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中文摘要 中文摘要 生命科学被誉为2 1 世纪的最前沿科学之一。随着人类第一张基因序列草图的完成 和发展，生命科学的研究正在进入一个崭新的后基因组学，即蛋白质组学时代。正如基 因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管电泳测序技术一样，借助于现代生物质谱 技术，后基因组研究将得到迅猛发展。而现代分离技术和生物质谱的联用技术，极大地扩 展了生物质谱的应用领域，正在成为生命科学研究中必不可少的技术支撑。 我们利用反相高效液相色谱电喷雾离子阱质谱联用技术，研究建立了对n 磷酰化 氨基酸与核苷混合反应体系中的单核苷酸，二核苷单磷酸和二核菅二磷酸等产物的 h p l c ，e s i m s 分离分析方法，并利用多级质谱技术建立了分析确证二核苷酸序列的质 谱学方法，解决了没有标准样品无法确证生成二核苷酸序列的问题。在吡啶介质中，我 们选择了四种最古老的磷酰化氨基酸与核苷反应，体系中观察到了单核苷酸，二核苷单 磷酸和二核苷二磷酸等产物，并通过对其裂解规律和特征离子的研究，目标产物也得到 了验证。结果发现，不同反应体系所产生的核苷酸种类和含量都不嗣，表明不同氨基酸 与核苷混合液反应时存在着活性差异。该研究结果将为“磷酰化氨基酸为生命起源过程 中核酸、蛋白质共同起源”学说，提供一定的实验数据和先进的研究方法。 我们还应用反相高效液相色谱一电喷雾离子阱质谱联用技术对兰索拉哗产品纯度进 行分析和考察，并对兰索拉唑生产中产生的副产物进行了结构鉴定。实验结果表明此方 法选择性好，灵敏度高，不需要标准对照品，操作简便。本研究为评价兰索拉唑质量提 供了较好的检测方法，为优化兰索拉唑工艺提供了技术依据。 关键词：反相高效液相色谱一电喷雾离子阱质谱联用，生命磷化学，磷酰化氢基酸，核 苷，单核茸酸，二核苷单磷酸，二核苷二磷酸，兰索拉唑。 a b s t r a c t u f es c i e i l c eh a sb e e r e g n i z e da so n eo ft h em o s tf i o n t i e r so ft h e2 1 酿 c e n t u r y w i t ht h ec o m p l c t i o no ft h em a p p i n go ft l l eh u m a ng e n o m e ，l i f cs c i e n c ei s p r o g r e s s i n gi n t ot h ep m t e o m i c sa g e s j m i l a fi ot h ef i f s tg e n em a p p i n gw h i c hw a s c o m p l e t e da h e a do fs c h e d u i eu s i n gac a p i l l a r ye l e d r 叩h o r e s i ss e q u e n c et e c h n i q u e ， p r o t e o m i c sr e s e a r c hw m a l s od e v e l o pq u i c k l yb e c a u s eo f t h ej n t r o d u c t i o no ft h e m o d e mb i o - m a s s s p e c t f o m e t r y ( b i o - m s ) t e c h n i q u e t b g e t h e rw i t hm o d e m s e p a r a t i o nt e c h n i q u e s ，t h ea p p l i c a t i o ns c o p e so ft h eb i o - m st e c h n i q u ew i l lb e e x t e n d e d ， a i l d l l j g hp e 订b 瑚a n c el i q u i dc h r o m a t o 掣a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c ，m s ) c o u p l i n gt e c h n i q u ei sb e c o m i n gan e c e s s a r ys u p p o r tt e c h n i q u ef o rl i f e s c i e n c er e s e a r c h i ni h ec h a p t e r2a n d3 ，u s i n ge l e c l f o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i m s ) ， h p l c m sa n do t h e ra n a l y t i c a l t e c h n i q u e s ，w eh a v ee s i a b l i s h e dah p l c 鹰s i ，m s m e l h o d o l o g yf o rs i m u l t a n e o u s l yd e t e r m i n i n gt r a c em o n o n u c l e o s i d em o m o p h o s p h a t e ， d i n u c l e o s i d e m o n o p h o s p h a t e a n dd i n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e i n p y r i d i n e r e a c t i o n b e t w e e nf o u ro l d e s in 一( o ，d d i i s o p m p y l ) p h o s p h o r y la m i n oa c i d sa n dt h em i x e d n u c l e o t i d e s ( a + c + g + u ) 1 n t h i s s y s t e m ， m o n o n u c l e o s j d e m o m o p h o s p h a t e ( x m p ) ，d i n u c l e o s i d em o n o p h o s p h a t e( x p y ) a i i dd i n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e ( x p y p - c y c l o ) ( x ，y = a ，c ，g u ) w e r eo b s e r v e d ，t h ep o s s i b l et a 唱e p r o d u c t sw e r e v a l i d a l e db ya n a l y z i n gt h e i rc l e a v a g ep a t l l w a y sa n dt h e j rc o e s p o n d i n gs p e c i f i ci o n s a tt h es a m et i m e ，h p u c - e s i m s m sw a su s e dt o i d e n t i f yt h es e q u e n c e so f d i n u c l e o t j d e s b a c k b o n e 仃a g m e n t a t i o nw a sc h a r a c t e r i z e db ya b u n d a mc i o n sa st 上l e m a j o rs e q u e n c e - d e f i n i n g 仃a g m e n ti o ns e r i e s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e d 也a tt h ef o u r m o d e lr e a c t i o n sp r o d u c e dd i 日f c r e n tk j n d so fx m p ，x p ya n d ) ( i y p - c y c l oa tv a r i o u s f a n g eo fc o n t e n t s ，w h i c hw 船a t t r i b u t e dt ot h ed i 丘- c r c n tr e a c t i o na c t i v i t y 孤ds e l c c t i v “y _ n i sh p l ( 狂s “m st c c h n i q u ec o u l db ep o t c n t i a l l yu s e dt of u r t h e ri n v e s t i g a t es i m i l a f r e a c t i o n sb e t w e e nd i p p a a 锄dt l l em i x e dn u d e o s j d e s i tm i 曲lp r o 啊d ee x p e f j m e n | a 】 p m o ff 研t h ea s s u m p t i o no fd i p p a ab e i n gt h es m a l l e s ti n t e 珊e d i a t co fc 0 - o f i g i no f 加c l e i ca c i d sa dp r o t e i n sd u 血g 埘g i n so fl 如 a b s t r a c t i nt l l ec h 印t e r4 ，t h ep i i r i t yo fl 卸s o p 批r o l ei l lt h em c d i c i n ea n dt l l e s t n l c t u r eo fs u b s j d i a r yp f o d u c tw e r ed e i e 蛐j n e db yr p h p u c - e s i m s m f s t h ef e s u i t i i i n d i c a t et h a tt l l i sm e l h o dh a sh i g l ls d e c t i v “y 柚ds e n s i t i “t y - ；t h es t 锄d a r do o n l r 鹅t s a m p l ci sn o tn e c e s s a r y 姐di ti se 醛yt 0c o n t m l 0 u rr e s e a r c hp r i v i d eab e t t c rm e t 量1 0 d f o rd e t e 册i n a t eo fl 柚s o p f a z o i e sq u a l l t i t y 蛐dat e c h o l o g ys u p p o r tf o r0 p t i m i s eo f l a n s o p r a z o l e sc r a f t 。 k e y w o r d s ：r p - h p l c - e s i - m 刚咙s ，l j f ep h 唧h o rc h c m j s t r y p h o s p o r y l a t j o n a m i n oa d d ，肌c l c o s i d e ，n u d e o t i d em o n o p h o s p h a t e ，d i n u c l e o s i d em o n o p h o s p h a 把， d i n u c l e o s i d ed i p h o s p h a t e ，i 且n s o p r a z o l e m 郑重声明 本人的学位论文是在导师的指导下独立撰写并完成的，学位论 文没有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则本人 愿意承担由此产生的一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ：宙书瀑 二年6 月弓日 第一章绪论 第一章绪论 2 1 世纪是生命科学的世纪，生命科学涉及到每个人的健康和生活问题；同时，生命 科学中又有许多高尖端科学技术问题等待科学家去解决，生命的起源与进化就是当代最 难解决的科学难题之一。随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究 也将进入一个崭新的后基因组学，即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于 大规模全自动毛细管测序技术一样，后基因组研究也将会借助现代生物质谱技术等得到 迅猛发展。而现代分离技术和生物质谱的联用技术，极大地扩展了生物质谱的应用领域， 在生命科学的研究中成为必不可少的技术支撑。 1 1 生命磷化学 1 1 1 磷与生命 生物体系极其复杂，但组成生物体的元素仅有碳、氢、氧、氮、硫、磷等十几种元 素。磷在生物体内的含量大约占元素总量的1 左右，但它却是组成生命活体至关重要 的元素。磷在体内主要以羟基磷灰石( 3 c a 3 ( p 0 4 ) 2 c a ( 0 h ) 2 ) 的无机盐形式存在于骨和 牙齿中，占其总量的8 7 6 ，部分磷以h p 0 4 0 和h 2 p 0 4 的形式存在于血、尿和组织液中， 起调节p h 值和c a 、p 平衡的作用，其余的磷则以磷酸酯、磷酸焦酯和三聚磷酸酯衍生 物的形式存在。 随着科学的发展，越来越多的事实表明磷在生命中的重要作用。首先组成遗传物质 的d n a 和r n a 由磷酸二酯键桥连核苷而成，细胞膜的主要组成部分是磷脂双分子层， 许多细胞代谢中间体如甘油磷脂和肌酸磷脂是磷酸酯，c a m p 、c g m p 、i p 3 是细胞间通 讯的第二信使，a r p 具有高转移潜势的磷酰基，常作为细胞内许多生化反应能量的供体， 辅酶n a d h 等也是核苷酸类衍生物；此外，磷酯类的盐是生物矿物质( 如骨头) 的主 要成份。另一方面，蛋白质酶的可逆磷酰化调控着基因转录、翻译、表达、肌肉收缩、 跨膜信号传导等一系列生命过程中十分重要的环节。 从化学意义上讲，磷参与的绝大部分生命过程，其化学本质基本上都是磷酰基转移 反应。随着有机磷试剂在有机合成中的应用越来越广，新的磷试剂不断的被开发。1 9 4 1 年，u p m a i i n 提出了在蛋白质的合成中，含有羧酸和磷酸的混合酸酐的假设，引起了多 肽化学家对有机磷试剂的极大兴趣，并开展了许多有机磷试剂作为催化剂合成多肽，磷 试剂既可以作为氨基保护基，又可作为羧基活化试剂。1 9 4 5 年a t h e n o n 及1 b d d 等人发 现a t h e n o n t o d d 反应【1 】使得合成磷酰胺及其酪类衍生物得到了极大的发展。 赵玉芬教授领导的研究小组，不断地对a l h e n o n t o d d 反应进行改进和发展，并把 该反应扩展到水相，在水、醇、四氯化碳和三乙胺存在下，使氨基酸与二烷基噩磷酸酯 郑州大学硕士论文 真接反应，成功对氨基酸进行了磷酰化改造。数年来，她所领导的研究小组在亚磷酸酯 的制备、反应活性、氨基的保护、羧基的活化、小肽的合成等诸多方面开展了卓有成 效的研究【盈。用磷酰基作为氨基保护基，刨立了氨基酸及小肽的直接磷酰化的方法。稳 定的m 氨基酸在n 磷酰化后性质变得非常活泼，这些n 磷酰化氨基酸及小肽可以发生 自身成肽【3 _ 1 0 】、成酯【1 1 - 1 3 1 、磷上酯交换”16 1 、磷酰基的n o 迁移反应7 】。通过对氨基 酸和磷酰化氨基酸的质谱方法研究，可以清楚的看到磷酰化氨基酸具有明显的质谱增敏 效应，能显著提高质谱信号的灵敏度等；分子生物学实验表明，些磷酰化氨基酸还具 有一定的生物活性，具有一定的生物学意义。研究组在实验过程中还发现，n 磷酰化氨 基酸能够在没有任何其他催化剂、脱水剂和能量给体( 如a r p ) 的情况下，与核苷反应 生成核苷酸【l ”，揭示了磷的生命化学本质是磷酰基的主动参与以及其他官能团精密调 控的协调过程1 2 0 j ，提出了“磷是生命化学过程的调控中心”的崭新学术观点。因此，n 一 磷酰化氨基酸被认为是生命起源过程中核酸、蛋白质共同起源的最小模型【2 1 - 矧，从这一 模型出发，可以合成出不同种类的多肽和寡核苷酸。 n 一磷酰化氨基酸不仅具有多样的化学性质，而且具有广泛的生物活性。在免疫、 医药、农药、保健、化妆品、生物技术等领域有着广阔的应用前景1 2 4 - 2 6 】。 磷在生命化学中独特的地位引起了很多科学家的注意，哈佛大学的w e s t h e i m e r 教 授从物理有机化学的角度阐述了大自然为什么为生命选择了磷1 2 7 】，诺贝尔奖得主 l t o d d 教授更是认为“磷主宰了生命”1 2 8 j ，提出“w h e r et h e r ei s1 i f e ，t h e r ei sp h o s p h r u s ”的著 名论断，甚至于在太空中寻找生命也用磷来作为标识i ”j 。这些无疑大大刺激了人们去了 解在生命从简单分子到复杂体系这一漫长过程中，组成生命的基本物质是怎么与磷相互 作用而逐渐进化到像现在这样精巧复杂的高等生命。 1 1 2 磷与生命起源 地球超源于4 5 亿年前，那么地球上的生命是从何时开始，又是如何产生的呢? 这 个问题至今仍是当代最难解的科学之谜之一1 3 0 _ 3 4 】。许多实验事实证明，磷在前生物条件 下对生命分子，如氨基酸、碱基、核苷、核苷酸、肽、寡聚核苷酸、核酸等的合成起着 十分重要的作用。 1 9 5 3 年，s t a n l e vl m i l l e r 在他的导师h a m l du r e v 指导下，用一个回流装置循环 水蒸气和气体c 凰，n h 3 ，h 2 ，模拟原始地球的大气，通过放电现象，得到了至少含有 l o 种不同的氨基酸及其它气体物质1 3 ”。随着科学的发展，1 9 7 4 年科学家们在木星和 土星的大气层中相继探测到了p h 3 ，并将它推测为合成生命物质所必须的磷的物质来源 【3 酗。王文清等f 3 9 枷】在p 咖锄p c r u m ac y r i l 实验室用含有p h 3 和不含p h 3 的混合气体，进 行了氨基酸的前生物合成，并用气相色谱作为分析手段，对反应产物进行了分析，发现 在相同的放电条件下，含有p h 3 的混合气体，形成了1 9 种氨基酸。实验结果表明磷可 第一章绪论 能与早期氨基酸的形成有关。 由于核苷分子中碱基远比氨基酸分子复杂，由模拟原始大气( n 2 ，c 地，h 2 0 、n h 4 + ) 的放电来产生核苷碱基的结果并不如生成氨基酸那么理想，但也有用此方法产生嘌呤和 嘧啶的报道【4 ”。f o x 在1 9 6 6 年利用苹果酸、尿素和聚磷酸进行1 0 0 1 加的加热反应， 得到了尿嘧啶，这是首次引入聚磷酸作为原始地球上的试剂，研究它对核苷碱基形成的 影响。 核苷上核糖和脱氧核糖羟基磷酰化后即得到核苷酸。m i l l e r 和p a f r i s 的工作发现焦 磷酸可以在磷灰石表面通过与c n 一加热反应生成 4 2 】，故推论可由不溶和极低反应性的磷 酸盐生成得到聚磷酸而参与磷酰化反应。这一推论不久得到证实。h u l s h o f 和 p 0 n n 锄p e r u m a 在1 9 7 6 年认为无论从化学的观点还是从生物学的观点，线状和环状聚磷 酸都应该是原始地球上最可能的一般缩合剂| 4 3 i 。r a b i n o w i w z 在1 9 6 9 年的工作和 y a m a n a k a 等在1 9 8 8 年的工作证明了在所有火山活动产生的多聚磷酸中，环三聚磷酸则 是最有效的缩合和磷酰化试剂【“4 5 l 。 从单核苷酸到d n a 、r n a 是化学进化的一大步。在前生物条件缺乏酶的情况下， 大自然怎么积累一定数量的单核苷酸，以什么样的方式进行聚合反应一直是生命起源中 一个非常令人感必趣的问题。目前，人们通常以以下三种方式模拟原始地球条件探索单 核苷酸可能的聚合方式：对单核苷酸的加热聚缩合：在水溶液中，前生源条件可能的缩 合剂存在下，单核苷酸的聚缩合；在各种可能的模板指导下的活化单核苷酸的聚缩合反 应。 基于多年的研究，赵玉芬教授提出了“磷是生命化学过程的调控中心”假说，认为磷 的化学规律控制着糖( 核糖，核酸) 以及氨基酸( 蛋白质) 的化学规律，从而控制着生命的 化学进化，并提出了如图1 1 的模型【4 6 】： i 固 核酸 图1 1 核酸与蛋白共同起源的模型 蛋自 郑州大学硕士论文 赵玉芬教授还提出了“n 磷酰化氨基酸是生命过程中核酸锤 白质共同起源”学说 4 7 4 9 l 。n - 磷酰化氨基酸作为一种最小的反应模型，可以用来研究生命起源过程中的很 多未解之谜，例如手性起源，遗传密码起源等，这一观点在国际上引起了广泛地关注。 目前，生命磷化学已经成为当今化学界的一大研究热点，吸引着众多的科学家从事这方 面的研究。 1 0 擞糖蠢谱和液质联用 l l 生糟质谱 质谐是用来测定化合物的组成、结构及含量的不可缺少的科学仪器。在有机结构 鉴定的四大工具( 核磁、质谱、红外、紫外) 中，质谱的灵敏度不仅远远超过其余三 种方法，而且它还是唯可以确定分子量的方法，而分子量对推测结构是至关重要的。 质谱的开发历史可追溯到2 0 世纪初j j t h o m s o n 创制的抛物线质谱装置，1 9 1 9 年 翩蛔i 制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的罩程碑。最初的质谱仪 主鬟用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进， 其瘕用范围也在不断扩大，到2 0 世纪5 0 年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机 纯台物的测定。 由于生物大分子的分子量大、极性大、热不稳定等结构特点和生物大分子的复杂 性、体内的动念变化和含量少等存在特性，使得生物大分子的分析和测定一直成为科 学家特别是化学家特别关注的课题。1 9 8 1 年快原子轰击( f a b ) 电离技术的发明【5 1 j ， 有人将其称为质谱学跨入生物学领域的里程碑。2 0 0 2 年，瑞典皇家科学院把诺贝尔化 学奖颁于美国弗吉尼亚州立大学教授、8 5 岁的约翰芬恩( j o h nf c 皿) 、日本岛津制作 所年轻工程师、4 3 岁的田中耕一( k o i c h it a n a k a ) 和瑞士联邦工业大学教授几美国斯 克里普斯研究所客座教授、6 4 岁的库尔特维特里希( k u r tw u t h r i c h ) 。芬恩的贡献在 于电喷雾电离( e l e c t r o s p m yi o n i z a t i o n ，e s i ) 的技术发明和解决了蛋白质多电荷分布的 相对分子量计算方法1 5 z 】，田中耕一则是第一位证明激光技术适用于生物大分子检测的 人，发明了质谱法分析生物大分子的全新技术一软激光解吸技术，而维特里希发明了一 种应用n m r 法测定溶液中生物大分子三维结构的分析方法，目前已有1 5 2 0 的蛋白 质结构是用n m r 测定所得。随着生命科学及生物技术研究的进一步发展，将新的电离 方法和碰撞诱导解吸( c m ) 技术的联合，应用于生物大分子的研究领域，形成了一个 新的分支学科即生物质谱学。目前生物质谱已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的 前沿研究领域之一5 3 】。 4 第一章绪 论 生物质谱主要用于解决两个问题，其一是精确测定生物大分子的分子量，其二是对 复杂生命体系中的微量和痕量的生命活性物质进行定性和定量。近期发展的各种软电 离技术及联用新技术扩展了质谱的可测量范围。主要的软电离技术有：( 1 ) e s i 技术 f 5 4 。5 5 l ；( 2 ) 基体辅助激光解吸( m a i d i ) 技术【5 6 硎；( 3 ) f a b 技术；( 4 ) 大气压 电离技术。其中前三种技术近年来的研究应用最为活跃。 近几年，人们广泛的将生物质谱用于肽序列分析、获得蛋白质修饰位点( 二硫键、 糖基化、磷酸化等) 、鉴别生物大分子的构象、观察非共价键相互作用的研究中1 5 8 棚】。 生物质谱已经成为新兴蛋白质组学研究的技术支撑【6 0 舰j 。 在生物质谱中，e s i m s 是最容易与常规的高分辨分离方法如h p l c 和h p c e 实现 在线联用的技术，它们的成功联用，进一步扩大了e s i ，m s 的应用范围和领域。在生命 科学、临床医学、药物机理研究、食品安全分析等方面都正发挥着重要的作用。 1 2 2e s i m s 技术简介 某些新技术的发展常常会戏剧性地改变整个质谱世界，从而使得许多种新类型的化 合物得到电离和分析。例如，1 9 6 6 年，出m u n s o n 和f i e l d 提出的化学电离技术( c 1 ) 使“软电离”变为现实，提供了挥发性有机化合物的分子量信息，而在此之前的电子轰击 屯离源( e i ) 则会产生很多的碎片离子。2 0 世纪8 0 年代，两个独特的应用领域向实用 质谱技术提出了挑战：分析大分子化合物；迫切地需要为液相色谱和质谱之间提供 有效的接口。电喷雾电离( e s j ) 恰恰为这两方面的特殊要求提供了完美的解决方案。 最终，电喷雾电离连同与之相近的大气压化学电离技术( a p c i ) 彻底改变了整个质谱技 术的发展和应用州j 。 d o l e 等人【5 4 j 于6 0 年代最早提出电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m a s s s p e c t m m e t f y ，e s l m s ) 的新思路，但当时并没有真正将其仪器化。直到1 9 8 4 年y a m a s h i t a 和f e n n 【5 5 】之后，e s i m s 才真正发展成为一类新的软电离质谱技术，它的电离过程是“离 子雾化”，样品溶液通过一根毛细管进入雾化室，在加热、雾化气( n 2 ) 和强电场( 3 5 k v ) 的共同作用下，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶 剂蒸发，液滴表面积缩小，导致分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相( 图1 2 ) 。 电喷雾离子化的特点是可产生多电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质 量分析仪都可以检测的范围，因而大大扩张了分子量的分析范围。离子的真实分子量可 以根据质荷比及所带电荷数进行计算，并可由计算机软件自动完成。图1 3 是常见的 e s 删s 质谱仪框图。 5 郑闸大学硕士论文 图1 ，_ 一2电喷雾质谱的原理示意图 图1 3e s l ，m s 装置的示意图 样品分子在离子源内质子化，产生各种各样的离子，这些离子经过质量分析器按其 质荷比( m z ) 分离，分离后的离子依次被检测器检测，并记录下来，形成一个按离子 质荷比大小排列的谱图，称为质谱图。e s i 适合于中等极性到强极性化合物分子，特别 是那些在溶液中能预先形成离子的化合物。从理论上讲，e s i 是最软的电离技术，它可 以保持物质分子的完整性，但由于样品在c i d 中，气体碰撞导致大部分的化合物产生显 著的碎片离子。这些碎片离子是解析质谱图、推断化合物结构的重要信息。新的软电离 6 第一章绪论 方法能把不挥发和热稳定性差的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等电离成气相离子， 得到很强的与分子量相关的离子，如【m + h 】+ 、【m h 】。、【m + n a r 、f m + k 】+ 等( 其中， m 为分子量) 。 1 2 3 p l c e s i m s 技术简介 高效液相色谱法( h i 曲p e 南珊a i l c el i q u i dc h r o m a t o 掣印h y ，h p l c ) 是2 0 世纪6 0 年 代末迅速发展起来的一种新型分离技术。它以经典液相色谱为基础采用了高压送泵液、 微粒型填料和各种高灵敏度检测器，因此，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度 高等特点。但是，尽管色谱是一种很好的分离手段，可以将复杂的混合物中的各个组分 分离开，但它的定性、定结构的能力较差，通常只是利用各组分的保留时间柬定性，这 在组分完全未知的情况下进行定性分析就更加困难了。将分离型技术与鉴定型技术进行 联用，一次性完成混合体系的分离、鉴定以及定量分析，受到众多科学家的高度重视。 l c m s ( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e 时，l c m s ) 联用技术的研究起于2 0 世纪7 0 年代，8 0 年代中期，电喷雾电离( e s i ) 和大气压电离( a p i ) 接口的相继研制 成功，才有了商品化的“了m s 联用仪，并很快进入实用性阶段，使人们对复杂体系中 的物质识别有了更加深入的认识。h p 蜊s 技术的出现，使人们能够快速、准确的将 混合物的组分实现在线分离，在线将分离后的样品直接送入质谱计中进行定性分析。目 前，这一新的h pl l e e s i m s 连用技术，在蛋白质组学、药物、临床医学、食品安全控 制，以及环境分析、添加剂等许多领域获得广泛的应用。 1 2 4h p i 剧e s i m s 在碱基、核苷和核苷酸分析中的研究进展 串联质谱技术近年来在生物大分子研究中发挥着越来越重要的作用，e s i 离子化技 术可以给出分子量信息，多级m s 可以对获得更多的碎片质量，以便给出更精确的分子 结构，自1 9 4 9 年c o h n 【删发表了用离子交换色谱成功实现了核苷的分离之后，1 9 6 7 年 和1 9 6 9 年h o n r a t h 的课题组【6 5 “l 报告了用h p l c 方法分离了核瞢和碱基。目前，分析 研究核苷酸的方法有很多，如光谱法【6 7 删、m s 法【6 9 7 2 1 、n m r 和硎r 【7 3 1 ，色谱法i7 4 1 、 c e 法【7 5 。7 7 】等。研究体系非常广泛，涉及细胞i 硼、矿物质【7 9 1 、食品i 蚰】、血浆1 8 l l 等领域。 在离子色谱模式中，流动相的p h 、离子强度、缓冲液阴阳离子、柱温对色谱行为 和保留时间有很大的影响，出峰顺序依次为单磷酸、二磷酸和三磷酸核苷酸，碱基的顺 序依次为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。在反相色谱模式中，其分离基 础是分离组分的极性差异，但是核苷酸的洗脱顺序却较难预测，因为在水介质中核酸内 部存在着碱基堆积现象，不同的核酸堆积方式有所差异，碱基的疏水作用对堆积现象起 关键作用【8 2 】。其它色谱分离模式如离子对色谱1 8 1 ，旺8 4 j 和亲台色谱f 8 s 8 q 也是复杂生物体 7 郑州大学硕士论文 系分离分析的重要手段。 i i n e l 等f 7 l 】用h p 娜i m s 技术分离鉴定了核苷类抗病毒药物3 叠氮- 3 脱氧胸 瞽、三氟尿苷、5 碘2 脱氧尿萤和5 一碘2 ，3 二脱氧尿苷。x u 等【8 7 j 用 h p 倒d a 】滩s i m s 方法分离鉴定了抗癌药物c a p e c i t a b i n e 和它的核苷代谢物。2 0 0 4 年，d r i e s s c h e 等i 踞l 用微型化的“m 强i ，m s m s 分离分析了m e l p h a l a n 修饰的寡聚脱氧 核苷酸。z h a o 等【8 9 】进行了血清中5 - a z a c y t i d i n e 的分离鉴定，并进行了药代动力学研究， 获得了重要的动力学参数。最近h a i n k 等用w a t e r sx t e ac 1 8 在4m i n 成功实现了9 种核苷酸的分离【删。大量的研究报道充分表明了【c m s f 舛删技术已经成为研究核营酸 的强有力的工具。 1 3 硕士论文的设计思路和主要研究内容 h p l c 具有快速、灵敏、准确和高效分离的特点，h p l l s 联用，特别是 h p 删e s n l s 联用技术，已经在生命科学等多个领域中得到了广泛应用。在廖新成教 授和曹书霞副教授的指导下，我的硕士论文选题思路是将h p 【c m s 等现代分析技术应 用于：生命起源的理论研究及h p l d m s 在药物分析中应用的初步尝试。 在生命科学的研究领域，存在着分析体系复杂、被分析物含量极微的问题。但是要 想获得准确的分析结果，必须充分考虑影响e s i m s 数据的一些仪器参数和实验条件， 如被分析物的结构、仪器的参数设置、溶解样品的溶剂等，通过改变这些条件，提高被 分析物的挥发性和带电荷能力，进而提高e s 王，m s 的灵敏度，达到我们所要求的目标。 同样，在进行l c ，m s 联用时，根据e s i ，m s 仪器的特点和h p l c 的基本原理，必须同时 考虑流动相组成和性质对物质的分离效果、质谱仪器，质谱信号等方面的影响。 1 3 1 磷酰化氨基酸与核苷相互作用的研究 赵玉芬教授领导的课题组，对磷酰化氨基酸与单一核苷反应生成核苷酸以及磷酰化 氨基酸与四种核苷在水中反应进行了系统的研究。实验结果表明，不同的氨基酸对核营 的反应，具有一定的选择性，但生命起源过程纷繁复杂，研究不同的磷酰化氨基酸和不 同核苷混合物在不同条件下的反应，从产物生成的种类和量来观察他们之间的选择性和 竞争性，同时考察p 在反应过程中的作用，无疑将会对生命起源和遗传密码起源的学说， 提供更多的实验证据。所以，我们以磷酰化氨基酸与四种核苷为反应模型，通过对复杂 反应物及反应产物所进行的质谱研究和h p l c 分析，考察相应的质谱参数和色谱条件， 建立一系列完整的h p l c m s m s 分离分析方法；用优化的h p m m s m s 条件，对不同 条件下的磷酰化氨基酸和核营混合液的复杂反应体系进行快速、有效的分析，观察所生 成的磷酸化核苷以及寡聚核苷酸等产物的生成种类与含量的多少，并考察所生成的寡聚 核苷酸的序列与磷酰化氨基酸的关系，此研究为更深入的进行生命起源研究，提供一定 8 第一章绪论 实验依据并奠定分析方法学基础。 1 3 2l 豫l d e s i ，m s 在医药分析中初步尝试 兰索拉唑( b n s o p r a z o l e ) 为新型的抑制胃酸分泌的药物，临床上用于十二指肠溃疡、 胃溃疡、返流性食管炎等的治疗，疗效显著，对幽门螺杆菌有抑制作用。它的世界销售额 连年上升，2 0 0 2 年在全球1 0 大畅销药中位列第九名，销售额高达2 8 4 9 亿美元【”】。应 用高效液相色谱电喷雾离子阱质谱( h p l c m s ) 联用技术建立测定兰索拉唑及其副产 物、杂质的最优条件，考察确证兰索拉唑产物中存在的副产物和杂质的结构，为评价兰 索拉唑质量，优化兰索拉唑生产工艺，提高产品质量提供技术依据。 9 郑州大学硕士论文 第二章磷酰化氨基酸与核苷反应体系的 h p l c e s i m s 分析研究 研究表明，n 磷酰化氨基酸和核苷反应能够合成出不同种类的多肽和寡核营酸。 对n 磷酰化氨基酸和核苷混台液的反应体系进行分析研究，观察体系中所生成的产物 种类与含量，将对“n 磷酰化氨基酸是生命过程中核酸蛋白质共同起源”学说，提供强 有力的实验数据。但由于该反应的反应活性和速率较低，反应体系中的反应物n - 磷酰 化氨基酸和核苷的量比较大，而核苷酸类产物的生成量却非常少，所以，将最新的 h p i - 删s 技术运用到该体系的分析中来，利用h p l 刖m s 的高灵敏性和高效分离功能， 探索对复杂样品中的痕量物质进行快速、准确的定性、定量分析。 在进行e s i 质谱分析时，为了保证样品能够充分的质子化，根据样品性质，需要对 溶剂、仪器参数等进行优化。在我们的反应体系中，不仅会有反应底物核苷，还会有单 磷酸核苷，二核苷单磷酸，二核苷二磷酸生成，因此为了获取简单、清晰的特征谱图， 并为后续的研究提供快速、准确的结构定性和定量的方法，我们首先选择四种核苷和三 磷酸核苷为研究对象，对其e s 玑l s 、e s 帆t s m s 、h p h 独s i m s 的质谱参数和实验条 件进行了优化研究，并在此基础上建立n 磷酰化氨基酸与核苷反应体系h p l ( 任s i i 订s 的分析方法。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与试剂 仪器：h p l ( 糨s i ，m s 配置a 画l e n t1 1 0 0h p l c 和b m k e r e s q u i f e3 0 0 0 离子阱液 相色谱质谱仪；大连依利特e l i t e p 2 3 0 p 色谱仪；s a n o r i u s a gb p2 1 1 d 电子天平( m a d e b vs a n o r i u s ) ；k q 1 0 0 b 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ；旋涡混合器 v o r t 既x w 8 0 a ( 上海精科实业有限公司) ；恒温振荡器z d _ 8 5 ( 常州国华电器有限公 司) ；冰箱b c d 2 7 2 a y ( 容声冰箱公司) ；m j l l _ 旬纯水机( 美国) ；高速离心机 ( b i o m e t r a ，德国) ；h a n n ai i l s 仇曲e n t sp h 2 1 1 型p h 计。 试剂：核督a d c n o s i n e ( 腺苷a 、鸟苷g 、胞苷c 、尿苷u ) 购自上海s a l l g o n 生物 工程公司( j m r e s c 0 进口分装) ；5 三磷酸腺苷( 5 、5 三磷酸鸟苷( 5 g ，r p ) 、 5 三磷酸胞萤( 5 c r p ) 、5 三磷酸尿苷( 5 u t p ) 购自s i g m a 公司( s t l d u i s ，m o ，u s a ) 。 n - 磷酰化氨基酸d i p p a l a 、d i p p 唱l ”d i p p - p m 、d i p p a r g ( 9 8 b yh p l c ) 实验室自备。 甲醇：天津市四友生物医学技术有限公司一级色谱纯，o 4 取m 有机系滤膜过滤备用。 1 0 第二章磷酰化氨基酸与核苷反应体系的h p l c e s i ，惦研究 超纯水( m i l l 一q 纯化) 。o 犁m ，0 4 舡m 滤膜：天津市腾达过滤器件厂。磷酸二氢钾、 氢氧化钠、盐酸：广东汕头市西陇化工厂 纯。吡啶、四丁基溴化铵：上海化工试剂厂 析纯。 2 1 2 核苷标准溶液的配制 分析纯。磷酸：洛阳市化学试剂厂分析 分析纯。甲酸、昧唑：天津化学试剂厂分 分别称取核苷a 、g 、c 、u 各约1 o m g ，置于不同的1 5 m l 离心管中，用无水毗啶 准确配制成浓度为2 0 0 0 卢g m l 的核苷标准溶液。分别取各标准溶液2 毗l 混合，得到8 q “l 的混合液，对其进行h p l c 分析。 2 1 3 三磷酸核苷标准溶液的配制 分别称取核苷r p 、g t p 、c 1 1 p 、u t p 各约1 o m g ，置于不同的1 5 m l 离心管中， 用无水吡啶准确配制成浓度为1 0 0 0 咖l 的核苷标准溶液。分别取各标准溶液2 印l 混 合，得到8 吮l 的混合液。分别取核苷混合液和三磷酸核苷混合液各4 毗l ，再次混合， 对其进行h p i _ c 分析。 2 1 4n 磷酰化氨基酸与核苷混合液反应体系的建立 分别称取a 、c 、g 、u 四种核苷各约5 0 m g ，咪唑5 2 m g ，置于2 5 m l 的容量瓶中， 用1 3 m l 的无水吡啶溶解，备用。加入不同的磷酰化氨基酸，配制反应液： ( 1 ) d i p p 舢a2 0 0 m g + 1 3 m l 核苷混合液( 反应体系i ) ； ( 2 ) d i p p a r g2 6 7 m g + 1 3 m l 核苷混合液( 反应体系i i ) ； ( 3 ) d i p p g l y1 8 9 m g + 1 3 m l 核苷混合液( 反应体系1 1 1 ) ； ( 4 ) d i p p 。p r o2 2 0 m g + 1 3 m l 核苷混合液( 反应体系l v ) ； 将上述反应液置于恒温振荡器中，3 7 0 c 恒温反应1 4 天。 反应体系i ，每日取反应液2 毗l ，加甲醇稀释至5 0 毗l ，摇匀，用o 弘m 的微孔滤膜 过滤，对其进行e s 删s 和h p l c 分析。 反应第1 4 天，四个反应体系各取反应液2 叩l ，加甲醇稀释至5 0 即l ，摇匀，用0 犁m 的微孔滤膜过滤，对其进行h p “：e s 删s 分析。 2 1 5 核苷、三磷酸核苷标准溶液及反应体系的明阢c 、h p l c m s 分析 液相条件： 条件a ：a 百l e m1 1 0 0h p l c 色谱仪；色谱柱：z o r b a xc 1 8 柱，2 1 1 5 0 m m ；流动相：溶 剂a 为o 0 5 k h 2 p 0 4 水溶液，溶剂b 为c h 3 0 h ；梯度设置为1 b ；流速； 1 l 郑州大学硕士论文 o 4 m l m i n ；进样量：1 0 l ；检测波长：2 6 0 n m 条件b ：大连依利特e l j t e - p 2 3 0 p 液相色谱仪；色谱柱：h y p e r s i lb d sc 1 8 柱，4 6 x 2 5 0 m m i 流动相：溶剂a 为1 0 m m o l l 四丁基溴化铵，1 0 m m o l lk h 2 p 0 4 及o 2 5 c h 3 0 h ， 并用n a 0 h 调p h 至6 9 ，溶剂b 为5 ，6 m m o 四丁摹溴化铵，5 0 l i l m o l i k h 2 p 0 4 及3 0 c h 3 0 h ，并用h c l 调p h 至7 o ；梯度设置为3 0 分钟内由2 0 溶剂b