（有机化学专业论文）毛细管电泳检测多种靶dna及小分子化合物.pdf

毛细管电泳检测多种靶d n a 及小分子化合物的研究 摘要 木工作将毛细管电泳一电化学检测技术引入靶d n a 分析中，将辣根过氧化物 酶( h r p ) 催化过氧化氢( h 2 0 2 ) 氧化邻氨基酚的酶促反应与其氧化产物的电极还原 相偶合，利用毛细管电泳电化学检测技术i 、日j 接检测邻氨基酚h 2 0 2 辣根过氧化物 酶( h r p ) 体系中的h r p 含量。在此基础上引入生物素亲合素系统，通过毛细管电 泳安培法进行分离检测2 1 个、3 9 个、8 0 个碱基的靶d n a 。 第一章为绪论，介绍了毛细管电泳技术的发展和研究现状以及本课题的意 义；第二章介绍了毛细管电泳电化学l 日j 接检测h r p 的情况；第三章用毛细管电泳 电化学检测2 1 个、3 9 个、8 0 个碱基的靶d n a ；第四章用毛细管电泳电化学检测 小分子化合物腺苷；第五章用毛细管电泳电化学发光检测腺苷。 在最传反应条件下，测定游离h r p 检测限为1 0 9 x 1 0 。1 2m o l l 1 ( s n = 3 ) ，线性 范围为2 - 3 1 0 。1 2 3 5 1 0 。1 0 m o l l 1 。 利用此方法成功应用于检测2 1 个碱基的靶d n a ，测定线性范陶为 4 o 1 0 川2 0 1 0 一m 0 1 l 一，检测限为1 2 1 0 。m 0 1 l - 1 ( s n = 3 ) 。对1 0 x 1 0 。1 0 m o l l - 1 的2 1 个碱基s s d n a 进行7 次平行测定，相对偏差为7 2 。在实验条件 最优化的情况下，可以达到通过毛细管电泳安培法对2 1 个碱基的单链d n a 进行 分离检测。 利用此方法成功应用于检测3 9 个碱基的靶d n a ，测定线性范围为 5 0 x 1 0 1 1 _ 1 2 x 1 0 一m 0 1 l ，检测限为2 4 x 1 0 。1 1m o l l 。1 ( s n = 3 ) 。对1 0 x 1 0 。o m o l l 以的3 9 个碱基s s d n a 进行7 次平行测定，相对偏差为6 4 。在实验条件最 优化的情况下，可以达到通过毛细管电泳安培法对3 9 个碱基的单链d n a 进行分 离检测。 利用此方法成功应用于检测8 0 个碱基的靶d n a ，测定线性范围为 5 o 1 0 。1 1 1 0 1 0 一m 0 1 l - 1 ，检测限为3 0 x 1 0 。1 1m o l l 。1 ( s n = 3 ) 。对1 0 x 1 0 。1 0 m o l l j 的8 0 个碱基s s d n a 进行7 次平行测定，相对偏差为6 9 。在实验条件最 优化的情况下，可以达到通过毛细管电泳安培法对8 0 个碱基的单链d n a 进行分 离检测。 利用此方法应用于同时检测2 1 个、3 9 个、8 0 个碱基的单链d n a ，成功实现 了同时进行多个单链d n a 的分离检测。 利用毛细管电泳电化学方法成功应用于检n d , 分子化合物腺苷，通过实验， 本文得m 运用2 5 1 0 m o l l 。1p h8 6 的t r i s 缓冲液，1 0k v 作为分离电压，1 2k v 和5 s 作为进样电压和进样时间可以对腺苷进行分离。 利用毛细管电泳电化学发光法成功应用于检测腺苷，通过实验，本文得出运 用0 0 4m o l l 1p h7 4 0 的p b s 缓冲液，1 2k v 作为分离电骶，1 5k v 和5s 作为进 样电压和进样时间，1 2v 作为榆测电势可以对腺二苷i 进行分离，灵敏度达到1 x 1 0 8 m0 1 i j l 。 关键词：毛细管电泳电化学榆测适体d n a腺苷 h st u d i e s0 nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i cw i t h e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nf o r r l ，埘p l ed n a t a r g e t sa n da d e n o s 烈e a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i ce n z y m ei m m u n o a s s a yw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o ni s a l la t t r a c t i v em e t h o dd u et oi t s h i 曲s e n s i t i v i t ya n dl o wd e t e c t i o nl i m i t t h e o r t h o a m i n o p h e n o l ( o a p ) 一h 2 0 2 - h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( h r p ) e n z y m e - l i n k e d i m m u n o a s s a ys y s t e mw a su s e d t h em e t h o dw a su s e dt od e t e c t21 - 3 9 - a n d8 0 m e t d n a t a r g e t si no n es i n g l es a m p l e d e t a i l so fs e l e c t i o nf o ro p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ep r e s e n t e d t h es y s t e mh a d e x t r e m e l yh i g hs e n s i t i v i t y h r pc a l lb em e a s u r e dw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 0 9 x10 。2 m o l l - 1 ( s n = 3 ) ，a n dal i n e a rr a n g eo f 2 3 x 1 0 - 1 2 3 5 x l o m m o l l 一 t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no f21 一m e rd n a t a r g e t s t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) w a s1 2xlo _ 1m o l l 一，a n dt h el i n e a rr a n g ei s 4 0 xl o l l 2 0 x1 0 一m o l l u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e2 1 m e td n at a r g e t s w e r ed e t e c t e d t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no f3 9 一m e rd n a t a r g e t s t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) w a s2 4 x1 0 。m o l - l ，a n dt h el i n e a rr a n g ei s 5 0 x1 0 - 1l 1 2 xl o m o l l 一u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e3 9 m e rd n a t a r g e t s w e r ed e t e c t e d t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no f8 0 - m e rd n a t a r g e t s t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) w a s3 0 1 0 。m o l l - 1 ，a n dt h el i n e a rr a n g ei s 5 0 x 1 0 - 1 1 1 o x l o m o l l u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e8 0 m e td n a t a r g e t s w e r ed e t e c t e d t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h es i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no f2 1 - ， 3 9 。a n d8 0 m e rd n a t a r g e t si no n es i n g l es a m p l e t h em u l t i p l e xa s s a ya l s op r o v i d e d g o o ds p e c i f i c i t yw i t h o u ta n yc r o s s r e a c t i o n am e t h o df o ri n d i r e c t l yd e t e c t i n gp r o t e i n sw a sd e v e l o p e db yc o m b i n a t i o no f a p t a m e rs s d n as e l e c t i v eh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o nw i t hc o r r e s p o n d i n gp r o t e i n s c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，e n z y m ec a t a l y z e dr e a c t i o na n de l e c t r oa n a l y s i s ，w i t ha v i d i nl a b e l e d h r p t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o na r e2 5 1 0 m o l l 。p h8 6 t r i sf o rt h eb u f f e rs o l u t i o n ，10k vf o rt h es e p a r a t i o nv o l t a g e ，12k va n d5sf o rt h e i n j e c t i o nv o l t a g ea n dt h ei n j e c t i o nt i m e an e wm e t h o do ft h ed e t e c t i o no fa d e n o s i n ew a sd e v e l o p e db yc o m b i n i n g c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s w i t h e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) b a s e do n t r i s ( 2 ，2 - b i p y r i d i n e ) r u t h e n i u m ( i i ) ( r u ( b p y ) 3 p ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fs e p a r a t i o n a n dd e t e c t i o na r e0 0 4m o l l p h7 4 0p b sf o rt h eb u f f e rs o l u t i o n ，1 2k vf o rt h e s e p a r a t i o nv o l t a g e ，15k va n d5sf o rt h ei n j e c t i o nv o l t a g ea n dt h ei n j e c t i o nt i m e ，a n d 1 2v ( v s a g a g c i ) f o rt h ed e t e c t i o np o t e n t i a l t h el i m i to fd e t e c t i o ni s1 0 xl0 6 m 0 1 l - 1 ( s n = 3 ) k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，a p t a m e r d n a ，a d e n o s i n e 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文 或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说 明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 战之j 碉 日期：2 叼年口6 月j 3 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用学位 论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。( 保 密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 本人签名： 导师签名： u 期：孙甲年o b , q1 3 日 口期：加，年p 6 月j 3l 5 7 、，粤 需 畈磨 三纤 战a鬈纷 青岛科技大学研究牛学位论文 第一章前言 毛细管电泳技术( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是一类以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性( 电荷、大小、等电点、极性、亲和 行为、相分配特性等) 为根据的液相微分离分析技术。它使分析科学得以从微升 水平进入纳升水平，并可进行单细胞分析。长期困扰我们的牛物人分子如蛋白质的 分离分析也因此有了新的转机。本章简要介绍毛细管电泳技术的方法和应用，毛细 管电泳检测技术和其在分析中的应用。 1 毛细管电泳技术简介 1 1 毛细管电泳的历史发展过程 毛细管电泳源远流长。以等电点为参考点，可以追溯到2 0 世纪4 0 年代共至更 远；而以采用管式分离通道为起点，则可以前推至1 9 2 7 年前后，当时，电泳分析 研究的开山祖i ) i l i t e s i l i u s 发明了管式移界电泳术【2 】。多数学者认为，毛细管区带电泳 的发展是现代c e 的源头，即使如此，其历史亦可追溯到2 0 世纪6 0 年代中期。 1 9 7 0 年，等速电泳研究先驱e v e r a e r t s 纠3 1 ，报道了他们关于等速电泳中区带电 泳的效应研究，所用方法可为现代c e 雏彤。1 9 7 4 年，v i r t a m e n 4 j 认为必须使用细孔 毛细管方能提高分离效率，此观点为m i k k e r s 等于1 9 7 9 年报道的研究所证实。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s _ 1 5 1 使用7 5p m 内径的熔融石英毛细管，以电迁移进样，在3 0 k v 电压- 卜产生了4 1 0 5 理论板的空前分离效率，对多种组分实现了分离检测，成为毛 细管电泳发展史上的一个里程碑。1 9 8 3 年后，h j e r t e n 等先后提出了毛细管凝胶电泳 和毛细管等电聚焦法，不仅可以大幅度提高了分离效率，而且可以使之实现操作自 动化，便于定性和定量操作。1 9 8 4 年t e r a b e 运用含s d s 的胶束的缓冲液“电泳”分 离了中性组分，实现了电泳与色谱的完美结合【6 】。1 9 8 6 年，l a u e r 报道，蛋白质毛细 管区带电泳效率竟然高达1 0 6 理论板，逼近理论极限。一时间，关于c e 的研究急速 升温，许多大科学家和分析仪器厂都先后卷入c e 研究。商品仪器于1 9 8 8 年推出。 1 2 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳按分离介质和分离原理不同，存在多种操作模式各种模式的分离 机理是不相同的。如今的毛细管电泳不再仅仅局限于分离荷电的大分子粒子， 也 适合分离阳离子、阴离子以及中性分子。 常见的毛细管电泳的分离模式【7 - 1 5 】包括毛细管区带电 b - l k ( c z e ) 、胶束电动毛细管 色谱( m e c c ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、毛细管等电聚焦( c l e f ) 、毛细管等速电泳 ( o t p ) 和亲和毛细管电泳( a c e ) 等。 毛细铨电泳榆测多种靶d n a 及小分子化合物 c z e 又称毛细管自由电泳，由于操作简单，多样化，是目前c e 中最基本，应 用最广泛的一种方式。在c z e 中，毛细管内只充入缓冲溶液，在直流高压驱动下， 溶质以不i j 的速率在分：证的区带内进行迁移而被分离，由于电渗流( e o f ) 的存在， 正负离子都可用c z e 分离，而中性溶质本身在电场中不移动，随e o f 一起流出毛 细管。c z e 的应用范围很宽，包括对氨基酸、多肽、离子、对映体等物质的分析。 在m e c c 中，是把一些离子型表而活性剂( 如十二烷基硫酸钠，s d s ) j j i j 至l j 缓冲 液中，当其浓度超过临界胶束浓度后，就形成有一疏水内核，外部带负电的胶束。 溶质在水相和胶束相( 准固定相) 之问产生分配。中性粒子因其本身疏水性不同，在 两相中分配存在差异而得以分离。m e c c 使c e 能用于巾性物质的分离，拓宽c e 的应用范围，是对c e 的极大贡献。 c l e f 模式是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，通过管壁涂层使电渗 流减d , n 最小，以防止蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带。在高压作用下，毛细管 内部建立p h 梯度，蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦，形成明显的区带，再 通过检溯器分另, j j j n 以确认。 c i t p 是一种较早的分离模式，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电 泳淌度不同得以分离，常用于分离离子型物质，但因其要采用不连续缓冲体系，分 辨率差，目前应用不多。 1 3 毛细管电泳的进样技术 目前至少有三种方法可以让样品直接进入毛细管，即电动法、压力法和扩散法 6 - 1 7 1 。电动法对毛细管内的填充介质没有特殊要求，属于普适方法，可以实现完全 自动化操作，也是商品仪器必备的进样方法。不过电动进样对离子组分存在进样歧 视。压力法进样没有歧视问题，但选择性差，样品及其背景都同时被吸进管中，对 后散分离可能产生影响。扩散进样具有双向性，在样品分子进入毛细管的同时，区 带中的背景物质也向外扩散。由此可以得到畸变程度较小( 和背景差别不大) 的初 始区带，能抑制背景干扰，提高分离效率，扩散也与电迁移速度和方向无关，可抑 制进样偏向，提高定性定量的可靠性。 1 4 毛细管电泳技术的特点 毛细管电泳通常使用内径2 5 1 0 0 岬的弹性【1 8 】( 聚业酰胺) 涂层熔融石英管， 其孔径日j 向下缩减到数纳米，向上扩展到3 0 0 5 0 0g m 。标准毛细管的外径为3 7 5 岬， 有些管的外径为3 6 0p m 或1 6 0p m 。毛细管电泳具备如下优点【1 9 l ： ( 1 ) 微量：进样所需体积可以小至1 微升，消耗体积在l - 5 0n l 之问，故称纳c e ； ( 2 ) 快速：几十秒十几分钟就能完成分离任务； ( 3 ) 高效：自由溶液c e 的效率在1 0 1 0 6 理论板之间，c g e 效率可达1 0 7 理论板以 2 青岛科技大学研究生学位论文 上： ( 4 ) 多模式：仅需一台仪器就可根据需要选用不同的分离模式： ( 5 ) 分析对象广：从无机离子到整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力： ( 6 ) 经济：实验消耗不过几毫升的缓冲溶液，维持费可用分人民币计算； ( 7 ) 洁净：通常使用水溶液，实属“绿色”分析技术； ( 8 ) 自动：c e 是目前自动化程度最高的分析方法。 1 5 毛细管电泳检测技术的发展 就毛细管电泳而言，极细的毛细管内径带来了很高的分离效能，但同时也给样 品组分的检测带来困难，对检测技术相应提出了较高的要求。如何增加检测器的灵 敏度，i 司时又不造成明显的区带腱宽，一直是c e 技术发展中的一个至关重要的问 题。迄今为止，已有许多检测技术与c e 联用，在不同的实际应用领域中发挥作用。 紫外可见光吸收是毛细管电泳中应用最广泛的一种榆测方法【2 0 2 4 1 ，石英毛细管 可透过2 0n l i l 波长以下的紫外光，因此允许从紫外到可见光这一波长范围内对样品 组分进行检测。而且由于透光窗口直接丌在毛细管上( “在柱检测) 。所以检测器本 身不存在死体积及因此而造成的组分混台所产生的样品区带展宽现象。事实上样品 组分的分离在检测窗v i 处仍在进行。为了获得高效，检测区的宽度应小于样品组分 的区带宽度，也就是说透光窗口应足够的小。毛细管电泳峰宽一般存2 5m m 之间。 所以透光窗的尺寸应控制在上述峰宽的1 3 以内。紫外可见光吸收检测法的主要缺 点是灵敏度不高。这主要是光程太短所造成的。 荧光检测法也是毛细管电泳中一种常见的“在柱”检测法【2 5 1 。因对组分区带不会 引起额外展宽，而且检测灵敏度很高，尤其是激光诱导荧光检测法( l i f ) 。其灵敏度 可高达1 0 。om o l l ，是日前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。荧光检测器的 缺点是仅能用于有天然荧光或易于用荧光试剂标记或染色的物质的榆测，而且检测 器的价格也较高。但由于l i f 的高灵敏度和高选择性它仍是毛细管电泳中不可缺 少的检测方式。 电化学检测方法【2 6 】可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题。对电活性组分 的检测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。安培检测是三 种电化学检测模式( 电导检测、电位检测、安培检测) 中最易实现。应用较广的一种 检测技术，为微体积环境中电活性物质的测定提供了高灵敏度的检测方法。但是， 安培检测也有自己的局限性，被检测物质必须具有良好的电化学活性，因而检测范 围有一定的局限性。 质谱( m s ) 法具有较强的定性功能【2 7 2 引。在一次分析中可获得很多结构信息， 因此尝试将分离技术与质谱法相结台可谓是分离科学方法学中的一项突破性进展。 1 9 8 7 年o l i v e r a s 2 9 】首次报道了毛细管电泳与质谱的联用技术。随之，该项技术迅速 毛细管电泳检测多种靶d n a 及小分了化合物 获得了认可和欢迎，并在过1 0 年间，得到了很大的发展，并将之成为商业化。 2 毛细管电泳分析d n a 、蛋白质及小分子化合物 2 1d n a 及碎片分析 自人类基凶组计划提出以来，d n a 的分析榆测一直是研究热门课题。到目前为 止，对d n a 的柃测分析【3 0 - 3 5 】主要分为以下两个方面： ( 1 ) 应用于d n a 片段多态性分析 d n a 片段多态性是生命科学中十分有趣而又有重要意义的现象。基因的多态性 包括长度多态性和序列多态性两方面的内容，基因的序列多念性分析主要是对碱基 替换引起的基因点突变进行检测，用毛细管无胶筛分电泳和单链d n a 构象多态性分 析及异源双链d n a 构象的多态性分析结合进行基因序列多态性分析，运用高效毛细 管电泳进行s s c p 技术和h p a 技术，。日j 以检测剑基因的点突变。蒋红丽等使用高效毛 细管电泳一激光诱导荧光分析d n a 片段，发现在一定体系筛分介质中，随着d n a 分 子链长的增加，d n a 分子在介质中旱现不同的运行机理，而 对于同一大小的d n a 分子，场强也影, 向d n a 分子的运行。 ( 2 ) 应用于d n a 序列测定 c e 测序法测定d n a 序列仍采用s a j l 2 e r 的链末端终止法原理f 3 6 】，只是通过毛细管 电泳将双脱氧核苷酸终止的一系列d n a 片段按其长度分离，其灵敏度可达到能鉴别 d n a 片段在长度上仅有一个核苷酸片段的改变。在a 、c 、g 、t 等4 种核苷酸分子中 去掉3 位氧，即形成4 种相应的双脱氧核苷酸。在4 个聚合反应中，分别加入d d n t p ， 各个反应在d n a 聚合酶作用并有引物存在下，以待测序d n a 为模板合成新d n a 链 时，d d n t p 随机渗入，形成系列3 端为d d n t p 的d n a 片段【3 7 j 。这些片段通过h p c e 分离后，以适当的检测器检测，数据经过计算机处理，即可得到d n a 核苷酸序列。 2 2 蛋白质分析 蛋白质是生物体的主要组成物质及生命活动的基础1 3 8 1 ，是由约2 0 种氨基酸彼 此以肽键的形式( 一c 删h 一) 连接起来的具有复杂结构的牛物大分子。那螳具有 催化作用的酶、具有免疫功能的抗体、起运输作用的血红蛋白、以及某些激素、毒 素等都是蛋白质。目前用于蛋白质分析的仪器和方法，自动化程度不高，手工操作 繁琐的凝胶电泳仍然是蛋白质分离的主要工具【3 9 】。c e e c d 的诸多优点，现能突破 这些方法的局限性，成为完全自动化分析蛋白质的最有效的手段之一。蛋白质分析 主要分为两方面： ( 1 ) 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，酶的检验分析对于研 究生命体内正常的生理活动和新陈代谢有很重要的意义【4 0 。杨文初等利用电泳中介 微分析( e m m a ) 技术，以酶反应为基础，研究了超微量乳酸脱氢酶( l d h ) 的毛细管 4 青岛科技大学研究生学位论文 电泳在线反应的e c d 检测方法，并对该方法在血清样品中的应用作了初步探讨。 w a n g 等采用c e e c d 技术检测老鼠神经胶质瘤单细胞的乳酸脱氢酶同功酶。 ( 2 ) 功能性蛋白的检测【4 1 1 。w a n g 等采用j 笛片毛细管电泳，以二茂铁为标记， 对鼠免疫球蛋白和i 碘代甲状腺原氨酸进行安培免疫分析，预言了将之应用于临床 分析的潜力。g a l l o w a y 4 2 , 4 3 1 小组用高于临界胶束浓度的s d s ，采用胶束电动电泳模 式的芯片毛细管电泳电导检测，对8 种蛋白质基本达到基线分离；该小组还采用 i t p c e 分离模式，将电导法与质谱联用检测了细胞色素和肌红蛋白，陈燕等用c z e 技术进行血清蛋白检测结果与琼脂糖凝胶电泳( a g e ) 技术【2 蜥j 。 2 3 小离子与细胞分析 毛细管电泳既能将无机离子当作样品看待1 47 1 ，也能将细胞当作“离子看待， 既可以分离离子和分子，也可以分离细胞等颗粒物质。毛细管电泳应用于细胞分析 主要有3 类，即细胞颗粒电泳，大量细胞提取物分析及单细胞分析。在细胞颗粒电 泳中，分离对象的重点是不同时期细胞的分选，如凋亡、坏死和正常细胞；对于细 胞提取物或者单细胞分析来说，分析的目标则是细胞内容物如蛋白质、d n a 、糖类 等的含量；细胞外源性物质如各种药物，特别是化疗药物在细胞中的转导、代谢等。 在细胞样品分析中常用的模式是毛细管区带电泳，毛细管凝胶电泳和毛细管无 胶筛分电泳。由于细胞膜的表面存在着带电的基团，如红细胞表面的唾液酸，使得 细胞在电场中可以迁移，所以主要应用于细胞颗粒的电泳和细胞内小分子物质的分 析。不同生理、病理条件下细胞膜表面的带电基刚有差异，导致不同时期细胞在进 行颗粒电泳时得以分离。也有片j 毛细管凝胶电泳分析细胞提取物中的肽类，如测定 谷胱甘肽和二硫化谷胱甘肽的含量以判断细胞的氧化损伤程度。对细胞内的d n a 和 蛋白质等大分子物质的分析则主要采用毛细管凝胶电泳，在毛细管中装入单体和引 发剂引发聚合反应生成凝胶，利用“分子筛”的作用机理h 8 1 ，根据d n a 或蛋白质的 尺寸不同进行分离；也可用毛细管无胶筛分电泳模式，在毛细管中加入线性非交联 亲水聚合物溶液进行无胶筛分。 2 4 毛细管电泳技术的前景展望 毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域的应用也 有较多应用【4 9 ，5 0 1 。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病 理研究、同功酶分析、p c r 产物分析、d n a 片段及序列分析等。在蛋白质应用领域， 毛细管电泳技术的位置已经稳固地确立，但随着蛋白质组学的发展，要求对于更多 复杂蛋白质体系进行分析、其蛋白质的种类多得多、蛋白质的丰度相差更大或对更 多临床牛物样品进行分析，现有的毛细管电泳仪的分辨能力仍然有限、通量也不能 满足，各个方面仍无法满足这种要求。一方面要求对蛋白质或其他分析物能更好地 5 毛细管电泳检测多种靶d n a 及小分了化合物 定性或了解更多的性质，联用技术的发展是一个方向，激光诱导荧光技术的联用是 一个成功的例子，而质谱的联用是一个仍在发展中的技术，电化学和电导检测器的 联用也取得了些进展，并- 月已经初步实现商品化其他的一些联用技术如n m r 、c c d 、 生物传感器、生物发光、蛋白质d n a 芯片榆测器等则仍在研发中。将成功应用于 基因组序列分析的简单高通量的阵列毛细管电泳技术思路应用于蛋白质组方法学 领域，至少将快速分离和高通量化的思路引入蛋白质组学方法学的研究可能是其思 路之。另一方面，实现多维化的毛细管电泳分离体系或微芯片化的毛细管电泳分离 体系，将有可能使得毛细管电泳技术能够在保留其自身优势的基础上，实现对复 杂样品的高效、快速和高通量平行分离分析。 3 毛细管电泳电化学酶催化分析 3 1 电化学酶催化分析标记物 电化学分析法将电化学分析法的高灵敏度与酶催化法的高选择性相结合，即崩 电化学分析技术测定用作标记物的无机物或有机物，或酶标记的催化产物，因而原 则上各种电化学分析技术均可作为电化学分析的检测。电化学分析测定技术主要有 离子选择性电极、极谱法、安培法和伏安法、阳极溶出伏安法、电位溶出伏安法等。 具体的方法主要根据所选用的标记物及分析对象来选择【5 1 1 。 电化学酶催化分析的标记物主要分为两大类：生物酶和电化学活性物质。可以 作为电化学酶催化分析标记物的生物酶必须满足以下条件： ( 1 ) 在检测过程中和保存条件下稳定； ( 2 ) 容易与抗体或抗原结合，但不降低活性； ( 3 ) 酶有高的特殊活性，可以在短时间内将大量底物分子转化为产物； ( 4 ) 在测定条件下体系底物非活性； ( 5 ) 酶催化反应产物具有电化学活性。 在e c i a 中常用的酶1 5 2 1 有碱性磷酸酶( a l p ) 、辣根过氧化物酶( h r p ) 、葡萄糖 氧化酶( g o d ) 、葡萄糖6 磷酸脱氧酶。其巾最常用的是碱性磷酸酶( a l p ) 和辣 根过氧化物酶( h r p ) 。磷酸苯酯和对氨基磷酸苯酯可以用作a l p 的底物，其酶催化 产物苯酚和对氨基苯酚以安培法检测，邻苯二胺、对苯二胺、邻联茴香胺等都可以 做h r p 的底物，在过氧化氢存在下，酶催化氧化产物以极谱法或伏安法检测。 3 2 毛细管电泳酶催化分析 毛细管电泳酶催化分析法将毛细管电泳技术引入酶催化分析中来陋5 7 1 ，使其具 有以下三个方面的突出优点： ( 1 ) 实现了极低的检测量的检测，例如，用7 0 止毛细管町以检测2 8 0 04 - 1 5 0 个 6 青岛科技大学研究生学位论文 鼠i g g 分子； ( 2 ) 酶催化产物的稀释极大减小，可以大大缩短酶催化放人时问。几个方面改 进的综合结果，使得由原来几个小时的测定时间缩短到了十几分钟甚至更短。 ( 3 ) 由于扩散路径缩短，使得催化反应孵化时间大大减少，例如，对于2 5 皿 毛细管，从管中心到表山的扩散距离约是0 0 1 2 5c m ，而一般的分析板，这个距离 为o 3 5c m ，由于时问与距离具自平方的关系，所以后者的扩散时间大约是前者的 7 8 4 倍； 毛细管电化学酶催化分析法将三个独特的优点：短检测时间、超灵敏度和微量 样品体积融合进+ 1 种方法之中。用毛细管电化学酶催化分析法测定人血清i g g ，其 检测限为5 6 1 0 j 4m o l l ，线性范围达4 个数量级。 3 3 毛细管电泳酶催化分析的综合应用展望 毛细管电泳酶催化分析有着分析速度快、样品用量少、易于自动化以及能够同 时检测样品中的多种成分等常规分析方法所不具各的优点【5 引。从毛细管电泳酶催化 分析方法的建立至今，它的这些优点很快地被人们所认识和接受，并且在生物医学 监测、疾病诊断、毒理分析、药物检测以及环境科学等方而得到了广泛的应用。但 是毛细管电泳酶催化分析目前还存在着一些局限性：日前毛细管电泳酶催化分析 还不能完全实现自动化，很多工作仍然需要手工来完成，其分析通量还不能和常规 分析方法相比较，当前毛细管电泳酶催化分析的榆测限主要还停留在nm o l l 。的 水平，还没有有效的手段使得检测限进一步降低等。 今后毛细管电泳酶催化分析的发展方向将是全自动、仪器小型化、快速高效以 及实时监测【5 9 。6 l 】。随着酶催化放大法的成熟，以及检测手段的进一步发展，毛细管 电泳酶催化分析在应用中将具有更高的灵敏度( 由于酶的放大作用) 和更好的选择 性( 由于酶催化底物的专一性) 。毛细管电泳酶催化分析目前存在的不能同时分析多 个样品的主要问题也会通过毛细管阵列电泳和微片上多通道电泳得到解决。随着在 线装置的进一步完善，毛细管电泳酶催化分析将最终摆脱手工操作的繁琐。相信以 后的毛细管电泳酶催化分析一定会在临床、药物分析及生物技术等各个领域发挥更 大的作用。 4 毛细管电泳电化学发光在分析科学中应用 4 1 毛细管电泳电化学发光技术简介 一些无机物的络合物、簇合物具有电化学发光( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) 现象，电致化学发光是一种电化学手段产生的化学发光。这种技术结合了电化学和 光化学分析的手段，具有灵敏度高、装置简单等优点，能较方便的应用于流动注射 ( f i a ) 和高效液相色谱法( h p l c ) 分析中。有关电致发光的的反应机理及其在分 7 毛细管电泳检测多种靶d n a 及小分子化合物 析化学中应用的综述，国内外已有很多报道，在分析化学中的应用也日益受到人们 的关注。f f l r u ( b p y ) 3 2 + 是研究最多和应用较广泛的化合物【图l - l 】。这是因为 r u ( b p y ) 3 2 + 化学性质稳定，口j 在水溶液中、不需除氧和除杂质、室温条件下发光，而 且引发电势值适当、激发态反应活性高、寿命长、发光效率高等特剧6 2 1 。 2 + 图1 - 1r u ( b p y ) 3 2 1 结构示意图 f 嘻1 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo fr u ( b p y ) 3 2 + r u ( b p y ) 3 2 + 的化学发光现象最早于1 9 6 6 年被l y t l e 等人发现，他们在强酸和强碱 i 拘r u ( b p y ) 3 2 + 的溶液中加入芳香胺，在暗房里观察剑了桔红色的发光现象，并测定了 其发光波长为5 9 5n m 。b a r d 等人在这方面进行过很多的研究，一般认为r u ( b p y ) 3 2 + 的 e c l 是南于激发态的r u ( b p y ) 3 2 + + 的产生所致，发光波长在6 1 0n m 左右。毛e r u ( b p y ) 3 2 草酸钠体系中，e c l 经历以下过程：正电位一f r u ( b p y ) 3 2 + 在玻碳或铂电极卜被氧化， 即r u ( b p y ) 3 2 r u ( b p y ) 3 3 + + e ；在电极表面附近扩散层内还有l 沁( b p y ) 3 2 + + c 2 0 4 2 。一 r u ( b p y ) 3 3 + + c 2 0 4 、和c 2 0 4 - - - - c 0 2 + c 0 2 。的化学反应产生，中间产物自由基阴离子 c 0 2 - 具有很强的还原性，它能与被氧化的r u ( b p y ) 3 3 + 反应生成激发态的r u ( b p y ) 3 2 p 而 发光，i t i 】c 0 2 。+ r u ( b p y h 即一c 0 2 + r u ( b p y h 孙8r u ( b p y ) 3 d8 - - r u ( b p y ) 3 2 + + h v 6 1 0 n m 。另 外，在i 沁( b p y ) 3 2 + 焦硫酸钠体系的阴极还原过程中，也有e c l 产生。首先，r u ( b p y ) 3 2 + 被还原为r u ( b p y ) 3 + ，然后，r u ( b p y ) 3 + 与焦硫酸根反应生成硫酸根的自由基阴离子， 从而生成激发态的r u ( b p y ) 3 2 1 6 引。 4 2r u ( b p y ) 3 2 + 电化学发光机理及特点 r u ( b p y ) 3 2 + 的电化学发光机理町以解释为：当r u ( b p y ) 3 3 + 与r u ( b p y ) 3 2 + 反应时产生 激发态i 拘r u ( b p y ) 3 2 ，r u ( b p y ) 3 2 + 是水溶液中的稳定物种，在+ 1 ，3v 至1 3v ( v s a a g c l ) 电势范围内分别氧化、还原为r u ( b p y ) 3 3 + _ j 5 1 r u ( b p y ) 3 + ，两者反应生成激发 青岛科技大学研究生学位论文 态r u ( b p y ) 3 护，r - u ( b p y ) 3 2 p 回到基态时发出波长约为6 1 01 1 l n 的橘红色光。机理如下： r u ( b p y ) f 什- e - - r u ( b p y ) 3 + r u ( b p y ) 3 钟+ e - - - r u ( b p y ) 3 + r u ( b p y ) 3 3 + + r u ( b p y ) 3 + - _ + r u ( b p y ) 3 2 + + + r u ( b p y ) 3 2 + r u ( b p y ) 3 h - - r u ( b p y ) 3 2 + + h 1 ， 一般认为r u ( b p y ) 3 2 + 体系的发光是因为金属到配体三重电荷传递态 ( m e t a l l i g a n dc h a r g et r a n s f e r , m l c t ) 跃迁回基态产牛的，r u ( b p y ) 3 ”的最低激发态 是m l c t 态，m l c t 全i 基态的跃迁较缓慢，因此发光时间较长，强度较高】。存乙 腈溶剂中i u ( b p y ) 3 ”与r u ( b p y ) 3 + 淬火发光效率约为5 - 6 ，比在其它体系中要高， r u ( b p y ) 3 2 + 与革酸盐在水溶液中的电化学发光反应发光效率约2 。 当某些还原剂或氧化剂与l 沁( b p y ) 3 2 + 的氧化或还原产物反应时也可产生电化学 发光现象，因此可以用r u ( b p y ) 3 2 + 的电化学发光反应体系来对这些还原剂或氧化剂进 行分析。r u ( b p y ) 3 2 + 在电极上失去一个电子生成r u ( b p y ) 3 3 + ，r u ( b p y ) 3 3 + 与强还原剂反 应产生激发态r u ( b p y ) 3 2 p 并发光的氧化还原( o x i d a t i o n r e d u c t i o n ) 机理可以表示为： r u ( b p y ) 3 p e - - r u ( b p y ) 3 ” r u ( b p y ) 3 + + r e d u c t a n t - * r u ( b p y ) 3 + r u ( b p y ) 3 3 + + r u ( b p y ) 3 + - + r u b p y ) 3 2 + + r u ( b p y ) ：3 2 + r u ( b p y ) f 计- - r u ( b p y ) 3 2 + + hv 这类还原剂有一般有草酸盐、n a b h + n 2 i - h 、氨基酸、n a d h 、脂肪或环胺等【6 5 】。 r u t b p y h 2 + 在电极上得到一个电子生成r u ( b p y ) 3 + ，r u ( b p y ) 3 + 与强氧化剂反应产生 r u ( b p y h 2 + 并发光的还原氧化( r e d u c t - o x i d a t i