（果树学专业论文）脐橙citrus+sinensis+osbeck晚熟芽变性状形成机理研究.pdf

l | 1 1 11 11 1i i i ii i it i l l i ii y 18 12 6 4 3 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 制秀 如需保密，解密时间 2 t ，略年，月弓。日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同7 - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蚴：扒昂易一 帆加6 年刚灿 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 , - t - 版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用- t - 同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者始挑彩如 导师始坝劣秽 签名日期：刎6 年位月弓m 日 签名日期：莎卅年，l ，月乡厂日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 摘要l a b s t r a c t i i i 缩略词表v l 课题提出和文献综述1 1 1 课题提出l 1 2 果实成熟调控研究进展2 1 2 1 果实成熟概念和类型2 1 2 2 果实成熟调控2 1 2 2 1 激素在果实成熟调控中作用3 1 2 2 2 光照在果实成熟调控中的作用。5 1 2 2 3 转录因子在果实成熟过程中的调控作用6 1 2 2 4 果实成熟过程中糖酸代谢调控及糖分在植物发育过程中的调控作用7 1 2 2 5 果实成熟过程中的色素积累调控8 1 2 2 6 果实成熟过程中其他方面的调控9 1 2 3 研究果实成熟的策略9 1 2 3 1 差异性研究技术1 0 1 2 3 2e s t 技术10 1 2 3 3m i c r o r n a 技术1 1 1 2 3 4 转基因验证1 l 1 3 芽变的研究进展1 2 1 3 1 芽变基础l2 1 3 2 芽变机理研究策略l3 1 3 2 1 分子标记在研究芽变方面的应用13 1 3 2 2 差异显示研究技术1 4 1 3 2 3 基因全长克隆技术1 5 1 3 3 果实成熟期芽变研究状况1 7 1 4 本研究的目的和意义，以及研究内容和路线。1 8 1 4 1 研究目的和意义1 8 1 4 2 研究内容和路线18 2 材料与方法1 9 2 1 材料l9 2 2 研究方法：1 9 2 2 1d n a 提取l9 2 2 2r n a 的提取1 9 2 2 2 1r n a 提取试剂或溶液1 9 2 2 2 2r n a 提取步骤2 0 2 2 3 色度指标和色素测定2 l 2 2 4 色素相关代谢酶基因的半定量r t - p c r 分析2 l 2 2 5 糖分和酸含量测定2 2 2 2 6 糖分和酸代谢相关酶基因的半定量r t - p c r 分析2 2 2 2 7 核基因组s s r 分析2 2 2 2 8 基因组a f l p 分析2 3 2 2 9c d n a a f l p 分析2 3 2 2 1 0 差异片段克隆，测序及比对2 5 2 2 1 1 差异表达片段的r t - p c r 分析2 5 2 2 1 2r a c e 克隆基因全长2 6 2 2 1 3 地高辛( d i g ) n o r t h e r n 杂交2 7 2 2 1 3 1r n a 转膜2 7 2 2 1 3 2 地高辛( d i g ) 杂交2 8 2 2 1 3 3 洗膜2 8 2 3 数据处理。2 9 3 结果分析一3 0 3 1 果实r n a 提取结果3 0 3 1 1 其他几种r n a 提取方法的评价3 0 3 1 2 改进r n a 提取方法的r n a 提取质量评价3 l 3 2 奉节晚橙成熟过程中色素代谢分析。3 2 3 2 1 果实成熟时期及果皮颜色差异3 2 3 2 2 果皮叶绿素和类胡萝卜素的含量变化3 3 3 2 3 与色素代谢有关酶的基因表达3 4 3 3 奉节晚橙成熟过程中糖酸代谢分析3 5 3 3 i 果实糖分在成熟过程中变化3 5 3 3 2 果实在成熟过程中蔗糖代谢相关酶基因分析3 6 3 3 3 果肉中柠檬酸和苹果酸含量在成熟过程中变化3 7 3 3 4 果肉中柠檬酸代谢相关酶基因在成熟过程中的表达变化3 8 3 4 基因组s s r 和a f l p 分析4 0 3 4 1 基因组的s s r 分析。4 0 3 4 2 基因组的a f l p 分析4 0 3 5 果实成熟过程中的c d n a a f l p 分析4 1 3 5 1 差异片段的统计和功能归类4 1 3 5 2 部分差异片段的r t - p c r 或n o r t h e r n 验证，以及差异表达分析4 5 3 6 有关基因全长克隆及分析5 0 3 6 1 柑橘多聚半乳糖醛酸酶基因( c i t p g ) 全长克隆及分析51 3 6 2 柑橘n a c d o m a i n 基因( c i t n a c ) 全长克隆及分析5 2 3 6 3 柑橘肉桂醇脱氢酶基因( c i t c a d ) 全长克隆及分析5 3 3 6 4 柑橘促分裂原活化蛋白激酶基因( c i t m a p ) 全长克隆及分析5 5 3 6 5 柑橘乙烯应答单元结合蛋白基因( c i t e r e b p ) 全长克隆及分析5 6 3 6 6 柑橘m a d s b o x 基因( c i t m a d s ) 全长克隆和分析5 8 z i 讨论6 ( ) 4 1r n a 提取方法6 0 4 2 奉节晚橙和奉节7 2 1 成熟过程中生理差异原因探讨6 l 4 2 1 着色差异原因探讨6 1 4 2 2 糖含量差异原因探讨。6 2 4 2 3 酸含量差异原因探讨6 3 4 3 转录水平差异探讨6 3 4 3 1s s r 和a f l p 的非差异结果探讨6 3 4 3 2c d n a a f l p 技术有效性及结果探讨6 4 4 3 3 克隆的相关基因与成熟关系探讨6 6 4 4 晚熟芽变性状形成机理探讨6 9 参考文献7 l 致谓 8 6 附录i 奉节晚橙和奉节7 2 1 脐橙在成熟过程中的色泽变化一8 7 附录i i 0 3 0 4 年度奉节晚橙和奉节7 2 1 脐橙相关生理指标分析8 8 附录i i i 博士期间发表的论文8 9 脐橙( c i t r u ss i n e n s i so s b e c k ) 晚熟芽变性状 形成机理研究 摘要 奉节晚橙( “t l u ss i n e n s i s0 s b e c k ) 是一个来源奉节7 2 - 1 脐橙的晚熟芽变品 种。这两个品种一起将构成一个很好的柑橘成熟机理研究体系。加强对奉节晚橙的 研究，明确奉节晚橙晚熟芽变发生的机理，将为柑橘熟期育种奠定理论基础，最终 有助于柑橘产业的持续健康发展。本文研究了奉节晚橙与奉节7 2 - 1 脐橙在果实成熟 过程中的糖酸、色素、以及转录水平的变化，探讨了晚熟芽变脐橙发生原因，取得如 下主要结果： 1 建立了一种适合于柑橘不同时期不同组织的r n a 提取方法。利用该方法所 提取的r n a 的a 2 6 0 a 2 s o 在1 6 5 1 9 0 之间，a 2 6 0 a 2 3 0 大于2 o ：其质量和浓度能够 直接用于其它分子研究，如r t - p c r ，c d n a a f l p 和n o r t h e r n 杂交( 地高辛) 实验。 2 着色差异分析表明：与奉节7 2 1 脐橙着色相比，奉节晚橙的转色期约延迟 3 0 天左右，造成这种着色延迟的原因主要是奉节晚橙果皮前期叶绿素含量减少进程 和后期类胡萝卜素积累进程推迟所致。奉节晚橙果皮的叶绿素含量显著减少发生在 1 1 月上旬到1 1 月下旬，迟于奉节7 2 1 品种，后者叶绿素含量显著降低发生在1 0 月 中下旬到1 1 月上旬；奉节晚橙果皮的类胡萝b 素含量显著积累始于1 2 月中旬，而 奉节7 2 1 品种则始于1 1 月初。另外奉节晚橙果皮中叶绿素含量在1 0 至1 1 月问显 著高于原品种，类胡萝b 素含量在1 2 至1 月间显著低于原品种。基因表达分析发现， 奉节晚橙果皮的类胡萝b 素合成酶的相关基因较强表达的时问也整体迟于奉节7 2 1 脐橙；叶绿素水解酶基因表达在1 0 至1 2 月中旬其表达强度较奉节7 2 1 脐橙弱，翌 年1 月份则有较强的表达。 3 通过对果实成熟过程中的糖分积累分析表明，奉节晚橙和奉节7 2 1 脐橙果 实在成熟过程中两个品种的糖分变化差异主要发生在果肉组织，且奉节晚橙果肉中 三种糖分含量在1 2 月中旬之前是显著低于奉节7 2 1 脐橙果肉中的糖分含量，而在 元月份后则明显高于后者；果皮中奉节晚橙的蔗糖含量在果实成熟前期两个时期( 1 0 月l l 同和1 1 月3 日) 显著低于奉节7 2 1 脐橙。而蔗糖相关代谢酶基因表达分析表 明，两个品种果肉中酸性转化酶和蔗糖合酶的基因表达表现明显差异，这种差异部分 影响了奉节晚橙和奉节7 2 1 果实间的糖分差异。 4 奉节晚橙和奉节7 2 1 脐橙果肉酸积累分析发现奉节晚橙在成熟前期柠檬酸 含量显著高于奉节7 2 1 脐橙，而在后期( 11 月底始) 则低于后者；在果实成熟中期， 奉节晚橙节果酸含量显著低于对照品种。柠檬酸代谢相关酶基因表达分析表明柠檬 酸合成酶和顺乌头酸酶基因表达在两个品种问表现差异，而造成奉节晚橙柠檬酸含 量与奉节7 2 1 的差异可能与此时奉节晚橙果肉中柠檬酸合酶基因表达较强和顺乌头 酸酶基因表达受抑制相关。 5 利用分子标记技术，s s r 和a f l p 对两个品种的d n a 差异进行分析，未发 现两个品种间在d n a 水平上可重复的差异。 6 采用c d n a - a f l p 技术分析了两个品种的果实在成熟过程中转录水平的表 达，并对e d n a a f l p 的结果进行了进一步验证。实验筛选了1 2 0 对选择性引物， 总共获得近2 00 0 0 多条清晰带，结果发现其中有3 4 对引物出现差异带，检测到1 4 4 条清晰的转录差异带( t d f s ) 。在成功回收的1 2 9 个t d f s 中，通过测序和序列比对 ( b l a s t x ) 分析表明表达差异片段主要与信号转导、转录因子、成熟衰老、抗逆性、 核糖体蛋白和d n a 复制等有关。 7 利用r a c e 技术，以c d n a - a f l p 技术获得的差异片段为基础克隆了6 个与 成熟相关的基因，分别命名为c f 舢( e f l 8 5 4 2 0 ) 、c i t c a d ( e f l 8 5 4 1 5 ) 、c i t m a d s ( e f l 8 5 4 1 7 ) 、c n 皇p ( e f l 8 5 4 1 8 ) c i t n a c ( e f l 8 5 4 1 9 ) 、c i t e r e b p ( 、e f l 8 5 4 1 6 ) ， 除了i i a d $ b o x 基因外，其它5 个目前在柑橘中还未见报道，且c i t m a d s 与目前报 道的柑橘m a d s b o x 基因序列不同。表达分析表明在果实成熟过程中，他们在两个品 种的果皮或果肉组织中有表达差异，可能与晚熟性状的表现有关。 以上研究结果表明，相对奉节7 2 1 脐橙，奉节晚橙在许多方面发生了改变，这 种性状的改变很显然不是因为某一相关指标因子发生突变而引起局部性状发生改 变，而确实是果实成熟过程或发育过程整体延迟所致。而导致这种整体改变可能是 平上而非在d n a 水平发生改变。由于果实成熟是一个综合而又复杂的过 跃变型柑橘果实是一个渐进式的程序性过程，因此要使奉节晚橙整体协调 ，那么这种改变的发生很有可能在果实发育过程或成熟过程发生的上游某 即可能是启动果实成熟丌始的一个开关发生变化，从而导致奉节晚橙 整体表现延迟。 词：柑橘；奉节晚橙；果实：晚熟芽变；c d n a a f l p ；糖分代谢；酸代谢； f o r m a t i o nm e c h a n i s mo fal a t e r i p e n i n gb u dm u t a n to fn a v e l o r a n g e ( c i t r u s s i n e n s i so s b e c k ) a b s t r a c t f e n g j i e w a n c h e n g ( f j w c ，c i t r u ss i n e n s i so s b e c k ) i san o v e ll a t e - r i p e n i n gn a v e l o r a n g em u t a n to f f e n g j i e 7 2 - l n a v e lo r a n g ( f j 7 2 一1 ) a c a d e m i c a l l y , f j w cm i g h t c o n s t i t u t eau s e f u le x p e r i m e n ts y s t e mw i t hi t sp a r e n t a ll i n ef o rt h es t u d yo fc i t r u sr i p e n i n g m e c h a n i s m t og e tt h ek n o w l e d g eo ri n f o r m a t i o n 觞m u c ha sp o s s i b l ea b o u tt h e o c c u r r e n c em e c h a n i s mo ft h i sm u t a n tw i np l a yag r e a tr o l ei nc i t r u sf r u i t - m a t u r e - t i m e b r e e d i n gv i ag e n ee n g i n e e r i n g , a n d a tl a s ti nm a i n t a i n i n gc o n s e c u t i v ea n dh e a l t h y d e v e l o p m e n to fc i t r u si n d u s t r y i no r d e rt og i v ec l u e sa s t ow h a tm e c h a n i s m sa r e m o n i t o r e di nt h em u t a n t , d i f f e r e n c eo ff j w ca n df j 7 2 - li nc o l o r a t i o no rp i g m e n t a t i o n s u g a r , a c i da n dm r n at r a n s c r i p t sd u r i n g f r u i t r i p e n i n g w e r ec o m p a r e d , a n dt h e o c c u r r e n c em e c h a n i s mo ff j w cw a sd i s c u s s e di nt h ee n d t h em a i nr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 a ne f f i c i e n tr n ai s o l a t i o nm e t h o dw a se s t a b l i s h e d ，w h i c hw a sp r o v e dt ob e w i d e l ya p p l i c a b l ei n d i f f e r e n tc i t r u st i s s u e sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s t h e a 2 6 0 a 2 3 0o fr n a w a so v e r2 0 ，a n dt h ea 2 6 0 a 2 s or a n g e df r o m1 6 5 1 9 0 ，i n d i c a t i n gl o w l e v e l so f p o l y s a c c h a r i d ea n dg o o dp u r i t yo f t h er n a t h eq u a l i t yo ft h ei t n a w a sf u r t h e r p r o v e db ym e a n s o fi m p c & d i gn o r t h e r nb l o ta n a l y s i sa n de d n a a f l p 2 c o l o r a t i o na n a l y s i sd u r i n gf r u i tr i p e n i n gi n d i c a t i n gt h a tf j w c sc o l o r a t i o nw a s d e l a y e da b o u t3 0d a y so rs o ，w h i c hw a sb e c a u s et h a tt h ed i s t i n c t i v e d e c r e a s eo f c h l o r o p h y l li nt h ep e e lo ff j w co c c u r r e df r o mt h ee a r l yo fn o v e m b e rt ot h el a t eo f n o v e m b e r , l a t e rt h a nt h a to fi t so r i g i n a lc u l t i v a rw h i c ho c c u r r e df r o mt h em i d d l eo f o c t o b e rt ot h ee a r l yo fn o v e m b e r ，a n dt h eo b v i o u sa c c u m u l a t i o no fc a r o t e n o i di nt h ep e e l o ft h em u t a n tb e g a no nd e c 12 m w h i l ei t so r i g i n a lc u l t i v a ro nn o v 3 m w h a t sm o r e ， a n a l y s i so fi n d e p e n d e n t s a m p l e st t e s ts h o w e dt h a tt h ec h l o r o p h y l lc o n t e n ti nt h ep e e lo f f j w cf r o mo c t o b e rt on o v e m b e rw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ，a n dt h ec a r o t e n o i dc o n t e n t f r o md e c e m b e rt oj a n u a r yw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to ft h ep a r e n t a ll i n e f j 7 2 l r e s p e c t i v e l y g e n ee x p r e s s i o no fs o m ec a r o t e n o i db i o s y n t h e t i cg e n e sa n dc h o l o r o p h y l l a s e g e n eu s i n gr r - p c rt e c h n i q u ew e r es h o w e dt h a tt h et i m eo fs o m ec a r o t e n o i db i o s y n t h e t i c g e n ee x p r e s s i o nr e a c h i n gam a x i m u m i nt h ep e e lo ft h em u t a n tw e r ep o s t p o n e df o ro n e m o n t hc o m p a r i n gt ot h o s eo fi t so r i g i n a lc u l t i v a r , w h i l et h eg e n ee x p r e s s i o no f c h o l o r o p h y l l a s ei nt h ep e e lo ff j w cr e a c h e dam a x i m u m i nj a n u a r y , a n dk e p ts l i g h t l y l o w e rl e v e if r o mo c t o b e rt od e c e m b e rt h a nt h a to ff j 7 2 1 3 a n a l y s i so fs u g a rs e a s o n a lc h a n g e si nt h ep u l pa n dp e e lo fb o t hf j w ca n d f j 7 2 ld u r i n gf r u i tr i p e n i n gd i s c o v e r e dam a j o rd i f f e r e n c eo fs u g a rc o n t e n t si nt h ep u l p b e t w e e nt h et w oc u l t i v a r s s u g a rc o n t e n t so fs u c r o s e ，g l u c o s ea n df r u c t o s ei nf j w cp u l p w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s ei nf j 7 2 1b e f o r et h em i d d l ed e c e m b e r 。a n db e c a m e h i g h e ra f t e rt h e n i nf r u i tp e e l ，o n l ys u c r o s ec o n t e n t si nf j w cw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e r i i i t h a nt h o s ei nf j 7 2 - 1a tt h et w oe a r l ys a m p l i n gd a t e sd u r i n gf r u i tr i p e n i n g t r a n s c r i p t a n a l y s i so fs u c r o s em e t a b o l i cg e n es h o w e dt h a tc i t a l ( c i t r u sa c i di n v e r t a s eg e n e ) a n d c i t s s i ( c i t r u ss u c r o s es y n t h a s eg e n e1 ) h a dd i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n si nt h ep u l p b e t w e e nt h et w oc u l t i v a r sd u r i n gf r u i tr i p e n i n gw h i c hw e r er e l a t e d 、析t i lt h es u g a rc o n t e n t d i f f e r e n c eo ft h e m 4 a c i dc o n t e n t so ff j w c d u r i n gf r u i tr i p e n i n gw e r ea l s oc h a n g e dc o m p a r i n g 、析t l l f j 7 2 - 1 t h ec i t r i ca c i dc o n t e n t si nt h ep u l po ff j w cw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h o s ei n f j 7 2 一lp u l pd u r i n gt h ee a r l yr i p e n i n gs t a g e s ，w h i l el o w e rt h a nt h el a t t e ra f t e rt h el a t e n o v e m b e r i nt h em i d d l eo ff r u i tr i p e n i n g ，m a l i ca c i dc o n t e n t si nf j w cw e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s eo ff j 7 2 - 1 t r a n s c r i p tc o m p a r i s o no fc i t r i cm e t a b o l i cg e n e s h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n c eo fc i t r i ca c i db e t w e e nt h et w oc u l t i v a r sm i g h tb er e l a t e dw i t h t h eh i g ht r a n s c r i p tl e v e lo fc i t r a t es y n t h a s eg e n ea n dw i t ht h eb l o c ko fc y t o s o l i ca c o n i t a s e g e n ei nt h ep u l po ff j w cd u r i n gt h ee a r l yr i p e n i n gs t a g e s 5 n or e l i a b l ed i f f e r e n c e so nd n al e v e lb e t w e e nt h et w oc u l t i v a r sw e r ed i s c o v e r e d b ys s ra n da f l pa n a l y s i s 6 e x p r e s s i o np r o f i l e so ft h et w oc u l t i v a r s f r u i td u r i n gf r u i tr i p e n i n gw e r ea n a l y z e d u s i n ge d n a a f l p a f t e rs c r e e n i n g12 0p a i r so fs e l e c t i v ep r i m e r sw h i c hp r o d u c e da b o u t 2 0 0 0 0c l e a rt r a n s c r i p tb a n d s ，o n l y14 4c l e a rt r a n s c r i p td i f f e r e n tf r a g m e n t s ( t d f s ) w e r e f o u n di n3 4p a i r so fp r i m e r s h o w e v e r , o n l y12 9t d f sw e r e s u c c e s s f u l l yr e c o v e r e d ， s e q u e n c e da n dt h e nb l a s t e db yb l a s t xt 0 0 1 t h eb l a s t xr e s u l t ss h o w e dt h a tm o s to ft h e t d f sw e r er e l a t e dw i t l ls i g n a lt r a n s d u c t i o na n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s s e n e s c e n c eo r m a t u r a t i o n , s t r e s sr e a c t i o n , r i b o s o m ep r o t e i na n dd n ar e p l i c a t i o n 7 u s i n gt h es e q u e n c eo ft d f s ，s i xg e n e sr e l a t e dw i mf r u i tm a t u r a t i o nw e r e s u c c e s s f u l l yc l o n e du s i n gr a c et e c h n i q u e t h e r ew e r en a m e da sc i t p g ( e f18 5 4 2 0 ) ， c i t c a d ( e f l 8 5 4 1 5 ) , c i t m a d s ( e f l 8 5 4 1 7 ) , c i t m a p ( e f l 8 5 4 1 8 ) , c i t n a c ( e f l 8 5 4 1 9 ) a n dc i t e r e b p ( e f18 5 416 ) r - 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r i p e n i n gb u ds p o r t ； e d n a a f l p ；s u g a rm e t a b o l i s m ；a c i dm e t a b o l i s m ；p i g m e n tm e t a b o l i s m i v 缩略词表 缩写a b b r e v i a t i o n全名f u l ln a m e b l a s t c a d c d n a a f l p c h l c i t a c c l a l c i t c s c i t l d h c i t s p s c i t s s c t a b d e p c d i g e r e b p e s t f j 7 2 1 f j w c m a p ( k ) m i r n a o r f p d s p g p s y r a c e r n a i 剿p s d s s s h s s r t d f ( s ) z d s 8 一c h x 8 一l c y 局部比对基本检索工具b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l 肉梓酵脱氢酶c i n n a m y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e c d n a 扩增片段k 度多态性c d n a a m p l i f i e d f r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m 叶绿素水解酶基冈g e n eo f c h l o r o p h y l l a s e 柑橘顺乌头酸酶基冈g e n eo fc i t r u sa c o n i t a s e 柑橘酸性转移酶基因g e n eo f c i t r u sa c i dl n v e r t a s e 柑橘柠檬酸合成酶基因g e n eo f c i t r u sc i t r a t as y n t h a s e 柑橘异柠檬酸脱氢酶基冈g e n eo f c i t r u si s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e s 柑橘蔗糖磷酸合成基因g e n eo f c i t r u ss u c r o s e p h o s p h a t es y n t h a s e 柑橘蔗糖合成酶基因g e n eo f c i t r u ss u c r o s es y n t h a s e 十入烷基三甲基溴化胺c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d 焦碳酸二乙酯，d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d 譬； 地高辛d i g o x i g e n i n 乙烯应答单元结合蛋i 亡l e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n 表达序列标签e x p r e