（遗传学专业论文）短小芽孢杆菌表达系统的优化研究.pdf

摘要 真菌病害是造成农作物产量损失的重要原因之一，利用天然的或经遗传改良 的微生物进行植物真菌病害的防治是当前困际上较为活跃的研究领域之一。本实 验室已从水稻叶片上分离出一株附生菌d x 0 1 ，经试验证明该菌具有天然拮抗某 些真菌的特性，若能进一步将其定向改造成具有更强抗真菌能力的工程菌，作为 生物农药的有效组分，从而可以减少因使用化学农药而造成的环境污染，无疑具 有重要的理论和现实意义。绿色荧光蛋白( g f p ) 基因作为标记基因，被广泛应用 于环境微生物学方面，由于其表达稳定，容易观测，因此，也可以作为启动子活 性的报告基因。为了进一步优化短小芽孢杆菌表达系统，以g f p 作为报告基因， 埘克隆自d x 0 1 菌株的启动子进行了一系列的研究。 采用p c r 技术，亚克隆来自短小芽孢杆菌( b a c i l l u sb r e v i s ) d x 叭菌株总基 因组中的启动子活性片段f 1 ，分别构建了大肠杆菌组成型表达载体 p u c l l 8 一f l g f p 和一个大肠杆菌一短小芽孢杆菌穿梭表达载体p h y 3 0 0 一f l g f p ，以缺 失启动子的绿色荧光蛋白( g f p ) 基因为报告基因，检测了该片段在大肠轩菌 d h 5 a 和短小芽孢杆菌d x 0 l 菌株中的启动活性，在荧光显微镜下，均观察到了 明亮的绿色荧光，证实活性片段f l 具有组成型启动子的功能，g f p 基因在2 种宿 主细胞中实现了组成型表达。该表达结果为w e s t e r n 印迹所证实。对2 种宿主表 达细胞中g f p 蛋白的表达量作了f a c s 分析，结果表明g f p 基因在d x 0 1 细胞中 的表达强度约为d h 5 a 中的2 倍。 运用来自噬菌体m u 的转座酶m u a ，对启动予f 1 进行了随机插入突变，从 巾筛选出1 3 个f 1 的突变体。对突变体的氯霉素抗性检测表明，与f 1 对照相比， 7 个含相应突变体的菌株其氯霉素抗性水平有显著提高，其中突变体f m 3 和 f m l 0 抗性提高了3 6 倍，可抗高达9 0 0 1 a g m l 氯霉素，揭示这些启动子突变体有 着更高的启动活性；4 个突变体氯霉素抗性水平下降；2 个突变体抗性水平基本 不变。c a t - e l i s a 检测的结果，也进一步证实了氯霉素抗性水平的变化与c a t 酶活力的变化有着密切的关系。在启动子f 1 的d n a 序列上，存在着不问插入 效应敏感位点，在这些位点附近的插入突变，可使启动活性急剧变化，并且相邻 的插入位点，其突变效应可能完全不同。f a c s 分析表明，在大肠杆菌中表现为 启动活性增强的f 1 突变体，转入短小芽孢杆菌d x 0 1 后其活性仍表现为增强。 采用r t - p c r 方法，克隆了萝h 抗真菌蛋白1 ( r s a f p i ) 的e d n a 全氏，在该 v l 基因的上游连上了一个短小芽孢杆菌4 7 株的中壁蛋白( m w p ) 信号肽，将r s a l p l 基因的终止密码子突变掉，其后接上绿色荧光蛋白( g f p ) 基因和t 7 终止子，分 别构建成a f p g f p 融合蛋白表达载体p u c l l 8 - f 1 s p ，a g f p 和p h y 3 0 0 一f 1 s p ，a g f p 。 w e s t e r n 杂交证实融合蛋白在大肠杆菌d h 5 a 中得到了表达。 f 附录部分 杂交墨西哥落羽杉是我国已故著名林木育种家叶培忠教授于1 9 6 3 年通过墨 西哥落羽杉( 母本) 与柳杉( 父本) 杂交所获得的新种。目前，其主要分布在上海、 江苏等地。杂交墨杉苗期长势不突出，早年并未引起林木工作者的注意，故目前 这些杂交墨西哥落羽杉的分布情况已很难从原始档案中查找到完整的资料。为 此，采用随机引物扩增多态性d n a ( r a p d ) 技术，对8 个可能是杂交墨西哥落羽 杉片林样本、其杂交母本一墨西哥落羽杉和杂交父本的同类书4 杉，共计1 2 个 样本进行了亲缘关系鉴定和遗传多样性分析。从3 1 个随机引物中筛选出1 7 个引 物，共扩增出1 6 4 条带。其中，多态带有1 6 2 条，占全部条带的9 8 8 。检测结 果表明：在8 号、1 1 号、1 2 号3 个柳杉样本中，1 1 号样本与原杂交父本的亲缘 关系最近；1 号、4 号和9 号三个片林样本是杂交墨杉群落的可能性最大；5 号 片林样本可能是未杂交的墨杉纯林；其他群落的样本是否为杂交墨杉尚不能通过 该实验得出明确结论。 v l i a b s t r a c t t h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) o f t h ej e l l y f i s ha e q u o r e af i c t o r i ai sau s e f u l r e p o r t e r m o l e c u l ef o r m o n i t o r i n gg e n ee x p r e s s i o n i nv i v oi n e u k a r y o t i c a n d p r o k a r y o t i c c e l l s ag f pv e c t o rw a sc o n s t r u c t e df o ri ns i t ud e t e c t i o no ft h er i c e e p i p h y t e b a c i l l u sb r e v i ss t r a i nd x 0 1 t h e p r o m o t e r l e s sg t p - s 6 5 tg e n e u 1 a s t r a n s c r i p t i o n a l l yf u s e dt oas t r o n gb b r e v i sp r o m o t e rp c p 0 1f u n c t i o n a lf 1f r a g m e n t ， w h i c hw a ss u b c l o n e df r o mt h eg e n o m eo fs t r a i nd x o ib yp c r t e c h n i q u e ，a n dt h e n r e s p e c t i v e l yi n s e r t e di n t op l a s m i dp u c l l 8a n da f te s c h e r i c h i ac o l i b a c i l l u ss h u t t l e v e c t o r p h y 3 0 0 p l kl e a d i n g t or e s u l ti n e x p r e s s i o n v e c t o r s p u c l1 8 一f l g f p a n d p h y 3 0 0 一f i g f p t h ed x 0 1c e l l sh a r b o r i n g t h ep l a s m i dp h y 3 0 0 f l g f pc o u l dp r o d u c e b r i g h tg r e e n f l u o r e s c e n c ew h e n t h e yw e r ee x a m i n e db yu s i n gf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p y t h er e s u l t sw e r ec o n f i r m e db yw e s t e r nb l o t a n a l y s i s t h et r a n s c r i p t i o nf r o m f 1 r e m a i n e dc o n s t i t u t i v e a l t h o u g h i tw a s2 8 0b ps h o r t e rt h a ni n p r o m o t e rp c p 0 1 g f p e x p r e s s i n gc e l l sw e r ea l s os o r t e db yf l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ( f a c s ) a n a l y s i s t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f c e l lp o p u l a i o n so f d x o l ：p h y 3 0 0 - f l g f pw a s w o f o l d h i g h e rt h a nt h a t o fd h 5 a ：p u c i1 8 f 1 9 f p ，w h i c hi m p l i e dt h a tt h eg f p e x p r e s s i o nv e c t o rp h y 3 0 0 - f l g f p w a s h i 曲l ye f f i c i e n ti nb b r e v i sd x 0 1 t h o u g h f 1 s h o w e dn oh o s tc e l ls p e c i f i c i t y , i td i s p l a y e dh i g h e rt r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yi nb b r e v i s d x 0 1t h a l l i n e 。c o l i d h 5 a t oi m p r o v et h ea c t i v i t yo ff 1 ，i n s e r t i o nm u t a g e n e s i so ff 1b a s e do ni nv i t r o t r a n s p o s i t i o nr e a c t i o nw a sp e r f o r m e d 2 2 7i n s e r t i o nc l o n e sw e r es c r e e n e df r o ma l l i n s e r t i o nl i b r a r y ，13m u t a n t sw e r ei d e n t i f i e da n ds e q u e n c e d t h e i rm i co fc m na n d c a t s y n t h e s i sw e r ea s s a y e d s e v e nm u t a n t sw i t he n h a n c e dt r a n s c r i p t i o na c t i v i t yi ne c o l id h 5 aw e r eo b t a i n e d t h em i c so fc a mo ff r 0 3a n df m l 0w e r e9 0 0g g m l ， w h i c hi s2 6f o l dh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 f o u rm u t a n t ss h o w e dl o w e rm i co f c a m ，m a dt w ok e p tu n a l t e r e d ，i ng e n e r a l ，t h em i co fc a m w a s p o s i t i v e l yr e l a t e dt o c a t a c t i v i t yi ne c o l id h 5 a c e l l s t h ei n s e r t i o n si nd n a s e q u e n c eo fp r o m o t e rf 1 r e s u l t e di nd i 脆r e n te f f e c t s r e m a r k a b l y , t h ei n s e r t i o n si nt h en e i g h b o rs i t e sl e dt o d i a m e t r i c a l l yo p p o s i n ge f f e c t s t h er e s u l t s o ff a c sa n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h e e n h a n c e d p r o m o t e r ss h o w e d s i m i l a r h i g ha c t i v i t i e si 1 1b b r e v i ss t r a i nd x 0 1 t h e a n t i f u n g a lp r o t e i n1 ( r s a f p l ) e d n aw a s d e r i v e df r o mr a d i s hc n l t i v a r “c h u a n x i n h u n g ”b yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ，a n dt h e nt h ep r o m o t e rf 1 a n dt h e v i l l m i d d l e - w a l l p r o t e i ns i g n a lp e p t i d eo fb b r e v i ss t r a i n4 7w e r ef u s e dt oi t s5 7 e n di na c o r r e c to r i e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y s u b s e q u e n t l y ，t h et e r m i n a t o rc o d o no ft h er s 一的l g e n ew a sm u t a t e da n dat 7t e r m i n a t o rw a sf u s e dt o i t s3 e n dr e s u l t i n gi nt h et w o e x p r e s s i o nv e c t o r sp u c l l 8 - f 1 s p a g f pa n dp h y 3 0 0 一f 1 s p a g f p t h ef u s e dp r o t e i n w a sc o n f i r m e d e x p r e s s e di ne c o l id h 5 ab y w e s t e r nb l o ta n a l y s i s r a p d a n a l y s e sw e r e c o n d u c t e do n g e n e t i cp o l y m o r p h i s m s o ft w e l v ef i rg e n o t y p e s t o i d e n t i f y t h e i r r e l a t i o n s h i p s t h e s eg e n o t y p e s i n c l u d e d e i g h ts u p p o s e dh y b r i d t a x o d i u mm u c r o n a t u mt e n o r ef o r e s t s a m p l e s a n dt h e h y b r i df e m a l e - p a r e n 卜l h l u c f o h a t n ? t e n o r ea n dt h es a m ec l a s so f h y b r i dm a l e - p a r e n 卜一c r y p t o m e r i a f o r t u n e i t t o o i b r e n ka n ds u g ic d a p o n i c a ( l f _ 1d d o n 1 7o f31 p r i m e r sw e r es e l e c t e dt ou s e f o rs e p a r a t e a m p l i f i c a t i o n r e a c t i o n sw i t hd n af r o m 12 g e n o t y p e s 1 6 4r a p d t i a g m e n t sw e r ep r o d u c e da n d9 8 8 o f t h e ms h o w e dp o l y m o r p h i s m t h er e s u l t s r e v e a l e dt h a tt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i po fs a m p l en o 11 i nt h r e ec r y p t o m e r i ag e n o t y p e s i st h ec l o s e s tt ot h eo r i g i n a lm a l e p a r e n t ；t h es a m p l e sn o 1 ，4a n d9 a r em o s t p o s s i b l y t h et r u eh y b r i dzm u c r o n a t u mt e n o r ep o p u l a t i o n s ；t h es a m p l en o 5m a y b et h ef a l s e h y b r i d c o n c l u s i o n s c o u l dn o tb ed r a w nf r o mt h ed a t ai nh a n df o rt h er e s ts a m p l e s 文献综述 1 植物抗真菌蛋白的分离及基因克隆的研究进展 真菌是一类营养体通常为丝状体，具细胞壁，异养的，以产生孢子的方式繁 殖的真核生物。真菌病害是造成农林生产损失的主要因素之一，作物病害的8 0 由病原真菌所引起，如霜霉病、自粉病、锈病、黑粉病等。据统计，每年欧洲小 麦生产二因真菌病害而损失约l 亿美元( 崔晓江1 9 9 4 ) 。1 8 4 5 18 4 6 年，欧洲曾冈 马铃薯晚疫病爆发面饿死几十万人，有1 5 0 万人逃荒迁居美国；1 9 7 0 年，美困 丘米小斑病流行，造成经济损失达1 0 亿美元。我国解放前，仅因小麦锈病和黑 穗病每年就损失粮食6 0 亿公斤。直到今天，真菌病害仍是世界范围内限制作物 产量的重要因素之一。植物受侵染后，常常引起叶片枯萎或者死亡，导致光合作 用能力下降，作物减产。针对真菌病害尚无特剐有效的方法，传统的策略有三个： 一是采取合适的栽培预防措施，如轮作、避免受侵染土壤和带病原植物的传播等： 一是使用化学杀菌剂：三是选育并采用抗性品种。这些方法虽然有效，但却各有 无法克照的缺点。轮作可能控制或减轻某些病害的发生与危害，但也可能加重另 外一些病害的发生。化学杀菌剂成本较高，且最终导致真菌的抗药性，其残毒会 危害人类和其它生物，造成环境污染等问题。抗病育种需时长，病原小种的分化 速度往往超过品种更新换代的速度，难以对新病原小种作出及时反应。近年来由 于对植物抗病反应机制及植物病原真菌致病机理的深入研究，研究者们提出了较 多利用基因工程技术控制植物真菌病害的设想。其中一条思路就是：从植物中分 离对真菌具有抑制作用的蛋白，克隆相关基因，转化烟草或做成其它转基因植物。 这方面的工作已初见成效。 】1 几丁质酶( c h i t i n a s e ) 几丁质酶是高等植物普遍存在的一种与抗真菌病害有关的酶。很多植物病原 真菌细胞壁的主要成份就是几丁质。几丁质酶主要水解几丁质多聚体$ - l ，4 键， 产生n ，乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用，也可以是内切作用，研究 得较多的是内切几_ r 质酶。它的分子量通常为2 5 3 6 k d ，多为单体，呈酸性或 碱性，等电点或高或低，抗蛋白酶，最适作用p h 值为6 左右，但变化幅度较宽， 5 0 。c 时酶活也稳定。许多提纯的植物几丁质酶还具有不同程度的溶菌酶特性。 几丁质酶通常可被包括病原真菌、植物寄生真菌、真菌细胞壁成分等多种不 相关的诱导因子所诱导。诱导可以发生在不同的组织和器官中，包括胚、种子、 根、茎、叶、花、愈伤组织、悬浮细胞等。高等植物中几丁质酶的表达是连续的， 通常含量较低，但经病原真菌侵染后，可诱导植物体内产生大量的几丁质酶。 s c h l u m b a u m 等( 1 9 8 6 ) 首先证实，菜豆积累的几丁质酶经过提纯，在体外能强烈 抑制真菌菌丝的生长和饱子萌发。主要通过水解真菌菌丝的生长端点来抑制真菌 7 e 长。病原真菌细胞壁中几丁质的降解，不仅破坏细胞新物质的沉积，致使病原 体死i 、：，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从而刺激寄主植物的抗性反应。 几丁质酶的定位研究也表明，几丁质酶总是在入侵植物体内的菌丝周围积累 ( b e n h a m o u19 9 0 ) 。 由丁真菌细胞壁残片可以诱导植物防卫反应，因此也有人认为，几丁质酶在 植物中也许不是直接参加防御反应，而是通过水解侵入的真菌细胞壁产生激发 子，启动植物的防御反应，导致植物产生和积累与抗病有关的酚类化合物和木质 素等。 在同植物中通过诱导可产生几种相关的几丁质酶。初步认为几 一质酶是由 1 个小的撼冈家族编码的，这些几丁质酶既有分泌于胞外的，也有定位于胞内的。 根据儿t 。质酶的氨基酸顺序及其初级结构，将几丁质酶至少划分为4 个类型 f c o l l i n g e19 9 3 ) 。 几丁质酶基因在植物抗真菌基因工程中的应用策略主要有2 种：( 1 ) 将几_ 丁 质酶基因引入根围细菌，使该工程菌表达分泌几丁质酶：( 2 ) 克隆的几丁质酶基 因在启动子的作用下，在转基因植物中超量表达，研究转基因植株对病原真菌的 抗性是否增加。所转植物一般为烟草，也有的是甘蓝型油菜。所用的启动子多为 c a m v3 5 s 。现在已对许多植物的j l _ 丁。质酶基因进行了分离克隆和测序( 表1 ) 。 几丁质酶转基因研究近几年获得了一些规律性的结果：( 1 ) r 有特定几丁质 酶才具有较高的抗真菌活性。目前，能成功地增加转基因植物对病原真菌侵染抵 抗作用的几丁质酶多为ia 型。v i e r h e i l i g 等( 1 9 9 3 ) 研究了ia 型几丁质酶的j l + 质结合部分，该部分是约4 0 个氨基酸的富含胱氨酸的n 端和c 端定位液细胞信 号对转基因烟草几丁质酶的表达和抗真菌作用的影响，发现c 端定位液胞信号 对转基因植物抗立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 的侵染至关重要，而缺失了几丁 质结合部位的几丁质酶的活性则无明显变化。( 2 ) 如果有p 一1 ，3 葡聚糖酶等抗真菌 蛋白的协同作用，几丁质酶的抗真菌作用更佳。s e l a b u u r l a g e 等( 1 9 9 3 ) 联合使用 la 型几丁质酶和b 一1 ，3 葡聚糖酶对f s o l a n i 的体外抑菌试验获得了较单独使用更 好的效果。同时导入两种基因的转基因西红柿表现出了对病原菌f o x y s p o r u m 更 强的抗一陛。( 3 ) 几丁质酶的作用存在着剂量效应，转基因植株中随着几丁质酶和 b 1 3 葡聚糖酶基因拷贝数的增加，转基因植株抗性也越来越高( z h u1 9 9 4 ) 。( 4 ) 必须考虑病原真菌本身习性的影响。对于胞问生长的菌丝，在转基因植株中，如 果再转入分泌于胞间的碱性几丁质酶基因，对增加其抗性会有所帮助( n e u h a u s 1 9 9 1 ) 。 表1 已克隆的几丁质酶基因f 周淼平1 9 9 8 ) t a b l e1c l o n e dc h i t i n a s e sg e n e 植物克隆类型植物克隆 类型 c d n aiac d l q a 赤豆 松树 g e n e i i g e n e i i ，i i ic d n aia 拟南芥菜白杨 g e n e c d n aib ，i ic d l n ala 大麦马铃薯 g e n e c d n aiae d n a 菜豆 c d n a 油菜 g e n e ia ，t g e n e g e n e c d n aia 鹰嘴百水稻 g e n e c d n ah ic d n a ia ，i i i ，i v 黄瓜甜菜 g e n e c d l 、j a 1 3 d 1n aia ，i i 玉米烟草 g e n e c d n a c d n aibc d n aia ，i i 豌豆西红柿 g e n e ia c d l n aia g e n e ib 花生小麦 g e n e i i 矮牵牛 e d n ai i 1 2 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶( p - 1 ，3 一g l u c a n a s e s ) b 1 ，3 葡聚糖酶在高等植物内广泛分布，它们在植物正常的阶段发育中发挥 重要作用，如韧皮部运输、胼胝质的运动、细胞壁合成、花的发育等等。6 - 1 ，3 葡聚糖酶是植物过敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 中合成的重要水解酶类， 在植物的抗病过程中扮演着重要角色。6 - 1 ，3 葡聚糖和几丁质是真菌细胞壁的重 要结构成分，在许多真菌的菌丝尖端，6 1 ，3 葡聚糖和几丁质暴露在表面，能够 直接受到p l ，3 葡聚糖酶和几丁质酶的攻击( s e l i t r e n n i k o f f 2 0 0 1 ) 。体外抑菌试验表 明，p 一1 ，3 葡聚糖酶对菌丝生长具抑制作用( k i m1 9 9 7 ) 。不过，只有液泡定位的碱 性葡聚糖酶能够降解菌丝壁，而胞间定位的类型则没有抑菌活一陆( a n f o k a1 9 9 7 ) 。 更为重要的是，在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多 种抗病反应的激发因子，诱导植物的全面抗病反应( k l a r z y n s k i2 0 0 0 ) 。在大豆巾， 已经发现葡聚糖激发子结合蛋白g e b p ( g l u c a ne l i c i t o rb i n d i n gp r o t e i n ) ，定位于 大豆根部细胞的质膜上，能够特异性地结合b l ，3 葡聚糖降解过程中释放出来的 寡糖激发子，诱导植物的防卫反应( 1 4 a m1 9 9 7 ) 。 b 1 ，3 葡聚糖酶的作用方式如图1 所示，由病原或植物信号因子诱导，经过 系列的反应，植物b 一1 ，3 葡聚糖酶( 包括胞内积累的碱性类型和胞间积累的酸性 类型) 大量合成。b 1 ，3 葡聚糖酶直接攻击真菌菌丝上的葡聚糖，抑制真菌的生氏， 同时，水解中产生的寡糖作为植物h r 中的激发予，诱导植物的防御反应。 瘸原茁 碱性葡聚 s a 和乙烯 叶询聚糖酶一 酸性葡聚糖酶 图13 - 1 ，3 葡聚糖酶抵抗病原真菌的机制 f i g 1a n t i f u n g a lm e c h a n i s m o f1 3 - 1 ，3 一g l u c a n a s e s 迄今，1 3 - 1 ，3n n n n 垄；n 已经转入到烟草、猕猴桃和玫瑰等植物中，获得 了转基因植株，其抗性表现不尽一致。更多的转化研究侧重于将1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶 基因和几丁质酶基因共同导入受体植物基因组中( 表2 ) 。对于卵菌纲的真菌而占， 由丁其菌丝壁不含几丁质，转化几丁质酶基因没有效果，导入3 - l ，3 葡聚糖酶基 因则更有意义。然而，迄今为止，没有证据表明该酶在“瘸原一寄主”的相互作用 为“基因对基因”模式，而更为可能的是，该酶参与的是一种对病原攻击的广泛的、 非特异性的反应。 表2b 一1 ，3 葡聚糖酶基因抗真菌基因工程研究 t a b l e2a n t i f u n g a lr e s e a r c hi nt r a n s g e n i cp l a n t so f3 - 1 ，3 - g l u c a n a s e sg e n e 植物外源罐幽抗病效果参考文献 烟荦 烟草1 3 - 1 3 葡聚糖酶抗性提高( p 咖t o p h t h o r ap a r a s i l i c a 和 l u s s o1 9 9 6 p e r o n o s p o r at a b a c i n a ) 猕猴桃 人豆1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶抗性提i 目q ( b o t r y t i sc i n e t e a l n a k a m u r a1 9 9 9 嫂现 大麦8 - l ，3 葡聚糖酶没有效果f p l o c a r p o a ，w ) d 曲m2 0 0 1 烟草烟草b - i ，3 葡聚糖酶和几丁质酶 有抑制效果( f u s a r i u ms o l a n i ) s e l a - b u r r l a g e1 9 9 3 烟草 凸措1 3 - i 3 葡聚糖酶和水稻几丁质酶症状减轻( c e r c o s p o r an i c o t i a n a e ) z h u l 9 9 4 番茄 烟草1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质酶症状减轻3 6 5 8 j o n g e d i j k1 9 9 5 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m fs pt y c o p e r s i c i ) 烟草 人麦b - 1 , 3 葡聚糖酶和几丁质酶症状减轻( r h i z o c t o m as o l a n i ) a c h1 9 9 5 菖精 出稽1 3 - i ，3 葡聚糖酶和水稻几丁质酶抗性提高 p h y t o p h t h o r am e g a s p e r m a ) m a s o u d1 9 9 6 投有效果 s t e m p h y l i u m 扫l f a e ) 胡萝h烟草f 3 - 1 ，3 葡聚糖酶和水稻几丁质酶抗性增强叫l t e r n a h a d a u c i , a m e l c h e r s2 0 0 0 r a d i c i n a ，c e r c o p o r ac a r p t a e ，e p y s i p h e h e r a c l e i ) 油菜烟草b l ，3 葡聚糖酶和水稻几丁质酶 f & l e r o t i n l as c l e r o t i o r i u m )蓝海燕2 0 0 0 烟学烟草b 1 ，3 葡聚糖酶和水稻几丁质酶症状减轻“h e r n a r i aa l t e r n a t a ) 箍海燕2 0 0 0 1 3 核糖体失活蛋白( r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n g p r o t e i n ，r i p ) 核糖体失活蛋i ! t ( r i p ) 来自植物，如大麦和小麦种子中的r i p ，它是一类特殊 的r n an 一糖苷酶型，能水解真核细胞核糖体2 8 sr r n a 上某一位碱基的n c 糖 苷键，释放一个碱基，从而阻碍蛋白质的合成。r i p s 并不作用于自身的核糖体， 只识踟亲缘关系较远的真核生物，包括真菌。提纯的大麦刚p 在体外能抑制真菌 的生长。将大麦r i pc d n a 基因置于一种受伤诱导的启动子控制下，转化烟草， 转基因烟草和对照植株相比，在立枯丝核菌( r 矗据o c 向n 胁s d 肠n f ) 侵染的情况下， 抗病性增强( l o g e m a n n1 9 9 2 ) 。体外实验表明，r i p s 和几丁质酶共同作用能大大 增强r i p s 杀灭真菌的作用，这可能是因为真菌细胞壁的破坏有助于r i p s 进入真 菌细胞内的缘故( l e a h1 9 9 1 ) 。 1 4 其它抗真菌蛋白 1 4 1 天麻抗真菌蛋白( g a s t r o d i a n i n l 天麻( g a s t r o d i ae l a t ab 1 ，) 是真菌寄生类型的兰科植物。它在与密环菌长期的 相互作用中，形成了一套有效的抑制及消化真菌的机制，一方面，密环菌侵染营 养茎是天麻取得营养物赖以生存的必要条件，另一方而，天麻为了自身的正常生 氏发育，严格限制密环菌的侵染范围。在营养茎中密环菌侵入不能越过皮层，顶 生球茎则从形成直至抽薹，一直处于拒菌状态，从而成为研究植物与真菌相互作 用的良好模式系统之一。1 9 8 8 年，胡忠等报告了从天麻中分离出一种对木霉和 密环菌菌丝生长有强抑制作用的蛋白，命名为天麻抗真菌蛋白，简称g a f p 。对 不同天麻材料的g a f p 分析表明：g a f p 的相对分予量为1 4k d ，等电点可能不 问，变动范围8 1 9 3 。体外抑菌试验证明g a f p 对腐生性真菌如木霉和密环菌 等有强抑制活性，半抑制浓度i c0 5 为o 0 8m g m l ；对寄生性真菌如棉花枯萎 病和稻瘟病作用很弱。对球茎生长期中7 个生长阶段g a f p 的含量测定和g a f p 免疫荧光组织定位观察证明g a f p 是营养茎被密环菌侵染诱导而大量合成的，合 成部位呵能是大担细胞：g a f p 由营养茎输送到顶生球茎，积累于皮层细胞中， 是皮层细胞的主要蛋白成分。g a f p 是天麻的一种重要功能蛋白质，是使顶生球 茎处于拒菌状态的主要物质。 x u 等( 1 9 9 8 ) 在1 9 9 7 年从人工栽培的黄天麻中分离得到一种抗真菌蛋a g a f p 1 ，该蛋白在体外对梨腐烂病菌、立枯丝核菌及灰葡萄孢等植物病原真菌 均有明显的抑制作用。王晓晨等( 1 9 9 9 ) 依据g a f p 1 的n 端部分氨基酸序列设计 简并引物，通过r a c e 的方法扩增得到g a f p 一1c d n a 全长。该c d n a 包含一个 编码1 7 1 个氨基酸的o r f ，5 端有一个氏为5 5b p 的非编码区，终止密码子r 游有一个1 4 1b p 的3 端非编码区。经检索发现，该基因的推导蛋白序列与火烧 兰f e p i p a c f 括h e l l o b o r i n e ) 和二叶兰( l i s t e r ao v a t a ) 的苷露糖结合蛋白以及雪花莲巾 的二背露糖结合凝集素具有很高的同源性。 1 4 2 杜仲抗真菌蛋( e u c o m m i aa n t i f u n g a lp r o t e i n ，e a f p ) 刘小烛等( 1 9 9 4 ) 从杜仲( e “c o 朋衙u l m o i d e so l i v ) 皮中分离纯化到一种新的抗 真菌蛋白，简称e a f p 。e a f p 是不含糖的简单单链蛋白，分子量为5 0 k d ，其 等电点大于1 1 , 0 。它具有很高的热稳定性，蛋白在沸水中保温3 0m i n 活性不变。 0 3 m g m le a f p 对绿色木霉和小麦赤霉菌的生长有明显的抑制作用。不过目前 尚未见该基网被克隆冉来的报道。 1 4 3 萝p 抗真菌蛋白( r s 一- a f p l 在行营养生长的植物组织中，系列的动态防御机制可以为受伤或者微生物 侵染所触发。新合成的碳水化合物能够沉积在植物细胞的细胞壁上，以阻止真菌 菌丝的侵a ( a i s t1 9 7 6 ) ，伤1 2 1 处原有的细胞壁蛋白将进一步氧化交联在一起以修 复伤口l i b r a d l e y1 9 9 2 ) 。这两利，反应均为细胞壁的防御反应。此外，植物还会在局 部区域进步产生小分子量的名为植物抗毒素的次生代谢物，以阻碍病原菌等的 攻击( v a ne t t e n1 9 8 9 ，m a h e r1 9 9 4 ) 。并且，一旦植物遭遇病原菌的侵袭，许多据 推测与防御反应相关的蛋白的合成将被诱导( l i n t h o r s t1 9 9 1 ) 。所有这些蛋白被称 为发病机理相关蛋白( p a t h o g e n e s i s f e l a t e dp r o t e i n s ，p r - 蛋白1 。目前，有5 个p r 一 蛋白家族的成员在体外抑菌试验中显示出抗真菌活性( m a u c h1 9 8 8 ) ，一些p r 蛋 白在转基因植物中表现出更高的抗真菌能力( b r o g l i e1 9 9 1 ) 。许多胁迫信号不仅可 诱导近处的如感染部位附近，而且同样可以发动远处的、未受胁迫的叶片里的防 御蛋白的合成，这种现象称之为系统获得性抗性。植物抗拒并发感染的免疫信号 分子晟具代表性的是水杨酸( m a l a m y1 9 9 0 ) , f n 甲基莱莉酮酸酯f f a r m e r1 9 9 2 ) 。最 后，植物和病原菌之间的相互作用可以引发局部区域的细胞坏死( d i x o n1 9 9 0 ) ， 植株在侵染部位形成枯斑，包围病原菌，阻止其蔓延。这种超敏反应也许可以用 “基因对基网”学说加以最合理的解释( e l l i n g b o e1 9 8 1 ) 。这是植物中显性抗性基因 的产物与病原体小种特异的引物相互作用的结果。这方面研究得最透彻的一个例 子是不同的番茄品系和不同的黄枝孢( c l a d o s p o r i u mf u l v u m l ) 小种之间的相互作 用。在植物中，黄枝孢产生小种特异性的激发子0k d 富含半胱氨酸的多肽) ， 由此仅在含对应抗性基因的番茄植物中才能启动超敏反应( d e w i t1 9 9 2 ) 。超敏反 应的发生由植物病原体相互作用的早期阶段所产生的活性氧化物所介导 ( l e v i n e1 9 9 4 1 。因此，植物营养组织的防御机制已经研究得非常广泛和深入。尽 管如此，有关种子在为众多微生物严重污染的土层下面是采用何种策略得以存活 并发芽这一问题却知之甚少。在种子发芽过程中，一个特别容易受侵染的阶段是 发芽早期，此时种子有力的天然物理屏障种皮被破坏，幼苗已经暴露在土壤 中。t e t r a s 等f 】9 9 2 ) 从萝h 种子中发现了一个全新的5k d 大小并富含半胱氨酸 的抗真菌蛋白家族。该家族包括两种同源异构体抗真菌蛋白r s - - a f p l 和 r s a f p 2 ，两者在萝h 种子的含量几乎相等，试验证明r s a f p s 对丝状真菌具有 广谱抗性。它们位于种子细胞的细胞壁，主要产生于细胞外层中，种子发芽时一 旦种皮破裂就优先释放出来。所释放的蛋白数量足以在种子周围形成微环境，从 而有效地抑制了真菌生长。两者的e d n a 以及含内含子的编码r s - a f p s 前体蛋 白的基因序列均被克隆。含r s a f p 2 嵌合体的转基因烟草在c a m v3 5 s 启动予 的调控下表现出列叶片瘸原真菌a l t e r n a r i ai o n g i p e s 更高的抗性。 1 4 4 水稻抗真菌蛋白( r a f p ) 水稻是最重要的粮食作物之一，全世界已发现的2 4 0 多种水稻病中，真菌性 病害占9 0 ( 梁光商】9 8 3 ) ，由此丽造成的损失是十分巨大的。研究者们发现在 水稻种子的萌发期存在着抑制真菌生长的蛋白，它们可能在水稻萌发期的防御机 制中超重要作用。刘虹等f 1 9 9 4 ) 从萌发的水稻种子中分离并纯化了一种能抑制多 种病原真菌生长的蛋白( 简称为r a f pi1 。在p d a 培养基上，2 0l a gr a f pi 可明 显抑制术霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 菌丝的生长，此蛋白还具有较广的抗真菌菌谱， 其分子量为1 6 5 9k d ，等电点为8 7 ，测序得到了其n 端2 0 个氨基酸序列，此 硕j _ ：作为分离此基因打下了基础。王槐春( 1 9 9 4 ) 将r a f pi 的部分序列对蛋白质 序列数掘库进行了快速类似检索，令人惊讶地发现r a f pi 与水稻胰蛋白酶抑制 齐l j ( r i c eb r a nt r y p s i ni n n b i t o r , r b t i ) 的n 端2 0 个氨基酸序列极其相似，总共2 0 个位置上有1 8 个位置的残基相同，从概率上推断两者实际上应该是同一个序列， 因而提出一个观点水稻抗真菌蛋白是否就是一种胰蛋白酶抑制剂。 1 4 5 橡胶蛋白( h e v e i n ) 橡胶蛋白是一种存在于巴西橡胶树( h e v e ab r a s i l i e n s i s ) 孚l 管细胞特化的液泡 黄色体内、与几丁质结合的小分子单链蛋白质，其分子量为4 7k d ，由4 3 个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸和苷氨酸。v a n 等( 1 9 9 1 ) 年u 用橡胶蛋白与几丁 质结合的能力，通过亲和层析得到了纯化的橡胶蛋白，并指出它是一种典型的植 物；_ l ；l 集素。b r o e k a e r t ( 1 9 9 0 ) 1 - 丑s l 管细胞的总m r n a 构建的e d n a 文库作模板，通 过p c r 反应获得了编码橡胶蛋白的1 0 1 8b p 组成的c d n a 克隆( h e v l ) 。h e v l 包括编码2 0 4 个氨基酸的开放阅读框，其中分为由1 7 个氨基酸组成的信号肽序 列、4 3 个氨基酸的高度保守的n 端区域和1 4 4 个氨基酸残基的c 端区域三部分。 橡胶蛋