（遗传学专业论文）raga基因内含子的人工剪接及其在酿酒酵母中的表达研究.pdf

、j f i i i f i i f r lii l l lllf llilli i i l l f f l l l f y 17 9 8116 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提 供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国 家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 一i 动。 学位论文作者签名：夔铆唆 2 0 0 8 年5 月3 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在3 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 耄唧 学位论文作者签名： 复御炙 解密时间： 7 0 |年岁月多 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： “w 一_一_1_”_ n ，内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) ：秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) ，机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) l 一 一 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其它个 人和集体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：爱神兵 勿醒年岁月弓日 摘要 摘要 当今世界能源短缺和环境污染已成为限制社会的发展进步的重要问题，与 其它化石燃料相比，乙醇具有可再生、提供清洁的燃烧和不产生温室气体等优 点，乙醇作为替代能源已逐步被人们所认识，成为解决上述问题的有效途径之 一。目前以淀粉为原料高效率发酵生产乙醇，主要通过遗传工程构建能够直接 发酵生淀粉产生乙醇的工程微生物，提高乙醇的产量。葡萄糖淀粉酶是转化淀 粉为葡萄糖、果糖糖浆的重要工业用酶。本研究的目的在于克隆少根根霉葡萄 糖淀粉酶基因，并建立酶活检测体系，为采用s h u f f l i n g 分子进化技术筛选高 活性基因葡萄糖淀粉酶，以及构建一步发酵生淀粉生产乙醇的酿酒酵母工程菌 株奠定基础。 根据已发表的米根霉葡萄糖淀粉酶序列，设计引物从少根根霉葡萄糖淀粉 酶基因组中扩增得到根霉葡萄糖淀粉酶基因( 含内含子) 。设计一系列引物，通 过p c r 方法在体外将该基因中四个内含子剪接除，获得少根根霉葡萄糖淀粉酶 基因编码序列，克隆到p m d - t 载体中获得中间载体p u g r a g a ，转入大肠杆菌进 行扩增并测序。从p u c r a g a 载体上用毖刎i 限制酶切下1 7 k bd n a 片段，将 其以正确的读码框克隆到酿酒酵母整合型表达载体p n k q k a n 的q 因子下游， 获得重组质粒p n k - q - k a n ，经h p ai 酶切、线性化后用电转化法转化尿嘧啶缺 陷型酿酒酵母b j 2 4 0 7 菌株，经营缺陷养筛选得到通过同源重组将外源基因插入 到其基因组t p i ( 磷酸丙糖异构酶) 启动子的下游的缺陷恢复型转化子 n k r a g a 0 1 ，培养7 2 小时后，在液体培养基上清液中检测到葡萄糖淀粉酶活性， 表明少根霉葡萄糖淀粉酶基因已能在酵母中表达并有效分泌到胞外。用 n k r a g a 0 1 一步法摇瓶发酵生淀粉初步证明，在试验条件下酒精产率可达5 左 右。 关键词：葡萄糖淀粉酶少根根霉酿酒酵母内含子人工剪接，一步法 a b s t r a c t a b s t r a c t e t h a n o lh a sb e e np r o m o t e da sas o l u t i o nf o rav a r i e t yo fc o m p l e xp r o b l e m s r e l a t e dt oe n e r g ya n dt h ee n v i r o n m e n t c o m p a r e dt of o s s i lf u e l s ，e t h a n o lh a st h e a d v a n t a g e s o fb e i n gr e n e w a b l e ，p r o v i d i n gc l e a n e rb u r n i n ga n dp r o d u c i n gn o g r e e n - h o u s eg a s e s m e t h o d sf o rt h ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o no fe t h a n o lf r o ms t a r c h i n c l u d eu s i n gag e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s mt h a tc a nd i r e c t l yf e r m e n ts t a r c h i n t oe t h a n o la n dh e n c el e a dt oa ni n c r e a s ei n t h e p r o d u c t i v i t yo fe t h a n 0 1 g l u c o a m y l a s ei sa l li n d u s t r i a l l ye x t r e m e l yi m p o r t a n te n z y m e ，u s e di nt h ee n z y m a t i c c o n v e r s i o no fs t a r c hi n t oh i g hg l u c o s ea n df r u c t o s es y r u p s t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d y i st oc o n s t r u c tar h i o p u sg l u c o a m y l a s eg e n e ( r a g a ) s p l i c e dt h ei n t r o n sa r t i f i c i a l l yb y p c rs u i t a b l ef o re x p r e s s i o ni n c e r e v i s i a eh o s t i nt h i ss t u d y , t w op r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e ds e q u e n c eo f r h i z o p u so r y z a eg l u c o a m y l a s ee d n a t h eg l u c o a m y l a s ed n a ( 、i t hf o u ri n t r o n s ) o f r a r r h i z u sw a sa m p l i f i e db yt h em e t h o do fp c rf r o mt h eg e n o m i cd n ao fr a r r h i z u s t h e n ，s e v e r a lp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt os p l i c i n gt h ei n t r o n sb yp c r n v i t r o s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w nt h a ta l li n t r o n si nt h er a g aw e r ed e l e t e dc o r r e c t l ya n d n om u t a n tw a si n d u c e di n t h ee x t r o n sc o m p a r e dw i t ht h er a g ag e n eo r i g i n a l l y c l o n e d t h er a g a g e n ea r t i f i c i a l l yc o n s t r u c t e dw a st r a n s f e r r e di n t os a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i n t e g r a t i v ee x p r e s s i o n v e c t o r s p n k - a k a n ( c o n t a i n i n g0 t - f a c t o r ) c o n s e q u e n t l yt h ep l a s m i d sp n k a k a n r a g aw a sl i n e a r e db yb a m hia n di n s e r t e d i n t os a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eb j 2 4 0 7 ( u r a 3 ) g e n o m ed o w n s t r e a mo ft h et p i p r o m o t e rb yt h em e t h o do fe l e c t r o p o r a t i o n ，a n dar e c o m b i n a n t 谢t l lr a g ag e n e i n t e g r a t e d i n g e n o m ew a so b t a i n e dt h r o u g ht h eu r a 3 s c r e e n i n ga n dn a m e d n k - r a g a 01 t h e nt h en k - r a g a 01w a sc u l t i v a t e df o r7 2 hl e dt os y n t h e s i so f s e c r e t e dg l u c o a m y l a s e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eg l u c o a m y l a s eg e n eh a sb e e n e x p r e s s e di na n ds e c r e t e df r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et ot h em e d i u m t h ef l a s k f e r m e n te x p e r i m e n tu s i n gn k r a g a 0 1a n dr a ws t a r c hd e m o n s t r a t e dt h ee t h a n o l p r o d u c i n gr a t ew a sa b o u t5 k e yw o r d s ：g l u c o a m y l a s er h i z o p u sa r r h i z u ss a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a r t i f i c i a l yi n t r o n ss p l i c i n go n es t e pm e t h o d i i 目录 目录 第一章引言1 第一节根霉葡萄糖淀粉酶的分子生物学2 第二节葡萄糖淀粉酶的高级结构3 i 2 1 催化结构域4 i 2 2 淀粉结合结构域5 1 2 3 连接区域7 i 2 4 总体结构7 i 2 5 根霉葡萄糖淀粉酶的高级结构8 第三节葡萄糖淀粉酶的酶学特性1 0 1 3 1 葡萄糖淀粉酶的热稳定性和p h 值l o 1 3 2 黑曲霉葡萄糖淀粉酶与底物的亲和力1 0 i 3 3 催化机理1 1 i 3 4 底物结合机理1 2 第四节葡萄糖淀粉酶在酵母宿主中的克隆表达研究1 3 第五节酿酒酵母表达系统1 4 第六节本研究的目的和意义1 6 第二章材料与方法= 1 7 第一节实验材料1 7 2 i i 菌种1 7 2 1 2 质粒1 7 2 i 3 试剂来源1 7 2 1 4 主要仪器1 7 第二节主要试剂及培养基配制1 8 第三节实验方法2 0 2 3 1 内含子的删除策略? 2 0 2 3 2 少根根霉基因组四个内含子的删除2 l 2 3 3 c o l i 感受态细胞制备及重组质粒转化2 5 i i i 。一i 一。 t + _ ，二一i ，一。” 一 。；，。 一 一 ，一、v _ ， 。了 - 二1 一j 一 一r 一z ，j ：一：一 一 ， 、 ，。 f 一 +。t，j，一“-l一 “v一、“ 目录 2 3 4 大肠杆菌电击转化用感受态细胞的制备以及重组质粒的转化2 5 2 3 5 质粒的碱裂解小量提取方法：2 6 2 3 6 酵母感受态细胞制备及质粒转化( 电击转化法) 2 6 2 3 7d n a 片段回收方法( 试剂盒回收) 2 7 2 3 8 酵母d n a 微量制备2 7 2 3 9 葡萄糖淀粉酶的表达2 8 2 3 1 0 不连续s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳2 8 2 3 1 1 葡萄糖标准曲线的绘制2 9 2 3 1 2d n s 法检测发酵上清中酶活力2 9 2 3 1 3 发酵液中乙醇浓度的测定：3 0 2 3 1 4 测定发酵液上清中乙醇浓度3 0 2 3 1 4 转化子稳定性测定3 1 第三章结果与分析3 1 3 1 外显子各片段的获得3 1 3 2 外显子的两两拼接3 2 3 3p u c - r a g a 载体的构建3 3 3 4 少根根霉葡萄糖淀粉酶基因的序列分析3 3 3 5 酿酒酵母表达载体p n k k a n r a g a 的构建3 5 3 6 酿酒酵母的遗传转化与重组子的筛选3 8 3 7 重组酿酒酵母在y p 眦4 1 8 平板上的生长情况3 9 3 8 培养基上清中葡萄糖淀粉酶活力淀粉圈检测4 0 3 9 培养基上清2 1 s d s p a g e 电泳分析4 2 3 1 0 葡萄糖浓度标准曲线的绘制4 2 3 1 1 培养基上清中酶活力测定j 4 3 3 1 2 甲基橙一乙醇标准曲线的测定4 5 3 1 3 培养基上清中乙醇浓度的测定4 6 3 1 4 载体p n k s r u 稳定性的检测4 6 第四章讨论4 8 第五章结论5 1 参考文献5 2 致谢5 9 i v 目录 个人简历6 0 v 第一章引言 第一章引言 目前能源短缺和环境污染极大限制了社会的发展进步，乙醇作为替代能源 已逐步被人们所认识，成为解决上述问题的有效途径之一。与其它石化燃料相 比，乙醇具有可再生、燃烧清洁和不产生温室气体等优点。寻找可替代能源已 经成为现代科学研究热点之一，受到各国政府的大力支持。随着工业污染的日 甚严重，减少温室效应气体及氮氧化物的排放是缓解污染的有效途径。近年来 石油价格屡创新高，也加重了人们对于传统能源的前景忧虑。针对一系列复杂 的能源和环境问题，乙醇正日益成为一种颇有前途的解决方法。我国于“十 一五”计划纲要中也明确提出，要开发燃料酒精等石油替代品，采取措施节 约石油资源，并提出优先发展燃料乙醇等先进适用技术，以缓解石油资源短缺， 改善大气环境，稳定粮食生产，促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展。 在世界石油资源紧缺、原油价格不断攀升、环境压力日益加重的情况下，推广 使用车用乙醇汽油具有重大的现实意义和深远的战略意义，是用科学发展观解 决当前影响我国社会经济全面协调持续发展的诸多制约因素的积极探索。 目前乙醇发酵工业上较先进的生产方法为酶法糖化酵母发酵，该方法特点 是淀粉糖化率高，且能减少1 4 的发酵时间，其流程如图1 1 n 1 所示。日本现 广泛使用这种方法生产乙醇。由于该法的局限在于对设备的要求较高。同时由 于国内尚无高品质糖化酶商品，虽然该生产工艺高效高产，但不适合我国国情， 国内企业目前尚很少使用。 圈一圈田回回，圆+ 回 网陌同网 i 一t 。一i - 图1 1 酶法糖化发酵乙醇生产流程图 工业生产乙醇使用的发酵原料一般为各种谷物淀粉，价格低廉。通过糖化 酶降解成为葡萄糖再利用酵母发酵生产酒精。 第一章引言 淀粉是由线性及带分枝的多聚葡萄糖组成的天然高分子化合物，由a d 一 葡萄糖以n - i ，4 以及q - i ，6 一糖苷键结合聚合形成的高分子物质，是重要的 可再生生物资源。谷物淀粉一般含7 0 - - 9 0 的支链淀粉和1 0 3 0 的直链淀 粉。由于生淀粉颗粒外围网络结构极为致密，水分子很难进入淀粉分子中，因 而几乎无法被淀粉酶直接降解。工业上使用的q 一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶都不具 备降解生淀粉的能力，因此需要加热蒸煮破坏淀粉分子之间的氢键，切断淀粉 链并破坏淀粉的螺旋型空间结构，使淀粉酶能充分与淀粉分子接触而水解淀粉。 a 一淀粉酶可以随机的方式切断直链淀粉中q - i ，4 键( 内切) ，增加体系中非还 原性末端的浓度，进一步提高糖化酶的作用效率。 高温蒸煮以及随后的降温过程需要消耗大量的能源，对设备的要求也很高， 增加了企业的生产成本，在能源物资价格高企的情况下降低了企业竞争力。酶 制剂的使用也增加了发酵成本，而且目前只能向国外公司购买。高额的成本要 求限制了国内企业使用酶法发酵这一先进工艺。因此国内还停留在菌落糖化发 酵的生产方式上。 葡萄糖淀粉酶在发酵工业中称为糖化酶。被大量用作淀粉糖化剂，是水解 淀粉产生葡萄糖的主要酶类，工业应用十分广泛，具有很高的商业价值。葡萄 糖淀粉酶可分为根霉型和黑曲霉型两类。其活性由q 一淀粉酶、糖化酶、葡萄糖 苷转移酶三部分组成。黑曲霉型葡萄糖淀粉酶的a 一淀粉酶活性低，糖化力强， 对支链淀粉的降解能力比较弱，而且其葡萄糖苷转移酶活性很强，导致淀粉降 解产物中有很多是非发酵的低聚糖，因此其对淀粉的利用率不高，工业应用价 值不高。黑曲霉型葡萄糖淀粉酶在内含子剪接过程中产生两种产物，即可被淀 粉吸附的糖化酶i 和不被吸附的糖化酶i i 。前者具有生淀粉降解的能力。根霉 型葡萄糖淀粉酶的a 一淀粉酶活性弱，糖化酶强，葡萄糖苷转移酶活性也弱，降 解淀粉的能力可以达到1 0 0 ，生成葡萄糖的转化率9 7 - 9 9 网。目前国内酒精生 产基本上还是采取微生物糖化然后酵母发酵方式。此工艺生产成本比较低，乙 醇产率比较高q 们。但其主要缺陷在于大量的淀粉底物要被生产菌株生长消耗， 降低了淀粉的转化率，总体生产效率不高。 第一节根霉葡萄糖淀粉酶的分子生物学 野生型米根根霉葡萄糖淀粉酶蛋白由三种组分组成，分别是分子量7 4 k d a 2 第一章引言 的g l u l ，分子量5 8 k d a 的g l u 2 和分子量6 1 k d a 的g l u 3 。g l u 2 和g l u 3 是g l u l 在 蛋白水解酶的作用下，切除蛋白n 末端若干氨基酸残基形成的1 。三种葡萄糖 淀粉酶具有相似的热稳定性、相同的最适p h 和p h 稳定性，对可溶性淀粉有相 似的糖化能力( 4 9 7 u n i t s ，6 3 1 u n i t s ，5 8 6 u n i t s ) ，降解淀粉都产生唯一的产 物葡萄糖。但对于不可溶淀粉，g l u 2 和g l u 3 几乎没有活性n 羽。其它根霉，如得 氏根霉n 引、雪白根霉n 钔也被证实存在多种形式。诸葛斌n 朝等对r h i z o p u so r - i u v n 菌种生熟淀粉发酵对比进行研究，推测生淀粉糖化酶的分泌与生淀粉的诱导有 关，并且认为该米根霉葡萄糖淀粉酶m r n a 的剪接方式，可能受到淀粉的诱导， 产生生淀粉糖化能力的g l ，或者熟淀粉糖化能力的g 2 ，高葡萄糖的存在会抑止 葡萄糖淀粉酶基因的转录( 图1 2 ) 。 图1 2 根霉葡萄糖淀粉酶两种形式m r n a 合成途径 f i g1 2s y n t h e s i sa p p r o a c h e so ft w ok i n do fr h i z o p u sg l u c o a m y l a s e t o s h ii h i k oa s h i k a r i n 6 3 等构建了米根霉的d n a 文库和c d n a 文库，通过对 具有生淀粉降解能力的米根霉g l u l 蛋白n 末端进行测序，根据测序结果设计简 并引物扩增出葡萄糖淀粉酶基因。通过a d n a 与其基因组d n a 测序结果的比较， 发现米根霉葡萄糖淀粉酶基因是一段2 0 4 9b p 的d n a 片段，含有四个内含子 ( i n t r o na 、b 、c 、d ) 。内含子a 包含6 0 个碱基，b 包含6 6 个碱基，c 包含4 8 个碱基，d 包含6 1 个碱基。野生型米根霉葡萄糖淀粉酶含还2 5 个碱基长的信号 肽。 第二节葡萄糖淀粉酶的高级结构 葡萄糖淀粉酶属于糖苷水解酶1 5 ( g h l 5 ) 蛋白质家族，至今已有近4 0 个来源 于丝状真菌、酵母菌、真细菌和古细菌的开放阅读框被划分到此家族n 7 1 引。典型 的真菌葡萄糖淀粉酶在结构上可分为催化结构域和淀粉结合结构域以及二者之 第一章引言 间的连接域9 1 。黑曲霉葡萄糖淀粉酶a g a 的结构已经研究的较为透彻。其中间连 接部分较长，两个结构域之间的相互作用较弱嘲、2 。大多数真核葡萄糖淀粉酶是 由催化结构域经0 - 糖基化的连接区域( 1 i n k e rr e g i o n ) 同淀粉结合结构域相连接组 成的多结构域酶。泡盛曲霉x 1 0 0 变种的葡萄糖淀粉酶和a g a ，已经分别从它们的 自由状态和同抑制剂结合状态中析解出详尽的三维结构。能被淀粉吸附的糖化 酶a g a i 由三部分组成乜利：n 末端催化( a a 卜4 4 0 ) ；近c 末端高糖基化连接( a a 4 4 1 - 5 0 8 ) 和反平行1 3 一折叠组成的淀粉亲和域( a a5 0 9 6 1 6 ) 。n 末端催化域通过 ( q q ) 6 一螺旋折叠形成一个漏斗状活性中心，经高度糖基化的o - 糖基化连接域 与c 末端通过反平行1 3 一折叠形成的两个淀粉亲和域相连接，在空间上形成相对 紧密、稳定的活性功能域；n 末端催化域是由三个非常稳定的疏水折叠元件组成， c 末端淀粉亲和域通过自身区段高度糖基化而形成稳定结构。n 末端催化域和淀 粉亲和域在氨基酸4 1 7 6 1 6 处分别含有三个和一个二硫健。分子量大约是 2 5 1 k d a ，包含3 8 的中性糖；4 6 8 5 0 8 氨基酸的o - 糖基化对维持酶的热稳定性、 吸附在颗粒状淀粉上和酶的分泌都非常重要心引；淀粉亲和域有两种功能：一是 与淀粉亲和，二是破坏淀粉表面，因而提高淀粉水解率妇3 2 屯2 5 1 。培养基的p h 值 影响酶的产量和酶的糖基化。糖基化有利于翻译早期葡萄糖淀粉酶多肽链在折 叠时形成稳定的活性构象哺1 。 1 2 1 催化结构域 黑曲霉葡萄糖淀粉酶的催化结构域由一个扭曲的( q q ) 6 一圆筒与一个中 心漏斗状的活性位点折叠而成，淀粉结合结构域由一个反平行的b 一滚筒折叠而 成，并带有两个能同淀粉或1 3 一环糊精结合的位点。 泡盛曲霉x 1 0 0 变种的葡萄糖淀粉酶的催化结构域包括1 3 个q 一螺旋，其中 1 2 个组成( q q ) 6 一圆筒。在此折叠过程中，6 个外部与6 个内部的q 一螺旋围 绕着漏斗状的活性位点，6 个外部q 一螺旋的c 末端与6 个内部的c l 一螺旋的n 末端相连接，所有的q 一螺旋都是高度保守的口7 。3 1 j 。催化位点包括位于其袋穴底 部行使司广义酸碱催化的g l u l 7 9 和g l u 4 0 0 残基口2 瑚3 ，如图1 3 所示。 4 第一章引言 n t e r m i n u s 冬l 图1 3 泡盛曲霉变种x 1 0 0 葡萄糖淀粉酶的催化结构域( a f t1 - 4 7 1 ) 与假四糖抑制剂复合 物的结构投影图，图中给出催化残基e 1 7 9 和e 4 0 0 的位置。 f i g1 3t h ep i c t u r eo fp r o j e c t i o ho fx l0 0g l u c o a m y l a s e i n h a b i t o rc o m p l e x 与泡盛曲霉x 1 0 0 变种相比，a g a 和s a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r a 葡萄糖淀粉 酶有着极其相似折叠方式的催化结构域，所不同的是s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r o 葡萄糖淀粉酶的催化结构域共有1 4 个q 一螺旋组成，在从n 末端开始的第一对 与最后一对反平行的成对q 螺旋的中段分别添加了一段较短的q 一螺旋m 1 。在 各种葡萄糖淀粉酶中，有较明显结构差异的是s a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r a 的葡 萄糖淀粉酶，它缺少淀粉结合结构域啪1 。 1 2 2 淀粉结合结构域 目前已经分别利用蛋白酶水解和基因重组的方法制备了a g a 的淀粉结合结 构域，且已利用核磁共振解析了其溶液中自由状态及同1 3 一环糊精结合状态的三 维结构啪删。淀粉结合结构域由8 个b 一链或也可视为2 个1 3 一片层形成扭曲的 b 一滚筒结构，如果将淀粉结合结构域与连接域的连接处定义为淀粉结合结构域 s 第一章引言 的“顶端 ，则在其远离顶端之处存在着两个与淀粉及模拟底物1 3 一环糊精结合 位点( s b s ) ，如图1 4 所示。二者与底物或b 一环糊精的非共价相互作用和三维 结构都迥然相异。定向突变的研究揭示出它们在与底物的亲合力上相差不是很 大，k a 值分别为：3 6 1 0 4 和1 6 1 0 5 l m o l 。等热滴定量热器对两个结合位点 与1 3 一环糊精结合过程中的热力学分析表明，二者与底物结合过程的焓变与熵变 很相似啪。 s b 图1 4a g a 的淀粉结合结构域结构投影图。黑粗线表示模拟底物的1 3 一环糊精分子。 f i g1 4t h ep i c t u r eo fs t a r c h - b i n d i n ga r e ao fa g a t h eb o l ds t a n df o rm o l e c u l a ro f 3 - c i r c l e d d e x t r i n ，w h i c hs i m u l a t es u b s t r a t e 6 第章引言 图1 5 黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域结构模拟图。黑色部分指示淀粉颗粒。 f i g1 5t h es i m u l a t ep i c t u r eo ft h es t a r c h b i n d i n ga r e ao f a s p e r g i l l u sn i g e rg l u c o a m y l a s e t h e b l a c ks t a n df o rg r a i no f s t a r c h 黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域的两个结合位点具有独立的功能，它们在 互相垂直的方向上与淀粉结合啪1 。位点l 主要行使识别位点的作用m 1 ，位点2 在 与环糊精结合后结构发生改变，表明它与环糊精的结合不是在最佳的方向上， 所以随后结构发生变动，并将结合的底物传递给催化剂结构域作用h ，如图1 5 。 1 2 3 连接区域 a g a 富含丝氨酸与苏氨酸的0 - 糖基化连接域( a a 4 4 0 5 0 8 ) ，包括一段长约3 0 个氨基酸、在其c 末端与淀粉结合结构域连接的高度o _ 糖基化片段2 1 。连接域 的此特殊部分对于酶的热稳定性、分泌及对生淀粉的降解都有特殊的贡献h 羽。 从氨基酸序列计算得到的8 5 6 2 2 8 d a 分子量和由天然g i 型产物经质谱实验测得 的最低分子量糖基化形式的1 8 9 9 1 3 d a ，可推导出对于每个多肽平均有6 3 个分 子的中性已糖与其共价结合，重组表达的a g a 其糖基化水平变化范围很大，包括 大量随表达宿主的不同而导致糖基化水平不同的产物，其中有酿酒酵母表达的 高甘露糖型a g a ，毕赤酵母表达的中度糖基化的a g a 以及黑曲霉的实验菌株表达 产物等等h 4 4 5 蚰1 。o - 糖基化区域的第一部分( a a 4 4 0 - 4 7 1 ) 大约带有1 0 个裸露的单 甘露糖残基，伴随着a s p l 7 1 和a s p 3 9 6 的n 一糖基化残基形成连接球状催化结构 域的带状结构h 7 1 。上述结构模型中并不包括高度0 一糖基化的后续连接域 ( a a 4 7 2 - 5 0 8 ) ，但是据推测这一部分围绕着催化结构域延续到了第4 7 1 残基之后， 使得淀粉结合结构域及其中一个结合位点靠近催化活性位点。连接域的全长在 构象上被认为是高度柔韧性的，这同双功能抑制剂与葡萄糖淀粉酶按l ：l 化学剂 量结合形成复合物的事实相符合h 8 1 。 1 2 4 总体结构 早期研究认为，葡萄糖淀粉酶降解生淀粉过程中淀粉结合结构域是其发挥 作用所必需的，葡萄糖淀粉酶的天然蛋白酶水解产物g i i 形式( a a1 - 5 1 2 ) 没有 淀粉结合结构域，因此对生淀粉活性较低。最近有研究表明，孤立的淀粉结合 结构域能在淀粉颗粒上与无淀粉结合结构域的g i i 形式协同作用降解不可溶性 底物，表明淀粉结合结构域能以单独实体形式与淀粉结合，这可以破坏淀粉颗 7 第一章引言 粒的紧密结构并协助催化结构域的水解作用h 9 1 。 完整的葡萄糖淀粉酶的三维结构( 包括淀粉结合结构域，催化结构域和0 _ 糖化连接域) 尚未完全析解。扫描隧道显微镜的探测表明，淀粉结合结构域与催 化结构域相距离9 o n m 砧0 1 ，己设计出针对不同靶位的双功能抑制剂，其中有针对 催化结构域的假四糖抑制剂a c a r b o s e 和针对淀粉结合结构域的环糊精以及硫糖 苷键和变化长度的聚乙二醇共价偶合的合成抑制剂，被进一步用于分析与不同 结构域的结合嫡，如图1 5 所示。四种上述双功能抑制剂可自发地同葡萄糖淀 粉酶的催化结构域和淀粉结合结构域的某一个结合位点紧密结合，等热滴定量 热器已对它们进行详细的描述。由此可得出结论，溶液中葡萄糖淀粉酶分子的 两个结构域是十分靠近或可以十分靠近的h 引。 1 2 5 根霉葡萄糖淀粉酶的高级结构 根霉葡萄糖淀粉酶的高级结构与黑曲霉葡萄糖淀粉酶相似，其具体结构目 前尚未研究清楚。已经确认根霉葡萄糖淀粉酶也是由淀粉结合结构域( 1 - 1 0 0 8 a 瞄司) 、催化结构域( 1 0 1 - 5 7 9a a ) 以及连接部分( 尚未确认) 组成。现己证实根霉 葡萄糖淀粉酶的淀粉结合域位于成熟酶蛋白的n 末端，属于糖类结合模式第2 1 家族羽，而黑曲霉类的葡萄糖淀粉酶淀粉结合域位于酶蛋白c 末端，属于糖类 结合模式第2 0 家族。对米根霉、环状芽孢杆菌以及黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结 合域部分氨基酸同源性的分析表明，根霉与典型真菌、细菌的葡萄糖淀粉酶淀 粉结合域同源性很低( 如图1 6 ) ，而且在第2 、3 个b 链之间有大段的插入部分 ( 2 7 - 4 5 位氨基酸) 。不过，这部分可能和根霉葡萄糖淀粉酶与生淀粉的结合有关 5 3 】 0 1 l j j 】i i ：j2 2 2 2 2 2 2 2 b c - 2 5 i - c g t 5 8 2 - l s g d q v s v r f v v n n a t t a l g q n 4 y l t g s v s e l g n w d p a k a - i g p m y n q w y - - q y6 3 3 t t r h i o r - g m y3i p s s a s v q l d s y n y d g s t - f s g k i y v2 74 5d n w n n n g n t t a a s y s a p i s g s n y6 7 。 誊 a r 啪m y5 0 9c t t p t a v a r f d l t - a t t t y g e n i l v g s i s q l g d w e t s d g - i a l s - - a d k y t s s d5 6 0 l l l i l l l l l l l l2 2 2 2 2 2 23 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 34 4 4 4 4 4 4 4 4 4 45 5 5 5 56 6 6 6 67 7 7 7 7 7 7 1 3 0 - 2 51 t g t6 3 4p n w i d v s v p a g k t i i f k f l k k q g s - t v t w e g g s n h t f t a p s s - - - g t a t i n v n w q p6 8 6 r i 妇- g m y 6 8b y w t f s a s i n g i k e f y i k y e v - - - s g k t y y d n n n s a n y q v s t2 0 6 a r 蚶g m y5 6 1p l w y v t v t l p a g e s f e y k f i r i e s d d s v e w e s d p n r e y t v p q a c g t s t a t v t d t w r 一6 26 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 45 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 67 7 7 7 7 7 7 7 7 8 第一章引言 图1 6b a c i l l u sc i r c u l a n sc g t a s e 、a s p e r g i l l u sn i g e rg l u c o a m y l a s e 和米根霉葡萄糖 淀粉酶淀粉结合域氨基酸同源性分析。数字标出黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域中七个b 链。2 7 个黑体的氨基酸残基形成了两个c 末端淀粉结合域中共同的b 链核心。“木”号表示 根霉与其它两种中相同的氨基酸残基。“”号表示根霉与其它两种中保守的氨基酸残基。 f i g1 6t h ea n a l y s jso fs t a r c h b i n d i n ga r e ao fb a c i l l u sc i r c u l a n sc g t a s e 、 a s p e r g i l l u sn i g e rg l u c o a m y l a s ea n dr h z o p u sa r r h i z u sg l u c o a m y l a s e 黑曲霉和根霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域的同源分析表明瞰，两个重要的芳 香族氨基酸( w 4 7 ，y 9 4 ) 在两种s b d 中的i 位点保守，如图1 7a 。根霉中6 3 s 在 黑曲霉中是y ，它在与底物作用中起着疏水环的作用。? i t 在黑曲霉中为y ，尽 管此y 在n m r 中没有表现出明确的作用，其它的葡萄糖淀粉酶s b d 该位置上通 常也是y 。7 3 s 在黑曲霉中为t ，这在n m r 中也没有表现出明确的作用，但在其 它葡萄糖淀粉酶中，该位置主要是t 或者d 。针对这三个位点的定点突变研究发 现，这些位置氨基酸的改变对于米根霉葡萄糖淀粉酶降解玉米淀粉能力有很大 的影响。因此，它们可能在根霉葡萄糖淀粉酶与淀粉的结合中起着重要的作用。 r o g a - s b o a n j g e rg a - s s o a ) 3i p s s a s v o l d s y n y d g s t f s g k i y v2 7 5 0 9c t t p t a v a v t f d l t - a t t t y g e n i y l5 3 3 ； 4 5d n w n n n g n t l a a s y s a p l s g s n y e y v f i f , s a s i n g7 8 5 41g d w e t s d g l a l s a d k y t s s d p l w y 、仃v t l p a5 71 ，+f；v t 7 9i k e f y i k y e v s g k t y y d9 8 5 7 2g e s f e y k f i r i e s d d s v e w e5 9 3 cata，x=腑yticd 刚蝴酗 b n d 基芋悉磊 a n i g e rg a s i t e2 7 ( n o tc o n s e w e d p u t a t i v es i t e li c o n s e r v e d ) w 4 7 y 9 4 舶l i n k e ru b i n d i n gd o 啪j n c 矗捻l j ，t i cd o m i n r o g a 图1 7 ( a ) 米根霉葡萄糖淀粉酶与黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域部分氨基酸残基同源性分 析。：i c 号标出黑曲霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合i 位点中重要的疏水氨基酸。标出标出黑曲霉 黧 _-_l_。_l 第一章引言 葡萄糖淀粉酶淀粉结合i i 位点中重要的疏水氨基酸残基。突变研究的位置用双下划线标出。 ( b ) 图是黑曲霉葡萄糖淀粉酶以及根霉葡萄糖淀粉酶淀粉结合域的结构模型。 f i 9 1 7 ( a ) h a a l y s isb e t w e e ng l u c o a r n y l a s eo fr h i z o p u sa r r h i z ua n da s p e r g ill u sn i g e r ( b ) t h em o d e lo fs t a r c h b i n d i n ga r e ao fa s p e r g i l u sn i g e rg l u c o a m y l a s ea n dr h i z o p u s a r r h i z u sg l u c o a m y l a s e 诸葛斌n 钉等根据对r h i z o p u so r - i u v n 菌种所产生的淀粉糖化酶在不同缓冲 液条件下酶活力的测定，推测出该生淀粉糖化酶最适p h 值，与根据氨基酸残基 计算的p h 比较得出结论：活力中心催化位点氨基酸是天冬氨酸( a s p ) 和谷氨酸 ( g l u ) ，该结论与t a n a k a 嘶1 等人的研究结果相同( 质子受体a s p 3 3 6 ，质子供体 g l u 3 3 9 ，t r p 2 7 9 结合底物) 。到目前为止，根霉葡萄糖淀粉酶高级结构尚未完全 清楚，依然有待研究。 第三节葡萄糖淀粉酶的酶学特性 1 3 1 葡萄糖淀粉酶的热稳定性署l l p h 值 生产中，糖化酶在高温蒸煮后投入，因此对酶的热稳定性有较高要求。在 产酶真菌范围中相比较而言