（外科学专业论文）抑制p糖蛋白表达逆转胰腺癌多药耐药.pdf

洲0 帆 y 17 8 4 6 7 3 抑制p 糖蛋白表达逆转胰腺癌多药耐药。 摘要 目的：研究黄芪( a s t r a g a l u s ，a s t ) 对人胰腺癌细胞株p a n c 1 中的p 糖蛋白的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法：选用人胰腺 癌耐药细胞株p ! a n c 1 ，通过m t t 法和免疫组织化学等方法，评价黄 芪对p 糖蛋白( p - g p ) 介导的耐药机制的逆转作用。采用m t t 法测定 不同浓度的黄芪，5 氟尿嘧啶( 5 n u o r o u r a c i l ，5 f u ) 及黄芪和5 f u 联合用药的情况下对胰腺癌细胞增殖作用的抑制效果，用免疫组织化 学的方法检测使用不同浓度的黄芪，5 氟尿嘧啶的情况下对p 糖蛋白 表达的影响。结果：由m t t 法检测a s t 和5 f u 对p a n c 1 细胞单 独抑制情况结果可见，两种药物与各自对应的对照组相比，均能明显 抑制胰腺癌p a n c 1 细胞的增殖，同一药物不同浓度组间均数的两两 比较结果显示：a s t 随其浓度的增高，对p a n c 1 细胞的抑制变化无 明显差异，而5 f u 随其浓度的增加出现抑制性增强，提示5 f u 对 p a n c 1 细胞的增殖抑制作用在一定范围内具有浓度依赖性。由5 f u 单独作用于p a n c 1 细胞的增殖抑制作用结果可见，5 f u 对p a n c 1 细胞增殖抑制率达1 5 3 0 时的药物浓度为o 5 u 咖1 和5 u g r n l ，为减 少药物浓度过大时可能产生的药物毒性作用，我们选择o 5 u 咖1 作为 与不同浓度的a s t 联合用药时的最终浓度。由a s t 与5 f u 联合用 药对胰腺癌p a n c 1 细胞的抑制作用结果可见，不同浓度a s t 联合 5 f u ( o 5 u 咖1 ) 后，对胰腺癌p a n c l 细胞的增殖抑制率明显升高，接 近或大于两种药物单独用药抑制率之和，与单独5 f u 或相应浓度a s t 组比较，差异有显著性，表明联合用药可显著提高单独用药对胰腺癌 p a n c 1 细胞的增殖抑制作用。联合效应分析结果显示，2 5 m 神、5 m g m l 的a s t 与5 f u 的联合效应为相加效应，1 0 m m l 、2 0n 拶7 f n l 的a s t 与5 f u 的联合效应为协同效应。由各组实验地与m m l 蛋 白表达免疫细胞化学染色结果可见，m d r 1 、心在p a n c 1 细胞中 的阳性表达均呈棕色反应。与心对照组相比，分别加入a s t 和5 f u 作用2 4 h 后，胞质的棕色颗粒都出现明显减少，其中5 f u 组比a s t 组作用下棕色着色颗粒多，a s t 在2 0 m i i l l 的浓度下颜色变化比 5 m g i i l l 更为明显，表明药物作用下，怂蛋白的表达量出现明显降低。 i o d 值的统计分析显示，不同实验组间与对照组相比心蛋白表达差 异具有显著性，脂对照组与5 f u 组之间魅表达无明显差异； 5 m m l a s t 组与2 0 m m l a s t 组之间a h 表达差异有显著性。m d 卜1 蛋白在不同组间的表达情况与地蛋白变化相似，各实验组与对照组 相比差异有统计学意义，m d r 1 对照组与5 f u 组之间m m l 表达无明 显差异；5 m g m l a s t 组与2 0 m 咖1 a s t 组之间m d r 1 表达差异有显 著性。结论：在胰腺癌细胞中，p 一糖蛋白呈高表达，针对p 一糖蛋白， 黄芪能有效地抑制p g p 的表达及功能，从而拮抗p g p 介导的多药耐 药，显著提高化疗药物5 一f u 对胰腺癌p a n c 一1 细胞的增值抑制作用， 为逆转多药耐药展示了良好的前景。 关键词：多药耐药；p 糖蛋白；胰腺癌 i n t e r f b r i n gp y c o p r o t e i nf 0 rr e v e r s i n 2m u l t l d r u g r e s i s t a n c eo fi n t e n e r l n gp y c o p r o t e l n1 0 rr e v e r s i n 2m u i t i d r u g r e s l s t a n c e0 l p a n c r e a t i ca d e n o c a r c i n o m a a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：1 o i 1 1 v e s t i g a t e t h ee 目睹c to fa s to n i n h i b i t i n gp g pe x p r e s s i o no f h u m a n p a n c r e a sc a r c i n o m a 一1 ( p a n c - 1 ) a i l d r e v e r s i n gd 1 1 l g r e s i s t a l l c ea t t 曲u t eo fp - g p m e t h o d s ：t h em t ta i l a l ) ，z e d m ec e un l u l t i p l i c a t i o no fp a n c - lu n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fa s t ， 5 - n u o r o u r a c i la n da s t p l u s5 一f l u o r o u r a c i la n di m m u n o h i s t o c h 锄i s t 巧 e v a l u a t e dt h ep - g pe x p r e s s i o no fp i a n c 一1u n d e rd i 虢r e n tc o n c e n t r a t i o n o fa s t ，5 一f l u o r o u r a c i la n da s t p l u s5 - f l u o r o u r a c i l r e s u l t s ：b yt h em t t a s s a ya s ta n d5 一f uo np a n c - 1c e l l si n l l i b i t i o na l o n er e s u l t sc a nb es e e n t h a tt l l et 、釉 d m g sa n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gc o n t r o lg r o u p s ， c o u l d s i g n i f i c a n t l yi n l l i b i tp a n c r e a t i cc a n c e rp i a n c - 1c e l l s ，t h es a n 舱d r u g si 1 1 d i f r e r e n tm e a nc o n c e n t r a t i o no f g r o u pc o m p a d s o no ft h e s et w or e s u l t s ： a s ti n c r e a s e dw i t hi t sc o n c e n t r a t i o no nt h ei i m i b i t i o no fp n c 1c e l l s d i dn o td i 行旨 s i g n i f i c 羽1 t l y w h i l et h e5 一f uw i t hi t s i n h i b i t o 巧 c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dt h e r e ，w h i c hs u g g e s t st h a t5 一f uo np i a n c 一1c e n p r 0 1 i f i e r a t i o ni nad o s e d 印e n d e n tw i m i nac e r t a i l l 啪g e 5 - f ua l o n eb y t h ei np i a n c - 1c e l l p r o l i f e r a t i o nr e s u l t ss e e n ，5 一f uo np f 气n c - 1 c e l l p r o l i f i e r a t i o nr a t eo fl5 3 0 o fm ed r u gc o n c e r l t r a t i o no fo 5 u i i da i l d 5 u g m l ，a sr e d u c et 1 1 ee x c e s s i v ec o n c e n t r a t i o no fd m g sm a yp r o d u c e t o x i c e f | | e c t s ，w ec h o s eo 5 u g m 1w i t hd i f f e r e n tc o n c e m r a t i o n so fa s ta sa 3 c o m b i n 撕o nw h e i lt h ef i n a l c o n c e n t r a t i o n b yt h ea s ta i l d 5 f u c o m b i n a t i o nt h e r a p yi np a n c r e a t i cc a n c e rp i a n c 1c e l l1 i n er e s u l t sc a nb e s e e n ，d i 伍邑r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa s tc o m b i n e d5 f u ( o 5 u r n l ) ，t h e i a n c - lo f p a n c r e a t i cc a n c e rc e up r o l i f e r a t i o ni l 吐l i b i t i o nr a t ew a sh i g h ， c l o s et o0 rg r e a t e rt 1 1 a ne i t h e rd r u ga l o n ea 1 1 d d m gi i l l l i b i t i o nr a t e ，a l l d i n d i v i d u a lc o n c e n t r a t i o n so f5 - f uo rt h ec o r r e s p o n d i n ga s t g r o u p ，t h e d i 您e r e n c e w 弱s i g m f i c a n t ，i n d i c a t i n gt h a tc o m b i n a t i o nt 1 1 e r a p yc 锄 s i g l l i 丘c 锄t l yi n c r e a s et h es i n g l ed m gi np a i l c r e a t i cc a n c e rp a n c 1c e l l s i r d l i b i t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e j o i n te 虢c t ，2 5 ，5m g m lo f a s ta i l d 5 - f uc o m b i n e de 疏c to ft h ea d d m e e 疏c t ，1 0 ，2 0m g i i l lo fa s ta 1 1 d 5 - f uc o m b i n e de 虢c ti s s y n e r g i s t i c e x p e m l e n t sb ya l ( ta n dm d 卜l 2 0 m g m 认s tg r o u po fd i 虢他n t i a l l ye x p r e s s e db e 咐e e na 虹s i g n i 丘c a n t l y m d r - 1p r o t e i ne x p r e s s i o nb e t w e e nd i f i e r e n tg r o u p sw i t l ls i m i l a rc h a j l g e s i na l ( tp r o t e i i l ，t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pa 1 1 dc o n t r o lg r o u pd i 伍暑r e n c ew a s s i g l l i 6 c a n t ，m n 1c o n t r o lg r o u p 锄d5 一f ug r o u pb e 觚e e nt h em m 1 e x p r e s s i o n w 弱n o t s i 9 1 1 i f i c a l l t l y d i f r e r e n t ；5 m m l a s tg r o u p 2 0 m g m l a s tg r o u pd i 髓r e n c e sb e 觚e e nt h em d r - 1e x p r e s s i o n s i 印i f i c a l l y c o n c l u s i o n s ：t h ep - g ph i 曲l ye x p r e s s e di 1 1h u m a np a l l c r e 弱 c a r c i n o m ac e l l t 1 1 ea s tc o u l de 虢c t i v e l yi n h i b i tt h ee x p r e s s i o na 1 1 d 如n c t i o l l i n go fp g pa n da g a i n s tt l l e 咖1 t i p l ed m gr e s i s t a l l c em e d i a t e db y p - g p t l l i sc o u l db eag o o d 如t l l r ef o rr e v e r s i l l gt h ei n u l t i p l ed m g r e s i s t a n c e k e yw o r d s ：枷1 t i d m g - r e s i s t a n c e p l y c o p r o t e i p a n c r e a t i c a d e n o c a r c i n o i n a 5 - 上- j 一 刖声 肿瘤在全球范围内是仅次于心血管疾病的第二大“杀手 ，胰腺 癌( p a n c r e a t i ca d e n o c a r c i n o m a ，p i a c ) 是一种恶性程度极高、治疗效果 及预后极差的肿瘤，发病率逐年上升，在西方国家已成为恶性肿瘤导 致死亡的第4 大原因( 1 、。除手术外，化疗也是重要的辅助治疗手段， 尤其对于不能切除的肿瘤，在缓解症状、延长生存时间和提高生存质 量等方面发挥重要作用。但是，多药耐药现象的存在是影响化疗临床 疗效的重要因素。多药耐药( m u l t i d m g r e s i s 切l n c e ，m d r ) 是指在肿瘤化 疗中细胞对于一种化疗药物产生耐受后，同时对其他同一或非同一类 型的化疗药物也产生耐药性。m d r 这种现象最早是在肿瘤化疗中发 现的，通常被描述为在细胞的功能和结构这两个不相关方面的同步的 耐药抵抗( 2 ) 。胰腺癌的多药耐药性严重影响着胰腺癌的化疗效果和预 后。临床上m d r 分为原发性( 固有的) 和继发性( 获得的) 耐药两种。前 者是指肿瘤细胞从最初就表现出对抗肿瘤药物的低反应性，胰腺癌细 胞既属于此类；后者是指肿瘤细胞对一些抗肿瘤药物起初表现敏感， 但是当一段时间暴露后就又表现出相当的低反应性。这两种耐药在胰 腺癌的化疗过程中都可以出现，但是它们的机制却都不明确。目前认 为可能存在的普遍耐药机制有：药理学机制和细胞机制。前者指与治 疗效果密切相关的药理学因素包括药物的剂量、给药时间、药物的代 谢及给药途径；后者主要包括以下几个方面：( 1 ) 通过细胞膜或胞浆 与细胞核之间药物摄入和外流改变使细胞内药物浓度降低，即转运介 导的耐药，常涉及m d r 基因( m d r l ) 、r 相关蛋白( m r p ) 、肺耐药 蛋白( l r p ) 等；( 2 ) 细胞内药物的激活或灭活改变所引起的代谢耐药， 涉及谷胱甘肽( g s h ) 、谷胱甘肽转移酶( g s t ) 和p 4 5 0 家族等；( 3 ) 通过 细胞内药物靶酶的水平改变或细胞内酶与药物的亲和力改变而导致 的靶耐药，涉及拓扑异构酶i i ( t o pi i ) 、二氢叶酸还原酶( d h f r ) 、微 管蛋白等；( 4 ) d n a 损伤修复功能加强，如甲基鸟嘌呤甲基转移酶 ( m g m t ) 升高等；( 5 ) 细胞凋亡调节的改变等( 3 1 。对于胰腺癌的r 机制而言，关于细胞膜转运蛋白，如p 糖蛋白、m i 心和l i 冲在药物 转运流动，细胞内药物浓度改变和药物分布等方面起到的重要作用相 对研究比较多，已得到一定的证实( 4 ) 。其中以p 糖蛋白为代表的耐药 蛋白是胰腺癌化疗失败和不良预后的重要因素( 弱。p 糖蛋白是 a b c ( a t p - b i n d i n gc a s s 甜e ) 通道蛋白家族中的一种，a b c 通道蛋白是 一类能够输送各种物质通过胞外及胞内胞膜的蛋白大家族，它的底物 非常广泛，包括各种离子、糖、氨基酸、维牛素、脂质、药物、寡糖、 寡肽和蛋白( 6 ) 。人类基因组中，多药耐药基因( m d r ) 含有两个亚单位即 m d d 和m d r 2 ，均位于7 q 2 1 1 ，二者有高度同源性，但只有m 出产 生耐药表型。p - g p 由m d r l 表达调控，属于a t p 依赖型转运蛋白家族， 具有1 2 8 0 个氨基酸，相对分子质量约是1 7 0 k d ( 刀。p g p 是抗癌药物 结合蛋白，位于r 细胞的细胞膜上，由前后排列的2 个重复分子 组成，每一半包括6 个跨膜的极度疏水区( 缸觚s m e n l b 啪ed o m a i n ，t m d ) 和1 个包含高度保守的a t p 结合域的亲水区( n u c l e o t i d eb i n d i n g d o m i n ，n b d ) ，中间由一个弹性连接多肽相连。p g p 有2 个a t p 结 合位点，每个a t p 位点都可以水解a t p ，还有一个大的细胞外环而 且可以在3 个位点被糖基化( 。 耐药逆转剂联合化疗药物是提高胰腺癌和胰腺癌术后复发治疗 效果的重要措施。第一代p g p 抑制剂是药理学化合物，这类化合物 原是用于其它适应症，但是这类化合物能够抑制p g p ，由于第一代化 合物作用力较弱和非选择性，限制了此类药物的应用；构成第二代 p g p 抑制剂的因子缺乏第一代化合物的药理学活性但是拥有更高的 p g p 亲和力，虽然这些化合物具有低毒性的优点，但是仍然具有限制 其临床应用的特性；构效关系和组织化学的方法促进了第三代p g p 抑制剂的发展，最初的目的是为了提高多药耐药肿瘤的治疗效果和抑 制p g p 的高度特异性和毒性，第三代p - g p 抑制剂具有较强作用力和 高选择性，其作用力是第一代和第二代p g p 抑制剂的1 0 倍以上( 9 1 0 、， 临床上也没发现第三代p g p 抑制剂能引起其他抗肿瘤药物的药代动 力学的变化，因此，这种从各种药物逐渐发展起来的化合物使癌症治 疗得到了极大地发展，目前正应用在已使用不同的抗肿瘤药物的几种 不同类型的癌症身上进行临床实验( 1 1 ) ，第一和第二阶段的研究已经成 功，第三阶段的实验已经开始，临床实验显示第三代p g p 抑制剂能 增加有p g p 表达的肿瘤细胞中的其他抗肿瘤药物的细胞内浓度，第 三代p - g p 抑制剂的进一步研究的目标是癌症患者的长期存活率。然 而，第三代p g p 抑制剂的第三阶段试验并没有成功，在p g p 抑制和 提高生存率方面并没有获得显著的成效u ，1 2 ) 。另一类引起广泛关注的 p g p 抑制剂是草本类成分( 1 3 ) ，由于其无毒性和自身没有药理学活性， 因此被作为理想的p g p 抑制剂。在一段连续的较长的历史时间里草 药被大量的应用于日常饮食中，其安全性得到了肯定，由于草药成分 能增强生物可利用率，提高组织穿透力( 如血脑屏障) ，减少胆汁排 泄，因此被认为是理想的m d r 抑制因子。 本实验采用的黄芪就是属于草本类成分，黄芪为豆科植物膜荚黄 芪或蒙古黄芪的根，经药物分析，其主要成分有黄芪苷、黄芪黄酮、 黄芪多糖及少量矿物质。我国已将黄芪提取物制成注射液应用于临 床，在肿瘤化疗过程中认为可提高机体免疫力，抑制肿瘤生长( 悼1 5 ) 。 有报道表明，多种中药黄酮成分可逆转肿瘤多药耐药性( 幡m ，但在胰 腺癌的化学治疗的研究领域国内外均未见相关报道，据此，在本研究 中我们应用黄芪注射液作用于胰腺癌细胞株p a n c 1 ，评估其对化疗 敏感性及耐药蛋白p 糖蛋白的影响，并探讨可能的影响机制。这类 p g p 抑制剂将会成为以后研究的热点，并在逆转多药耐药中发挥重要 的作用。 材料和方法 1 材料 1 1 细胞株 人胰腺癌细胞株p a n c 1 购自中国科学院细胞库。 1 2 主要实验试剂 1 2 1 细胞培养试剂 d m e m 培养基购自g i b c o 公司；优级胎牛血清购自1 1 1 v i 仃o g e n 公 司；黄芪注射液( a s t ) 、氟尿嘧啶注射液( 5 f u ) 购白天津金耀氨基 酸有限公司。 1 2 2 免疫组织化学抗体 a k t 2a m i b o d y 和m d 卜1a n t i b o d y 购自b i o w o r l dt e c l u l o l o g y 公司。 1 2 3 试剂 m t t 、二甲基亚砜( d m s o ) 购白s i 鄹【l a 公司；h i s t o n s t i a i l l l m p l u s t s 、3 ，3 d i 锄i n o b e n z i d i n et e t 珊l y d r o c h l o r i d es u b s t m t e 瞄t 购自北京 中杉金桥公司；其余所用试剂均为国产分析纯市售商品。 1 3 主要实验仪器 主要仪器包括f o m as 嘶e si iw r a t e rj a c k e t e dc 0 2i n c u b a t o r ( 美国 t h e m o 公司) ；s w 二l j i f 超净工作台( 苏州安泰空气技术有限公司) ； o l p u sa x 8 0 s 手动显微镜( o 删p u s 公司) ；酶标仪e l x 8 0 0 购 自基因公司；t a l u l o n 2 5 0 0 凝胶图像扫描系统( 美国b i o r a d 公司) 。 1 4 分析软件 i p p 分析软件，s p s s13 o 统计分析软件。 2 方法 2 1 细胞培养 p a n c 1 细胞株复苏后接种于含1 0 胎牛血清及青霉素、链霉素 各1 0 0 u 札的d m e m 培养液中，在3 7 、5 c 0 2 培养箱中培养， 细胞呈单层贴壁生长后每2 d 换液1 次，生长密度达9 0 时用o 2 5g l 的胰酶消化传代。 2 2 不同药物对p a n c 1 细胞存活率的影响 2 2 1a s t 与5 f u 分别单独刺激必c 1 细胞 弃去培养基后，用p b s 液洗涤两次，加入o 2 5 胰酶和 o 0 2 e d t a ，消化5 m i n 后吸弃，用含1 0 血清的d m e m 培养基终 止反应，吹散、混匀、计数，以5 1 0 4 m 1 接种于9 6 孔板中，置于c 0 2 培养箱中( 5 c 0 2 、9 5 空气、3 7 ) 培养。培养2 4 h 后，随机分为 对照组、a s t 刺激组、5 f u 刺激组。吸弃培养基，对照组加入d m e m 培养基，刺激组分别加入a s t ( o 、2 5 、5 、1 0 、2 0 m 鲋【1 1 1 ) 和5 f u ( o 、o 0 0 5 、0 0 5 、o 5 、5 u 咖1 ) 进行培养。 2 2 2m t t 法测定细胞存活率 每组加入药物作用2 4 h 后，取出培养板，每孔加入m t t ( 浓度 为5 m 咖1 ) 应用液2 0 u 1 ，继续在培养箱中培养4 h ，吸去培养基，每 孔加入1 0 0 u ld m s o ，室温避光振荡1 0 缸n ，使产生的紫色f o m a z a n 结晶溶解，用酶标分析仪在4 9 0 n m 下测定各孔吸光度。实验设4 复 孔，取平均值进行统计学处理。 2 2 3a s t 与5 f u 联合用药对p a n c 1 细胞存活率的影响 根据a s t 与5 f u 分别对胰腺癌p a n c 1 细胞增殖的影响，选择对 p a n c 1 细胞抑制率在1 5 3 0 的5 f u 药物浓度，再与不同浓度的a s t ( 2 5 、5 、1 0 、2 0 m 咖1 ) 联合用药作用2 4 h ，同样用m t t 法检测联合 用药对细胞增殖抑制作用。按公式：细胞抑制率= 1 ( 药物组吸光值 对照组吸光值) l o o ，计算各组细胞抑制率。合并用药效果，根据 金( 正均) 氏公式( 1 8 判断：q - e a + b ( e a + m a e b ) ，其中e a + b 为合并 用药抑制率，e a 和e b 分别为a 药和b 药单用的抑制率。q 值介于o 8 5 1 1 5 说明药物间为单纯相加，q 1 1 5 2 o 说明药物间为协同，q o 8 5 说明药物间为拮抗。 2 3 不同药物对n 悄c 1 细胞内a l 【t 与m d r 1 蛋白表达的影响 2 3 1 不同药物刺激p a n c 1 细胞 p a n c 1 细胞以5 1 0 佃密度接种于有盖玻片的1 2 孔板内，培 养2 4 h 后，随机分为空白对照组、不同浓度的a s t 治疗组( 5 、 2 0 m 咖1 ) 、5 - f u 治疗组( o 5 u g i i l l ) 。吸弃培养基，按照实验方案分 别加入对应的药物，对照组以d m e m 培养基取代，c 0 2 培养箱中常 规培养。 2 3 2 免疫组织化学检测a k t 与m m l 蛋白表达 2 4 h 后，将盖玻片取出，用多聚甲醛固定3 0 m i n 后，用p b s 液洗 涤2 次，3 m i n 次。3 h 2 0 2 去离子水3 7 孵育1 5 m i n ，p b s 洗涤3 次， 3 m i r l 次。滴加山羊血清3 7 封闭2 0 m i n ，倾去。分别滴加心( 1 ： 5 0 ) 、m n l ( 1 ：5 0 ) ，4 过夜。p b s 洗涤3 次，3 m i n 次。滴加二抗， 3 7 孵育1 5 i i l i n ，p b s 洗涤3 次，3 i i l i 次。按d a b 显色试剂盒说明 书进行显色，玻片再经过复染、脱水、透明后，最后滴加足量的封片 剂进行封片，行镜下观察。每个指标选取3 张片子，每张片子取5 个 高倍视野，运用i m a g ep r 0p l u s ( i p p ) 软件分析舭与m d r 1 蛋白表达 的累积光密度值( i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s 毋，i o d ) 。i o d 值越大，表 明目标蛋白表达量越高。 2 4 统计分析 采用s p s s1 3 o 统计软件，方差齐性检验后对多组间的比较采用 单因素方差分析，组间的两两比较采用独立样本t 检验，实验数据以 均数士标准差( x 士s ) 表示，p o 0 5 为有统计学意义。 3 结果 3 1a s t 和5 f u 分别单独用药对胰腺癌p a n c 1 细胞增殖抑制作用 m t t 法检测a s t 和5 f u 对p a n c 1 细胞单独增殖抑制情况结果见 表1 。由表1 ，图1 ，图2 可见，两种药物与各自对应的对照组相比，均能 明显抑制胰腺癌p a n c 1 细胞的增殖( 氏f = 5 2 2 3 ，尸 o 0 1 ； r f u - o 9 71 ，p o o1 ) ，其中a s t 药物各浓度组与对照组两两比较的 尸值分别为：o 0 0 1 、o 0 0 1 、o 0 0 1 、o o o l ，药物5 f u 各浓度组与对照 组两两比较的尸值分别为：o 0 0 7 、o 0 0 2 、o 0 0 1 、o 0 0 1 ；同一药物不 同浓度组间均数的两两多重比较结果显示：a s t 随其浓度的增高，对 p a n c 1 细胞的抑制变化无明显差异( 芦o 5 6 8 ) ，而5 f u 随其浓度的增 加出现抑制性增强，提示5 f u 对p a n c 1 细胞的增殖抑制作用在一定 范围内具有浓度依赖性，其中各浓度组与o 0 0 5u 酌：1 1 15 f u 组比较的p 值分别为o 0 1 8 、o 0 0 1 、o 0 0 1 ，o 5 、5 与o 0 5u g 瑚5 一f u 组比较的尸值 分别为o 0 0 5 、o 0 0 1 ，o 5 与5u 卧：1 1 15 f u 组比较的p 值为o 0 1 6 。 3 2 联合用药对胰腺癌p a n c 1 细胞的增殖抑制作用 由5 f u 单独作用于p a n c 1 细胞的增殖抑制作用结果可见，5 f u 对p a n c - 1 细胞增殖抑制率达1 5 3 0 时的药物浓度为o 5 u 酌：i l l 和 5 u g m l ，为减少药物浓度过大时可能产生的药物毒性作用，我们选择 o 5 u 咖l 作为与不同浓度的a s t 联合用药时的最终浓度。a s t 与5 f u 联合用药对胰腺癌p a n c 1 细胞的抑制作用结果见表1 和图2 。由表 可见，不同浓度a s t 联合5 f u ( 0 5 u g m 1 ) 后，对胰腺癌p a n c 1 细胞 的增殖抑制率明显升高，接近或大于两种药物单独用药抑制率之和， 与单独5 f u 或相应浓度a s t 组比较，差异有显著性p o 0 1 ) ，表明 联合用药可显著提高单独用药对胰腺癌p a n c 1 细胞的增殖抑制作 用。联合效应分析结果显示，2 5 m m 1 、5m “的a s t 与5 f u 的 联合效应为相加效应，1 0 m 咖l 、2 0m m l 的a s t 与5 一f u 的联合效 应为协同效应。 表1a s t 和5 f u 及联合用药对p a n c 1 细胞的增殖抑制作用( i 士sn = 4 ) t a b l e1蛐i t o 珂硪e c to fa s t ，5 f u 锄dt l l e i ru i l i o nm e d i c a t i o nf o rp a n c 1c e n s p 0 0lv sc o n h - 0 l ， 不同浓度5 一f u 作用2 4 小时后组间两两比较： 各浓度5 一f u 实验组v s 空白对照组尸值为0 9 7 1 ，尸值为0 0 0 3 ，其中， 0 0 0 5 u g m 1 ，o 0 5 9 m 1 ，0 5 u g m l ，5 u g m 1 5 一f u 组v s 空白对照组尸值分别 为：4 6 8 l ，1 7 1 6 ，2 8 8 1 ，1 7 9 3 ；尸值分别为：0 1 4 6 ，0 0 2 4 ，0 0 0 2 ，0 0 0 1 ； 0 0 5 9 m 1 ，o 5 u g m l ，5 u g m 1 5 一f u 组v s o 0 0 5 u g m 1 5 一f u 组，值分别为： 3 3 5 9 ，1 1 5 2 ，1 7 3 5 ；尸值分别为：0 0 1 8 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ；0 5 u g m l ，5 u g m 1 5 一f u 组v s o 0 5 9 m 1 5 一f u 组f 值分别为：o 5 4 8 ，o 0 2 0 ，p 值分别为：o 0 0 5 ，o 0 0 1 ： 0 5 u g m 1 5 一f u 组v s 5 u g m 1 5 一f u 组，值为0 2 3 6 ，尸值为0 0 1 6 。 不同浓度5 一f u 作用2 4 小时后抑制率组间两两比较： 各浓度5 一f u 实验组v s 空白对照组尸值为1 2 9 8 6 ，尸值为o 0 0 2 ，其中， o 0 0 5 u g m l ，0 0 5 9 m l ，o 5 u g m l ，5 u g m 1 5 一f u 组v s 空白对照组，值分别 为：8 8 7 3 ，1 1 0 1 9 ，7 5 4 6 ，5 8 9 4 ，；尸值分别为：o 0 0 1 ，o 0 0 1 ，0 0 0 1 ，o 0 0 1 ； o 0 5 9 m l ，o 5 u g m 1 ，5 u g m 1 5 一f u 组v s 0 0 0 5 u g m 1 5 一f u 组尸值分别为： 3 3 5 6 ，1 1 4 3 ，1 7 3 4 ；户值分别为：0 0 1 8 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ；o 5 u g m 1 ，5 u g m 1 5 一f u 组v s 0 0 5 9 m 1 5 一f u 组尸值分别为：0 4 8 6 ，0 8 9 3 ，尸值分别为：o 0 0 5 ，o 0 0 l ； o 5 u g m 1 5 一f u 组v s 5 u g m 1 5 一f u 组尸值为0 2 3 8 ，尸值为0 0 1 6 。 不同浓度黄芪作用2 4 小时后组间两两比较： 各浓度黄芪实验组v s 空白对照组，值为5 2 2 3 ，尸值为o 0 0 1 ，其中， 2 5 m g m 1 ，5m g m 1 1 0m g m 1 ，2 0i n g m 1 黄芪组v s 空白对照组尸值分别为： 1 0 6 9 ，1 0 2 2 7 ，2 4 1 0 ，3 2 6 7 ；尸值分别为：o 0 0 1 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ；5 n l g m 1 ， 1 0m g m l ，2 0m g m l 黄芪组v s 2 5 m g m 1 黄芪组尸值分别为：0 7 5 l ，0 2 6 2 ，0 3 2 1 ； 尸值分别为：0 8 7 8 ，o 0 6 9 ，0 0 5 5 ；1 0m g m l ，2 0m g m l 黄芪组v s 5 m g m 1 黄芪 组尸值分别为：0 0 1 4 ，0 0 2 1 ，尸值分别为：o 0 9 8 ，o 0 8 0 ；1 0m g m l 黄芪组 v s 2 0 m g m l 黄芪组尸值为0 0 0 0 ，尸值为0 9 2 9 。 不同浓度黄芪作用2 4 小时后抑制率组间两两比较： 各浓度黄芪实验组v s 空白对照组尸值为5 4 1 7 ，尸值为0 0 0 1 ，其 中，2 5 m g m 1 ，5m g m 1 1 0m g m l ，2 0m g m 1 黄芪组v s 空白对照组尸值分别为： 5 9 7 3 ，1 0 8 6 4 2 ，8 2 7 7 ，6 5 6 6 ；尸值分别为：0 0 0 l ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ；5i i l g m 1 ， 1 0m g m l ，2 0m g m 1 黄芪组v s 2 5 m g m l 黄芪组，值分别为：0 7 6 1 ，0 2 6 9 ，1 9 6 5 ，； 1 5 尸值分别为：o 8 8 0 ，0 0 6 9 ，0 0 8 8 ；1 0m g m 1 ，2 0m g m l 黄芪组v s 5 m g m 1 黄芪组 尸值分别为：0 0 1 4 ，1 2 6 1 ，尸值分别为：0 0 9 8 ，o 1 0 6 ：1 0m g m 1 黄芪组v s 2 0 m g m l 黄芪组尸值为1 1 5 7 ，尸值为0 5 3 9 。 各浓度黄芪+ o 5 u g m 15 一f u 作用2 4 小时后组间两两比较： 各浓度黄芪+ o 5 u g m 15 一f u 实验组v s 空白对照组膛为1 0 3 8 ，尸值为0 0 0 1 ， 其中，2 5 m g m l 黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 组，5 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m 15 一f u 组，1 0 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组，2 0 i l l g m l 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组v s 空白对照组，值分 别为：5 1 8 2 ，5 2 9 7 ，5 0 9 2 ，4 6 7 0 ，尸值分别为：o 0 0 1 ，0 0 0 1 ，0 o o l ，0 0 0 1 ； 5 m g m l 黄芪+ o 5 u g m 15 一f u 组，1 0 m g m l 黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 组，2 0 m g m 1 黄 芪+ o 5 u g m 15 一f u 组v s 2 5 m g m l 黄芪+ o 5 u g m 15 一f u 组尸值分别为 0 0 3 5 ，o 0 3 5 ，0 6 3 6 ，尸值分别为0 0 0 1 ，0 0 0 1 ，0 0 0 1 ：1 0 m g m 1 黄芪+ o 5 u g m 1 5 一f u 组，2 0 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组v s 5 m g m 1 黄芪+ o 5 u g m 15 一f u 组尸 值分别为：0 1 6 7 ，1 0 3 8 ，尸值分别为0 0 0 l ，0 0 0 1 ：1 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m 15 一f u 组v s 2 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组尸值为0 4 6 2 ，尸值为0 0 0 1 。 各浓度黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 作用2 4 小时后抑制率组间两两比较： 各浓度黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 实验组v s 空白对照组尸值为1 5 4 9 5 ，尸值为 o 0 0 1 ，其中，2 5 m g m l 黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 组，5 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组， 1 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组，2 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m 15 一f u 组v s 空白对照 组尸值分别为：1 0 9 6 2 ，2 7 3 9 3 ，3 3 6 2 4 ，2 5 6 6 3 ，尸值分别为： o 0 0 1 ，o 0 0 1 ，o 0 0 1 ，o 0 0 1 ：5 m g m l 黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 组，1 0 m g m l 黄芪 + 0 5 u g m 15 一f u 组，2 0 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组v s 2 5 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m 1 5 一f u 组雅分别为0 4 1 4 ，o 1 5 4 ，0 0 1 5 ，尸值分别为o 0 0 1 ，0 0 0 1 ，o 0 0 1 ：1 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m 15 一f u 组，2 0 m g m l 黄芪+ 0 5 u g m 15 一f u 组v s 5 m g m 1 黄芪 + 0 5 u g m 15 一f u 组尸值分别为：0 1 5 9 ，1 0 5 7 ，尸值分别为0 0 0 1 ，o 0 0 1 ：1 0 m g m 1 黄芪+ 0 5 u g m l5 一f u 组v s 2 0 m g m l 黄芪+ o 5 u g m l5 一f u 组尸值为o 4 8 5 ，尸值为 o 0 0 1 。 1 6 0 8 0 6 蓄0 4 0 2 0 0 拿。 笾3 0 暑 擗2 0 晕i o o 图1 不懈5 f u 对p a n d l 黝抑制作用 尸 0 0 ，鸺m d f 幻1h h ；b i b r ye i b c t a f5 - f u tp a n d lc e b 2 5 5 l