。吸出酚相及 中间相( 可以吸除少量靠近中间相的水相液体) ，剩余的水相用等体积氯仿再抽提 一次。 1 4 吸出约3 0 0 微升上清液，加入6 0 微升1 0 m 醋酸铵和6 0 0 微升无水乙醇，颠 倒数次混匀，此时可见d n a 沉淀产生。 1 51 0 0 0 0 9 离心1 分钟，弃上清。加入7 0 乙醇洗涤d n a 沉淀两次，尽量吸除 残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入5 0 1 0 0 微升n u c l e a s ef r e ew a t e r 溶解d n a 。 2 p c r 扩增烟酸受体g p r l 0 9 a 基因 由于人基因组中烟酸受体g p r l 0 9 a 基因不存在内含子，我们直接通过p c r 的 方法扩增得到烟酸受体g p r l 0 9 a 。构建到表达载体p e g f p n 1 的炯酸受体 g p r l 0 9 a 的引物为p 1 ，p 2 。p 1 的序列为5 a a g c t t g c c 么c c a t g a a t c g g c a c q 盯c t g c a g g a t 3 ，长3 6 b p ，粗体部分为h i n di i i ，斜体部分k o z a k 序列， 用于增强目的蛋白表达，t m 值为7 2 ，p 芝的序列为 5 g g t a c c g t a g g a g a g g t t g g g c c c a g a ，r a 3 ，长2 9 b p ，粗体部分为k p n i ，t m 值为6 6 。c ，合成的d n a 引物呈很轻的干粉状附在离心管壁上，先离心，再打开管盖，按每1 0 d 加入1 0 0 9 l 无菌d d h 2 0 ，充分震荡至完全溶解，2 0 保存。以人基因组为模板，以p 1 ，p 2 为引物，按表中反应体系加入各组分，p c r 扩增目的基因。 p c r 反应体系： 组分 体积 1 0 x p c r 缓冲液 5 9 l 温州医学院硕士学位论文 p c r 扩增的程序如下 预变性：9 5 。c ，5 m i n ； 9 5 。c 变性5 0 s ，6 0 。c 退火3 0 s ，7 2 。c 延伸1 5 m i n ，2 5 个循环。 最后于7 2 。c 延伸1 0 m i n 。 3 p c r 产物的检测及回收 取所有的p c r 产物，与1 0 d n a 上样缓冲液混合后，跑1 琼脂糖凝胶电泳1 6 0 v ， 2 0 3 0 m i n ，紫外光下确定p c r 产物片断，割下含片断的胶块，放入e p 管中。 加入7 0 0 “1 溶胶液，5 5 。c 溶胶；澄清液转入p c r 产物回收柱，8 0 0 0 r p m 离心3 m i n ( 为确保浓度，可将离心后的液体重新上柱，再次离心。) 弃去管中液体；加入 5 0 0 9 l 漂洗液，8 0 0 0 1 0 0 0 0 r p m 离心l 一2 m i n ，弃去管中液体，重复一次；回收柱 丌盖，1 2 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，去除残留酒精；回收柱转入新的e p 管，加入3 0 1 a l 蒸馏水，1 3 0 0 0 r p m 离心3 - 5 m i n ，溶解并收集d n a 。 4 与t 载体连接 将各个回收的d n a 片断按表1 的组成混合连接到p m d 2 0 t 载体上，连接 条件为4 。c ，过夜。 连接反应体系： 组分体积 p m d 2 0 t 载体 p c r 产物 t 4 d n a 连接酶 1 0 x 连接酶缓冲液 1 5 1 t l 6 7 肛l l l x l l g l 5 转化 1 2 温州医学院硕士学位论文 转化e c o l id h 5 a 感受态细胞：将l o o g l 感受态细胞菌液与连接产物混合， 冰上放置半小时，4 2 。c 热激9 0 s ，再在冰上放置一段时间；加入9 0 0 i j , 1l b 培养基， 3 7 c 培养2 - 3 h ；4 0 0 0 r p m 离心3 , 、- 5 m i n ，弃去大部分上清，剩余培养基与沉淀 混匀，涂布含5 0 9 9 m l 氨苄青霉素抗性平板，3 7 c 倒置培养1 5 小时左右；用小枪 头挑选长势较好的菌落，移入1 0 m l 左右液体培养基中，3 7 c 摇床振荡培养过夜。 6 质粒抽提、酶切鉴定 试剂盒使用前，在每5 m l 溶液1 中加入3 0 0 1 x l r n a s e a ，使r n a s e a 终浓度达 到0 6 m g m l 。溶液1 使用完毕后，立即置于4 保存。 菌液7 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃去上清；加入1 0 0 9 l 溶液1 ，振荡至彻底悬浮， 7 移入1 5 m l e p 管；加入1 5 0 9 l 溶液2 ，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂 解，裂解后的菌体变得清亮；加入1 5 0 9 l 溶液3 ，混合颠倒离心管数次，室温放 置5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟；将4 2 0 肛1 结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后 将上一步的上清加入离心吸附柱中( 尽量去除杂质) ，混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ， 倒掉废液收集管中的废液；加入7 5 0 p , 1 漂洗液于离心吸附柱中，静置l m i n 后， 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s ，倒掉废液收集这中的废液，重复一次，倒掉废液后，再次子 1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，尽量去除漂洗缓冲液；小心取出离心吸附柱，将其套入一 个干净的1 5 m l e p 管中，加入蒸馏水3 0 9 l ，室温放置2 - - 一5 m i n 后，1 2 0 0 0 r p m 离 心l m i n 。 回收纯化的质粒d n a 样品按表2 组成混合进行酶切。3 7 酶切1 2 h ，1 琼脂 糖凝胶电泳，1 6 0 v 。2 0 3 0 m i n 。割胶回收样品片断，测序。 表3 酶切体系表 7 烟酸g f r l 0 9 a 受体构建表达载体 测定序列正确后，将上一步的回收样品片断按表3 组分与p e g f p n 1 连接， 4 c 连接过夜。 1 3 连接体系表t 温州医学院硕士学位论文 组分体积 回收片断 1 0 x 连接酶缓冲液 t 4 d n a 连接酶 p e g f p n 1 7 p 1 l g l l g l 1 5 p l 转化大肠杆菌感受态细胞，p e g f p - g p r l 0 9 a 涂布含k a n a 抗性的l b 培养基， 3 7 。c 培养过夜。挑选菌落，移入液体培养基，3 7 。c 摇床培养过夜。提取菌体质粒， 酶切，检测片断大小。酶切体系同表。g p r l 0 9 a 片段应为1 0 9 2 b p 。将检测正确 的样品对应的菌液扩大培养，提取质粒并保存。 8 烟酸受体g p r l 0 9 ac 末端缺失体构建 烟酸受体的c 末端从内侧2 9 5 位的氨基酸到外侧末端的3 6 3 氨基酸。如下 面图2 所示，我们构建了四个突变体，a 2 9 5 3 1 4 ，a 3 1 5 3 2 6 ，a 3 2 7 3 4 3 ，a 3 4 4 3 6 3 。 我们缺失c 末端的中f b j 的一段核苷酸序列，再把前、后端核苷酸序列通过重叠 p c r 进行连接( 缺失体a 3 4 4 3 6 3 除外，它c 未端已经没有了氨基酸序列) 。所 有烟酸受体g p r l 0 9 ac 末端缺失体都经d n a 序列分析证实。 6 2 9 5 31 4 l c 末端一j 31 5 3 2 6 乞= = = ：= ：= = = = = = ：= = = = = = = = = = = = = ：= = = = = = = 一：一= ：三一 l c 末端_ j n 端 3 2 7 3 4 3 c 端 e z 互z = = ：= = = = = = = = = ：= ：= = = = = = = = = = = = ：= = = = ：= = = = = = 土 l c 末端_ j 3 4 4 3 6 3 c ：= = = = = = = = = ：= = = = = = = = = = = = = = ：= = = = = = ：= ：= = = = = = = = = = = = ：= = 兰e = = j l c 末端j 图2 酸受体缺失体示意图 烟酸受体g p r l 0 9 ac 端4 个缺失体引物 1 4 温州医学院硕士学位论文 9 构建烟酸受体c 末端点突变体 为了把3 1 8 位苏氨酸突变为丙氨酸，我们通过在第3 1 8 位苏氨酸的左右设计 引物，引入突变，把3 1 8 位苏氨酸突变为丙氨酸。利用重叠p c r 构建g p r l 0 9 a ( t s l 8 a ) 。g p r l 0 9 a ( s 3 2 6 a ) 、g p r l 0 9 a ( t 3 2 7 a ) 、g p r l 0 9 a ( t 3 3 2 a ) 和 g p r l 0 9 a ( t 3 3 8 a ) 位于s a c i 酶切位点附近，我们通过在s a c i 前( $ 3 2 6 和t 3 2 7 ) 后( t 3 3 2 和t 3 3 8 ) 设计一段引物包括s a c l 酶切位点，引入突变，定点突变丙氨 酸。p c r 扩增目的片段。回收p c r 产物，构建到到p m d 2 0 - t 载体，抽提质粒， 酶切和测序鉴定。用相应的两个酶进行双酶切，回收所需片段。以野生型 p e g f p g p r l 0 9 a 为基础，用相应的两个酶进行双酶切，回收需要片段。连同载 体一起连接三个片段，构建点突变体。所有点突变体都经d n a 序列分析证实。 点突变体引物 点突变体正向引物反向引物 温州医学院硕十学位论文 b 1 8 a t 3 2 7 a 1 r 3 3 2 a t 3 3 8 a a 1 c 1 g c a g g a d g a g c t c g c a g g g g a c c c c 1 0 细胞传代培养 将培养的细胞从细胞培养箱中取出来，吸除培养皿内旧的培养液。再往培 养皿中加入适量p b s 缓冲液清洗，除去残留的钙离子。接着向培养皿中加入胰 蛋白酶e d t a 混合液少许，以能覆满瓶底为限，轻轻晃动培养皿，吸除消化液。 将培养皿置于3 7 。c 细胞培养箱中，2 5 分钟，当发现细胞质刚缩，细胞间隙增大 后，细胞变成圆形，将培养皿取出。加入适量培养液，用吸管吸取营养液轻轻反 复吹打培养皿壁上的细胞，使之从培养皿壁脱离形成细胞悬液。计数板计数后， 把细胞悬液分成等份分装入数个培养皿中，置细胞培养箱中培养。 1 1 细胞转染及筛选 1 1 1 将4 u g 质粒与9 2 u l 无血清d m e m 低糖培养基于1 5 m le p 管混匀，同时取 8 u l 脂质体2 0 0 0 与9 2 u l 无血清d m e m 低糖培养基于另一支1 5 m le p 管混匀， 室温静置5 m i n 。 1 1 2 将脂质体2 0 0 0 与无血清d m e m 低糖培养基混合物加入含质粒与无血清 d m e m 低糖培养基的混合液中轻轻混匀，室温静置2 0 m i n 。 1 1 3 将6 孔板中的细胞培养基换为无血清的d m e m 低糖培养基，并将上述含有 质粒，脂质体2 0 0 0 及无血清d m e m 低糖培养基的混合液逐滴加入6 孔板中， 1 6 温州医学院硕士学位论文 并轻轻前后翻动6 孔板，使之充分混匀。 1 1 4 转染5 6 h 后，向6 孔板中加入含1 0 ( v v ) f b s 的d m e m 培养基。 1 1 5 转染4 8 h 后，加约l m l 胰酶消化细胞，3 7 处理3 - - 5 m i n ，轻轻拍打孔板， 使细胞分散脱落，并转入细胞培养皿培养，培养基为含1 0 f b s ，8 0 0 m g lg 4 1 8 的培养基。每隔3 - - 4 天换一次培养基，如此连续筛选3 周即可拿到稳定融合表 达的细胞。 1 2 细胞冻存 从培养箱中取出细胞，吸去培养液，用p b s 洗涤，加入胰酶消化，3 7 处 理3 - 5 m i n ；轻轻拍打孔板使细胞分散；加入与先前细胞培养一致的培养液，再 加1 0 血清，5 d m s o 混匀，分装进冻存管；8 0 。c 冰箱放置过夜后，转入液 氮罐保存。 1 3 受体内吞分析 在铺有盖玻片6 孔板种稳定表达受体g f p 的h e k 2 9 3 细胞，2 4 h 后用1 0 0 9 m 的烟酸处理4 h ，吸掉培养基，用4 的多聚甲醇固定1 0 m i n ，吸掉多聚甲醇，滴 一滴5 0 在载玻片上，将长有细胞的盖玻片从6 孔板中取出，向下盖在甘油上， 避免气泡出现，3 0 m i n 后等片子干，使用共聚焦激光扫描显微镜观察受体定位。 激发光4 8 8 n m ，发射光5 2 5 _ 2 5 n m 。 1 4 检测第二信使c a m p 变化 1 4 1 制备细胞裂解液：将4 体积水加入1 体积5x 裂解缓冲液，使用前在室温平 衡1 裂解缓冲液。 制备荧光素酶检测试剂：检测缓冲液回温融解后加入5 荧光素底物混匀， 配成1 的检测液待用。 1 4 2 吸干培养皿中的细胞培养液，此过程必须仔细，不要接触贴壁细胞。 1 4 3 每孔加入5 0 u ll x 裂解缓冲液，晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖 细胞，裂解1 5 分钟。 1 4 4 将荧化学发光检测仪的程序设置为：1 秒延迟及2 秒荧光素酶活性测量读 数。 1 4 5 取1 5 u l 细胞裂解液至新1 5 m le p 管内，再加入装有2 0 u l 荧光素酶检测试剂 的离心管中，快速混匀。 1 4 6 将离心管置于化学发光检测仪内并开始读数，保证每个样品从混合裂解液 1 7 温州医学院硕士学位论文 与检测夜到仪器读数的时间间隔一致，记录数据。 1 5 蛋白免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 1 5 1 制备蛋白样品 尽可能吸干6 孔板内细胞的细胞培养液，每孔立即加入1 0 0 u l r i p a 细胞裂解 液( 含完全蛋白酶抑制剂) ，置于冰上裂解3 0 m i n 。裂解完后，用枪将细胞碎片 和裂解液移至1 5 m l 离心管中，4 。c 1 3 0 0 0 r p m 离心5 分钟，取上清为蛋白样品。 取4 0 u l 蛋白解样品加入1 0 u l5 xs d s p a g e 凝胶上样缓冲液，1 0 0 加热1 0 分钟 使蛋白变性。等待上样凝胶。 1 5 2s d s p a g e 电泳 1 5 2 1 清洗玻璃板：洗洁精清洗，自来水冲净后，过遍蒸馏水后晾干；玻璃板对 齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上； 1 5 2 2 制胶与上样： 根据目的蛋白的分子量大小，本实验的目标条带e r k l 2 包含4 2 k d 与4 4 k d 大小的蛋白条带，于是选择了1 2 分离胶。在5 0 m l 离心管按所需丙烯酰胺浓 度配制分离胶( 即下层胶) ，按下表中所示比例依次加入各成分混匀。加完t e m e d 后聚合反应立即开始，应迅速旋动混合物进行下一步。 1 2 t r i s 甘氨酸s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液： 将丙烯酰胺溶液灌至两块玻璃板中间的间隙中，给浓缩胶留出一定空间。用 巴氏吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层去离子水。待聚合完成( 室温3 0 m i n 左右) ，当水和胶之间有一条折射线时说明胶已凝固，尽可能倒干去离子水。 在5 0 m l 离心管按下表中所示比例依次加入各成分混匀配制浓缩胶。加完 t e m e d 后迅速将分离胶溶液灌至聚合好的分离胶上，立即插入干净的齿梳，注 意不要混入气泡。室温垂直放置待聚合。 1 8 温州医学院硕士学位论文 i r i s 甘氨酸s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳5 浓缩胶溶液： 聚合后，小心拔去齿梳，清洗后将凝胶固定在电泳装置上，在上下槽中加入 i r i s g l y c i n e 电泳缓冲液，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。 按预定顺序用微量注射器加样，每个样品上样量为1 5 u l 。 1 5 2 3 电泳：3 0 v 电压电泳浓缩胶，待m a k e r 进入分离胶开始分离后将电压上调 至1 2 0 v 继续电泳，直到指示m a k e r 所要求的条带跑出，关闭电源。 1 5 3 转膜 1 5 3 1 从电泳槽中移出凝胶装置，小心撬开玻璃板取凝胶，用切胶板把胶切割所 需条带范围，切去左上角( 第一个样品的最前端) 作为电泳方向记号。 1 5 3 2 准备裁剪合适的p v d f 膜，于甲醇中浸泡3 0 s 后放入转移缓冲液中平衡。 于转移缓冲液中，将海绵挚、滤纸、凝胶、p v d f 膜、滤纸、海绵依次叠加夹于 转膜夹子。 1 5 3 4 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。 再将转移槽固定于电泳装置，在槽中加入转移缓冲液。将整个电泳槽置于冰水里， 2 2 0 m a 电泳6 0 m i n 。 1 5 4 免疫反应 1 5 4 1 取下膜置于盒子中，t b s t 清洗后。将膜置于1 5 m l 封闭液中，室温摇动封 闭1 h 。封闭后，可减小后续的一抗或二抗和p v d f 膜的非特异性结合，降低背 景，增强信噪比。 1 5 4 2 标记一抗：倒去封闭液，将一抗a n t i p e r k l 2 荧光素酶抗体以1 ：5 0 0 0 1 9 温州医学院硕士学位论文 的比例加入到1 5 m l 的5 b s a 的t b s t 混合液中。将此混合液加入膜中，4 过 夜摇动标记一抗。 1 5 4 3 倒去一抗溶液后，t b s t 摇动漂洗3 次，每次1 0 m i n 。 1 5 4 4 标记二抗：将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠i g g 抗体以1 ：5 0 0 0 的比例 加入到1 5 m l 的5 脱脂奶粉的t b s t 混合液中。加入膜中，常温摇动标记1 h 。 1 5 4 5 除去二抗溶液后，t b s t 摇动漂洗3 次，每次1 0 m i n 。t b s 摇动漂洗 1 次1 0 m i n 。最后将膜置于t b s 溶液等待化学发光反应。 1 5 5 化学发光反应、显影、定影 1 5 5 1 在暗室中，将准备好1 显影液和定影液于盘中。 1 5 5 2 将5 发光底物a 和b 两种试剂等体积混合，补蒸馏水至1 混合溶液。 在保鲜膜上，膜蛋白面朝上，在膜上均匀滴入混合溶液。2 m i n 充分反应后，吸 干残液，覆