（分析化学专业论文）单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究.pdf

， s t u d yt h ee x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no fm e m b r a n ep r o t e i n so nl i v i n g ， c e l l su s l n gs m i l em o l e c u l a r 工o r o em e a s u r e m e n tt e c h n o l o g v b y s u nx i a o l a n b s ( s h a n x id a t o n gu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a e t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rw r a n gk e m i n a s s o c i a t ep r o f e s s o rw a n g q i n g m a y ，2 0 1 1 咖2 2舢3帅7，0m 9iiiiiim y 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 翔、a 】、兰日期：勘年如弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密同。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：扪，a 1 导师签名： 专要斧 日期：沙if 年岁月；1 日 日期：沙c ( 年j 月j i ，日 o l - 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 摘要 膜蛋白在细胞表面识别、信号转导、酶活性和物质运输等方面扮演着重要的 角色，因此在活细胞水平研究膜蛋白的表达与分布情况具有重要意义。基于原子 力显微镜( a f m ) 的单分子力测定( s m f m ) 技术特别适合在近生理环境下测定 生物分子间的相互作用，本文利用这一技术研究了膜蛋白分子与抗体或者核酸适 体的相互作用，并从纳米尺度上考察了膜蛋白分子在活细胞表面的分布情况，有 利于进一步了解活细胞水平上膜蛋白分子的性质，对研究膜蛋白介导的生物过程 具有重要的参考价值。本论文完成的工作包括： 1 基于s m f m 技术在活细胞水平上研究了细胞膜上多药耐药相关蛋白1 ( m r p l ) 的表达情况。通过测定m r p l 与其抗体间的相互作用力，考察了人舌 癌细胞经高剂量平阳霉素( b l m ) 反复间歇诱导前后细胞表面m r p l 的表达差异。 结果表明，m r p l 与其抗体间存在特异性相互作用力，当针尖运动速率为2 5i t m s 时，其大小约为1 8 24 - 3 5p n 。同时，药物诱导后m r p l 在人舌癌细胞上的表达明 显增强。研究结果对于了解活细胞水平上m r p l 的表达提供了新的方法，有助于 癌细胞多药耐药性( m d r ) 的研究，还有望用于活细胞水平上其他生物分子的表 征。 2 基于s m f m 技术和激光共聚焦荧光显微技术联用，研究了乳腺癌细胞膜 上肌腱蛋白c ( t e n a s c i n c ) 的表达与分布情况。本工作利用s m f m 技术测定了 乳腺癌细胞膜上t e n a s c i n c 与其核酸适体的相互作用，并通过a f m 与激光共聚 焦显微镜联用考察了t e n a s c i n c 在乳腺癌细胞表面的表达与分布情况。结果表明， t e n a s c i n c 与其核酸适体g b i 1 0 存在特异性相互作用力，当针尖运动速率为2 g m s 时，其大小约为1 9 04 - 1 5p n ；t e n a s c i n c 在乳腺癌细胞表面表达较强，在正 常乳腺细胞上几乎不表达。本工作拓展了s m f m 技术在活细胞水平上核酸适体 蛋白质相互作用研究中的应用，有望为癌症发生、发展机制的研究提供有价值的 信息。 3 基于s m f m 技术研究了肝癌细胞膜上t e n a s e i n c 的表达与分布情况。由 于t e n a s c i n c 在不同组织器官上表达不同，且其往往与癌症的发生有关，因此本 工作在上一工作的基础上比较了几种不同肝癌细胞株上的t e n a s c i n c 与其核酸适 体的相互作用，并通过a f m 与激光共聚焦显微镜联用考察了t e n a s c i n c 在几种 不同肝癌细胞株表面的表达与分布情况。结果表明，几种不同肝癌细胞株上 t e n a s c i n c 与其核酸适体存在特异性相互作用力，当针尖运动速率为2g m s 时， 其大小约为1 9 0a - 1 5p n ，与乳腺癌细胞上t e n a s c i n c 与核酸适体的相互作用力大 i i 硕士学位论文 暑葛量曼! 曼曼! 詈曼寡詈詈曼鼍寡皇鼍詈曼! 曼! 詈皇苎皇詈! 曼詈詈蔓皇! ! ! ! ! ! ! ! ! i i 二i 小一致。t e n a s e i n c 在几种不同肝癌细胞株上均有较强表达，表达量几乎相同， 在正常肝细胞株上几乎不表达。本工作的研究结果表明，采用s m f m - 激光共聚焦 联用技术，有利于在活细胞水平上研究核酸适体蛋白质的相互作用。 关键词：原子力显微镜；单分子力测定；活细胞；膜蛋白；抗体；核酸适体 i i i l i a b s t r a c t t h em e m b r a n ep r o t e i nt a k e sa ni m p o r t a n tp a r ti nm e m b r a n er e c o g n i t i o n ，s i g n a l t r a n s m i t t i o n ，e n z y m ea c t i v a t i o na n ds u b s t a n t i a lt r a n s p o r t a t i o n i ti si m p o r t a n tt os t u d v t h ee x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no f p r o t e i no nl i v i n gc e l lm e m b r a n e i ti ss u i t a b l et o m e a s u r et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i o m o l e c u l e si np h y s i o l o g i c a le n v i r o n m e n tb ys i n g l e m o l e c u l a rf o r c em e a s u r e m e n t ( s m f m ) b a s e do na t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y ( a f m ) t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i na n da n t i b o d yo r a p t a m e rw e r es t u d i e di nt h i st h e s i sb v sm f m f u r t h e r m o r e ，t h ee x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o n o fp r o t e i no nl i v i n gc e l l m e m b r a n ew e r ea l s od e t e c t e di nn a n o s c a l e t h e s ew e r ei nf a v o ro f u n d e r s t a n d i f i gt h e p r o p e r t i e so fm e m b r a n ep r o t e i no nl i v i n gc e l l a n dh a dg o o dr e f e r e n c ef o rs t u d y i n g b i o l o g i c a lp r o c e s sw h i c hi n d u c e db ym e m b r a n ep r o t e i n t h em a i nw o r kf i n i 矗e di n t h i st h e s i si n c l u d i n g ： 1 s t u d i e dt h ee x p r e s s i o no fm u l t i d r u gr e s i s t a n c ea s s o c i a t ep r o t e i ni ( m r p 1 ) o n l i v i n gc e l lm e m b r a n eb ys m f m t h ei n t e r a c t i o nf o r c eb e t w e e nm r p 1a n da n t i m r p1 w a sm e a s u r e du s i n gs m f m a n dt h ee x p r e s sd i f f e r e n t i ao fm r p 1o nh u m a nt o n g u e c a n c e rc e l lb e f o r eo ra f t e rr e p e a t i n gt r e a tw i t hh i g hd o s eo fb l e o m y e i n ( b l m ) w e r e d e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a ss p e c i a li n t e r a c t i o nb e t w e e nm r p 1a n d a n t i - m r p l w h e nt h el o a d i n gr a t ew a s 2 5 l | m s ，t h ef o r c ew a sa b o u t18 2 士3 5p n t h e e x p r e s s i o no fm r p 1o nh u m a nt o n g u ec a n c e rc e l lb e f o r er e p e a t i n gt r e a tw i t hh i g h d o s eo fb l mw a sm u c hl o w e rt h a nt h a ta f t e rr e p e a t i n gt r e a tw i t hh i g h d o s eo fb l m t h e s e r e s u l t sa r es i g n i f i c a n ti ns t u d y i n gt h es i n g l em o l e c u l a rp r o p e r t i e so fm r p 1o n l i v i n gc e l ll e v e l t h e yc a na l s op r o v i d er e f e r e n c ef o rs t u d y i n gr n u l t i d u gr e s i s t a n c e ( m d r ) e n g e n d e ra n db e t t e rt h e r a p y 2 s t u d i e dt h e e x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no ft e n a s c i n c p r o t e i no nl i v i n g m a m m a r yc a n c e rc e l lm e m b r a n eb ysm f ma n d c o n f o c a l t h ei n t e r a c t i o nf o r c e b e t w e e nt e n a s c i n - ca n dg b i 一10a p t a m e rw a sm e a s u r e di nt h i sw o r kb ys m f m t h e d i f f e r e n te x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no ft e n a s c i n co nm a m m a r yc e l la n dm a m m a r v c a n c e rc e l lm e m b r a n ew e r ea l s od e t e c t e db yc o m b i n a t i o na f m w i t hc o n f o c a l t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a ss p e c i a li n t e r a c t i o nb e t w e e nt e n a s c i n ca n dg b i 10 。a n d t h ef o r c ew a sa b o u t19 04 - 15p na t2l x m sl o a d i n gr a t e t h ee x p r e s s i o no f t a n a s c i n 。c o nm a m m a r yc a n c e rc e l lm e m b r a n ew a se l e c t r o p o s i t i v e ，b u tn e g a t i v eo nm a m m a r y c e l lm e m b r a n e t h e s eh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a t i o ni nu n d e r s t a n d i n gt h ei n t e r a c t i o n i v b e t w e e na p t a m e ra n dp r o t e i n a l s op r o v i d e dr e f e r e n c ef o rm a m m a r yc a n c e re a r l y d i a g n o s i s 3 s t u d i e dt h ee x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no ft e n a s c i n cp r o t e i no nl i v i n gl i v e r c e l lm e m b r a n eb ys m f m t h et e n a s e i n cm a ye x p r e s sd i f f e r e n to nd i f f e r e n tt y p e so f t i s s u e sw h i c hr e l a t e dt om a n yc a n c e r s t h ei n t e r a c t i o nf o r c e sb e t w e e nt a n a s c i n ca n d a p t a m e ro nn o r m a ll i v e rc e l la n dt h r e ed i f f e r e n tk i n d so f l i v e rc a n c e rc e l ll i n e sw e r e m e a s u r e di nh i sw o r kb ys m f mi nb a s i so fp r e v i o u sw o r k t h ed i f f e r e n te x p r e s s i o n a n dd i s t r i b u t i o no ft e n a s c i n co nl i v e rc e l la n dl i v e rc a n c e rc e l lm e m b r a n ew e r ea l s o d e t e c t e db yc o m b i n a t i o na f mw i t hc o n f o c a l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a s s p e c i a li n t e r a c t i o nb e t w e e nt e n a s c i n ca n dg b i - 1 0o nd i f f e r e n tk i n d so fl i v e rc a n c e r c e l l s a n dt h ef o r c e sw a st h es a m ea sm e a s u r e do nm a m m a r yc a n c e rc e l lw h i c hw a s a b o u t19 0 士15p na t2i t m sl o a d i n gr a t e t h ee x p r e s s i o no ft a n a s c i n co nl i v e r c a n c e rc e l lm e m b r a n ew e r ee l e c t r o p o s i t i v e ，b u tn e g a t i v e o nn o r m a ll i v e r c e l l m e m b r a n e t h e s ea r eg o o df o rs t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i na n da p t a m e rb y c o m b i n a t io ns m f mw i t hc o n f o c a l k e yw o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ；s i n g l em o l e c u l a rf o r c em e a s u r e m e n t ；l i v i n g c e l l ；m e m b r a n ep r o t e i n ；a n t i b o d y ；a p t a m e r v - 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 本文所用英文缩略词表 v i 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明和版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 本文所用英文缩略词表v i 第1 章绪论1 1 1 活细胞膜蛋白表达与分布的研究意义1 1 2 活细胞膜蛋白表达与分布的研究方法2 1 2 1 非成像方法2 1 2 2 成像方法2 1 3 原子力显微镜单分子力测定在生物分子相互作用中的应用4 1 3 1 原子力显微镜概述4 1 3 2 单分子力测定概述8 1 3 3 原子力显微镜单分子力测定研究d n a d n a 相互作用9 1 3 4 原子力显微镜单分子力测定研究d n a 蛋白质相互作用1 0 1 3 5 原子力显微镜单分子力测定研究蛋白质蛋白质相互作用1 1 1 3 6 原子力显微镜单分子力测定研究配体受体相互作用1 2 1 4 本论文拟开展的工作1 3 第2 章单分子力测定技术研究活细胞上m r p l 的表达1 4 2 1 前言1 4 2 2 实验部分1 5 2 2 1 主要试剂和仪器1 5 2 2 2 实验方法1 5 2 3 结果与讨论1 7 2 3 1 原子力显微镜成像1 7 2 3 2 单分子力测定a n t i m r p l 与m r p l 相互作用1 8 2 3 3m r p l 与a n t i m r p l 间特异性相互作用力的证明一2 0 2 3 4 动态力谱分析a n t i m r p l 与m r p l 相互作用：2 l 2 4 小结2 2 第3 章单分子力测定技术研究乳腺细胞表面t e n a s c i n c 的表达与分布2 3 3 1 前言2 3 3 2 实验部分2 4 3 2 1 主要试剂和仪器2 4 3 2 2 实验方法2 4 v i i 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 3 3 结果与讨论2 6 3 3 1 原子力显微镜成像2 6 3 3 2 单分子力测定乳腺细胞表面t e n a s c i n c 与g b i 1 0 的相互作用2 7 3 3 3g b i 1 0 与t e n a s c i n c 特异性相互作用的证明2 9 3 3 4a f m 与激光共聚焦显微镜联用测定乳腺细胞表面膜蛋白的表达与 分布：3 0 3 4 j 、结31 第4 章单分子力测定技术研究肝细胞表面t c n a s c i n c 的表达与分布3 2 4 1 前言3 2 4 2 实验部分3 2 4 2 1 主要试剂和仪器3 2 4 2 2 实验方法j 3 3 4 3 结果与讨论3 3 4 3 1 原子力显微镜成像3 3 4 3 2 单分子力测定肝细胞表面t e n a s c i n c 与g b i 1 0 的相互作用3 4 4 3 3g b i 1 0 与t e n a s c i n c 特异性相互作用力的证明3 6 4 3 4a f m 与激光共聚焦显微镜联用测定肝细胞表面膜蛋白的表达与分 布3 8 4 4 小结4 0 结论4 1 参考文献_ 4 2 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录4 9 致谢5 0 v i i i 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 活细胞膜蛋白表达与分布的研究意义 生物膜所含的蛋白叫作膜蛋白，膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白( 或 称外周膜蛋白) 、内在膜蛋白( 或称整合膜蛋白) 和脂锚定膜蛋白。外在膜蛋白主 要分布在膜的内表面，为水溶性蛋白，约占膜蛋白的2 0 3 0 ；内在膜蛋白是 两性分子，可不同程度地嵌入脂双层分子中，约占膜蛋白的7 0 8 0 。有的内 在膜蛋白贯穿整个脂双层，两端暴露于膜的内外表面，这种类型的膜蛋白又称跨 膜蛋白；脂锚定膜蛋白是通过与之共价相连的脂分子插入膜的脂双分子层中，从 而锚定在细胞质膜上i l 】。 膜蛋白的功能是多方面的【1 1 ：( 1 ) 有些膜蛋白可作为“载体 将物质转运进 出细胞，如许多恶性肿瘤细胞上的多药耐药跨膜蛋白，它可以将药物等小分子“泵 出”细胞从而导致细胞内药物浓度降低，减弱药物对细胞的作用，这是癌细胞产 生耐药性的重要原因之一；( 2 ) 有些膜蛋白是激素或其他化学物质的专一受体， 如甲状腺细胞上有接受来自脑垂体的促甲状腺素的受体，可判断抗甲状腺药物的 治疗效果，预示甲亢型格雷夫斯病经抗甲状腺药物治疗后的复发；( 3 ) 有些膜蛋 白具有酶的特性，可使专一的化学反应能在膜上进行；( 4 ) 有些膜蛋白分子是细 胞表面抗原，它能和特异性的抗体或者其他的特异性生物分子结合，因此可以用 于识别细胞。如人细胞表面有一种人类白细胞抗原( h l a ) ，它是一种变化极多 的二聚体，在不同的人身上表现有不同的h l a 分子，在进行人体器官移植时， 被植入的器官常常出现被排斥的现象，这是由于植入细胞的h l a 分子不被受体 接受的缘故。 由上可知，膜蛋白在细胞表面识别、信号转导、细胞间接触、酶活性和物质 运输等方面都扮演着重要的角色。德国马普学会生物物理研究所教授、1 9 9 8 年诺 贝尔化学奖得主米歇尔在2 0 0 6 年的一次演讲中提到：膜蛋白研究大有潜力，可能 成为未来科学发展的重点领域之一。这是因为许多疾病都与某些特定的膜蛋白表 达异常有关，且现在市场上销售的药物8 0 以上作用于膜蛋白，在活细胞水平研 究膜蛋白的表达与分布有助于进一步了解膜蛋白与疾病产生之间的关系。 本章主要就活细胞膜蛋白表达与分布的研究方法作简要综述，重点介绍基于 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 的单分子力测定( s i n g l em o l e c u l a r f o r c em e a s u r e m e n t ，s m f m ) 技术在研究生物分子相互作用、表征膜蛋白分子分布 情况等方面的应用，并在此基础上提出本论文的研究工作设想。 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 1 2 活细胞膜蛋白表达与分布的研究方法 目前研究膜蛋白的相关方法主要有非成像方法和成像方法，下面介绍几种具 有代表性的非成像方法和成像方法。 1 2 1 非成像方法 1 2 1 1 流式细胞术法 流式细胞术是一种细胞分选或分析技术。它可对蛋白质的表达进行荧光定量 研究 2 , 3 1 ，且可在活细胞水平上同时测得多个参数【4 ，5 1 ，与传统的荧光显微镜检查 相比具有速度快、精度高、准确性好等优点。美国b d 公司与斯坦福大学将流式 细胞分析与抗体免疫识别相结合创造性的开发出了b dp h o s f l o w 试剂用于蛋白磷 酸化流式细胞分析技术，拓展了细胞信号转导的研究手段。该技术的主要步骤包 括：( 1 ) 获取活的单细胞悬液，用刺激剂在适宜的条件下刺激细胞，以激活胞内 信号级联反应；( 2 ) 用多聚甲醛固定细胞，之后用去污剂或醇类使细胞破膜；( 3 ) 用荧光标记的抗体来染色细胞；( 4 ) 应用流式细胞仪分析样本并获取数据。 1 2 1 2 质谱法 质谱法是指用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后并进行检测的 方法。基于质谱法检测蛋白质的表达被广泛地应用于肿瘤标志物的确定和评价 6 - 8 ，s i u 等【9 】利用质谱法检测不同蛋白质在肾脏癌细胞上的表达，研究结果显示： 相对在正常肾脏细胞上的表达，有的蛋白质在肾脏癌细胞上的表达表现出过表达 现象，而有的蛋白质却难以在肾脏癌细胞上表达。该研究充分说明了质谱法可以 应用于研究细胞表面蛋白质的表达。s y k e s 等【1 0 】利用质谱法量化未经加工的细胞 溶解产物中核糖体蛋白的相关表达水平，该研究方法无需对复杂样品进行分离、 鉴别、纯化和修正。 1 2 2 成像方法 1 2 2 1 凝胶电泳成像 凝胶电泳成像是以凝胶( 如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等) 为支撑物的区 带电泳成像，常被用来分离不同物理性质的分子，如蛋白质、d n a 等。凝胶电泳 成像技术用于蛋白质的分子量测定、蛋白质的纯化分离等研究取得了突破性进展， 是一种灵敏、可靠、经济的经典方法【1 1 , 1 2 。h e 等【1 3 1 在改进的微流控阵列中用凝 胶电泳方法检测了蛋白质，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和芯片内原位免疫印迹技术 实现了芯片内蛋白质的分离分析研究。结果表明通过使用玻璃微流控芯片进行凝 胶电泳成像使得蛋白质的分离更快速，特 蛋白质的特异性分离更高效。该方法为芯 2 硕士学位论文 蛋白质等打下基础。 1 2 2 2 激光共聚焦显微成像 激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，通过计 算机处理图像使光学成像的分辨率提高了3 0 4 0 。它可以对细胞作断层扫描 和三维立体成像，从外观到内在结构对细胞的认识得到提高，是形态学、分子生 物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中的强有力研究工具。激光共聚焦显微 镜可以更精确、更直观、更有效的进行蛋白质表达的定位和定量分析 1 4 , 1 5 】。 s h a n g g u a n 等【l6 】用激光共聚焦显微镜观察了人急性淋巴细胞白血病t 淋巴细胞 c c r f c e m 表面酪氨酸激酶( p t k 7 ) 分别与其核酸适体s g c 8 和p t k 7 抗体的结 合情况。通过分别用异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的s g c 8 和磷脂酰乙醇胺( p e ) 标记的p t k 7 抗体与细胞相互作用，用无s g c 8 作用的细胞作为对照进行激光共聚 焦显微镜成像，结果显示用f i t c 标记的s g c 8 和p e 标记的p t k 7 抗体作用的细 胞外围有很强的一圈荧光，而对照实验中只有来自细胞内部的自发荧光出现，如 图1 1 所示。表明s g c 8 对细胞表面蛋白p t k 7 的强特异性识别能力，为研究细胞 表面p t k 7 蛋白的表达与分布，癌细胞的筛选等提供了新的思路，具有重要的生 物医学应用价值。 p e o v e r l a y f f t c & p e l i b f i t c i g g - p e l i b f i t c a n t i p t k 7 一p e s g c s - f r r c a n t i p t k 7 p e 图1 1f i t c 标记的s g c 8 核酸适体和p e 标记的p t k 7 抗体分别与c c r f c e m 细胞作用的激 光共聚焦显微镜荧光成像酬1 6 】 一一一一一一一一一 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 1 2 2 3 扫描探针显微镜成像 扫描探针显微镜是各种新型探针显微镜( s t m 、a f m 、化学力显微镜、磁力 显微镜等) 的统称，由于其具有原子级表面分辨率、制样简单、操作环境多样化 ( 大气、真空、液下) 等优势而成为现代表面分析的重要方法【1 7 】，被广泛用于 d n a 、蛋白质及细胞等的成像。其中a f m 特别适合在近生理环境下观察生物样 品的形貌、研究生物分子的结构【1 8 。2 2 】等。尤其是新近发展的基于a f m 的单分子 力测定技术更是拓展了a f m 在研究生物分子相互作用2 3 ，2 4 1 、蛋白质在活细胞上 的表达与分布情况等方面的应用。下面将重点介绍这一技术在生物分子相互作用 研究方面的应用。 1 3 原子力显微镜单分子力测定在生物分子相互作用中的应用 1 3 1 原子力显微镜概述 1 9 8 2 年，美国i b m 公司的b i n n i n g 和r o h r e r 发明了扫描隧道显微镜( s t m ) ， 其分辨率可达原子水平，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着 重大的意义和广泛的应用。但由于s t m 是利用量子隧道效应产生隧道电流的原 理制作而成，因此它不适用于非导体表面的研究。为了观察绝缘材料表面的原子 图像，1 9 8 6 年b i n n i n g 和r o h r e r 又合作发明了a f m ，其横向分辨率可达到0 1n m ， 纵向分辨率可达到0 0 1n l t l ，放大倍数高达1 0 0 万倍以上，是透射电子显微镜 ( t e m ) 的1 0 3 倍，且可以在大气、真空、液下等环境中操作，微小的a f m 针尖 可以用于研究许多不同材料的不同表面，应用范围非常广泛。 1 3 1 1 原子力显微镜的组成部分与基本原理 a f m 主要是由执行光栅扫描和z 轴定位的压电扫描器、反馈电子线路、光学 反射系统、探针以及计算机控制系统构成。其中，一端带有极细极尖针尖的对微 弱作用力极为敏感的微悬臂探针被用来扫描样品表面，针尖样品间相互作用的改 变由光学反射系统监测，如图1 2 所示。当a f m 针尖趋近样品表面并与表面轻轻 接触时，探针尖端原子和样品表面原子产生极其微弱的相互作用力，该作用力造 成微悬臂的弯曲或偏转。此时由激光二极管打出的激光束通过微悬臂背面后反射， 然后通过对光的偏转极其敏感的光电检测系统获取反射激光信号位置的偏转，由 计算机实现对信号的采集，应用计算机及其软件分析微悬臂的变形程度及方向从 而获取样品表面形貌或者相互作用力数据。 4 硕士学位论文 e ) e f l e c t j | o ns 魄羽a l 图1 2a f m 的构造及其工作原理示意刚”】 1 3 1 2 原子力显微镜的应用 a f m 自发明起便为表面研究带来了巨大的变化，研究证明a f m 具有空间分 辨率高、制样简单、操作环境多样化、获得信息多样化、能进行纳米刻蚀和操纵 等优势。因此a f m 的应用范围囊括化学、生物、物理、材料、电子等许多领域。 ( 1 ) a f m 成像。a f m 最先是用来作为表面成像使用的仪器，且它对生物样 品的成像研究可以满足生理环境下实时在线研究。本研究小组杨柳等【2 6 】利用a f m 的高分辨成像观察了天然与半合成抗生素对大肠杆菌形态的影响，结果表明抗生 素细微化学结构差别能够引起大肠杆菌表面纳米水平上的不同结构损伤，这些损 伤与药效有关。且a f m 在通过表面形态表征来验证抗生素的作用机理方面具有 一定的优势，有助于从微观角度解释抗生素药效与其化学结构之间的关系。随着 科技的进步，a f m 也已成功走向高分辨快速成像模式，a f r i n 等【2 7 】利用a f m 针 尖在活细胞表面制造一个小孔，实现了a f m 对活细胞内部结构的高分辨成像， 然后通过在针尖上修饰分子与细胞作用，观察了d n a 通过膜孔传递的过程，如 图1 3 所示，这一结果为活细胞水平上研究细胞内部结构及基因传递提供了依据。 一 圈 闰圈 _ 塑 图1 3a f m 观察细胞内线粒体结构( 左) 和质粒d n a 转染( 左) 示意图【2 7 】 图| 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 ( 2 ) 表面物化性质研究。a f m 除可以获得表面形貌信息外，还可以获取样 品的弹性、硬度、黏着力、粗糙度等信息【2 引，满足各种研究的需要。同时其对操 作环境的要求相比t e m 而言要低得多，适合许多用t e m 难以满足要求的研究， 比如近生理条件下对生物样品的研究。 ( 3 ) 相互作用力研究。a f m 的纳米级针尖可以测量皮牛级微弱相互作用力。 通过对a f m 针尖进行不同分子的修饰可以使针尖的曲率半径显著减小，从而更 有利于相互作用力的测定。目前a f m 用于生物分子相互作用的研究已取得突出 成就，比如基于a f m 的力测定技术用于分子识别的研究【1 7 】、蛋白质折叠与去折 叠过程【1 8 锄1 的研究、细胞粘弹性质的研究、抗原抗体间相互作用1 2 1 , 2 2 的研究等。 ( 4 ) 纳米刻蚀与操纵。a f m 主要通过一微小的针尖与样品接触来工作，因 此a f m 可以在纳米尺度上直接操纵原子和分子，并进行纳米刻蚀。如t i n a z l i 等 【2 9 】在基底修饰一类蛋白质复合物，通过a f m 针尖操纵另一蛋白质与基底蛋白质 进行相互作用，结果观察到a f m 针尖通过操纵不同蛋白质与基底相互作用后可 使基底呈现不同的花样( 图1 4 ) 。据此可同时检测多种蛋白质，并提高检测的灵 敏度。 脯匐叫l 瞄n n l 嘲蛐 图1 4 a f m 操纵蛋白质示意图1 2 9 1 1 3 1 3 原子力显微镜与其他仪器的联用 a f m 发明至今已接近三十年，作为一种能独立使用的、高分辨的成像和力测 定仪器，它已成为微米和纳米领域的价值无法限量的研究工具。尽管相对其他表 面研究仪器而言其具有操作简便、检测灵敏和多功能性，但是这一仪器也有一定 的局限性，如它无法确定a f m 针尖接触的区域和针尖与样品的绝对距离等。f l o r e s 等【3o 】形象的将a f m 比作盲人，其可以借助手或者其他工具触摸物体从而获取物 体的形貌等特征( 图1 5 ) ，但是却无法通过眼睛直观的看到物体的特性。而通过 a f m 与其他仪器的联用可以有效解决这一难题。 目前应用较广泛的联用形式主要有：( 1 ) 光学显微镜与a f m 联用以使a f m 获得“眼睛”；( 2 ) 干涉测量法与a f m 联用以使a f m 获得测量绝对距离的能力； ( 3 ) 拉曼光谱法与a f m 联用以达到免标记化学区分物质的效果；( 4 ) 其他一些 6 硕士学位论文 诸如表面等离子体共振技术、椭圆偏光法、石英晶体微天平技术等与a f m 联用 以计算样品的吸附质量、评估不同样品的影响等。常应用于活细胞上膜蛋白研究 的联用技术主要是a f m 与普通光学显微镜的联用和a f m 与激光共聚焦显微镜的 联用，接下来将重点介绍这两种联用技术。 图1 5a f m 工作原理与盲人探路的相似性示意图【3 0 】 将光学显微镜与a f m 联用使得a f m 的应用取得了巨大突破，尤其对生物科 学领域的研究意义重大【3 1 1 。通过二者的联用可以精确的将a f m 针尖定位到细胞 表面感兴趣的位置进行研究，尤其是当有了光学图像与针尖横向位移叠加功能后 针尖的定位就更加精确。通过使用透光的基底，a f m 可以与全内反射荧光显微镜 ( t i r f ) 和荧光寿命成像显微镜等仪器联用以用于细胞的高分辨成像及力测定等 研究。g u m p p 等【3 2 】用a f m 与t i r f 联用成功的同时研究了k u f e r 等【3 3 】设计的单 分子剪贴过程的单分子实验。通过使用有层次的分子操纵力将荧光标记的生物分 子从库区拉起、转移，然后堆放到大约1 0r i m 大小的目标区域，如图1 6 所示。 结果显示a f m 与t i r f 联用可以精确的测定单个荧光团，还可以同时平行获得数 小时内分子剪贴过程中的高分辨力谱，具有稳定、高分辨等优势。 和) “ 羹醯董致蘑隆重甏邀 圈 蕃一 图1 6a f m 与t i r f 联用研究单分子剪贴过程示意图【3 2 l a f m 与激光共聚焦显微镜联用技术常用于荧光标记的细胞样品表面生物分 子的高分辨成像【3 。由于激光共聚焦显微镜在荧光显微镜成像基础上加装了激光 扫描装置，还带有一个针孔挡板，使得可以测量不同焦平面上的荧光i q 像，检测 7 单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究 灵敏度和图像质量比传统的荧光显微镜有显著提高。用免疫标记物选择性的标记 细胞的不同器官进行激光共聚焦显微镜荧光成像，通过a f m 测定不同荧光信号 位置处细胞的性质可