（细胞生物学专业论文）大白菜phk4基因的功能分析.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致 谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示 和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：熟 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁 师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容 相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：盏坠指导教师签名： 刁叼。以乡 签名日期：沙，口年歹月弓日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 双组分信号系统是真核细胞和原核细胞感受并传递环境信号刺激的重要途径。近年 来对模式植物拟南芥双组分信号系统的研究取得了重要的进展。研究表明双组分信号系 统参与植物对激素( 乙烯、细胞分裂素) 的应答、渗透反应以及光信号的转导和传递。 细胞分裂素在植物的生长和发育过程中参与调控各种各样的生理过程，如促进细胞 分裂和芽的分化，抑制主根的伸长，调控顶端优势，促进维管束的形成、花朵和果实的 发育以及花青素的合成，参与雌配子形成、胚的发育、叶绿体的形成、胁迫反应和病原 抵抗以及延缓开花时间、叶片衰老等。 植物细胞分裂素受体属于组氨酸蛋白激酶家族，是植物双组分信号系统的组分。对 拟南芥的研究发现了a h k 2 、a h k 3 和a h k 4 c r e l w o l 作为细胞分裂素受体而存在， 能够与细胞分裂素结合进行信号转导。a h k 2 和a h k 3 在拟南芥的根、茎、叶和花中均 有表达，a h k 4 主要在根中表达。c r e l j 突变体在细胞分裂，种子萌发以及芽的形成等 方面表现出对细胞分裂素应答的缺陷。w o l 突变体则在根的维管束系统表现出对细胞分 裂素应答的缺陷。在酵母表达系统中，保守的h i s 和a s p 残基突变体会失去依赖细胞分 裂素生长的特性，而c r e l i a h k 4 基因能够使酵母h i s 激酶突变体在有细胞分裂素存在 的情况下恢复生长。拟南芥中，c r e l a h k 4 w o l 的表达会提高其对t - z e a t i n 的结合能 力。 大白菜与拟南芥同为十字花科植物，但其基因组测序结果尚不完整。论文作者所在 实验室已从大白菜中分离得到了长为3 1 5 6 b p 的e d n a 序列，该序列与拟南芥a h k 4 基 因同源，命名为删。 酵母突变体t m l 8 2 是一个组氨酸激酶基因缺失的突变体，该突变在特定培养基上 是致死性的。本文将大白菜p h k 4 基因转入酵母突变体t m l 8 2 并对拟南芥口j j l 解一j 突变 体进行了转化研究，旨在通过功能互补分析验证p h k 4 的基因功能。主要研究结果如下： 1 构建了酵母表达载体p c u y 3 1 5 p h k 4 ，将其导入酵母突变菌株t m l 8 2 中，经 细胞分裂素刺激，突变菌株恢复生长，初步验证p h k 4 具有细胞分裂素受体功能。 2 构建了植物过表达载体p 1 3 0 0 3 5 s i p h k 4 ，冻融法导入根癌农杆菌g v 3 1 0 i ，获 得工程菌g v 3 1 0 1 p 1 3 0 0 3 5 s i p h k 4 。对拟南芥突变体口j l l 觯j 的转化研究仍在进行中。 关键词：细胞分裂素受体；p h k 4 基因；酵母功能互补分析 f u n c t i o na n a l y s i so fp h k 4o e n ef r o mc h i n e s ec a b b a g e a b s tr a e t t w o c o m p o n e n ts i g n a l i n gs y s t e mi s a l l i m p o r t a n tw a yt o s e n s ea n dt r a n s m i tt h e e n v i r o n m e n t a ls i g n a l si np r o k a r y o t i ca n de u k a r y o t i ec e l l s i n r e c e n ty e a r s ，i m p o r t a n t p r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d ei n s t u d i e so nt h ec o m p o s i t i o n sa n df u n c t i o n so ft h ep l a n t t w o c o m p o n e n ts i g n a l i n gs y s t e m s t u d yr e s u l t ss h o wt h a tt w o - c o m p o n e n ts i g n a l i n gs y s t e m s a r ei n v o l v e di nt r a n s d u c t i o na n dt r a n s m i s s i o no fs i g n a l so fp l a n th o r m o n e ( e t h y l e n e ， c y t o k i n i n ) ，o s m o s i sa n dl i g h t c y t o k i n i n sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rt 1 1 ed e v e l o p m e n ta n dg r o w t ho fp l a n t s t h e yt a k ep a r t i nt h er e g u l a t i o no fv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si np l a n t s ，s u c ha sp r o m o t i n gc e l ld i v i s i o n a n db u dd i f f e r e n t i a t i o n ；i n h i b i t i n gr o o te l o n g a t i o n ；r e g u l a t i n ga p i c a ld o m i n a n c e ；p r o m o t i n g t h ef o r m a t i o no fv a s c u l a rb u n d l e s ，t h ed e v d o p m e n to ff l o w e r sa n df r u i t s ，a n dt h ep r o d u c t i o n o fa n t h o c y a n i n ；p a r t i c i p a t i n gi ng a m e t ec e l l a n de m b r y od e v e l o p m e n t ，b i o s y n t h e s i so f c h l o r o p l a s t , s t r e s s r e s p o n s ea n dp a t h o g e nr e s i s t a n c e ；d e l a y i n g b l o s s o mt i m ea n dl e a f s e n e s c e r f l c e ，a n ds oo n t h ec o l ( i n i i lr e c e p t o r sb e l o n gt ot h ef a m i l yo fh i s t i d i n ep r o t e i nk i n a s e s ，t h e ya r e e l e m e n t so ft w o c o m p o n e n ts i g n a l i n gs y s t e m s t u d i e so nt h ea r a b i d o p s i ss h o w e dt h a t 削h l q ， a h 硒a n da h k 4 c r el 侧o la r et h ec y t o k i n i nr e c e p t o r s ，w h i c ha r ei n v o l v e di nc o m b i n i n g w i t hc 0 k i 血sa n dt r a n s m i t t i n gt h es i g n a l si n t ot h ec e l l s a h k 2a n da h k 3e x p r e s si nt h e r o o t s ，l e a v e s ，s t e m sa n df l o w e r s a h k 4e x p r e s s e sm a i n l yi nt h er o o t s t h ec r e i 一m u t a n t s s h o w e dal a c ko fc y t 0 1 ( i n i nr e s p o n s e s ，s u c ha sc e l lp r o l i f e r a t i o n ，g r e e n i n ga n ds h o o tf o r m a t i o n t h ew o lm u t a n t sd i s p l a yd e f e c t si nt h er o o tv a s c u l a rs y s t e m i ny e a s te x p r e s s i o ns y s t e m s , t l a e c o n s e r r e dh i sa n da s pm u t a n t sa b o l i s hac y t o l 【i n i n d e p e n d e n tg r o w t h ，w h i l et l l ec 尬j 删 c o m p l e m e n tt h ey e a s tm u t a n t st h a tl a c kt h ee n d o g e n o u sh i sp r o t e i n 虹n a s ea n dr e s t o r 也e a b i l i t y t o g r o w i nac y t o k i n i n d e p e n d e n tm a n n e r i n a r a b i d o p s i s ，e x p r e s s m n o f a h k 4 7 c r elf w o le n h a n c e db i n d i n go ft z e a t i n b o t hc h i n e s ec a b b a g ea n da r a b i d o p s i sa r eo fe r u c i f e r o u sp l a n t s ，b u tt h eg e n o m eo f c h i n e s ec a b b a g eh a sn o tb e e nc o m p l e t l ys e q u e n c e d o u rl a bi s o l a t e dt h ep h k 4g e n ew h i c h i s h o m o l o g o u sw i t ha h k 4 百h i s o l a t e de d n as e q u e n c eo tp h k 4i s315 6 b p ht h i sp a p e r 、心碥p h k 4g e n ew a st r a n s f e r r e di n t ot h ey e a s tm u t a n tt m l8 2a n dt h e t r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i sa h k 4m u t a n tw a sc o n d u c t e di no r d e rt oc o n f i r mt h ef u n c t i o n o tp h k 4 t h ef u n c t i o nc o m p l e m e n te x p e r i m e n t s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ey e a s te x p r e s s i o nv e c t o rp c u y 315 一p h k 4w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e r r e di n t o i i 辽宁师范大学硕士学位论文 t m l 8 2 u n d e rt h es t i m u l a t i o no fc y t o k i n i n t h el o s s 。o f - f u n t i o nm u t a n tt m l8 2w h i c hi s 、e t h a l o i lg l u c o s em e d i u mc o u l dr e s t o r eg r o w t h t h i sp r e l i m i n a r ys h o w e dt h a t 尸删f u n t i o n sa sa r e c e p t o rf o rc y t o k i n i n 2 t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp l3 0 0 3 5 s i p h k 4w a sc o n s t r u c t e da n d 仃a n s f e r r e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i ng v 3 101 s t u d i e so nt 1 1 et r a n s f o r m a t i o no f 口 ：4 1m u t a n t a r e u n d e r t h e w a y k e y w o r d s ： c y t o k i n i nr e c e p t o r ；p h k 4 ；y e a s tf u n t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o na n a l y s i s i i i 大白菜p h k 4 基因的功能分析 目录 摘要。：i a b s t r a c t i i 1l 者论1 1 1 双组分信号系统概述1 1 1 1 双组分信号系统的特征。2 1 2 高等植物的双组分信号系统4 1 2 1 细胞分裂素信号途径4 1 2 2 乙烯的信号转导5 1 2 3 光敏色素的作用与双组分信号系统5 1 3 细胞分裂素信号转导系统5 1 4 植物基因功能的研究方法7 1 4 1r n 加技术7 1 4 2 基因打靶技术8 1 4 3 基因捕获技术1 0 1 4 4 基因芯片技术1 0 1 4 5 生物信息学1 1 1 5 酵母表达系统1 1 1 6 实验目的和意义1 2 2 1 实验材料13 2 1 1 材料1 3 2 1 2 实验试剂和药品1 3 2 1 3 菌株13 2 1 4p c r 引物13 2 1 5 主要仪器设备1 3 2 2 实验方法1 4 2 2 1p h k 4 基因的克隆14 2 2 1 1 引物设计1 4 2 2 。1 2 目的片段的扩增14 2 2 1 3 目的片段的回收1 5 2 2 1 4 连接16 2 2 1 5 转化1 6 辽宁师范大学硕士学位论文 2 2 1 6 质粒的碱法提取1 6 2 2 1 7 质粒的限制性内切核酸酶检测1 7 2 2 1 8 测序分析18 2 2 2p h k 4 基因酵母表达载体构建18 2 2 2 1 酵母表达载体的扩增1 8 2 2 2 2 p m d l 9 t 3 k ( n o ti - s p e ，) 和酵母表达载体p c u y 3 1 5 质粒d n a 的提取 18 2 2 2 3p m d l 9 - t 一3 k ( n o ti - s p e ，) 和酵母表达载体p c u y 3 1 5 质粒d n a 的酶切 18 2 2 2 4 连接及转化19 2 2 3p h k 4 基因过表达载体构建1 9 2 2 3 1 p m d l 9 - t - 3 k ( b 9 1 i s p e ，) 和过表达载体p 1 3 0 0 3 5 s i 质粒d n a 的提取 19 2 2 3 2p m d l 9 - t - 3 k ( b g ti - s p e ，) 和过表达载体p 1 3 0 0 3 5 s i 质粒d n a 的酶切2 0 2 2 3 3 连接及转化一2 0 2 3 结果与分析2 2 2 3 1 删基因的克隆2 2 2 3 2 酵母表达载体的扩增2 2 2 3 3p h k 4 基因酵母表达载体构建2 3 2 3 4p h k 4 基因过表达载体构建2 3 2 4 小结2 4 3 1 实验材料2 7 3 1 1 植物材料2 7 3 1 2 菌种：2 7 3 1 3 试剂2 7 3 1 4 培养基2 8 3 1 5 仪器设备2 8 3 2 实验方法2 8 3 2 1p h k 4 基因转化酵母菌株的研究2 8 3 2 1 1 质粒p c u y 3 15 p h k 4 的提取2 8 3 2 1 2 氨基酸溶剂配制2 8 3 2 1 3s c u r a 、l e u 培养基的配制2 8 v 一 大白菜p h k 4 基因的功能分析 3 2 1 4 酵母感受态制备及转化2 9 3 2 2p h k 4 基因转化拟南芥突变体的研究3 0 3 2 2 1 工程菌的构建一3 0 3 2 2 1 1 质粒p 13 0 0 3 5 s i p h k 4 的提取3 0 3 2 2 1 2 根癌农杆菌感受态细胞的制备3 0 3 2 2 1 3 冻融法转化一3 0 3 2 2 1 4 阳性菌落的检测3 0 3 2 2 2 1 拟南芥播种- 31 3 2 2 2 2 转化用拟南芥突变体根部的预培养31 3 2 2 2 3 农杆菌的培养3 1 3 2 2 2 4 浸染31 3 2 2 2 5 抗性植株的筛选。31 3 3 结果与分析31 3 3 1p h k 4 基因转化酵母菌株的研究3 l 3 3 2p h k 4 基因转化拟南芥突变体的研究3 2 3 3 2 1 工程菌的构建3 2 3 3 2 2 拟南芥转化3 2 4 讨论3 4 4 1 表达载体的构建3 4 4 2 酵母感受态的制备3 4 4 3 叶盘转化法3 4 结论。3 5 参考文献3 6 附录a 附录内容名称3 9 附录b 附录内容名称4 0 攻读硕士学位期间发表学术论文情况。4 1 致谢4 2 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 大白菜英文名为c h i n e s ec a b b a g e ，双子叶植物，白花菜目，十字花科，芸苔属，单 叶，总状分序，花黄色，花瓣排成十字形，草本。 芸苔属是日常生活中主要的蔬菜来源，如大白菜、甘蓝( b o l e r a c e av a t c a p i t a t al ) 、 花椰菜( 曰o l e r a c e av a r b o t r y t i sl ) 、油菜( b c h i n e n s i sl ) 、芥菜( b j u n c e al c z e r n e t c o s s ) 雪里红、青菜等【l 】。十字花科在世界各地广泛分布，主要产于北温带，尤其是地 中海地区。芸苔属和萝卜属是我国主要蔬菜和油料作物，一年生至多年生草本，少数为 灌木或乔木。本科植物包括模式植物拟南芥，以及一些药用植物和观赏植物，如荠菜， 大青，独行菜等可入药，桂竹香，紫罗兰，羽衣甘蓝等可用作观赏【2 】。 十字花科植物在人们的生活中是极其重要的蔬菜，有重要的经济价值，其中模式植 物拟南芥的分子生物学成果为其他物种的研究奠定了基础。 植物在生长和发育过程中会受到各种环境条件变化的影响，如营养供应，光照，酸 度，渗透压，温度等等。植物为了生存必须对这些变化作出相应的反应。在大多数情况 下，这种反应是通过应答各种各样的信号来完成的【3 】。 蛋白质磷酸化和蛋白质去磷酸化是原核生物和真核生物调节细胞内信号转导的重 要机制，此过程由蛋白磷酸激酶催化完成。根据磷酸化的底物的特异性不同，将蛋白激 酶分为三类：s e r t h r 激酶，t y r 激酶，h i s 激酶【4 】。其中h i s 激酶作为双组分信号系统的主 要元件，双组分信号系统通过h i s 激酶接受外界的相关信号，经过一系列的磷酸级联反 应进行信号转导调节植物生长发育的各个过程。 1 1 双组分信号系统概述 双组分信号系统( t c s ，t w o c o m p o n e n ts y s t e m ) 分为简单的t c s 和杂合的t c s 两种类 型( 图1 1 ) 1 5 】。简单的t c s 包括用于感应输入信号的感应h i s 蛋白激酶即感应器( h k ) ， 和用于调节输出信号的应答调控器( 1 汰) 。感应器通常位于细胞质膜【6 】，用于感应外界 环境信号刺激，自身磷酸化其h i s 残基，然后将磷酸基团转移到应答调控器的a s p 残基 上，通过这种h i s a s p 磷酸化传递来激活下游特异的信号输出 7 - 9 。杂合型t c s 由三部 分组成，分别为同时含有h i s 激酶和接受结构域的杂合感应激酶，含h i s 的磷酸转移蛋 白( h p t ) ，和应答调控器。h p t 在杂合感应器和应答调控器间进行磷酸传递，磷酸基团 通过h i s a s p h i s a s p 传递，丰富了信号转导的途径。在真核生物中，如酵母、植物， 大多采用的是杂合的t c s 7 , 9 】。现已在拟南芥中发现了5 5 种与双组分信号系统相关的蛋 大白菜p h k 4 基因的功能分析 白，其中有1 7 种杂合感应激酶( 包括感应激酶) ，6 种磷酸转移蛋白( a h p ) 和3 2 种 应答调控器( a r r ) 【7 ，l o 】( 如图1 1 所示) 。 一 、 a b | n p u t t r a n s m , t l e rm c e i v e r o u t 0 0 t d a l l a h d o m a hd o m a hd o m a h 晡s a d i n ek i n a s e r e s p o n s er e g u l a t o r 盯pp h r d f m a h 图1 1a 为简单的双组分系统，由感受器h i s 激酶和应答调控器两部分组成，其中h 为h i s 残 基，d 为天冬氨酸残基：b 为杂合的双组分系统，由杂合型h i s 激酶，含h i s 的磷酸转移蛋白和应答 调控器三部分组成( 引自j o s e p hj k i e b e r , 2 0 0 2 ) 。 f i g 1 1c a r t o o nr e p r e s e n t a t i o n so ft w o - c o m p o n e n tp h o s p h o t r a n s f e rs c h e m e s ( c i t i n g 鼢j o s e p hj k i e b e r 2 0 0 2 ) 1 1 1 双组分信号系统的特征 双组分信号系统的实质是一个磷酸转移的过程，即感应器的输入结构域与外界信号 结合，使h i s 激酶的h i s 自动磷酸化，随之将磷酸转移到h p t 上，进而传递给r r 的a s p 残基。有些r r 是转录因子，其输出结构域与d n a 结合，调节目的基因的活性；有些 r r 则与转录无关，仅仅作为信号传递过程的一个元件，将外界信号向下传递。 ( 1 ) h k 将拟南芥的1 7 种h i s 激酶进行序列分析后将其分为三个家族，即乙烯受体家族， 光敏色素家族以及a h k 家族。其中a h k 家族又分为细胞分裂素受体和渗透感应受体 两个部分。典型的h i ( 具有5 个保守的模块区，即h 、n 、g 1 、g 2 、f 。其中保守的 吾卜1 弋一 辽宁师范大学硕士学位论文 h i s 是h 模块的重要特征，这五个模块区对h k 的活性是非常重要的，但这五个模块区 并不是在每一个h k 中都保守存在的，如乙烯受体家族的e t r 2 和e r s 2 以及所有的光 敏色素受体均没有这五个模块区，也不起h i s 激酶的作用。乙烯受体e i n 4 仅含有h 区 而无其它四个模块区，除此之外其它的成员均具有h i s 激酶的活性【4 】。 a h k 家族由a t h k l 、a h k 2 、a h k 3 、a h k 4 ( c r e l w o l ) 、a h k s ( c r d 2 ) ，以及 c k l l 组成，此家族各蛋白的氨基酸相似度达3 8 6 9 。最近分子生物学提供有力的证 据表明a h k 2 ，3 和4 作为细胞分裂素受体起作用【l o 】。c r e l j 的突变体在细胞分裂、萌 发以及芽的形成等方面表现出对细胞分裂素应答的缺科1 1 l ；w o l 突变体则在根的维管束 系统表现出对细胞分裂素应答的缺吲1 2 】。在酵母表达系统中，保守的h i s 和a s p 残基突 变体会失去依赖细胞分裂素生长的特性，而c r e l a h k 4 基因能够使酵母h i s 激酶突变 体在有细胞分裂素存在的情况下恢复生长【1 1 , 1 3 】。拟南芥中，在有t - z e a t i n 存在的情况下， c r e l a h k 4 w o l 的表达量会提耐1 4 】。 ( 2 ) h p t 含有h i s 的磷酸转移蛋白( h p t ) 是杂合的双组分信号系统的重要元件，在拟南芥 中已经发现5 种h p t ，即a h p l 、a h p 2 、a h p 3 、a h p 4 、a h p 5 1 4 】。h p t 存在于植物细胞 的细胞质和细胞核内，能在这两个区域内发挥生理作用，而且h p t 还能在细胞质和细胞 核之间进行穿梭。感应器h i s 激酶存在于细胞膜上，而应答调控器则定位于细胞核中， 因此信号在感应器与调控器之间的传递产生了隔膜，另外有些h i s 激酶不能直接与应答 调控器相互作用，h p t 蛋白便起到桥梁的作用来传递他们之间的信掣b 】。 h p t 含有高度保守的x h q x k g s s x s 模块区，对拟南芥基因组的进一步研究发现， 还存在第六个h p t 蛋白，即a h p 6 a p h p l ，它与其它a h p 蛋白的不同之处在于它的保 守h i s 残基被a s n 取代【l 们。 ( 3 ) r r 根据对蛋白结构和氨基酸序列的分析，将3 2 种应答调控器分为三类：即a 型应答 调控器( a t y p ea r r s ) 、b 型应答调控器( b t y p ea r r s ) 、和拟应答调控器【4 j 。 a 型应答调控器 a 型应答调控器由一个接受结构域和一个较短的输出结构域组成。它的接受结构域 的氨基酸序列具有5 0 9 3 的一致性，但是与b 型应答调控器差别极大，还不到3 0 【l 0 1 。 a 型应答调控器主要是细胞分裂素的反应基因，并且可能会参与细胞分裂素的相关信号 通路。 b 型应答调控器 大白菜p h k 4 基因的功能分析 在拟南芥中共发现了1 2 种b 型a r r s ，它们都含有保守的g a r p 模块区，能够与 d n a 结合，起到转录因子的作用，除了a r r 2 3 以外，其它b 型应答调控器的接受区的 氨基酸相似性达3 0 7 2 。b 型应答调控器的n 端含有一个接受结构域以及一个大的c 端输出结构域【10 1 。研究发现，a r r 2 能够特异的与植物n c l 基因的保守启动子相结合【1 7 1 ， a r r l l 的c 端结构域与g a l 4 的d n a 结合结构域连接后，能够激活该基因的转录【1 6 1 ， 存在于a r r l 和a r r 2 的c 端结构域的核算定位信号v 1 ( 腿) r 也说明了b 型a r r s 可能是转录调控因子【l 训。 拟应答调控器( a p r r s ) 对拟南芥基因组的进一步研究发现有9 个基因编码了a p r r s 蛋白，即 a p r r l a p r r 9 i l 引。a p r r 的接收区与a r r l 的接收区一致性达3 0 3 6 ，但接收区中 用于结合磷酸的a s p 残基被g l u 、a s h 或者g i n 所取代，但是许多a p r r s 仍在其保守的 模块区含有a s p 残基，并且在双组分信号的磷酸转移过程中仍能起到输出最终信号的作 用【1 0 1 。现在研究发现拟应答调控器可能会作为生物钟发挥功能【1 8 】。 1 2 高等植物的双组分信号系统 1 2 1 细胞分裂素信号途径 细胞分裂素( c t k ) 参与植物生长发育的许多生理过程，如细胞的分裂、芽分化的 诱导、叶片衰老的延缓等【2 0 】。近年来发现了c r e l 基因，它编码一种h i s 蛋白激酶，此 激酶n 端具有与细胞分裂素结合的结构域【2 1 1 。拟南芥e r e l 突变体表现出了不依赖细胞 分裂素的生理反应，在拟南芥的原生质体中也证明了c r e l 基因编码细胞分裂素受体。 在激酶缺失的酵母突变体中，用拟南芥的c r e l 基因来恢复酵母突变体，结果表现出当 细胞分裂素存在时能使酵母突变体恢复突变。这些研究说明：1 c r e 能与细胞分裂素 结合；2 细胞分裂素与c r e l 结合后能够激活c r e 的h i s 蛋白激酶活性；3 在酵母突 变体内，c r e l 能将磷酸转移到h p t 上，从而激发双组分信号系统的级联反应【2 1 1 。c r e l 并不能调节所有的细胞分裂素反应，在拟南芥中还发现了其它的细胞分裂素受体，如 c k l l l 2 2 ，a h k 2 ，a h k 3 等【2 3 1 。 拟南芥应答调控器( a r r s ) 分为a 型和b 型，a r r l 与a r r 2 为b 型a r r ，它们 参与细胞分裂素信号转导。当a r r l 发生突变，则会表现出对细胞分裂素的不敏感，而 a r t l 的过量表达则会引起对细胞分裂素的超敏感，即a 型a r r 的a r r l 突变体和超表达 系统会引起细胞分裂素应答的变化。研究拟南芥的叶肉原生质体发现：b 型a r r 能调 控细胞分裂素诱导的a 型a r r 的表达【2 4 】。根据研究有人推测出了细胞分裂素的作用模 式：细胞分裂素与h i s 激酶结合( 如c r e l ) 激发了双组分信号系统，使磷酸开始转移， 辽宁师范大学硕士学位论文 从h k 转移到了h p t ，使b 型a r r 磷酸化，激活b 型a r r ，进而激活a 型a r r 的转 录活性。a 型a r r 与b 型a r r 可能一起或者分别与各种蛋白相互作用，引起细胞分裂 素在细胞中的各种应答【2 5 1 。 1 2 2 乙烯的信号转导 乙烯是对植物生长发育很重要的植物激素，调节着植物生长发育的不同阶段，如花 的形成、种子萌发、叶片脱落、性别分化、以及诱导成熟等瞰】。 通过对拟南芥乙烯信号转导系统的研究，已经发现了五种乙烯受体，其中e r s l 与 e r s 2 为h i s 激酶，e t r l 、e t r 2 和e i n 4 为杂合激酶【l 纠。e t r l 是最早被鉴定且研究最 清楚的乙烯受体【2 6 】。它是跨膜蛋白，其n 端位于膜的外则，具有3 个跨膜片段，乙烯 的结合位点即在此跨膜结构域内，c 端则定位于细胞质。e t r l 通过半胱氨酸之间的二 硫键形成二聚体，能自身磷酸化，参与乙烯作用【27 1 。当二聚体与乙烯结合，c 端的h i s 激酶结构域便自身磷酸化其h i s 残基，将磷酸基团转移至e t r l 自身的接受结构域的a s p 残基上。当e t r l 未结合乙烯时，就与胞质中的c t r l 作用，引发m a p k 级联反应，抑 制下游e i n 2 。c t r l 与r a s 相类似，具有相同的s e r t h r 结构，可能引发m a p k 级联 反应。当e t r l 与乙烯结合后，e t r l 发生磷酸化，不能再与c t r l 发生作用，于是使 e i n l 激活，从而激活下游转录因子，将信号传递到核内引起乙烯应答，产生生理反应【4 】。 1 2 3 光敏色素的作用与双组分信号系统 植物通过光受体来应答光信号进而调节其生长发育。在拟南芥中，已经发现了5 种 光敏色素受体，即p h y a 、p r y b 、p h y c 、p h y d 和p h y e 。研究发现，植物光敏色素 与细菌h i s 激酶的序列相似性说明高等植物的光敏色素可能是h i s 激酶，并且能够利用 光信号进行磷酸转移【2 4 】。 植物光敏色素与感应器h i s 激酶具有相似的结构，即n 端含有一个感受信号的感应 器，c 端含有h i s 激酶结构域。对p h y b 突变体的研究发现，h i s 激酶结构域对p h y b 信 号传递至关重要，但去除这个结构域对p h y b 的活性并无影响【2 9 1 。通过酵母双杂交实验， 发现了拟南芥中与p h y a 作用的一种底物p k s l ( 碱性可溶性蛋白) ，这表明植物光敏 色素可能由古老的h i s 激酶演化为s e r t h r 蛋白激酶【2 引。 1 3 细胞分裂素信号转导系统 植物细胞中的细胞分裂素在植物生长发育的各阶段都起着极其重要的作用。近年来 对拟南芥的细胞分裂素信号通路做了大量的研究【3 0 3 5 1 ，首先发现了c g 基因，c k 编码 了一个与双组分信号系统相关的h i s 激酶。推测c k l l 在此信号通路中作为一个细胞分 大白菜p h k 4 基因的功能分析 裂素受体存在【3 9 j 。c r e l ( a h k 4 ) 编码了一个具有一个感应结构域和两个应答调控结 构域的杂合h i s 激酶m 】。c r e i 以及a h k 2 ，a h k 3 都是拟南芥h i s 激酶家族的成员， 它们都具有细胞分裂素受体的功能【4 l 】，研究发现，c r e l 在根中作为细胞分裂素受体起 作用m 。 细胞分裂素受体通过h p t s 进行多步磷酸传递，将细胞分裂素信号传递到细胞核中 【4 2 】。拟南芥中的a h p 2 过量表达对植物的生长发育无影响，但抑制a h p 2 表达时，细胞 分裂素对拟南芥根伸长的抑制作用会表现得更加敏感【4 3 1 。除此以外，在对拟南芥原生质 体的研究中发现，当有t - z e a t i n 作用的时候，朋r 尸j ，会被激活m 】。 作用于细胞分裂素的应答调控器( r r s ) 分为两类，即a 型和b 型【3 0 - 3 2 1 。b 型r r s 在c 端具有类似于转录因子的结构域，而a 型则没有。b 型r r s 能激活目的基因，作为激 活因子作用于基因表达。a 型r r s 的一部分仅仅作为应答调控器，而另一部分则有可能 作为激活因子，例如拟南芥中的a r r 4 7 ( a 型a r r s ) 在细胞分裂素的作用下能够激 活目的基因表达m 】。拟南芥基因组编码了多种r r ，其中有1 0 种a 型r r s 以及1 1 1 2 种的b 型r r s 3 0 m 】，大量的r r 基因说明了r r 功能和作用位点的多样性4 5 1 ，从而推测 出细胞分裂素信号是通过特异的h p t 和与其相对应的r r 进行传递的，并且通过一些信 号途径的交叉对目的基因进行调控【4 l 】( 如图1 2 所示) 。 k 3 ，? 质膜 翻l 胞咳 。j ri a 型a r r 匝一p h y bl m = p h y b l p r ) 图1 2 细胞分裂素信号传导途径( 引自a l e x a n d e rh c y l ，2 0 0 3 ) f i g 1 2c y t o k i n i ns i