（分析化学专业论文）铜锌生命配体配合物的合成及其与dna的作用和生物毒性研究.pdf

荆螂辨 铜锌一 - - i = 命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生 物毒性研究 学位论文完成日期 指导教师签字 答辩委员会成员签字 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵! 翅遗直墓丝益蔓挂别主明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者虢朗向够签字日期加f 。年6 月f l 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络 向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者虢查弋向牛 导师擀 彩步多 签字日期：加 d 年 月i 己日 签字日期：弘f 辞5 月1 2 日 铜，锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 铜锌一生命配体配合物的合成 及其与d n a 的作用和生物毒性研究 摘要 关于铜锌生命配体配合物的研究是过渡金属配合物研究的最活跃的课题之 一，其药用性一直是科研人员关注的重要方面。本文通过合成新型铜锌生命配 体配合物，与结构己知的同系列的配合物进行比较研究，采用多种方法研究其生 物活性，即以电子吸收光谱法、荧光光谱分析法研究了它与d n a 作用，采用琼 脂糖凝胶电泳法研究了该配合物对d n a 的切割作用，首次以斑马鱼胚胎作为模 式生物研究了配合物的生物毒性，旨在为高效低毒药物研发提供理论依据。主要 研究结果如下： ( 1 ) 合成了一种新的锌( i i ) - 色氨酸一邻菲哕啉混配配合物 z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 】c i 7 h 2 0 ( 1 ) ( t r p 代表色氨酸离子，p h e n 代表邻菲哕啉) ，通过元素分析、红外光谱、电导 及热重差热分析对其进行表征。 ( 2 ) 对锌( i i ) 一色氨酸一邻菲哕啉三元配合物 z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 】c 1 7 h 2 0 ( 1 ) 及两种已 知结构的锌- 邻菲哕啉二元配合物 z n ( p h e n ) 2 】c 1 2 5 h 2 0 ( 2 ) 和锌邻菲哕啉一氯三元 配合物【z n ( p h e n ) c 1 2 ( 3 ) 进行了比较研究。电子吸收光谱法和荧光光谱法实验结 果表明：锌生命配体配合物与d n a 发生作用强弱顺序为配合物l 配合物2 配合物3 ，但它们与d n a 作用模方式有所不同；琼脂糖凝胶电泳实验结果显示： 在抗坏血酸存在条件下，锌配合物1 与p b r 3 2 2d n a 作用1 0m i n 时已经对 p b r 3 2 2d n a 产生显著作用，配合物2 和配合物3 与p b r 3 2 2d n a 作用1 0m i n 时无明显作用，从作用时间来看，配合物1 的切割活性比另外两个更强。从浓度 来看，当浓度为2 5g m o l l 1 时，配合物2 将约5 0 i 型d n a 转变为i i 型d n a ， 而在配合物3 体系中，d n a 主要以i 型存在；当浓度为1 0g r n o l l 1 时，配合物 2 将i 型d n a 完全转变为1 i 型d n a ，并且切割出i i i 型，配合物3 也将i 型d n a 完全转变为i i 型，但没有切割出i i i 型，说明配合物2 切割活性比配合物3 强。 综上，锌生命配体配合物对p b r 3 2 2d n a 切割活性顺序为：配合物1 配合物2 配合物3 。 在斑马鱼胚胎毒性实验中，综合2 4 h p f 时的致死率和孵化期7 2 h p f 时的半致 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 死浓度和孵化率三个指标数据比较结果可以得到：锌的三种配合物对斑马鱼胚胎 毒性作用顺序为：配合物2 配合物1 配合物3 ，说明相对于配合物2 ，配合物 1 因引入一个色氨酸离子配位，降低了配合物的生物毒性。 ( 3 ) 选取两种己知结构的铜( i i ) 生命配体配合物且p c u ( s f ) p h e ne 1 4 h 2 0 ( 4 ) ( s f 代 表司帕沙星) 和【c u ( s f ) 2 4 h z o ( 5 ) ，以电子吸收光谱法、荧光光谱分析法研究了 它与d n a 的作用，采用琼脂糖凝胶电泳法研究了该配合物对d n a 的切割作用， 并考察了它们对斑马鱼胚胎的生物毒性。两种铜生命配体配合物与d n a 发生作 用强弱顺序为配合物4 配合物5 ，其与d n a 作用模方式也是不同的。在抗坏 血酸存在条件下，铜配合物4 与p b r 3 2 2d n a 作用1 0m i n 时已经对p b r 3 2 2d n a 有显著作用，而配合物5 与p b r 3 2 2d n a 作用1 0m i n 时无明显作用，从作用时 间来看，配合物4 的切割活性更强。铜的两种配合物对斑马鱼胚胎毒性作用顺序 为：配合物4 配合物5 。上述结果表明，相对于配合物5 而言，配合物4 中一 个配体司帕沙星换成邻菲哕啉后，与d n a 作用增强的同时，生物毒性也明显增 强。 关键词：铜锌一生命配体配合物；d n a ：琼脂糖凝胶电泳；斑马鱼胚胎 s y n t h e s i s ，d n ab i n d i n gs p e c t r s c o p ya n db i o t o x i c i t yo n z e b r a f i s he m b r y os t u d i e so f c u ( i i ) z n ( i i ) 1 i f el i g a n d c o m p l e x e s a b s t r a c t t h er e s e a r c ho fc u ( i i ) z n ( i i ) 一l i f el i g a n dc o m p l e x e si so n eo ft h em o s ta c t i v ea r e a s i nt r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e ss c i e n t i f i cr e s e a r c h t h e b i o l o g i c a la c t i v i t i e so ft h e s e c o m p l e x e sp l a ya ni m p o r t a n tp a r ti nl i v e s r e s e a r c h i t sm e d i c a le f f e c ti sc o n c e m e do f t h ei m p o r t a n ta s p e c t s i nt h i sp a p e r ，n e wc u ( i i ) z n ( i i ) 1 i f e l i g a n dc o m p l e x e sa r e s y n t h e s i z e d ，as e r i e so fk n o w nc o m p l e x e sw e r ec h o s e nt o s t u d ya sc o m p a r i s o n r e f e r e n c e av a r i e t yo fm e t h o d sa r eu s e dt or e s e a r c ht h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e s ：t h e i n t e r a c t i o no ft h ec o m p l e x ew i t hs p e r md n a w a si n v e s t i g a t e db ye l e c t r i ca b s o r p t i o n s p e c t r s c o p y , e t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) f l u o r e s c e n c es p e c t r s c o p ya n dg e le l e c t r o p h o r e s i s m e a s u r e m e n t s t h e b i o t o x i c i t y o ft h e c o m p l e x ew a sd e t e r m i n e db yz e b r a f i s h e m b r y o s w i t ht h ee x p e c t i o no fp r o v i d i n gt h e o r e t i c a lb a s i sf o rd r u gd e v e l o p m e n to f n e wm e t a lc o m p l e x e s m a i nr e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) a n o v e lc o m p l e xo f z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 c l 7 h 2 0 ( 1 ) ( t r p = l t r y p t o p h a n ， p h e n2 p h e n a n t h r o l i n e ) w a ss y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a la n a l y s i s ，i r s p e c t r s c o p ya n dt g d t a ( 2 ) z n ( t r p ) ( p h e n ) z c 1 7 h 2 0i ss t u d i e dc o m p a r e dw i t ht w ok n o w nc o m p l e x e s 【z n ( p h e n ) 2 】c 1 2 5 h 2 0 ( 2 ) a n d 【z n ( p h e n ) c 1 2 】( 3 ) t h er e s u l t so fe l e c t r o n i ca b s o r p t i o n s p e c t r o m e t r ya n df l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r yi n d i c a t e dt h a tt h et h r e ez n ( i i ) 1 i f el i g a n d c o m p l e x e sb o n dt od n ab yd i f f e r e n tm o d e s ，w i t ht h eo r d e ro ft h eb i n d i n ga b i l i t vo f t h ec o m p l e x e st od n a ：c o m p l e x1 c o m p l e x2 c o m p l e x 3 t h er e s u l t so f a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a ta f t e r10m i no ft h ea c t i o nb e t w e e n c o m p l e x e sa n dp b r 3 2 2d n a i nt h ep r e s e n c eo fv i t a m i nc a sa r e d u c i n g r e g e n t ，c o m p l e x1h a ss i g n i f i c a n te f f e c to np b r 3 2 2d n a ，b u tc o m p l e x2a n dc o m p l e x 3h a v en oo b v i o u se f f e c to np b r 3 2 2 d n a a c c o r d i n gt ot i m e ，t h ea c t i v i t yo fc o m p l e x i i i 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 ic l e a v i n gp b r 3 2 2d n ai ss t r o n g e r c o n c e r n i n gt h ec o n c e n t r a t i o n ，w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fc o m p l e xi s2 5l a m o l l 一1 ，n e a r l yah a l fo fp b r 3 2 2d n ai sc l e a v e d f r o mt y p e ii n t ot y p e1 1w i t hc o m p l e x2 , w h i l et h e r ei so n l yt y p e lw i t hc o m p l e x3 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fc o m p l e xi s10p m o l l - 1 ，p b r 3 2 2d n ai sc o m p l e t e l y c l e a v e df r o mt y p e ii n t ot y p e1 1w i t hc o m p l e x2 , w h a ti sm o r e ，s o m et y p ei i ia p p e a r s ， w h i l et h e r ei sn ot y p ei i ia p p e a r sw i t hc o m p l e x3a l t h o u g hp b r 3 2 2d n ai sa l s o c o m p l e t e l yc l e a v e df r o mt y p e ii n t ot y p ei i t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc o m p l e x e s2 c u t t i n ga c t i v i t yi ss t r o n g e rt h a nc o m p l e x e s3 t os u mu p ，t h et h r e ec o m p l e x e sc l e a v e p b r 3 2 2d n a i nt h ep r e s e n c eo fv i t a m i nca sar e d u c i n gr e g e n tw i t ht h eo r d e ro f c l e a v a g ea c t i v i t yo ft h ec o m p l e x e st od n a ：c o m p l e x1 c o m p l e x2 c o m p l e x3 t h e b i o t o x i c i t yo f t h ec o m p l e x e so nz e b r a f i s he m b r y o si ss t u d i e db ys t u d y i n gt h e m o r t a l i t yo f2 4 h i ： f , m e d i a nl e t h a ld o s ea n dh a t c h i n gr a t eo f7 2 h p f o fz e b r a f i s he m b r y o s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb i o - - t o x i c i t yo ft h ez n ( i i ) - - l i f el i g a n dc o m p l e x e so n z e b r a f i s he m b r y o si si n c r e a s e di nt h eo r d e r ：c o m p l e x3 f o r mi i 。目前，琼脂糖凝胶电泳 已经被广泛用来研究物质对d n a 的断裂作用【5 6 - 6 0 1 。h ej 等用琼脂糖凝胶电泳法 研究了带胍基侧臂的2 ，2 一联吡啶为配体的两种铜的配合物与超螺旋d n a 的切 割活性，证明铜离子与带胍基侧臂的2 ，2 联吡啶螯合以后，对超螺旋d n a 的 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 切割活性表现为高效的断裂作用同时探讨了这两种配合物对超螺旋d n a 的切割 活性受p h 值影响【5 6 】。s u d h a m a n ic n 等合成了三种镍与邻菲哕啉及2 ，2 一联吡啶 的新型配合物，并用琼脂糖凝胶电泳法研究了这几种配合物多超螺旋p u c l 9 d n a 的切割活性，结果显示所得配合物具有较高的核酸酶活性【5 8 1 。 1 2 斑马鱼作为模式生物的研究进展 斑马鱼( b r a c h y d a n i or e d o 或d a n i or e r i o ) ，是一种原产于印度的鲤科小型热 带鱼，成鱼体长3 - - - 4c m ，鱼体分布有头尾方向的蓝色条纹，雌鱼体大，腹部明 显膨出：雄鱼体细长，尾鳍发达、体外产卵、受精、发育。斑马鱼的胚胎发育具 有普通硬骨鱼胚胎发育的一般特点，即经过受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、分裂、 成形、孵化等时期，如图1 - 1 。 卵裂期：鱼g 口受精后，细囊胚期：细胞分裂数目增原肠胚期：随着动物极细胞分裂的 胞质向动物极移动，开始加，帽状，卵黄囊高度细数目增加，开始向植物极延伸，逐 细胞分裂。 胞阶段 渐包裹伟卵黄囊。 分裂期：可见雏形， 成形期：体表色素沉积较多，孵化期：破绒毛膜后，背腹鳍均 肌节形成，躯干包裹 眼部色素明显加深，长出胸鳍。长成，孵化出仔鱼，下颌突出于 着卵黄囊。上颌，称之为突吻。 图1 1 斑马鱼胚胎发育六时期图 f i g u r ei l s i xd e v e l e p m e n t a ls t a g e so fz e b r a f i s h 斑马鱼受精卵外有较厚的透明胶膜，受精卵内密布有卵黄颗粒。受精后1 0 m i n 受精卵近动物极端出现一片状突起，突起基部出现一分裂沟，以后突起消失1 该突起是受精卵完成第二次成熟分裂后释出的第二极体。3 0r a i n 后受精卵动物 极端向外膨出形成一明显的亮区，此即胚盘。 9 铜，锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 卵裂期时斑马鱼的卵裂较快且清晰。前6 次卵裂均为明显的由动物极向植 物极方向进行的径裂，随着卵裂的进行，卵裂球愈来愈小，规则地排列于胚盘表 面，并渐向胚盘外表面推移，但细胞界限仍能分辨。 囊胚期时随着胚胎的发育，胚盘卵裂球数渐增，卵裂球间的细胞界限渐变 模糊，胚盘高矗于卵黄上，此即囊胚早期。解剖镜下有一较“平坦”的区域即卵 黄合胞体层。此后，细胞界限消失，细胞数目逐增，且原胚盘变的愈来愈矮即囊 胚中期。到囊胚晚期，囊胚表面细胞向卵黄部分下包，胚盘变成弓状，卵黄合胞 体层变为钟形或圆顶形，预示原肠作用将开始切片观察，胚盘细胞分为三群：胚 盘最表面为一层扁平的包被层细胞，细胞排列较紧密，染深蓝色；卵黄之上胚盘 之下为卵黄合胞体层，为多核无质膜分隔的细胞融合体；包被层边缘与卵黄合胞 体层紧密相连，二者间疏松的细胞群即深层细胞，各细胞中染色体清晰，并可见 细胞有丝分裂相，深层细胞与卵黄问的空腔为囊胚腔。 原肠胚期时胚盘细胞下包至卵黄1 2 处时，整个囊胚边缘处形成略厚的胚 环，其上层细胞为上胚层，下层细胞为下胚层，胚环背侧增厚形成胚盾。切片观 察，胚盘较薄盖在卵黄的一侧，单个细胞数增多，细胞体积较小，表层细胞仍为 扁平状，深层细胞分散存在，细胞核较大，染成蓝紫色。原肠胚期胚层运动的方 式是外包，胚胎可能因外包功能的缺失而妨碍前后体轴的形成，会导致卵黄外突 和原肠外凸，在该阶段仍会存在胚胎细胞的自溶现象，故以卵黄外突、原肠外凸 和卵凝结作为观察终点可以了解毒物对原肠胚期的影响。在分裂期肌节开始形 成，为器官形成的初级阶段。染毒后的胚胎可能会出现严重的发育阻滞和神经管 缺损，后者表现为尾部畸变，从而影响早期器官的形成。此时，尾部畸变和卵黄 囊异常可作为毒性指标。成形期和孵化期是胚胎发育的后期，在发育毒理学上有 特殊的意义，心脏和血液循环系统在该时期逐步成熟，在有效染毒的条件下，可 观察到心肌肿大、心率不稳、后主静脉血流减慢或停止、神经管缺损、脊椎和尾 部弯曲、色素沉积减少【87 】等现象，其中孵化时间也可作为一个重要的观察指标， 而心跳停止作为死亡的评判标准是非常简便有效的。 斑马鱼的精子和卵子在受精过程中解除了抑制卵细胞物质代谢的调节物质， 使卵激活，完成第二次成熟分裂并排出第二极体；同时受精激活了卵质流动而形 成胚胎物质，细胞质流向动物极形成胚盘，卵黄颗粒集中于植物极，卵黄周围有 1 0 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 很薄一层细胞质包围。卵黄内含有胚胎发育所需的全部营养及调节物质，因此斑 马鱼的胚胎发育均在胶膜内进行，直至幼鱼破膜出壳。斑马鱼从第l o 次卵裂开 始进入中囊胚转换( m i d b l a s t u l a tr a n s i t i o n ，m b t ) ，细胞分裂速度减慢，合子基因 开始表达，细胞明显开始移动1 5 8 1 。中囊胚转换把胚盘细胞分为三群，最外层的包 被层最终发育为胎皮，是胚体最外的保护层，在胚体发育后期被丢弃；卵黄合胞 体层是由近植物极的胚盘细胞及近动物极的卵黄细胞融合形成的，作为胚盘和卵 黄之间的过渡地区，可将卵黄物质转运到囊胚腔被卵裂球利用，并可作为原肠作 用时胚环细胞外包扩展的附着基质，深层细胞是胚胎发育的主体。此时细胞分化 的方向尚未确定，所以中囊胚转换是胚胎早期发育的转折点。 因为具有产卵量大、易收集、繁殖周期快、易养殖、个体小、养殖花费少、 能大规模繁育，斑马鱼可用作高效而价廉的生物活性分析工具。在投入大量资金 做动物实验前，斑马鱼可提供高质量、高通量的化合物体内活性筛选、毒性分析 等【2 4 】相关研究。斑马鱼的研究开始于2 0 多年前，最早从事研究的是美 o r e g o n 大学的s t r e i s i n g e r 等【5 引。由于斑马鱼繁殖能力强、胚胎透明、突变表现型明显、 胚胎发育同步且发育速度快生长速度快以及其基因与人类基因相似性高的优势， 是研究脊椎动物发育机制、遗传突变和疾病的良好模式动物，已成为生物学家在 实验室进行科研的新选择【6 0 】【6 l 】【6 2 】，斑马鱼现以其特有的优势在众多领域得到广 泛的应用。 斑马鱼是发育生物学和遗传学研究的理想模式。 至u 1 9 9 0 年，世界上已有十多家发育生物学实验室开始采用斑马鱼作为研究 对象。1 9 9 4 年5 月，德美两家实验室筛选出几千尾斑马鱼突变体，并发表了第一 个斑马鱼基因连锁图，成为斑马鱼作为脊椎动物分子发育生物学及人类基因组计 划模式动物的标志，发育生物学最直接的主要研究内容之一是细胞谱系分析。细 胞谱系分析通过记录特定细胞在胚胎发育中的分裂历史来提示其特定的百发育 命运，并观察其发育潜能f 6 3 1 。斑马鱼具有的超强繁殖能力，使其成为目前惟一 可以进行大规模随机诱变筛选隐性突变体的脊椎动物，其胚胎透明、在体外发育， 可以很容易地观察单个胚胎连续、动态的发育过程。与其他脊椎动物相比，斑 马鱼最大的优点就是具有多达6 0 0 0 多种的遗传突变种，这些突变种可提供极佳 的正向遗传学材料来进行发育机制的研究。t t l b i n g e n ( h a f f t e re ta l ，1 9 9 6 ) 6 4 】和 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 b o s t o n ( d r i e v e r e ta l ，1 9 9 6 ) e 6 5 】的两个研究团队使用化学诱变剂e n u ，在斑马鱼中进 行大规模的突变筛选，最后得到了约2 0 0 0 个突变体，有透明胚胎和早期幼鱼表 型，并克隆出一部分变异基因( 大约1 0 0 个) 。 近几年，转基因斑马鱼被大量培育出来，并在科研上起到重要作用。2 0 0 7 年复旦大学宋后燕、钟涛教授领衔的复旦大学分子医学教育部重点实验室上海市 自然科学基金重点项目课题组成功培育出一种神奇的可直观监测环境雌激素污 染的“转基因斑马鱼 ，专家认为，转基因斑马鱼用于检测水环境中的雌激素十 分方便、快速，对环境保护和生殖生理以及生殖病理具有重要应用和理论研究价 值。夏铭等建立了一个转基因斑马鱼动物模型来研究胰岛8 细胞的发育【6 6 1 。首先， 他们构建了斑马鱼胰岛素( i n s u l i n ，i n s ) 启动子与绿色荧光蛋i 刍( g f p ) 组成的表达 载体，命名为i n s ：g f p 。其次，将质粒在斑马鱼1 细胞期注射到细胞质内。最后 成功获得了生殖系稳定遗传胰岛素转基因斑马鱼，在成鱼和幼鱼期均可以通过 g f p 标记b 细胞。从他们构建的胰岛素转基因斑马鱼，可以直观判断胰岛的发育 情况，为研究胰岛的发育、损伤和再生提供了一个简便和直观的新型工具。美国 辛辛那提医学中心分别构建了报告基因受三种响应元件控制的转基因斑马鱼，用 于监测水中的污染物。三种响应元件分别是( 1 ) 芳烃响应元件，可对许多多环烃， 卤化共面分子如二氧( 杂) 芭和多氯联苯作出响应；( 2 ) 亲电子响应元件，可对苯醌 和许多其他的潜在的亲电子氧化剂作出响应；( 3 ) 金属响应元件，可对重金属离 子如汞，铜，镍，镉和锌等作出响应。新加坡国立大学于1 9 9 9 7 1 6 申请的世界专 利w 0 0 0 4 9 1 5 0 公开了利用甾类激素诱导启动控制表达荧光蛋白的转基因斑马鱼 监测水环境中甾类激素、甾类激素类似物；利用重金属诱导启动控制表达荧光蛋 白的转基因斑马鱼，监测水环境中的重金属锌、铜、镉和汞。n e b e r td a n i e l w 于2 0 0 4 7 2 9 申请的美国专利u s 2 0 0 4 1 4 7 0 3 0 公开了利用报告基因受污染物诱 导响应元件控制的转基因斑马鱼，利用荧光检测计和虫荧光素，通过检测荧光的 强度来检测污染物的浓度。污染物诱导响应元件包括：金属响应元件，芳烃响应 元件，雌激素响应元件，亲电子响应元件，维甲酸响应元件【6 引。 斑马鱼是人类疾病研究的理想模型。 斑马鱼基因与人类基因的相似度达到8 7 ，这意味着在其身上做药物实验所 得到的结果在多数情况下也适用于人体。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、 1 2 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有 数以千计的斑马鱼胚胎突变体，不但是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的 也可作为人类疾病模型。目前，科学工作者们相继利用斑马鱼建立了多种人类疾 病模型，并且开展了药物对斑马鱼不同疾病模型作用的研究，如抗新生血管形成、 止血、凋亡和增殖、脂质代谢、炎症和中枢耐受等【6 7 】。剑桥p h y h m i x 买药公司的 s e r b e d z i j a 等t 6 8 】以斑马鱼为材料，成功地构建了一新的血管生成药理模型，并用 血管生成抑制药物( s u 5 4 1 6 ，t n p 4 7 0 ) 和v e g f 进行验证，结果与对哺乳动物的作 用效果一致，从而从实验上证明利用该模型可预测药物对人的作用效果，即以斑 马鱼作为血管生成模型筛选小分子药物是可行的。阿德莱德大学的遗传学家迈克 尔拉戴利博士说：“从对斑马鱼胚胎的研究中，我们可以清楚地看到它的基因变 化情况，这将有助于人们弄明白癌症产生的原因并最终战胜这类疾病。”，作为 肿瘤模型，斑马鱼被称为是一种理想的脊椎动物模型。因为从肿瘤生物学角度 来看，鱼和人的肿瘤在组织学上非常相似而且与人相同的是，鱼的肿瘤也具有遗 传性【6 9 】【7 0 1 。比较人和鱼的基因序列，发现在细胞周期基因、肿瘤抑制子、致癌 基因等方面都具有保守性。此外，在药物作用方面，发现虽然斑马鱼与人的蛋白 同源性小于7 0 ，但蛋白功能域( 如药物作用的靶点) 的同源性接近1 0 0 。最 后，斑马鱼的胚胎具有与肿瘤相似的特征：快速分裂的细胞、细胞凋亡速度延缓 和旺盛的血管生成等【7 l 】。 斑马鱼是毒性评价中新型实验动物。 科学研究实验室中，科研工作者不仅可以把斑马鱼作为发育生物学和遗传学 研究的理想模式和人类疾病研究模型和人类基因组计划中功能染色体组研究的 理想模型1 2 引，也将之应用在毒性评价工作中( 水环境监测，或有机物质等) ，例如 检测城市混合性工业污水的毒性及水质监测，检测水环境中的重金属、有机农药、 多元混合物，或海底沉积物中有机物毒性检测等【删【6 8 1 。 斑马鱼已经被o e c d 的指导手册列为实验标准鱼类【矧，被用于乙酸甘油酯和 氯化钾危害评价，二氯甲苯和氨基十一烷酸急性毒性检测。斑马鱼急性毒性实验 是监测工业污染及污水检测的重要手段之一。国内一些机构在做水体毒性实验 时，一般选择人们熟悉的四大家鱼一草鱼、青鱼、鲢鱼、鳙鱼作为实验鱼种的。 但四大家鱼虽然是本地种，但养殖周期长，做实验时有不便之处。而斑马鱼一年 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 四季都可繁殖，更重要的一点，它是国际标准化组织推荐的五大实验鱼种之一， 实验得出的数据可以在国际上被认证。上海市环境监测中心曾经从青浦赵屯等处 多个断面采来水样，用斑马鱼作了河水急性毒性实验。实验结果显示，从苏州河 干流取来的河水，没有达到急性毒性实验规定的5 0 鱼类致死的浓度。铁岭市环 境保护局曾利用斑马鱼对铁岭市2 6 家有代表性的企业所排放的污水进行了急性 毒性实验，并把毒性测试与理化监测相比较，综合评价污染源的污染程度，划分 了这些污水的毒性级别。为控制水环境的毒性污染和强化污染管理体制提供了科 学的依据。 斑马鱼胚胎毒性技术得到广泛应用。 从人与自然和谐共处的角度看，虽然鱼类急性毒性实验能够很好地分析化合 物的毒性，但是这与人性道德所倡导的理念不一致。因为实验所用幼鱼或成鱼在 实验过程中会感到疼痛和折磨，这和当前的动物权利保护立法相抵触，而且l c 5 0 值的环境毒理价值不高，这就需要寻求新的替代方法。斑马鱼胚胎实验和鱼细胞 毒素实验就是两种较好的方法【6 6 1 。斑马鱼胚胎毒性技术是各国际标准组织认可的 标准毒性测定方法，属于致畸效应检验，具有材料方便易得、易操作、灵敏度高、 可重复性及可靠性高等优点，又有可记录多项毒性指标的特点，而且与传统的鱼 类急性实验相比具有成本低、影响因素少特别是斑马鱼胚胎发育过程中受重金属 的影响较大，其中c u 的毒性最强，h g 次之，c r 最弱，有机农药次之，有机试剂 中含卤索取代基和苯胺类毒性最大。因此，斑马鱼胚胎技术可以检测城市混合性 工业污水的毒性及水质监测，检测水环境中的重金属、有机农药、多元混合物， 斑马鱼胚胎实验毒性指标敏感度均高于成鱼急性毒性实验【_ 7 0 1 ，而且可以减少实验 动物的数量。因此斑马鱼胚胎毒性技术对测定符合污染物毒性并分析毒物的致畸 效应方面有很好的发展前景，对解决我国目前污水监测和控制等问题有重要的指 导和实践价值。 此外，斑马鱼胚胎透明，从完整的活体可观察到所有内部器官和结构，避 免了杀死或解剖动物，从而可多角度观察动力学过程。特别是斑马鱼胚胎与癌细 胞的相似性，快速分裂的细胞、细胞凋亡速度延缓和旺盛的血管生成等【6 2 1 ，而且 斑马鱼胚胎对药物十分敏剧6 9 】，实验毒性指标敏感度均高于成鱼急性毒性实验， 可以减少实验动物的数量。因此斑马鱼胚胎作为实验室药物生物毒性研究的模式 1 4 铜锌- 生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 生物具有非常广阔的前景。 1 3 本文的研究目标和内容 本文的研究目标旨在合成新型的过渡金属配合物，并通过多种方法研究其生 物活性，设计合成具有高生物活性的过渡金属配合物，为研发潜在的高效低毒的 金属配合物类药物积累基本的实验数据和参考方法。 主要研究内容包括： ( 1 ) 设计合成了一种新的锌色氨酸邻菲哕啉混配配合物 z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 c l 7 h 2 0 ，通过元素分析、红外光谱、电导及热重一差热分析对其 进行表征，推测该配合物中z n ( i i ) 的配位数为五，为四方锥构型。 ( 2 ) 通过电子吸收光谱法，荧光光谱法和琼脂糖凝胶电泳法研究了三种锌配合物 和两种铜配合物与d n a 作用机理及切割活性，用斑马鱼胚胎作为生物模型研究 了它们的生物毒性。 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 1 6 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 2 实验部分 2 1 实验用仪器及试剂 ( 1 ) f - 4 5 0 0 荧光分光光度计( h i t a c h i ，j a p a n ) ： ( 2 ) n i c o l e t38 0f t - i r 傅立叶变换红外光谱仪( t h e r m of i s h e rs c i e n t i f i ca m e f i c a ) ： ( 3 ) u v - 2 5 5 0 型紫外可见分光光度计( s h i m a d z u ，j a p a n ) ； ( 4 ) z r y - 2 p 型差热分析仪及h c t - 1 型微机差热天平( 北京恒久科学仪器厂) ； ( 5 ) d d s 1 1 a 型电导率仪( 上海理达仪器厂) ； ( 6 ) c x 3 l 型生物显微镜( o l y m p u s ，j a p a n ) ； ( 7 ) b p 3 1 0 分析天平( s a r l o r i u s ，g e r m a n y ) ； ( 8 ) d d y - 8 c 型电泳仪( 北京市六一仪器厂) ； ( 9 ) b 5 4 5 熔点测定仪( b u c h i ，s w i t z e r l a n d ) ； ( 1 0 ) p h s 3 dp h 计( 上海精科科技仪器有限公司) ； ( 1 1 ) l d z x 5 0 k b s 立式压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗器械厂) ； ( 1 2 ) h h s 恒温水浴锅( 江苏国胜实验仪器厂) ； ( 1 3 ) s h b i i i 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ； ( 1 4 ) 1 0 1 0 电热恒温鼓风干燥箱( 上海跃进医疗器械厂) ； ( 1 5 ) 7 8 h w - 1 型恒温磁力搅拌器( 杭州仪表电机厂) 。 ( 1 6 ) 鲑鱼精d n a ( 生化试剂，s i g m a 公司，其纯度用u v 谱检测，彳2 6 枷2 8 0 1 8 ， 浓度用2 6 0n l - n 处的摩尔消光值检测( = 6 6 0 0m o l - i c m j ) ( 1 7 ) p b r 3 2 2d n a ( 生化试剂，广州东盛生物科技有限公司) ( 1 8 ) 琼脂糖凝胶( b i o w e s ta g r o s e 基因科技有限公司分装) ( 1 9 ) l 色氨酸( 生化试剂，层析纯，中国科学院上海生物化学研究所) ( 2 0 ) 溴化乙锭( 生化试剂，美国a 1 t i i e s c o 公司) ( 2 1 ) 抗坏血酸( 分析纯，s i g m a 公司) ( 2 2 ) 邻菲哕啉( 分析纯；天津市天新精细化工丌发中心) ( 2 3 ) 司帕沙星( 分析纯；北京莱瑞森医药科技有限公司) ( 2 4 ) 三羟基氨基甲烷以及其它试剂均为国产分析纯 铜锌生命配体配合物的合成及其与d n a 的作用和生物毒性研究 ( 2 5 ) t f i s - n a c l 缓冲液( p u7 4 0 ，p h7 6 0 ) ；分析实验用水为二次水 2 2 铜锌一生命配体配合物的合成 ( 1 ) 【z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 】c 1 7 h 2 0 的合成 将z n c l 2 ( 1m m o l ，1 3 6r a g ) ，邻菲哕啉( 2m m o l ，9 6r a g ) 分别溶于1 0m l 蒸馏 水和乙醇( v v = i ：1 ) 混合液中，得无色透明溶液。将色氨酸( 2m m o l ，4 0 8m g ) 溶于1 0m l 蒸馏水中，滴加n a o h ( 2t o o l l ) 溶液至完全溶解，溶液p h 为1 2 ， 用h c i ( 1 5m o l l ) 调p h 为1 0 。在室温下，将邻菲哕啉溶液滴加至z n c l 2 溶 液中，同时不断搅拌，溶液无明显反应现象，加热回流2 小时，溶液呈浅澄 色。将色氨酸溶液滴加入上述溶液中，得浅棕黄溶液，加热回流4 小时后停 止加热和搅拌，静置约一周后析出黄色晶体，抽滤并依次用蒸馏水、乙醇洗 涤各两遍，产量为4 2 6m g ，收率为2 5 8 。【z n ( t r p ) ( p h e n ) 2 c 1 7 h 2 0 ( 膨旷7 8 9 ) 的元素分析结果如下( 括号内数据为计算值) ：c ：5 2 9 6 ( 5 3 2 3 ) ，h ： 1 0 6 7 ( 1 0 6 5 ) ，n ：5 1 9 ( 5 1 9 ) 。熔点：1 7 3 。产物溶解性：溶于水、无水乙 醇、无水甲醇和d m s o ，难溶于丙酮和乙酸乙酯。 ( 2 ) z n ( p h e n ) 2 c 1 2 5 h 2 0 的合成 将z n c l 2 ( 1m m o l ，1 3 6m g ) ，邻菲哕啉( 1m m o l ，1 9 8r a g ) 分别溶于1 0m l 蒸 馏水和乙醇( 刀胪1 ：1 ) 混合液中，均得无色透明溶液。在室温下，将邻菲哕啉 溶液滴加到z n c l 2 溶液中，同时不断搅拌，溶液无明显反应现象，加热回流 约2 小时后反应液显浅橙黄色，继续回流两小时，停止加热，静置，第二天 析出浅黄色棱柱状晶体，产量为1 4 6m g ，收率4 6 2 。 【z n ( p h e n ) 2 c 1 2 5 h 2 0 咿5 8 6 ) 1 拘分析结果如下( 括号内数据为计算值) ：c ： 4 9 5 9 ( 5 0 o o ) ，h ：9 6 0 ( 9 7 2 ) ，n - 4 2 5 ( 4 5 1 ) 。熔点：3 2 6 。产物溶解性： 溶于水、无水甲醇，难溶于无水乙醇、丙酮、d m s o 和乙酸乙酯。 ( 3 ) z n ( p h e n ) c 1 2 的合成： 将z n c l 2 ( 1m m o l ，1 3 6r a g ) ，邻菲哕啉(