（微生物学专业论文）细菌群体感应系统对合成聚羟基脂肪酸酯调控作用的研究.pdf

摘要 细菌根据特定信号分子的浓度可以检测周围环境中自身或其它细菌的数量变化。当 环境中信号分子达到一定的浓度阈值时，信号分子进入细胞内与其胞内受体结合启动相 关基因的表达来适应环境中的变化，这一调控系统被称为细菌的群体感应系统 ( q u o r u m s e n s i n g ，简称q s ) 。它作为微生物体内重要的调控系统调节许多生物学功能。 聚羟基脂肪酸酯( p 0 1 y h y d r o x y a l k a n o a t e s ，简称p h a s ) 是自然界中许多细菌在特定 生理( 如碳源过量，氧、磷、氮、镁缺乏等) 条件下在胞内合成的内聚脂。它除了具有 与化学合成高分子材料相似的理化和机械性能外，还具有生物可降解性、生物相容性、 光学活性、以及生物合成过程中可利用再生原料等特性。因此，p h a s 作为对环境友好 的高分子聚合物可以替代石油化学塑料，近年来备受关注。 q s 系统是否调控细菌合成p h a 的生物过程呢? 近年来，许多实验结果强烈预示着， 细菌q s 系统很可能参与p h a 的调控，但目前尚缺乏直接的实验证据。 本研究以野生型n p “如聊d 刀础口p ，d 门伽口为原始材料，采用理化手段和分子生物学 技术分析细菌群体感应系统对生物合成聚羟基脂肪酸酯的调控作用。研究发现：1 ) 与野 生型铜绿假单胞菌p a 0 1 的p h a 积累量相比较，c 4 h s l 合成酶基因突变株p a 0 2 1 0 ( 砌奶减少约1 5 、3 o x o c 1 2 h s l 合成酶基因突变株p a 0 2 1 4 ( z 口如和p a 0 2 1 6 ( 胁 砌忉减少了5 0 。这初步表明群体感应系统正调控p h a 的生物合成，并且以 3 o x o c 1 2 h s l 为信号分子k ，w 口，r 群体感应系统调节系统在调节p h a 合成中占有更主 要的作用；2 ) 添加信号分子特异抑制剂阿奇霉素后，野生型铜绿假单胞菌p a 0 l 、 p a 0 2 1 0 ( 砌和p a 0 2 1 4 ( 胁d 的p h a 积累量均比不添加阿奇霉素下降了约5 0 。 这说明外源添加信号分子合成抑制剂导致群体感应系统不能正常启动时，p h a 的生物合 成受到了抑制，从另一方面证明了群体感应系统参与到了p h a 的生物合成的调节系统 中；3 ) 补加适量c 4 h s l 信号分子，铜绿假单胞菌p a 0 1 、p a 0 2 1 0 ( 砌伽和p a 0 2 1 6 ( 7 淞砌仂的p h a 最大积累量分别增加了1 5 、2 3 和2 9 ，但p a 0 2 1 4 ( ，甜d 无 增加趋势；4 ) 在互换上清的实验中，铜绿假单胞菌p a 0 1 的p h a 积累量减小，p a 0 2 1 6 ( 玩，砌p h a 积累量增加；5 ) r t p c r 分析发现，生物合成p h a 的关键基因p 乃口c j 在细菌群体感应系统突变株中转录量低，而当补加适量信号分子后，其转录量上升。综 己l 吉 丁i目 细菌的群体感应系统( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 参与许多生物学功能的调控，如生物 发光，抗生素形成，色素产生，芽孢形成，根瘤菌与植物共生，生物膜形成等【1 1 。革兰 氏阴性菌的q s 系统主要由n 酰基高丝氨酸内酯( n a c y l h o m o s 撕n el a c t o n e ，简称a h l ) 类信号分子及其受体蛋白组成。a h l 信号分子可自由穿透细胞膜并在环境中积累，当 其达到一定浓度阈值时，能与细胞内相应受体蛋白的氨基端结合，从而调控某些功能基 因的表达。近年来，细菌q s 系统作为细菌生理行为的重要调控系统是否还具有更多的 生物学功能成为微生物学界的热门研究课题。聚羟基脂肪酸酯( p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e s ， 简称p h a s ) 是一种高分子聚合物，自然界中许多细菌在特定生理( 如碳源过量，氧、 磷、氮、镁缺乏等) 条件下可以在胞内合成p h a 作为碳源和能源的储藏物。它具有与 化学合成高分子材料相似的理化和机械性质。更为重要的是，具有化学合成高分子材料 所没有的生物可降解性、生物相容性、光学活性、以及生物合成过程中可利用再生原料 等特性。近年来，世界范围内对环境保护的呼声越来越高，“白色垃圾 已经成为困扰 人类的难题之一，因此对生物可降解材料的开发和利用愈发显得紧迫而重要。p h a 作为 一种极具发展前途的“生物可降解塑料 日益受到来自研究领域和工业界的广泛关注， 国家“八五 、“九五”、“十五”和“8 6 3 重点攻关专门立项支持p h a 的产业化，由此 可见其研究的重要性。 本论文目的在于获得q s 系统是否参与p h a 生物合成调控过程的直接证据，进而探 讨q s 系统调控p h a 生物合成的可能机制，从而为设计适当的技术手段提高p h a 的产 量和产率提供理论指导，并且丰富细菌q s 系统的生物学功能。 1 。文献综述 1 1 细菌群体感应系统 长期以来，细菌被看作单细胞生物，彼此孤立。近些年的研究发现，单个细菌之间 是存在着信息交流的，并且通过这种不同个体甚至不同种群间的信息交流对外界环境的 变化进行群体性应答。这种细菌与细菌之间的信息交流称为群体感应( q u o n l ms e n s i n g ， 简称q s ) 【2 川。具有群体感应的细菌不仅能够向环境中分泌一种特殊的、可以扩散的小 分子化学物质( 也称为信号分子) ，而且还可以检测环境中的信号分子，并且以细胞密 度依赖型的方式对信号分子的积累进行应答。当环境中的信号分子达到一定的浓度阈值 时，它与细菌内的特异受体蛋白结合，诱导一系列靶基因的表达，调控相关的生物学功 能。在过去的二十年中，许多种类的信号分子已经被证实，如n 酰基高丝氨酸内酯 ( n a c y l h o m o s e 血el a c t o n e ，a h l ) 、环硫代内酯( a 皿) 、羟基棕榈酸甲酯( p a m e ) 、卤 化呋喃、甲基十二烷酸( d s f ) 、丁内酯和小分子多肽等。这些物质参与许多细菌生物 学功能的调控，包括生物发光、色素的产生、抗生素的合成、质粒的接合转移、生物群 游现象、生物膜的形成、动植物病原细菌毒力因子的产生等等【8 1 羽。 1 1 1 群体感应信号分子 不同的细菌往往利用不同的信号分子。 1 1 1 1 革兰氏阴性细菌信号分子 革兰氏阴性细菌主要以n 酰基高丝氨酸内酯( n a c y l - h o m o s e 血el a c t o n e ，a h l ) 类 物质作为信号分子。此类信号分子都具有相似的基本结构，即高丝氨酸五元内酯环，伴 有一条从4 1 4 个碳的可变酰基侧链以及在第三个碳原子上有氧、羟基替代或无替代物。 侧链通过氨基化合与内酯化的高丝氨酸的环状部分连接起来形成酰基高丝氨酸内酯( 分 子结构如图1 1 所示) 。目前已经证实的a h l 有5 0 多种，都存在于革兰氏阴性细菌中 ( 其中包括植物和哺乳动物的病原菌) ，这些细菌分别属于么e 阳m d 玎口只丑“r 砌。娩r f 日， 风p “如掰d 刀砸& 口加和抟坶加砌等属【1 9 1 】。有些细菌可以产生多种a h l ，如绿脓杆菌在 产生n - b u t a l l o y l h s l ( c 4 一h s l ) 和n ( 3 一o x o d o d e c a n o y l ) h s l ( 3 o x o c 1 2 - h s l ) 的同时也 产生少量的n - h e x a i l o y l h s l ( c 6 - h s l ) ，3 一o x o c 6 一h s l 和n 一( 3 一o x o d e c a n o y l ) 一h s l ( 3 - o x o c lo h s l ) 。 积累到一定浓度( 阙值) 时，信号分子与特定的r 受体蛋白的n 端结合，形成一定的 构象，使r 受体蛋白的c 端能与特定d n a 序列相结合( 结构基因的启动子序列) ，从 而促使或阻碍某些功能基因的表达【3 ，2 3 1 ( 如图1 3 ) ，同时，a h l 类信号分子与r 受体蛋 白相结合的复合体也对a h l 类信号分子本身r 及受体蛋白的产生具有反馈调节效应 【刎。 图1 3 革兰氏阴性细菌中典型的群体感应调节 f i g 1 3q u o n l ms e n s i n gi ng r 锄- n e g a t i v eb a c t e x 时，促进激酶中组氨酸残基磷酸化，然后把磷酸基团转移给激酶中天冬氨酸残基，。使之 磷酸化，再通过磷酸化与去磷酸化作用，使受体蛋白磷酸化，磷酸化后的受体蛋白能与 d n a 特定靶位点结合，达到调控的目的。( 如图1 4 ) - ， -。 图1 4 革兰氏阳性菌中的群体感应系统 f i g 1 4q u o n l 瑚s e n s i l l gs y s t e mi ng 十 1 2 3 群体感应信号分子的检测方法 1 2 3 1 物理学的检测手段 通过高效液相色谱技术来检测纯化来自液体培养基的标本。该方法除了能够定量外 还能鉴定信号分子的性质。我们同时还可以通过质谱、核磁共振和红外光谱来检测信号 分子的性质。但其操作复杂，费用昂贵。 1 2 3 2 采用微生物传感菌检测法。 即运用某些细菌的色素或者荧光检测信号分子。比如利用能产生紫色色素的紫色杆 菌( c 办，d m d 6 口c 纪，f “mv f d 肠c e “m ) 来检测信号分子。当该细菌产生信号分子的功能性基 因被人为地删除后，这时的变异株就成为信号分子的生物感应器，一旦该细菌遇到外源 性的信号分子时，就能产生紫色色素。又如一些带有z 缎彳召和k c z 为基础的荧光系统的 质粒被装载入某些细菌中，使得操作更为简便。 1 2 3 2 薄层层析。 将物理、化学的手段和生物发光感应器结合起来检测信号分子。薄层层析的方法是 在底层放置待测标本及已知的标准物，在分离后，上层覆盖一层琼脂，琼脂内含有特异 性或非特异性发光感应器的细菌。经过数小时的孵育后，根据所得到的荧光位点与标准 物的位点相比较，就可以得知待测物中是否含有信号分子【2 5 】。 6 一类是短链p h a ( s h i d n c h a i n 1 e n g t l lp h a 或、s c l p h a ) ，如聚羟基丁酯和聚羟基戊酯 ( p o l y h y d r o x y v 2 l 1 e r a t e 或p h v ) ；另一类是中长链p h a ( m e d i u m c h a i n l e n 啦p h a 或 m c l 一p h a ) ，如聚羟基己酸酯( p o l y h y d r o x y h e x a n o a t e 或p h h x ) ，聚羟基辛酸酯 ( p o l y h y d r o x y o c t a n o a t e 或p h o ) 等。近年来有报道指出不少菌株可同时合成两种或两 种以上的单体，并且多数以共混形式存在【3 2 出】。近来又有报道少数菌株可合成短链与中 长链共聚物的脂肪酸【3 5 】。 9 鼍 图1 7 ( a ) 和羟基丁酸的共聚物( b ) 3 羟基丁酸和4 羟基丁酸的共聚物 f i g 1 7( a ) p 0 1 y h y d x y b u t y r a t c o p o l y m e r s ( b ) p o l y ( 3 一h y d r o x y b u t y r a t e c o 一4 h y d r o x y b u t y r a ：t e ) 1 2 3 聚羟基脂肪酸的物化性质 p h a 的物理性质主要是由其单体的组成而决定的。依单体的组成不同，p h a 具有 从坚硬的晶体到柔软的弹性体等一系列不同聚合物的性质。图表1 中是p h b ( 单一共聚 物) ，p h b v ，p h b 4 b ( 短链共聚物) 和p h b h x ( 中长链共聚物) 与聚丙烯的物理性质 比较。 表1p h a 和聚丙烯的物理性质。 1 曲l e l p r d p e n i e so fp h a a n dp o l y p r o p y l e n e ( p p ) 注：p h b v 含2 0 3 h v 单体，p h b v 含1 6 4 h b 单体，p h b 瓦否i 6 瓦3 百a ，单体【3 6 1 。 对于p h a 来说，不仅单体的侧链会影响到它的物理性能，单体的主链对于p h a 的 热力学常数也将产生较大的影响【3 7 ，3 8 1 ，另外一些超高分子量的p h b 也具有良好的物理 性能，如d o i 等用基因重组菌e c d ，fx l l b l u e 生产的p h b 分子量达m 、= 3 1 l 1 0 6 的 p h b 的拉伸率可达4 0 0 【3 9 1 。 屯 钳 一 i。_i。l 田 一 ， 一1 2 4 聚羟基脂肪酸的应用 p h a 首先是作为一种由微生物合成的、性能类似于聚丙烯的可降解“塑料而引起 人们广泛关注的，因此它的主要应用范围是与塑料相关的领域，即可抛弃的塑料用具， 如包装膜，手袋，容器等。但由于p h a 在价格上还很难于传统的塑料工业竞争，因此 限制了p h a 的广泛应用，目前对p h a 的应用主要集中在一些高附加值的领域。( 表2 列举了p h a 的一些应用) 表2p h a 可能的应用领域【2 9 1 。 t a b l e2p o s s i b l ea p p l i c a t i o no fp h a 【2 9 1 包装膜、手袋、容器等 注射剂、药物、杀虫剂除草剂、肥料等的长效使用生物可降解载体 香水瓶 可以随意处理的剃刀、厨房用具、尿布、妇女卫生用品等 手术针、线、钉及药签 创口包扎材料 由于p h a 具有良好的生物相容性，生物可降解性和压电效应，因此决定了其在组 织工程中的广泛应用。如应用于骨折固定材料，替代心血管系统这类管状和膜状组织的 材料骨架，以及心脏泵等。 另外p h a 的单体都是手性单体，因此在制药、化妆品等行业也有应用，如可以用 来合成抗生素、维生素和信息素等化合物【4 0 1 。 1 2 5 聚羟基脂肪酸的分子生物学研究 1 2 5 1与p h a 相关的酶及其基因 许多蛋白参与了p h a 合成、保持、降解和其他相关的代谢途径。因为p h a 在细菌 体内以细胞质内不连续的包涵体存在，所以许多蛋白位于p h a 包涵体的表面4 1 ，! 勿。表 3 中列举了一些p h a 相关的蛋白、基因以及一些与p h a 合成途径中相耦联的酶，如 f a b d ，丙二酰辅酶a 酰基转移酶( m a l o n y l c o a a c pt r 锄s a c y l a s e ) 【4 3 1 ；f a b g ，3 酮酰 辅酶a 还原酶( 3 k e t o a c y l c o ar e d u c t a s e ) 【4 4 】等。 表3与p h a 相关的酶及其基因 1 a b l e3 d e s i g n a t i o no fg e n e si n v o l v e di np h ab i o s y m h s i s ，a u x i l i a r ys t r u c t l l i 甜p r o t e i n s b o u n dt op h a g r a n u l e sa n dp h ag r a n u l e sa 1 1 dp h ad e 酽a d i n ge n z y m e s 基因基因编码的酶相关途径 p ，z 州 p h n b p h c i c p 地e b - 酮基硫解酶 量警秀氅挚a 还原酶 生物合成途径 p h a 合成酶 一“一“ i i i 类p h a 合成酶的第二个亚基 9 酸合成羟基丁酸与中长侧链脂肪酸共聚物p ( 3 h b 3 h a m s c ) 、自脂肪酸p 氧化途径分支 合成m s c p h a 的途径等等。总之，微生物代谢的多样性决定了微生物合成p h a 代谢途 径的复杂性。另外在同种微生物体内可能存在多种p h a 合成途径。例如pp “f f 出中 至少存在这三种合成3 羟基脂酰c o a 的途径：( 1 ) 脂肪酸作基质时的p 氧化途径；( 2 ) 可 以被代谢为乙酰c o a 的基质如葡萄酸、乙酸、乙醇时的脂肪酸沈门d v d 合成途径：( 3 ) 乙 酸为基质时乙酰c o a 与3 羟基脂酰c o a 缩合的链延伸反应途径【4 7 1 。天，甜6 朋聊用糖作 碳源时主要以五步反应合成p ( 3 h b ) ，而以脂肪酸为碳源培养时利用烯酰c o a 水合酶合 成短链和长链脂肪酸的共聚物【4 7 ，4 引。 ! 呼i 瑟j c 萌 。、纽脚a d d 一 岫o i 够c o ，唧p _ 呻彝制蚴矗m- k 丐。研 附牛c 矾蝴斗哆 i ，膏u u 饥坩憎u n 毫，每h 州唧萌冀埘啊c o 翔h g j 。 加- 懈l p h a 渤ci 呐，c i r 似酒睁c o 1 a u 电帅0 翻嘲啪 o 髓一翻嘲瞳挣 = 一旧净岫哇r 锨脚c o a 懈 f ，移每咐增蚋撙铆- a c p 墨拦繇微、c p 墨b i 她睁a c pi ：= ：i ，：= ：_ 蛳a c p 摹够a c p j j j j 图1 8p h a 代谢途径 f i g 1 8 p h am e t a b 0 1 i cp a 【1 1 w a y s p h 以，6 酮基硫解酶；p h a b ，n a d p h 依赖的乙酰乙酰辅酶a 还原酶；p h a c ，p h a 合 成酶：p h a g ，3 羟酰基酰基转移蛋白辅酶a 转运酶；p h a j ，( r ) 一烯酰基一水合酶； f a b d ，丙二酰辅酶a 酰基转移蛋白辅酶；f a b g ，3 酮酰辅酶a 还原酶。 1 2 6p h a 的鉴定与检测 1 2 6 1 重量分析法【4 明 重量分析的原理是p h b 聚合物能溶于热的氯仿而与其它细胞组分分开，通过抽提、 离心、去掉其他细胞组分，用醇类溶剂沉淀，离心去上清液，可以得到p h b 。但这一方 法需要沉淀出至少毫克级的p h b 才能称量，而且这一方法的准确性与p h b 能否完全沉 淀有关。 1 2 6 2 紫外光谱法【5 0 】 紫外光谱法的原理是p h b 在浓硫酸溶液中加热可以转化为巴豆酸，后者在2 3 5i l i i l 处有一吸收峰值。该方法测定的是能转化为巴豆酸的p 舳聚合物的含量，排除了其它 脂类的干扰，与细胞内总脂的含量无关，但缺点是该方法细胞的预处理过程比较繁琐， 测定过程更加复杂，而且这一方法还受到一些非p 髓物质的干扰。 1 2 6 3 高效液相色谱法【5 c ! 】 高效液相色谱法主要应用于测定p h a 聚合物的分子量、聚合度及单体排列顺序等。 1 2 6 4 气相色谱法【5 0 5 1 】 气相色谱法的原理是p 髓能在浓硫酸的作用下解聚，脱水成巴豆酸，巴豆酸可进 一步转化为巴豆酸甲酯，后者能通过气相色谱测定。该方法可用于p 耶纯品及细胞中 p h b 的检测。该方法的缺点是酯化时间和色谱分析时间较长，对发酵过程的在线监控是 不适用的。 1 2 6 5 核磁共振法【5 2 】 核磁共振法的原理是结合1 h - n m r 和1 3 c - n 脉及其二维图谱，核磁可以准确地区 分出某一化合物或混合物中不同的结构单元及其量比，有助于分析单体的结合方式，确定 是否共聚物。缺点是仪器较昂贵，样品分析时间较长，受分子量大小的限制，结果分析比 较复杂。 1 2 6 6 流式细胞光度和荧光分光光度法【5 3 】 可产生荧光的物质，其量可以通过其荧光强度反映出来，这是荧光分光光度法的原 理。这两种方法的优点是能快速获得p h a 的含量，所需样品量少，省去了繁琐的样品 制备过程，缺点是对中链p h a 的着色不灵敏。 除了上述鉴定及检验技术，还有二维傅立叶红外光谱学技术( 2 d f h u 【5 0 5 4 1 、傅立 叶红外光谱f t - i r 分析方法【5 5 种】、偏光显微镜、x 射线及电镜法被用来研究p h a 的结 晶形态【5 8 ，5 9 1 。 1 2 成途径可能存在着物质流的竞争。这些结果强烈预示着，细菌q s 系统很可能参与p h a 的调控，但目前尚缺乏直接的实验。 1 4 随细菌生长的变化而变化，在细菌增长阶段，p h a 的积累未达到最大值，这可能由于信 号分子未达到阈值，没有启动基因表达，也可能只是由于菌体积累量不足而合成p h a 的量很小；当细菌生长到衰亡期，o d 值逐渐降低，胞内p h a 积累也随着降低，这可能 是由于菌体裂解而使胞内p h a 也裂解到培养基中从而未能检测到，也可能q s 系统调控 了p h a 的降解。所以只从野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 的信号分子的积累( 与菌体生长 一致) 和菌体合成p h a 的时间曲线来看，并不能确定q s 系统与p h a 合成是否有关联。 1 9 水 t e 缓冲液 1 0i i 翠。儿 1 m m o 儿 胰对峪酶 2 8 5 m l h s h c l ( p h8 o ) e d t a ( p h8 0 ) 将r n a 酶溶于1 0 m m o l lt r i s h c l ( p h7 5 ) 、1 5 删【i l o 。n a c l 中，配成1 0 m m l 的浓度，于1 0 0 加热1 5 i n i n ，缓慢冷却至室温，保存于2 0 。 5 0 t a e 电泳缓冲液： 2 4 2 9 l ，l t r i s 。 5 7 1 m l l冰乙酸 1 0 0 m l lo 5m o l le d l a ( p h = 8 o ) 1 0 l o a d 堍b u 脑：( 儆 1 s d s 5 0 0 02 g l y c e r o l ( 甘油) 一 b r o m p h e n o lb l u e ( 溴酚兰) 电击缓冲液 1 0 m m 0 1 l h s - h c l ( p h 7 5 ) 2 7 0 m m o 。蔗糖 l 删m 0 儿 m g c l 2 酚氯仿异戊醇 苯酚：氯仿：异戊醇按体积比按2 5 ：2 4 ：1 混匀 3 1 5 主要仪器 1 址s i t ey l e 1 0 0 0 型电热恒温水浴锅；德国b i o m e t r at g r a d i e n tp c r 电泳仪；北京市 六一仪器厂d y y t c 型d n a 电泳仪；美国g d s 8 0 0 0s y e s t e m 凝胶成像仪。 3 1 6 培养基一 l b 培养基：蛋白胨1 0 9 ，y e a s te x t r a c t5 9 ，n a c l l o g ，调p h 值至7 2 ，定容1 l ， 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ； 培养农杆菌的m m 培养基：k 2 h p 0 41o 5 9 l ，k h 2 p 0 44 5 9 几，m 9 2 s 0 4 7 h 2 00 2 l ， f e s 0 45 m l ，c a c l 21 0 m l ，【1 1 c 1 22 m g l ，( n h 4 ) 2 s 0 42 0 l ，甘露糖醇2 0 9 l ，蒸 2 i 馏水定容1 l ，1 2 1o c 灭菌2 0 m i n ，p h7 o ； 在以上培养基中加入1 5 1 8 琼脂即为相应固体培养基，倒平板备用。 m m 培养基：m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，c a c l 20 0 2 9 ，f e 2 ( s 0 4 ) 3o 0 4 9 ，k h 2 p 0 41 0 9 ，k 2 h p 0 4 1 0 9 ，n h 4 c lo 5 9 ，d - 葡萄糖酸钠1 5 9 ，调p h 值至7 o ，蒸馏水定容至l l 水，1 1 2 高 压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 脓杆菌p z l r ( 护口g ：，口c z 伊口尺) 所用的m m 固体培养基：k 2 h p 0 4l o 5 9 ，k h 2 p 0 4 4 5 9 ，m 9 2 s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，f e s 0 45 m g ，c a c l 21 0 m g ，m n c l 22 m g ，( n h 4 ) 2 s 0 42 o g ，甘露 糖醇2 0 9 l ，调p h 值至7 o ，蒸馏水定容1 l ，加入1 5 琼脂粉，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 3 2 方法 3 2 1培养条件 大肠杆菌d h 5 a 、野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 的培养条件【4 5 】：l b 培养基，3 7 ， 2 2 0 r 】r i l i n 。 3 2 2 分子水平的操作方法 3 2 2 1野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 基因组d n a 的提取 1 ) 取1 6 h 摇床培养菌液5 i n l ，4 ，6 0 0 0 r m i n ，离心2 m i n ，弃去上清； 2 ) 加0 9 的生理盐水1 n 1 l ，旋涡振荡，混合均匀，离心弃上清，将离心管中液 体充分吸干； 3 ) 加0 8 5 m ls u c r o s 扩m s 溶液，漩涡振荡，再加l o o p l 溶菌酶( 1 m 幽n l ) ，3 0 ， 保温1 5 m i i l ； 4 ) 加1 2 5 m l1 5 s d s 溶液，l o o l 蛋白酶k ( 2 5 m m l ) ，轻柔混合，3 7 ，保 温2 5 h ，直至浑浊液体变澄清； 5 ) 等体积酚氯仿异戊醇抽提，室温，5 0 0 0r m i n ，离心2 0 m i i l ； 6 ) 少量吸取上清，分装到e p 管中，加2 倍体积的无水冷乙醇，轻轻地上下颠倒混 匀，观察是否有絮状沉淀出现，冰上静置1 5 m i n ，4 ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 5 m i n ； 7 ) 沉淀用7 0 乙醇洗涤，真空冷冻干燥，复溶于t e 缓冲溶液，加1 0 p 1r n a s e ， 6 5 ，1 0 3 0 m i i l ，除去r n a 。2 0 或4 保存。 3 2 2 2 质粒提取 1 ) 取1 6 h 摇床培养菌液1 m l ，4 1 2 0 0 0 r m i n 离心1 m i n ，弃上清，空干； 2 ) 加溶液i1 0 0 u l 振荡混匀； 3 ) 加溶液i i2 0 0 p l 轻混匀； 4 ) 加溶液i i i1 5 0 l 轻混匀； 5 ) 4 1 2 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，用枪小心取上清； 6 ) 静置样品分三层，取上层水相于新e p 管； 7 ) 加等体积的酚氯仿，振荡混匀； 8 ) 静置样品分三层，4 1 2 0 0 0r m i n 离心l om i l l ，用枪小心取上层水相； 9 ) 加冷乙醇1m l ，振荡混匀； 1 0 ) 4 1 2 0 0 0 r i i l i n 离心1 0 m i n ，弃上清； 1 1 ) 加7 0 乙醇l m l ，振荡混匀； 1 2 ) 静置样品分三层，4 1 2 0 0 啦m i n 离心1 0 i i l i n ，弃上清； 1 3 ) 晾干，加t e 缓冲液( 其中含有2 0 g m l 的胰r n a 酶) 3 0 l ，使d n a 完全溶 解，电泳检测，作后续实验或2 0 、4 保存。 3 2 2 3目的基因的p c r 扩增 1 ) 目的基因的引物设计 r h l i ： n 5 一a gg g a t c ca t ga t cg 缸t t gc t ct c tg 抒3 ； c 5 一g g ca a g c t tt c ac a cc g cc a tc g ac a gc g g 一3 1 a s i ： n 5 一g c ca g a t c ta t ga t c 垂ac a aa t tg g tc g g 一3 ； c 5 - g c gc t c g a g t c at g aa a cc g cc a gt c gc t g 一3 口，印： n 5 - g c cg g 7 i a c ct t ct t ga a ga c ga a ag g gc c t 一3 ； c 5 唱c cg g t a c c t t ac c aa t gc t t 柏tc a gt g a - 3 纪f ： n 5 g c cc t g c a g t t ct c at 酉t t ga c ag c tt a t 3 ； c 5 一g c cc t g c a g t c ag 醇c g ag 舀g g cc c gg c t 注：大写字母为酶切位点。 ， 2 3 2 ) p c r 反应体系 1 0 p c rb u 虢r 2 p l d n t p s 2 p l p f 1 m p r l p l 1 e m p a l t e2 山 1 细d n ap o l y m e r a s e0 2 “l 盟地q ! ! ：墨世。 总体积2 0 m 3 ) 反应条件 9 4 3 0 s ；5 0 4 5s ；5 5 2 曲；共2 5 个循环。反应前9 4 变性2 m i n ，反应后 7 2 延伸1 0 m i i l 。 4 ) 结果检测 p c r 产物在含溴化乙锭的1 o 琼脂糖上电泳，检测其纯度与大小。 3 2 2 4p c r 产物的回收及纯化 p c r 产物的回收和纯化按试剂盒说明进行。 1 ) 样品用琼脂糖凝胶电泳后，将目的d n a 片段切出； 2 ) 将切下的凝胶块放入1 5 m l 的e p 管中： 3 ) 向反应管内加入约1 5 。3 倍凝胶量的n 2 l i 溶液( 通常为6 0 0 “l ) ，5 5 加热 5 l o m i l l ，使凝胶完全融化； 4 ) 按每2 0 p l 硅胶树脂结合约1 p gd n a 的比例加入适量的硅胶树脂后，充分混合； 室温放置2 0 m i n ； 5 ) 5 0 0 0 r i n i n 离心1 m i i l ，然后弃去上清； 6 ) 在反应管中加入5 0 0 此洗净用缓冲溶液，振荡搅匀后，5 0 0 0 r m i n 离心l i n i n ， 弃上清；重复操作一次； 7 ) 离心后将上清清除彻底，然后加入1 倍硅胶体积的t e 缓冲溶液或无菌水，搅匀， 5 5 水浴静置5 m i n ； 8 ) 5 0 0 0 r m i n 离心1 m i n ，回收上清，即为所要的d n a 溶液。 3 2 2 4 p c r 纯化产物与t 载体连接1 7 0 】l 目的片段 1 6 山 载体质粒 l 山 连接酶 1 “l ! q 丕垦坠照12 丛! 总体积 2 0 “l 冰上加样，4 反应2 4 h 。 3 2 2 5 大肠杆菌d h 5 0 【感受态细胞的制备【7 0 】 1 ) 接大肠杆菌d h 5 q 单菌落于2 0 l l l l l b 中，3 7 振荡过夜培养； 2 ) 取5 0 0 此新鲜菌液接种于5 0 0 m ll b 中，3 7 振荡培养达到o d 6 0 0 = o 3 ( 约2 5 h ) ； 3 ) 冰浴1 0 m i i l ，分装于无菌离心管，4 ，4 0 0 0r m i n 离心1 0 m i i l ； 4 ) 弃上清，菌体悬浮在2 5 m l 预冷的o 1 m 的c a c l 2 溶液中，冰浴3 0 m i n ，4 0 0 ，i i l i n ， 4 离心1 0 m i i l ； 5 ) 弃上清，菌体悬浮在1 5 m l 预冷的0 1 mc a c l 2 溶液中，混匀； 6 ) 处理细胞立即用于转化。若保存，按每份0 2 m l 加等体积的3 0 甘油于7 0 冻 存。 3 2 2 6 质粒转化 1 ) 热激转化( 转化大肠杆菌) 取2 0 0 l 感受态细胞，缓慢加入连接了目的基因的p m d - 1 8 质粒2 0 “l ，混合均 匀，冰浴2 0 3 0 m i n ；另取未连接目的基因的p m d 1 8 载体2 0 p l 用于转化以检验感 受态细胞： 4 2 ，水浴热激9 0 s ，然后冰浴5 1 1 1 i n ，使刚转化的菌株形成稳定态； 无菌条件下，加入0 8 m ll b 培养基，3 7 培养箱轻微摇培1 1 5 h ； 4 ，4 0 0 0 玎，m i n ，离心1 0 m i n ，吸弃上清0 6 m l ，剩余混合均匀； 将i p t g 和x - g a l 均匀涂布在含氨卞的l b 培养基上，晾干，使溶液被完全吸收； 2 0 0 l 菌液涂布于l b 平板，3 7 恒温箱培养1 6 h 后观察结果。 阳性克隆的筛选：取出培养板于4 放置数小时，使菌落蓝色更明显。携带重 组质粒的克隆无p 半乳糖苷酶活性，菌落成奶白色或蛋壳蓝。 用灭菌牙签或枪头挑取白色菌落，在含有氨苄抗性的l b 培养基中培养过夜，提 取质粒，验证重组质粒是否转化进感受念大肠杆菌。 2 5 2 ) 电转化 取培养至对数生长期的新鲜菌液3 m l ，3 0 0 0 r m i n ，4 ，离心1 5 m i n ，收集菌体； 用预冷的无菌水洗涤菌体两次，再用电击缓冲液洗涤菌体； 用电击缓冲液悬浮菌体，取适量菌悬液，加入连接了目的基因质粒d n a 混匀并 转移至电击槽中电击，同时做阴性对照； 取出电击后适量菌液涂布选择培养基，3 7 培养过夜培养，观察转化子。 3 2 2 7 克隆片段d n a 的测序及序列分析 将转化了目的基因质粒的大肠杆菌d h 50 【交由上海生工生物工程技术服务有限公司 进行测序。 3 2 2 8 酶切反应 1 ) 酶切反应体系 双酶切： d d h 2 0 1 1 山 质粒5 m 1 0 b u 脓 2 p l 限制性内切酶i 1 山 阻剑性凼切酶! ! 丝! 总体积 2 0 “l 单酶切： d d h 2 0 1 2 p l 质粒 5 山 1 0 b u 圩e r 2 m 阻剑凼切性酶! 琏! 总体积2 0 山 2 ) 酶切反应条件 3 7 水浴l h ，电泳检测。 3 2 2 9a h l 的鉴定 1 ) a h l 鉴定原理 c 4 h s l 的鉴定原理 产生紫色色素的紫色杆菌( c 厅厂d 聊d 蚰c 招r f “聊v f d 7 口c e ”历) 产生a c y l h s l 信号分子的 功能性基因被人为地删除，这时的变异株c v 0 2 6 就成为a c y l h s l 信号分子的生物感应 2 6 器，一旦该细菌遇到外源性的a c y l h s l 分子时，就能产生紫色色素。但其主要应用于 检测c 4 h s l 、c 6 h s l 等短链信号分子。 3 o x o c 1 2 h s l 的鉴定原理 报告菌p z l r ( 耖口g ：z 口c z ，舭识) 遇到的a c y l h s l 分子时，其肠c z 基因会被激活， 产生p 一半乳糖苷酶，它与固体培养基中的x g a l 作用，使菌体产生蓝斑。 其主要应用于检测c 8 h s l 、c 1 2 h s l 等长链信号分子。 2 ) a h l 鉴定方法 c 4 h s l 鉴定步骤 a ) 野生型铜绿假单胞菌p a o l 、c 4 h s l 合成酶基因突变株和c v 0 2 6 分别接种于 l b 培养基，2 0 0 r m i i l ，3 7 ，过夜培养； b ) 验证所用平板培养基为l b 固体培养基( x g a l 终浓度为4 0 p g m l ，琼脂为1 5 ， 按1 0 混合c v 0 2 6 菌液) ，用打孔器打孔； c ) 分别取1 中所得野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 、c 4 h s l 合成酶基因突变株培养基 上清液2 0 此滴加到l b 固体培养基所打孔儿中，以野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 培养基 上清液作阳性对照，1 5 p m 的c 4 h s l 作为系统阳性对照，以水作为阴性对照。过夜培 养，次日观察。 3 o x o c 1 2 - h s l 鉴定步骤 a ) 野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 、3 一o x o c 1 2 - h s l 合成酶基因突变株和p z l r 分别接 种于l b 培养基，2 0 0 r m i n ，3 7 ，过夜培养； b ) 倒培养基平板，然后涂布上x - g a l ，晾干； c ) 用灭菌小刀将固体培养基切割成宽1 c m ，间隔o 5 c m 的条带，取离心所得上清 夜滴加到固体培养基条带的一端，保证各个上清点样点在同一水平线上，用灭菌牙签沾 取报告菌p z l r 菌液( o d 6 0 0 o 4 ) ，间隔均匀地接种于上清点样点以下的固体培养基 的条带上； d ) 2 8 ，培养1 5 1 9 h ，观察蓝色斑点距上清点样点的距离。 3 2 3 突变株的构建 3 2 3 1c 4 h s l 合成酶基因突变株的构建( 见图3 1 ) 1 ) 由野生型铜绿假单胞菌p a 0 1 的基因组d n a 中p c r 扩增目的基因，办仃片段； 2 ) 由质粒p u c l8 中p c r 扩增目的基因口，印片段； 2 7 3 ) 分别与p m d 一1 8 载体连接，得到p m d ，向、p m d 口，印，并分别转化于大肠杆菌 d h 50 c 中： 一 4 ) 测序鉴定是否为目的基因； 5 ) 提取p m d - 砌盯、p m d 一日，印目的质粒，分别由限制性内切酶勋，2 i 酶切； 6 ) 单酶切后的p m d 一砌与口印基因片段连接，并转化与大肠杆菌d h 5c 【中； 7 ) 提取第6 步构建的质粒，经b 口聊h i 胁挖讲i i 双酶切，得到目的片段，电转化入野 生型铜绿假单胞菌p a 0 1 中得到c 4 h s l 合成酶基因突变株； 8 ) 鉴定突变株。 k p n |k p n l 豳z z z 冱z z 黝 a m p 鬯埸弦勉勉狃砌蒯1 图3 1 c 4 h s l 合成酶基因突变株的构建流程图 f i g 3 1 c o n s t n l t i o no fm u t a n tc 4 h s l 3 2 3 23 o x o c 1 2 h s l 合成酶基因突变株的构建( 见图3 2 ) 类似与2 2 1 中c 4 - h s l 合成酶基因突变株的构建 m “旺 0 p s t l p 对l 臣冱z 弦弦z 琵z 物 把f b g l l x h o l 。 图3 23 o x o c 1 2 - h s l 合成酶突变株的构建流程图 f i g 3 2 c o n s t r u t i o no f m u t a n t3 o x o c 1 2 h s l 3 2 1 3 3 c 4 一h s l 、3 o x o - c 1 2 一h s l 合成酶基因双突变株的构建 c 4 - h s l 合成酶基因突变株与3 o x o c 1 2 一h s l 合成酶基因突变株两种构建方法的总 和。 3 3结果 3 3 1野生型铜绿假单胞菌p a o l 基因组d n a 的提取 结果见下图： 图3 3铜绿假单胞菌p a 0 1 基因组d n a 电泳图 f i g 3 3a g 啪s eg e le l e c 仰p h o r c s i s 跹a l y s i so fp a 01g e n o m i cd n a m 九- h i n d i d i g e s t ；1 阴性对照；2 基因组d n a 由图可以看出所提基因组纯度很高，完全可以满足下一步p c r 扩增模板的要求。 3 3 2 基因组中目的基因的扩增 3 3 2 1电泳结果： 图3 4目的基凼电泳图 m d l 2 0 0 0 ；1 ，办盯；2 ，口豇；3 伽p ；4 胞f f i g 3 4 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so fo b j e c t i v eg e n e 3 3 2 2 测序检测 1 ) 测序结果 砌盯基因的测序结果： g c c t 气t t c g g c a g t g a c a g c t t g c a t g c c t g c a g g t c g a c g a r t a g g t c c a t g a r c g a a t t g c t c t c t g a a t c g c t g g a a g g g c t t t c c g c c g c c a t g a t c g c c g a g c t 3l g g g a c g c t a c c g g c a t c a g g t c t t c a t c g a g a a g c t g g g c t g g g a c g t g g t c