（细胞生物学专业论文）拟南芥earli1基因在生物和非生物胁迫中的抗性功能.pdf

拟南芥e a r l h 基因在生物和非生物胁迫中的抗性功能 摘要 剧皿以( e a r l ya r a b i d o p s i sa l u m i n i u m i n d u c e dg e n e l ) 属于毋尸! r 尸( h y b r i dp r o l i n er i c h p r o t e i n ) 基因家族。h v p i 冲广泛存在于高等植物中，是富脯氨酸蛋白( p r p ) 的一个亚 类。p r p 是五类细胞壁结构蛋白中的一类，它们在植物细胞生长和发育过程中决定特殊 的细胞壁结构，在植物受到物理伤害或病原体侵染时起防卫功能。本研究的目的在于通 过表达调控、生理生化分析及形态观察，研究e a r l l l 在生物和非生物胁迫中的功能， 为阐明细胞壁蛋白在逆境条件下的作用机制提供证据。 本工作通过卡那霉素抗性筛选得到了e a r l l l 过表达拟南芥转基因株系，采用 r t - p c r 和n o r t h e r n 印迹杂交技术对e a r l l l 基因的表达水平进行分析，结果表明转基 因植株中e a r l h 基因的表达量相对于野生型个体明显提高。同时，通过p c r 技术筛选 得到多个e a r l l l 基因的t - d n a 敲除纯合突变体。用基因两端的序列设计引物进行 r t - p c r ，在纯合敲除突变体中检测不到巴4 皿以全长m r n a ，说明该基因已被t - d n a 打断。n o r t h e m 印迹杂交结果显示s a i l8 6a 0 6t - d n a 纯合敲除突变体产生一条比野 生型m r n a 要小的条带，说明在突变体中不能转录产生完整的e a r l l l 基因m r n a 。 以c 0 1 0 野生型拟南芥为材料分析各种胁迫因素对尉剧川基因表达的影响， r t - p c r 及n o r t h e m 印迹杂交结果显示e a r l l l 基因可以被n a c l 诱导，其转录水平在一 定程度上随n a c l 浓度的提高而增加。比较过表达、敲除突变体及野生型拟南芥在不同 浓度n a c l 和甘露醇胁迫下的表型特征和生理指标，结果表明在一定程度上，过表达植 株表现出更强的耐盐和耐旱性，而敲除突变体对盐和干旱的耐受能力与野生型个体相比 明显下降。 n o r t h e m 印迹杂交结果显示蒜薹灰霉菌( b o t r y t i sc i n e r e ap e r s e xo f g a l i cs p r o u t s ) 接 种处理可以诱导拟南芥e a r l l l 基因的表达。采用台酚蓝染色观察真菌侵染状况，发现蒜 薹灰霉菌对过表达植株叶片的侵染程度比野生型个体叶片要轻，而敲除突变体植株叶片 被侵染的程度较为严重。转e a r l l l 基因酵母在半乳糖诱导后与转空载体酵母相比生长速 度明显下降，进一步说明e a r l l l 基因具有抗真菌的功能。表型及扫描电镜观察表明敲除 突变体叶片更易被昆虫啃食。 通过农杆菌转化方法将e a r l l l 基因导入烟草( 秦烟9 5 ) ，采用p c r 、r t - p c r 以 及n o r t h e r n 印迹杂交技术对具有卡那霉素抗性的再生植株进行了鉴定，并以转基因烟草 为材料进一步验证了e a r l h 的耐盐性。 关键词 h y p r p ，删魁仃，过表达，t - d n a 敲除突变体，n o r t h e r n 印迹杂交 r e s i s t a n c eo f a r a b i d o p s i se a r l hg e n et oa b i o t i ca n db i o t i cs t r e s s e s a b s t r a c t e a r l h ( e a r l ya r a b i d o p s i sa l u m i n i u m i n d u c e dg e n e l ) b e l o n g st oh y p r p ( h y b r i dp r o l i n e r i c hp r o t e i n ) g e n ef a m i l y h y p r pm a k e su pas u b c l a s so fp r p ( p r o l i n er i c hp r o t e i n ) w h i c hi s w i d e l ye x i s t e di nh i g h e rp l a n t s p r pr e p r e s e n t so n eo ff i v et y p e so fs t r u c t u r a lc e l lw a l l p r o t e i n st h a tm a yf u n c t i o nb o t hi nd e t e r m i n a t i o no fs p e c i f i cs t r u c t u r eo fc e l lw a l ld u r i n gp l a n t d e v e l o p m e n ta n di nd e f e n s eo fp l a n t sa g a i n s tp h y s i c a ld a m a g ea n dp a t h o g e ni n f e c t i o n t h e a i mo ft h ep r e s e n tw o r ki st ou n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no fe a r l hg e n eu n d e rd i f f e r e n ts t r e s s e s b yi n v e s t i g a t i n gt h ee x p r e s s i o np a t t e r n s ，p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n dm o r p h o l o g i c a l v a r i a t i o n so f e a r l ho v e r e x p r e s s i o n ( o x ) a n dt - d n ak n o c ko u t ( k o ) l i n e s h o m o z y g o u so xl i n e sw e r es c r e e n e db yk a n a m y c i n ( k a n ) s e l e c t i o n h i g h e re x p r e s s i o n l e v e lo fe a r l hi nt h e s eo xl i n e sw a sc o n f i r m e db yr t - p c ra n dn o r t h e r nb l o ta n a l y s i s h o m o z y g o u st o d n ai n s e r t i o nl i n e sw e r ei d e n t i f i e db yp c r f u l ll e n g t he a r l hm r n a c o u l dn o tb ed e t e c t e db yr t - p c r ，w h i l eo n l yas h o r t e rt r a n s c r i p tb a n dc o u l db ed e t e c t e db y n o r t h e r nb l o ta n a l y s i si nk ol i n e s e a r l y - f l o w e r i n ga r a b i d o p s i se c o t y p ec o l u m b i a - o ( c o l o ) w a su s e d t o a n a l y s e t h e e x p r e s s i o no fe a r l hu n d e rv a r i o u ss t r e s s e s r t - p c ra n dn o r t h e mb l o ta n a l y s i sr e v e a l e d t h a te a r l hc o u l db ei n d u c e db yn a c l m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n dp h y s i o l o g i c a l a n a l y s i ss h o w e dt h a to xl i n e so fe a r l hh a ds t r o n g e rs a l ta n dd r o u g h tt o l e r a n c ec o m p a r e d w i t hc o l - 0w i l dt y p ep l a n t s ，w h i l et h et o l e r a n c eo fe a r l hk ol i n e sw a sd e c r e a s e d o b v i o u s l y n o r t h e mb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a te a r l hc o u l da l s ob ei n d u c e db yi n o c u l a t i o no f b o t r y t 括c i n e r e ap e r s e xo fg a l i cs p r o u t s g e r m i n a t i o no f b o t r y t i sc i n e r e as p o r e sd e p o s i t e do n l e a fs u r f a c eo fw i l dt y p e ，o v e r e x p r e s s i o na n dt - d n ak n o c ko u tp l a n t sw e r em o n i t o r e d m i c r o s c o p i c a l l ya f t e rt r y p a nb l u es t a i n i n g h y p h a eo fb o t r y t i sc i n e r e ag r e wv i g o r o u s l yo nl e a f s u r f a c eo fe a r l hk ol i n e s ，w h i l et h e i rg r o w t hw a si n h i b i t e do nl e a fs u r f a c eo fo xl i n e s y e a s tc e l l sh a r b o r i n ge a r l hh a da s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( p 5 0 腭也可 以进行二次洗脱或增大洗脱体积。 1 4 2e d n a 第一链合成 t m e d n a 第一链的合成采用f e r m e n t a s 公司的试剂盒r e v e r t a i d f i r s ts t r a n de d n a s y n t h e s i sk i t # 1 6 2 1 。 ( 1 ) 在p c r 管中加入0 l - 5 z g 总i 矾a 和1 肛lo l i g o ( d t ) 1 8 ，再) j i d e p c t r e a t e dh 2 0 至1 2 肛l ， 温和混匀后离心3 5s 。一般情况下可不力i d e p c t r e a t e dh 2 0 ，直接加l1 肚总r n a 1 4 西北大学硕士学位论文 至终体积为1 2 肛l 。 ( 2 ) 7 0 反应5m i n 后，置于冰上。稍微离心以便收集管壁上的液滴。 t m ( 3 ) 将p c r 管置回冰上，依次j j i k 4 肛l5 r e a c t i o nb u f f e r 、l 肛lr i b o l o c k r i b o n u c l e a s e i n h i b i t o r ( 2 0u 肚) 和2 肛l1 0 m m o l ld n t pm i x 。温和混匀后离心数秒。 ( 4 ) 3 7 反应5m i n 。 ( 5 ) 加入l 弘lr e v e r t a i dm m l x l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0u # l ) 至终体积为2 0 肛l 。 ( 6 ) 4 2 反应6 0m i n 。 ( 7 ) 7 0 处理1 0m i n 终止反应。 1 4 。3 琼脂糖凝胶电泳快速检测总r n a 的质量 制备r n a 甲醛变性胶的操作比较麻烦，为了快速检测提取的总r n a 用于后续反 转录实验，可以通过1 2 琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 的质量，电泳时间2 0 3 0m i n ， 电压1 6 0v 。 1 4 4p c r 扩增引物的设计 根据n c b ig e n b a n k 数据库中下载的尉碰朋序列，采用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设 计引物序列并委托上海生物工程公司合成。两引物扩增产物的长度为4 6 2b p 。 上游：5 ，- t t t c t t c g c c c t t a a c a t c a 3 下游：5 ，- t t t c t t c g c c c t t a a c a t c a 3 7 为了比较过表达植株和突变体相对于野生型c 0 1 0 植株的尉皿以表达情况，本工 作以拟南芥持家基因a t a c t i n 8 作为内参。p c r 产物大小为4 2 8b p 。 设计的内参引物如下： 上游：5 ，a t g a a g a t t a a g g t c g t g g c a 3 7 下游：5 ，t c c g a g t t t g a a g a g g c t a c 3 7 1 4 5p c r 反应体系 在0 2m lp c r 反应管中加入以下反应组分： i s 第二章e a r l i i 过表达及t - d n a 敲除纯合体的筛选 表2p c r 反应体系 t a b l e2p c rr e a c t i o ns y s t e m h 2 0 10 x b u f f e r d n t p s ( 2 5 m m o l le a c h ) 引物( 2 0 p m o l # l ) t a q d n a 聚合酶( 5u # l ) 模板c d n a 1 2 7 5j 【l 2 弘l 2 肚 上下游各1p l 0 2 5 弘l 1 止 总体积 2 0 l 将反应组分混匀后离心数秒，在p c r 热循环仪上进行扩增。扩增反应程序：9 4 。c5 m i n ；9 4 3 0s ，5 9 3 0s ，7 2 5 0s ，1 0 个循环；9 4 c3 0s ，5 7 3 0s ，7 2 5 0s ， 1 0 个循环；9 4 。c3 0s ，5 6 3 0s ，7 2 。c5 0s ，5 个循环；7 2 。c1 0m i n 。 用1 2 琼脂糖凝胶电泳检测p c r 产物，电泳缓冲液为o 5 x t b e ，胶中含o 5 z g m l g e lv i e w 核酸染料，4v c m 进行恒压电泳。 1 5n o r h t e mb l o t 分析 1 5 1 植物总r n a 提取 实验方法参照本章1 4 1 。 1 5 2 杂交探针的制备 以质粒p p z p 2 1 1 e a r l hd n a 为模板进行p c r ，反应体系和反应条件同上。使用 胶回收试剂盒( 购自天根生物工程公司) 中的标准程序回收目的基因片段，用于探针 制备。 p c r 产物的回收 ( 1 ) 在紫外灯下切取目的条带，用纸巾吸净凝胶表面的液体。 ( 2 ) 称量凝胶重量，以1m g = l z l 换算凝胶体积。 ( 3 ) 根据凝胶浓度，按表l 提供的参数加d e ab u f f e r 。 1 6 西北大学硕一f ：学位论文 表3 凝胶浓度与应加的b u f f e rd e - a 的体积 t a b l e3g e lc o n c e n t r a t i o na n dv o l u m eo fb u 佰e rd e a 凝胶浓度b u f f e rd e a 体积 1 o 1 5 q 0 3 个凝胶体积 4 个凝胶体积 5 4 凝胶体积 ( 6 ) 将d n a - p r e pt u b e 置于2m lm i c r o f u g et u b e 中，将步骤5 中的混合液转移到 d n a p r e pt u b e 中，2 5 0 0 x g 离心1m i n 。 ( 7 ) 弃滤液，将d n a - p r e pt u b e 置回到原来的2m lm i c r o f u g et u b e 中，：j n a 5 0 0 t lb u f f e r w l ，2 5 0 0 x g 离心1m i n 。 ( 8 ) 弃滤液，将d n a - p r e pt u b e 置回到原2m lm i c r o f u g et u b e 中， j i j ) k 7 0 0 肚已加入 无水乙醇的b u f f e rw 2 ，2 5 0 0 x g 离心1m i n ，以同样的方法再用7 0 0 肚b u f f e rw 2 洗涤一次。 ( 9 ) 将d n a p r e pt u b e 置于1 5m l 离心管中，1 2 0 0 0 x g 离心1m i n 。将d n a p r e pt u b e 置 于另一洁净的1 5m l 离心管中，在s i l i c a 膜中央加入2 5 3 0 肛e l u e n tb u f f e r 或去离子 水，室温静置1m i n 。1 2 0 0 0 x g 离心1m i n 收集d n a 。 参照r o c h e 公司d i gh i g hp r i m ed n al a b e l i n ga n dd e t e c t i o ns t a r t e rk i ti i 中的标准程 序制各地高辛标记探针。 取l 腭回收的目的基因片段( 终体积为1 6 肚) 至一经d e p c 处理的p c r 管中， 在沸水中变性1 0m i n 后于冰水中迅速冷却，然后加入4 弘ld i g - h i g hp r i m e ，混和均匀 后于3 7 。c 放置2 4h ，6 5 加热1 0m i n 或加入2 “l0 2m o l le d t a 终止反应，然后按 照说明书对标记好的探针和d i g 1 a b e l e dc o n t r o ld n a 进行梯度稀释，采用碱性磷酸酶 底物n b t 和b c i p 进行显色反应，确定探针的浓度。 1 5 3r n a 甲醛凝胶电泳 ( 1 ) 1 0 m o p s ( 甲醛凝胶电泳缓冲液) ：m o p s ( p h7 o ) 0 2m o l l ，乙酸钠8 0m m o l l ， e d t a ( p h8 0 ) 1 0 m m o l l 。2 0 9 3gm o p s ( 3 ( n 一玛琳代) 丙磺酸) ，3 4g 乙酸钠， 1 7 第二章r ，过表达及t - d n a 敲除纯合体的筛选 1 8 6g e d t a ，加d e p c 水至5 0 0 m l ，用n a o h 调p h 至7 0 ，黑暗保存。 ( 2 ) 琼脂糖凝胶配置：将0 5g 琼脂糖溶于3 5 5m ld e p c 处理的水中，加热至沸( 中 间摇一次) ，冷却至5 0 6 0 。c 后加入5m l1 0 x m o p s 、9m l 甲醛和o 5 肛l e b ( 1 0 m g m l ) ( 可选) 。在通风橱内灌制凝胶，于室温放置3 0m i n 或更长时间使凝胶 凝固。 ( 3 ) 在一灭菌的微量离心管内混合下列液体，以制备样品。r n a ( 多达3 0g g ) 2 0i f l ， r n a 上样缓冲液( 1 0 x m o p s ：甲醛：甲酰胺，7 5 ：1 3 1 ：3 7 5 ) 2 0 肛l ， 于6 5 v 温浴1 5m i n ，置于冰中冷却，微离使管内所有液体集中于管底。 ( 4 ) 加2 肚灭菌的并用d e p c 处理的甲醛凝胶上样缓冲液。甲醛凝胶上样缓冲液： 甘油5 0 ，e d t a ( p h8 0 ) lm m o l l ，溴酚蓝0 2 5 ，二甲苯青f f0 2 5 。 ( 5 ) 加样前，将凝胶预电泳5m i n ，电压为5v c m 。 ( 6 ) 将凝胶浸入1 x m o p s 电泳缓冲液中，将样品加至凝胶加样孔，3 4v c m 电压电 泳3 0 6 0 m i n 。 ( 7 ) 电泳结束后( 溴酚蓝迁移出约8c m ) 在紫外凝胶成像装置中观察并照相。 1 5 4 变性r n a 向尼龙膜的毛细管转移 ( 1 ) 取一d e p c 水浸泡过的方盘，加入适量d e p c 处理的2 0 x s s c 溶液( 3m o l l n a c l ， o 3m o l l 柠檬酸钠( p n8 0 ) ) 。方盘上放一倒扣的电泳槽( d e p c 水浸泡) ，电泳 槽上铺上一张干净的滤纸，滤纸两端浸没在2 0 x s s c 溶液中，电泳槽与滤纸之间 不得有气泡。 ( 2 ) 取出凝胶，倒扣( 点样孔朝下) 于滤纸上，用玻璃棒滚动以赶走凝胶与滤纸之间 的气泡。剪一块与凝胶大小相同的尼龙膜准确地覆盖在凝胶表面，膜一经与凝胶 接触，不可再移动。 ( 3 ) 将三张与膜大小相同的滤纸在2 0 x s s c 溶液中浸湿后铺在膜上，排除气泡。滤纸 上放一卷与膜大小相同的吸水纸，吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板，玻璃板上 压o 5 1k g 的重物，水平放置，转移1 2 - 2 0h 。 ( 4 ) 转移结束后，在尼龙膜上记录点样孔的位置。尼龙膜在1 0 x s s c 溶液( d e p c 处 西北大学硕士学位论文 理) 中浸泡5r a i n 后，1 2 0 。c 烘烤半小时固定交联r n a ，备用。 1 5 5 杂交 将交联处理的尼龙膜放入带有预杂交液的杂交管中，在杂交炉中于4 2 。c 预杂交1 2 h 。去掉预杂交液，加入含有探针的杂交液( 在8m l 标准杂交液中约加入2 0 0n g 于 1 0 0 。c 变性5r a i n 的探针) ，于4 2 。c 杂交1 2 2 0h 。杂交结束后，在室温下用2 x s s c 、o 1 s d s 溶液( d e p c 处理) 洗膜2 次，每次5m i n i 在6 5 用o 5 x s s c 、o i s d s 溶液 ( d e p c 处理) 洗膜2 次，每次1 5m i n 。 1 5 6 杂交信号的检测 将漂洗过的尼龙膜浸于w a s h i n gb u f f e r o 1m o l lm a l e i ca c i d ，0 1 5m o l ln a c l ，p h 7 5 ，0 3 ( w ) t w e e n2 0 ：d e p c 处理】，漂洗1 - 5m i n 后将膜浸入1 0 0m l 封闭液( 1 0 b l o c k i n gr e a g e n t ，o 1m o l lm a l e i ca c i d ，o 15m o l ln a c l ，p h7 5 ，d e p c 处理) 温育3 0 m i n 。然后放入2 0m la n t i b o d ys o l u t i o n ( a n t i d i g o x i g e n i n - a 原液按1 ：10 0 0 0 用封闭液稀 释) 中，温育3 0m i n i 再用1 0 0m lw a s h i n gb u f f e r 洗膜2 次，每次1 5m i n 。在2 0m l d e t e c t i o nb u f f e r 【o 1m o l ln a c l ，1 0m m o l lr i f f s h c l ( p h9 5 ) ，d d h 2 0 用d e p c 处理 中平衡2 5m i n 。将膜放入一干净培养皿中，加入10m lc o l o rs u b s t r a t es o l u t i o n ( 将2 0 0 肛l n b t b c i p 储液加入到1 0m ld e t e c t i o nb u f f e r ，混合均匀) ，在黑暗中显色1 6h 以上。 显色时应避免摇晃。用5 0m l 双蒸水洗膜5m i n 以终止反应，实验结果在扫描仪上扫 描拍照。 2 结果 2 1 利用抗性标记筛选过表达纯合体 观察播种在附加5 0m g m lk a n 的1 2 m s 培养基上的拟南芥幼苗的生长情况。过表达 转基因植株因为整合有n p 死，基因，能够在k a n 培养基上存活并良好生长。相反野生型拟 南芥对照虽然能够在5 0m g m lk a n 培养基上萌发长出子叶，但很快子叶变白，植株开始 死亡，并且根发育不完全。k a n 主要影响植物叶绿素的合成及根的发育过程( 图2 ) 。 利用孟德尔遗传规律，根据子代表型( k a n 抗性) 分离比来判定亲代的基因型。如 果t 2 代种子k a n 分离比约为3 ：1 ，说明t 1 代母本是杂合体。如果t 2 代种子几乎全部 都有k a n 抗性，则t 1 代母本为纯合株系。 1 9 第= 章d 呦过表达世- d n a 敲除纯体的筛选 b 图2l “n 抗性筛选 f i g 2 k i nr e s i s t a n c es e l e c t i a n a ：过表达植株在5 0 i 玎g 几k a n 培养基r 的牛长情况；b ：野牛型植株在s o m g ：l k a n 培养基f ，的生长情况 2 2 敲除突变纯合个体的筛选 采用二条引物进行p c r ，检测7 个不同株系，结果如图3 所示。l 、4 株系只能通过s p f 和s p r 扩增w , 4 6 2b p 的条带，说明i 、4 是野生埤! 株系。3 、6 栋系采用s p f 和s p r 或s p f 和 l b p j 匀能扩出条带，说明它们是杂合体。2 、5 、7 植株d n a 用s p f 和s p r 不能扩增出条带， 而用s p f 和l b p 能扩增得到一个3 0 0b p 的条带说明它们是纯合突变体。扩增反应经三次 重复得至相同结果。 图3t - d n a 敲除突变纯台十体的k r 筛选 f i g 3 t - d n a k n o c k o u th o m o z y g o t es e l c f i o ab y p c r m ：m a r k e r ：1 0 0b p 2 5 0b p ，5 0 0b p ，7 5 0b p ，1 0 0 0b p ，2 0 0 0b p ：1 - 7 ：不i - i t - d n a 插 入系s p f 和s p r 扩增结果：r - 7 ：不同t - d n a 插入系s p f 和l b p 扩增结果 北大学碰士学位论文 23 过表达及t d n a 敲除突变纯合体e a r l i i 的表达分析 r t p c r 结果显示e a r l i i 在野生型c o l 一0 个体中表达量相对较低，在过表达转基 因植株中表达量相对较高，而在t d n a 敲除突变纯合体中没有检测到e a r l l l 的表达 ( 圈4 ) 。经三次独立实验得到相同结果。 o x k 0 。“ ， e a r l l l a c t2 ，8 图4 不同材料e a r l i i 表达的r t - p c r 分析 f 电4 r t - f c ra n a l y s i s o f e a r l l lg e n e i nd i f f e r e n t g e n e t i cb a c i g r o u n d s c o l - or 咀c 0 1 4 野生型o d n a 为模板：o x ：以过表达纯台体植株e d n a 为模板ik o ：以敲除突变 纯合体c d n a 为模扳 2 4 过表达及敲除突变体伽j 基因的n o r t h e r n 印迹分析 n o r t h e r n 杂交结果显示，野生型c o l - 0r n a 的杂交条带几乎不可见，说明e a r l l l 本身的表达水平很低。过表达植株r n a 杂交所得的条带非常明显，说明过表达植株 e a r l l l 的表达量明显上升。t d n a 敲除突变体n o r t h e r n 杂交显示有一条相对于野生型 较小的带( 图5 ) 。 第，帝e a r l i i 过表达厦t - d n a 敲隙纯台体的筛选 c o l - 0 c 0 9 0 i s a l l )o x ( e a r l 1 ) k 0 ( e a r l i i 渊 图5n o r t h e r nb l o t 分析 f i g 5 n o r t h e r nb l o t a n a l y s i s c 0 1 4 ) ：c 0 1 0 野生型k n a ：o x ：过表达纯台体r n a tk o 敲除突变纯台体r n a 3 讨论 经过k a n 抗性筛选得到删皿 过表达转基因纯合体r t - p c r 和n o r t h e mb l o t 显 示在r n a 水平，过表达植株e a r l l l 基因表达量相对于野生型c o l 一0 明显升高。n o r t h e r n 杂交条带显示过表达条带相对于野生型稍大些，原因为过表达个体中插入的e a r l h 基因受3 5 s 启动子和m a s 终止子控制，转录后的m r n a 与野生型e a r l i l m r n a 相比在 5 和3 端有所不同。 通过p c r 筛选得到三个t - d n a 敲除突变纯合株系。用基因两端的引物对t - d n a 敲除突变纯合株系进行r t - p c r ，不能检测到e a r l l l 基因的表达。n o r t h e r n 杂交结果显 示s a i l8 6a 0 6t - d n a 敲除突变纯台体相对于野生型有一条较小的带，说明在突变体 中不能转录产生完整的e a r l l l 基因m p n a 。 两北大学硕士学位论文 第三章删肚以在非生物胁迫中的抗性功能 1 材料和方法 1 1 实验材料 涉及的不同材料包括拟南芥：野生型c 0 1 0 、e a r l l l 过表达纯合体( 尉碰川o x ) 、 和e a r l l lt - d n a 敲除突变体纯合体( 尉r 删k o ) 。纯合体筛选及鉴定过程详见第二 ：凸： 罩o 1 2e a r l l l 抗盐性分析 1 2 1 表型分析 将1 1 所述的三种拟南芥材料种子经消毒灭菌后分别播种到含有0 、1 0 0 、1 5 0m m o l l n a c l 和1 蔗糖的1 2m s 培养基上，于2 5 + 2 、每天1 6h 光照、1 5 0 0l x 条件进行培养。l o 天后观察幼苗生长状况，用相机拍照进行记录。 1 2 2 种子荫发率分析 将1 1 所述的三种拟南芥种子在4 处理2 天以打破休眠状态，分别播种到含0 和1 5 0 m m o l ln a c l 、1 蔗糖的1 2m s 培养基上，每组实验做三个重复，培养条件如1 2 1 ，三 天后开始统计种子萌发率。萌发率统计以肉眼观察种子长出白色幼芽为标准。 1 2 3 根伸长量的测定 将拟南芥种子分别播种于含1 蔗糖的1 2m s 培养基上，培养皿垂直放置以利于根 向下生长，待根长到1 5c m 左右时，转移生长较为一致，状态良好的拟南芥幼苗到含0 、 5 0 、1 0 0 、1 5 0m m o l l n a c l 、1 蔗糖的1 2m s 培养基上进行胁迫处理，并对根的初始长 度进行标记。培养皿继续保持垂直放置，1 0 天后小心将根取出培养皿，用直尺测量根( 主 根) 的长度，处理前后根的长度差即为根伸长量。 1 2 4 叶片鲜重测定 将拟南芥种子分别播种在含0 、1 0 0 、1 5 0m m o l ln a c l 、1 蔗糖的1 2m s 培养基 上，培养条件如1 2 1 。为了进行较为精确的比较，三种材料种子播种在同一个培养皿 中。三周后将幼苗从培养皿中取出，去掉根部分，称量之前用吸水纸吸去叶片上多余的 水分。每种材料每个培养皿分别称量2 0 株幼苗叶片重量，计算平均每株幼苗叶片的重 量。以三个培养皿中平均每株幼苗叶片的重量计算平均值和标准差。 第四章e a r l l l 伍生物胁迫下的抗性功能 1 2 5 脯氨酸含量测定 脯氨酸含量的测定方法参照张志良的植物生理实验指导【7 8 1 。由于拟南芥植株 较小、材料较轻，实验中所用材料和试剂均缩小l o 倍。 在8 个离心管中分别滴加0 、2 0 、4 0 、8 0 、1 2 0 、1 6 0 和2 0 0 肚1 0 0 # g m l 脯氨酸标 准溶液，向各管补加蒸馏水至2 0 0 肛l ，然后加入2 0 0 肛l3 磺基水杨酸、2 0 0u l 冰乙酸 和3 0 0p l2 5 茚三酮，于沸水浴中显色lh 。冷却后加入4 0 0p l 甲苯，涡旋振荡，静 置分层，吸取红色甲苯相，测定o d 5 2 0 。以o d 值为横坐标，脯氨酸浓度( t g m l ) 为 纵坐标，绘制标准曲线。 分别取不同拟南芥材料叶片5 0m g ，用5 0 0 肛l3 磺基水杨酸研磨提取。将匀浆液移 至离心管中，放入沸水浴中提取1 0r a i n ，冷却后于3 0 0 0r p m 离心1 0m i n ；吸取上清液 2 0 0p l ，然后加入2 0 0 肛l3 磺基水杨酸、2 0 0 肛l 冰乙酸和3 0 0 肚2 5 茚三酮，与制 作标准曲线一样进行显色、萃取和比色，最后根据标准曲线计算脯氨酸的含量。 1 2 6 钠元素测定 三种拟南芥材料在1 2m s 培养基上长三周后，分别用去离子水和1 0 0m m o l ln a c i 溶液淹没处理2h ，然后用冷的去离子水冲洗三遍以上。剪取叶片，在6 5 烘两天，研 磨成细粉，准确称量后用2m l 硝酸和高氯酸( h n 0 3 ：h c l 0 4 = 4 ：1 ) 浸泡材料过夜， 加热煮沸3 0m i n 以上，至材料溶解至澄清状态后定容至2 5m l 容量瓶中。用原子吸收 光谱仪( s o l a a rm 6 ，型号：i r i sa d v a n t a g ei c p ，美国热电公司生产) 测定钠离 子和钾离子的含量。 1 2 - 7 基因表达 1 ) e a r l h 基因表达的半定量r t p c r 分析 c o l 一0 野生型拟南芥在含l 蔗糖的1 2m s 培养基上生长一周后，转移到含0 、5 0 、 1 0 0m m o l ln a c l 、1 蔗糖的1 2m s 培养基上继续生长一周，叶片用于r n a 提取。c d n a 合成、r t p c r 实验方法及所用引物参照第二章1 4 。 2 ) e a r l h 基因表达的n o r t h e r n 杂交分析 c 0 1 0 野生型拟南芥在含1 蔗糖的1 2m s 培养基上生长两周后，分别用1 0m l 无 菌水及1 0 0m m o l ln a c i 淹没材料，1 2h 后用冷水冲洗三遍以上，用滤纸吸掉多余水分， 西北大学硕士学位论文 叶片用于r n a 提取。杂交所用探针及后续实验方法参照第二章1 5 。 3 ) a t n h x l 基因表达的半定量r t p c r 分析 分别取c 0 1 0 野生型、过表达及突变体拟南芥植株为材料提取r n a ，用于r t p c r 分析，实验方法参照第二章1 4 。根据n c b ig e n b a n k 数据库中下载的a t n h x i 序列， 采用p r i m e r p r e m i e r5 0 软件设计引物序列并委托上海生物工程公司合成。所用引物为： 上游：5 ，- a a c t t t g t c a t t t c t t g c g g a g 3 ， 下游：5 ，- a g g g a t a t g t a t g g a t t t t g g g 3 ， r t - p c r 产物大小4 6 8b p 。 1 3e a r l l l 对耐旱性的影响 1 3 1 根伸长量和叶片相对含水量的测定 将拟南芥种子分别播种在含1 蔗糖的1 2m s 培养基上，培养皿垂直放置以利于根 向下生长，待根长到1 5c m 左右时，转移生长较为一致、状态良好的拟南芥幼苗到含0 、 2 0 0 、3 0 0m m o l l 甘露醇、1 蔗糖的1 2m s 培养基上，培养皿继续保持垂直放置。十天 后用直尺测量根长，计算根伸长量，并称量叶片鲜重和干重。用公式：相对含水量( ) = 【( 鲜重一干重) 鲜重 x 1 0 0 计算相对含水量。 1 4e a r l l l 对植物激素a b a 的反应 1 4 1 种子萌发率分析 将拟南芥种子播种在含0 、1 、2 和5 # m o l la b a 和l 蔗糖的1 2m s 培养基上， 每组实验做三个重复，培养条件如1 2 1 ，六天后开始统计种子萌发率。 2 结果 2 1 三种实验材料在盐胁迫下的表型和生理研究 2 1 1 表型分析 c 0 1 0 野生型、过表达及t - d n a 敲除突变体种子在1 2m s 培养基上生长状态良好， 长势比较一致。在含1 5 0m m o v ln a c l 的培养基上生长十天后大部分种子都能萌发，但 过表达植株幼苗子叶显得较绿，而突变体有部分幼苗子叶开始变白( 图1 ) 。 * 日窜e 4 p l i 在生物胁迫下的抗性功能 呵 j ? 案 圈1 在1 2 m s + 1 5 0 m m o l l n a c i 培养基上的生长十天后，敲除突变体叶片开始变白 f i g 1s e e d l i n g s m n g r o w no r i 2 m s + 1 5 0 m m o l l n a c i f o r t e ad a y s a n d t h ep a l e g r e e nc o l o r o f t h e k o i sa p p a r e n t ac d mbf _ r l i i 过表达株系；ce a r l i it - d n a 敲除突变体 该宴验经= 次重复得到相似结果 2 12 种子萌发率统计 种子萌发率统计结果显示在i 2 m s 培养基上( 叩没有任何胁迫时) ，三种拟南芥 种子萌发率比较一致，最终都能达到9 0 以上。在培养基中添加1 5 0 m m o l l n a c i ，过 表达株系种子在播种后第三和第四天萌发率分别为3 0 和5 6 高于野生型2 2 和5 3 t 但随后几天萌发率增加缓慢，萌发率还不如野生型种子。突变体种子在n a c i 培养基上 的萌发率始终不如野生型( 图2 ) 。 两北大学硕十学位论文 ：1 2 0 一i 耋8 0 g ；4 0 矗 ：2 0 k 占0 a 34567 d i d 十c 0 1 0 - - - o - - e r 10 i + e r l l l 如 图2 萌发率统计 f i g 2g e r m i n a t i o nr a t e 345671 0 d a y s b a ：种子在1 2m s 培养基上的萌发率变化；b ：种子在1 1 2m s + 1 5 0m m o l l n a c l 培养基上的萌发率 变化。图中数据是两次重复实验的平均值，b a r ：平均值的标准偏差 2 1 3 植株叶片鲜重测定 已知尉皿门基因在幼苗的叶片和根尖中表达【3 1 1 。为了研究过量表达或不表达 e a r l h 基因是否会影响幼苗叶片在盐胁迫下的生长，测定了在1 0 0 、1 5 0m m o l ln a c l 胁迫下植株叶片的鲜重。结果显示在不同浓度的盐胁迫下e a r l h 突变体相对于野生型 材料，叶片的平均鲜重显著减少，但是过表达植株叶片鲜重与野生型相比没有显著差异 ( 图3 ) 。 n a c ：l ( m m o v l ) 图3c o l - 0 、e a r l l lo x 和e a r l l lk o 在盐胁迫下叶片的鲜重 f i g 3f r e s hw e i g h to fc o l - o ，e a r l i io x a n de a r l l lk ol e a v e si ns a l t 图中数据是3 次重复实验的平均值，b a r ：平均值的标准误差；显著性分析采用成组数据t 检验， 表示与对照相比有显著差异( p 0 0 5 ) 2 7 协的幻o )善盏g；晨。 珥 披 埔 8 6 2 o 口