（遗传学专业论文）九叶青花椒的起源及遗传多样性研究.pdf

中文摘要 九叶青花椒的起源及遗传多样性研究 遗传学专业硕士研究生徐洁 指导教师邓洪平副教授 摘要 九叶青花椒( z a n t h o x y l u ma l t l l s t u f l lv n o v e m f o l i u s ) 。隶属芸香科( r u t a c e a e ) 花椒属 ( z a n t h o x y l u ml ) ，为竹叶花椒( z a n t h o x y l u ma z t a r u m ) 一变种，最早发现f 重庆江津市， 目前在重庆市、四川及贵州等省市有广泛栽培。该变种具果实清香、麻味纯正、产量高、抗 逆性强等特点，已逐渐成为重庆市部分区县退耕还林的首选树种。 以往对九叶青花椒的研究，主要侧重于出芽育苗、田间管理及丰产技术等方面，而九叶 青花椒的起源及遗传多样性分化背景等方面未见报道，极大地限制了其种质资源的开发和利 用。本文以九叶青花椒、花椒、竹叶花椒为研究材料，采用传统数最分析方法及a n d e r s o n 设 计的。形象化散点图”和“杂种指数法”，结合r a p d 分子标记技术及聚类分析等数值分类学 手段，运用s p s s 、n t s y s - - p c 2 0 2 a 、p o p g e n e 3 2 等计算机软件，从表观形态到分子水平对九 叶青花椒的起源及遗传多样性进行了分析和研究，结论如下： ( 1 ) 无论表观形态还是分子水平的研究，均显示九叶青花椒是竹叶花椒和花椒渗入杂交产 生的杂交复合体，且竹叶花椒对杂交复合体的形成贡献大于花椒，其起源地为重庆江津市。 ( 2 ) 九叶青花椒在营养器官呈现出一定形态分化的同时。生殖器官保持相对稳定。 ( 3 ) 适合九叶青花椒的最佳r a p d 反应程序为：9 4 c 预变性2 m i n ，9 4 3 0 s ，3 7 3 0 s ，7 2 8 0 s 4 0 个循环，最后7 2 l o m i n ；最佳反应体系为2 5 p l ，其中t a q 酶2 u ，d n t p s ( f o r u m ) 0 5 “1 ，d n a5 0 n g ，g i 物l 肛l ( 8 p m o l p 1 ) ，2 5 p l1 0 p c r b u f f c r ( 2 0 m mm g c l 2 ) 。 ( 4 ) 6 2 条随机引物中筛选出1 6 条能扩增出多态性条带的引物，共检测到九叶青花椒居群 1 5 7 个位点，其中多态位点1 3 2 个，多态位点比率为8 4 0 8 ，观察到的等位基因数为1 8 5 ， 有效基因数为1 5 0 。 ( 5 ) 九叶青花椒遗传多样性较为丰富，根据多态位点百分比、s h a n n o n 指数及n e i 的遗传分 化指数估算的4 个九叶青花椒居群遗传多样性由高至低的排列顺序均为c b a d 。在其种下水 平，大部分遗传变异存在于居群内，居群间仅占小部分，有较高水平的基因交流。聚类分析 表明，滔群c 与居群d 遗传距离最近，其次是居群a 与居群b 。 ( 6 ) 九叶青花椒已具有相对独立且稳定的形态特征，形成了不同于花椒及竹叶花椒的分类 群，将其定义为竹叶花椒的变种是科学可行的。 关键词：九叶青花椒渗入杂交起源遗传多样性r a p d 英文摘要 s t u d i e so nt h eo r i n g i na n dg e n e t i c d i v e r s i t yi nz a n t h o x y l u ma r m a t u m 虬 n o v e m f o l i u s m a j o r ：g e n e t i c ss p e c i a l i t y ：e v o l u t i o n a r yg e n e t i c s t u t o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rd e n gh o n g p i n gg r a d u a t e ：x uj i e a bs t r a c t z a n t h o x y l u ma r m a t u mv n o v e m f o l i u sw h i c hb e l o n g s t ot h eg e n u so f z a n t h o x y l u ml i nr u t a c e a ew a sf o u n di nj i a n g j i no fc h o n g q i n g i t sav a r i e t yo f z a n t h o x y l u ma r m a t u ma n di t sm a i n l yp l a n t e di nc h o n g q i n g 、s i c h u a na n dg u i z h o u p r o v i n c e z a r m a t u r ev n o v e m f o l i u ss h o w sap l e a s a n to d o r , f e r t i l i t ya n dh i g h l ys t r e s s r e s i s t a n c e ，w h i c hg r a d u a l l yb e c o m e st h ep r e f e r r e ds p e c i e sf o rc o n v e r s i o no fc r o p l a n d t of o r e s tp r o j e c t ( c c f p ) i np a r t so f c o u n t i e si nc h o n g q i n g a tp r e s e n t r e s e a r c h e so nza r m a t u mv n o v e m f o l i u sm a i n l yf o c u so ni t sb u d d i n g , b r e e d i n g , f e r t i l i t y , e t o i t so r i g i na n dg e n e t i cb a c k g r o u n do fd i v e r s i t yn e v e rb e r e s e a r c h e d ，w h i c hc o n f i n e st h ee x p l o i t a t i o na n du s i n go fi t si d i o p l a s m i cr e s o u r c e t h e r e f o r e i nt h i st h e s i st h ez a r m a t u mv n o v e m f o l i u s ，z b u n g e a n u ma n dz a r m a t u m w e r es e l e c t e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s t h et r a d i t i o n a lh u m e r i c a la n a l y s i s ， r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ) m a k e r st e c h n i q u e s ， a n d e r s o n p i c t o r i a l i z e dp i c t o r i a ls c a t t e rd i a g r a m , i n d e xv a l u e ，c l u s t e ra n a l y s i sa n ds o f t w a r es u c ha ss p s s 、 n t s y s - - p c 2 0 2 a 、p o p g e u e 3 2w e u s e di n t h e t h e s i st os t u d yo nt h eo r i g i na n dg e n e t i c d i v e r s i t yf r o mt h ep h e n o t y p et ot h eg e n o t y p e t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da s f o l l o w i n g s ： ( 1 ) s t u d i e so nm o r p h o l o g i ca n dm o l e c u l a rl e v a lb o t hs h o w e dt h a ti n t r o g r e s s i v e h y b r i d i z a t i o no c c u r r e da m o n g za r m a t u r ea n dz b u n g e a n u m t h ec o m p l i c a t e d p o p u l a t i o n - h y b r i dc o m p l e xi sz a r m a t u mv n o v e m f o l i u s a n dz a r m a t u r ec o n t r i b u t e s m o r et ot h ep o p u l a t i o n - h y b r i dc o m p l e xt h a nz b u n g e a n u m i t so r i g i na r e ai sj i a n g i i ni n c h o n g q i n 1 1 两南大学硕十学何论文 1 ( 2 ) f o rza r m a t u r ev n o v e m f o l i u s m o r em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o ni nt h e n u t r i t i o no r g a na n dt h ep r o d u c t i o no r g a na r er e l a t i v e l ys t e a d y ( 3 ) i nr a p de x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no ff i v ei m p o r t a n tc o m p o n e n t s s u c ha st a qd n a p o l y m e r a s e ，t e m p l a t ed n a ，p r i m e r ( 8 p m o i 0 1 ) ，d n t p ( 1 0 m m ) a n d1 0 p c rb u f f e r ( 2 0 r a mm g c l d i n 2 5 1 a lr a p dr e a c t i o ns y s t e mw e r e2 ：0 u ，5 0 n g ，l 山，0 5 1 1 1 ， 2 5 1 t lr e s p e c t i v e l y t h er e a c t i o np r o g r a mw a sa sf o l l o w s ：p r o - d e n a t u r ea t9 4 f o r2m i n t h e n9 4 f o r3 0 s ，3 7 * ( 2f o r3 0 s7 2 cf o r8 0 s ，f o r4 0c y c l e s ，f i n a l l ye x t e n d e da t7 2 f o r 1 0 m i n ( 4 ) 6 2r a n d o mp r i m e r sw e r eu s e dt os e l e c tt h ep r i m e r st h a tc o u l dp r o d u c e p o l y m o r p h i cb a n d sw i t l lt h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sd n a 6p r i m e r sw e r es e l e c t e d 1 3 7 p o l y m o r p h i cb a n d sw e r eo b t a i n e dw h i c ha c c o u n t sf o r8 4 0 8 a m o n gt o t a l1 5 7b a n d s t h e o b s e r v e d n u m b e r o f a l l e l e s i s l 8 5 a n d t h ee f f e c t i v e n u m b e r o f a l l e l e s i s l 5 0 ( 5 ) b a s e 讨o nt h ep r o p o r t i o no fp o l y m o r p h i cl o c i 、s h a n n o n $ i n d e xa n dn e i s i n d e x ，t h ef o u rz a r m a t u mv n o v e m f o l i u sw e r ea r r a n g e di nt h ed e g r e eo fg e n e t i c d i v e r s i t y ：c b a d a c c o r d i n gt o t h es h a n n o n si n d e xa n dn e i s i n d e x ，g e n e t i c d i v e r s i t yo fz a r m a t u mv n o v e m f o l i u sw a so nr e l a t i v eh i 曲l e v e la n dg e n e t i cv a r i a t i o n m a i n l yd i s t r i b u t e dw i t h i np o p u l a t i o n g e n ef l o w sa r ei nah i g h e rd e g r e e c l u s t e ra n a l y s i s s h o w st h a tt h ef i t t e s td i s t a n c ew a sf o u n db e t w e e np o p u l a t i o naa n dp o p u l a t i o nb ，t h ed i s t a n c e b e t w e e np o p u l a t i o nca n dp o p u l a t i o ndw a st h es e c o n d 2 8i n d i v i d u a l sc l u s t e r e di n t oab u n c h d i s p l a y i n gt h eg e n e t i ch o m o g e n e i t ya r ei nah i g h e rd e g r e e ( 6 ) a tp r e s e n t z a r m a t u mv n o v e m f o l i u sh a sh i so w ns t e a d ym o r p h o l o g i cc h a r a c t e r a n di t sac l a s s i f i e dg r o u pd i f f e r e n tf r o mz a r m a t u ma n dz b u n g e a n u m s o ，i t s s c i e n t i f i c a l l ya n df e a s i b l yt od e s c r i b eza r m a t u mv n o v e m f o l i u s 舾av a r i e t y k e y w o r d s ：z a r m a t u mv n o v e m f o l i u s i n t r o g r e s s i v eh y b r i d i z a t i o n o r i g i n g e n e t i cd i v e r s i t yr a p d i i i 独创性声明 学位论文题目：垫堕南蕉狴量照超选焦垒聋i 垒豳整 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：彳每；苦 签字日期： j 。7 年毕月j 牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：囱不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：稼浩 签字日期：j 。0 7 年净月2 牛日 锄签名：缈渗彳 签字日期；夕7 年乒凡彩日 文献综述 第1 章文献综述 1 1 生物多样性的研究现状和国际热点 生物多样性( b i o l o g i c a ld i v e r s i t yo rb i o d i v e r s i t y ) 是生物及其与环境形成的生 态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，包括数以百万计的动物。植物、 微生物和它们所拥有的基因以及它们与其生存环境形成的复杂的生态系统，是生 命系统的基本特征。 生物多样性包括多个层次或水平：基因、细胞、组织、器官、种群、物种、 群落、生态系统、景观等。每一层次都具有丰富的变化，即都存在着多样性。但 研究较多的主要有遗传多样住、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。遗 传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传 变异。种内多样性是物种以上各水平的多样性的最重要的来源。遗传变异、生活 史特点、种群动态及其遗传结构等决定或影响着一个物种与其它物种及其环境相 互作用的方式，且种内的多样性是一个物种对认为干扰进行成功反应的决定因素。 种内的遗传变异程度也决定其进化的潜势。物种多样性是指生物有机体的复杂多 样化即植物、动物及微生物种类的丰富性，它是人类生存和发展的基础。生态系 统多样性是指生物圈内生境、生物群落和生态过程的多样化及生态系统内生境差 异、生态过程变化的多样性。生境的多样性是生物群落多样性甚至是整个生物多 样性形成的基本条件。生物群落的多样性主要指群落的组成、结构和动态( 包括 演替和波动) 方面的多样化。从物种组成方面研究群落的组织水平或多样化程度 的工作已有较长的历史，方法也比较成熟。景观多样性是近些年由生态学和地理 学结合形成的景观生态学研究的内容。景观多样性是指景观结构、功能和时间变 化方面的多样性，是景观水平上生物组成多样化程度的表征。生物多样性研究的4 个主要层次中，物种多样性和生态系统多样性的研究比较深入，而景观多样性层 次上的研究起步较晚，近年来刚刚受到重视。景观多样性的研究不仅有和于在大 尺度上开展生物多样性的理论研究工作，而且在制定区域规划与管理、评价人类活 动对生物多样性的影响和制定保护生物多样性计划等各方面有重大的意义1 1 3 】。 生物多样性的研究包括了生物多样性的起源、组成、功能、保持和保育。研 究主题由1 9 9 2 年的4 个方面增加到现在的1 0 个领域，包括5 个核心领域纵观该 领域的研究现状可以看出以下7 个方面已成为当静生物多样性研究的热点：生 物多样性的调查、编目及信息系统的建立；人类活动对生物多样性的影响； 生物多样性的生态系统功能；生物多样性的长期动态监测；物种濒危机制及 保护对策的研究；栽培植物与家养动物及其野生近缘的遗传多样性研究；生 物多样性保护技术与对策。此外，遗传修饰生命体释放对环境和人类健康可能产 曲阿人 硕十7 忙论文 生的影响以及外来种效应等也受到幽际社会的广泛关注1 1 4 - 7 1 。 中国是一个生物多样性高丰富度的国家。但由于近代人口猛增，人均自然资 源的数鞋持续下降，加上对自然环境的不合理丌发利用，生态环境f 1 趋恶化，森 林大面积减少，部分动植物和高等真菌濒临灭绝，使得中国成为生物多样性丧失 最严重的地区之一。生态环境的f 1 益退化和生物多样性的严重损失，引起中国各 级政府逐步重视对自然资源和环境的保护。从5 0 年代中期起，即开始颁布一系列 法规以解决中国生物多样性所面i 临的严重问题，使生物多样性的损失保持在最小 程度，以加强生物多样性的保护和永续利用的研究2 ，引。 1 2 植物遗传多样性研究 1 2 1 遗传多样性概念 广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和；狭义上， 是指种内基因的变化，包括同种不同的居群之间或同一种群体内不同个体的遗传 变异【叭。 通常，遗传多样性最直接的表现形式就是遗传变异水平的高低。在自然界， 由于个体生命的有限性，其特定分布格局的居群或居群系统( 宗、亚种、种) 才 是进化的基本单位，故遗传多样性不仅包括遗传变异高低，也包括遗传变异分布 格局，即居群的遗传结构，居群遗传结构上的差异是遗传多样性的一种重要体现， 一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小，也有赖 于遗传变异的居群结构【1 0 】。 1 2 2 遗传多祥性的影响因素 ( 1 ) 繁育系统 繁育系统通常的定义是代表直接影响后代遗传组成的所有性特征，主要包括 植物的花综合特征、花的寿命、花开放式样、自交亲和程度和交配系统，他们结 合传粉者和传粉行为构成了影响生殖后代遗传组成和适合度的主要因素，其中交 配系统是核心。植物的交配系统，指植物种群种远交( 或近交) 所占的比例。它 是影响植物种群遗传多样性最关键的生物因素之一，它既影响种群内的遗传多样 性，也影响着种群间的遗传分化【1 1 l 。交配系统不仅决定了群体未来世代的基因型 频率从而决定了居群遗传结构的式样而且影响到植物群体的有效规模、基因流 和选择等其他因素 j 2 , 1 3 1 。 ( 2 ) 基因流 基因流足指由于迁移和杂交等原因导致一个居群的基因进入另一个居群的基 因库，使接受者的基因频率发生改变【1 0 i 。如果说，自然选择使导致种群分化最主 2 文献综述 要的进化力量，那么基因流则是对抗选择作用的蘑要因素1 “】。一般来说，基凶流 畅通的物种、种群f 1 日j 遗传分化小；反之，种群间遗传分化大f 1 5 1 。基因流主要有花 粉流和种子流。在花粉流中，由于风力和昆虫的作用，可使花粉传播的距离增大， 从而增加居群| 日j 的基因交流，使居群内的遗传多样性变大，居群间的遗传分化减 小。在种子流中，种子的大小、轻重对基因流都有很大的影响，如果种子质量轻， 体积小，则有利于风力和顺水传播，以增加居群间的基因交流；如果借助重力散 布的种子可能不利于居群问的基因流动，会导致明显的遗传分化【1 “。 ( 3 ) 遗传漂变 遗传漂变是指等位基因频率在实际的种群中呈现世代随机波动的现象。遗传 漂变在随机过程中的两个假设，在进化上具有重要的意义【l4 1 。首先，在大种群中， 通过突变产生新等位基因的频率相当低，这种概率波动可以忽略不计，因为等位 基因在许多个体中都会存在，也就是它的频率相当高。而且，新变异的存活也是 一个小概率事件，一个突变体通常无法传递给后裔。一个新产生的中性突变最有 可能面临的命运就是经过少数几代后就从种群中消失，即使是一个选择优势的突 变，它在种群中固定下来的机会也是微乎其微。所以，在这些种群中，等位基因 频率发生较大差异的可能性可以被安全地排除。其次，新突变的频率随着时间的 推移逐渐增大的可能性同样存在，甚至中性突变的频率可以达到一个相当高的水 平，在这种情况下，该突变体在种群中很难会丢失，也就是说，这个突变体可以 在种群中保持相当长时间的多态性【1 4 1 。 在小种群中，这种中性突变体的漂变也会有两个重要的后果。第一，小种群 可能会随着时间的推移达到一种遗传均一性。这是因为在经过了足够多的世代之 后，频率小的基因在漂变过程中进一步降低的概率要比增加的概率大些，所以， 较稀少的等位基因在漂变过程中倾向于丧失，较普通的等位基因倾向于被固定。 因此，漂变的结果使每一个等位基因都将成为其祖先种群中某一等位基因的后代， 使等位基因向纯合体发生不可逆的变化，即导致变异体的减退。另外，由于这一 过程在不同隔离种群间是独立发生的，这些种群就会在它们各自的基因频率上发 生分化【1 4 】。 “) 自然选择 自然选择既是对生物个体的选择，同时也是对基因和基因型的选择，选择的 关键是生物能否在变化的环境中生存并可繁殖后代。自然选择包括生物因素( 竞 争、采食、人类的打扰、病虫害侵袭等) 和非生物因素( 纬度、气候、土壤、火 山、冰期等) 。选择对植物群体变异和遗传结构的影响，大部分证据来自两个方面： 一方面来自对直接受选择作用的表型性状的观察和实验，这些表型性状包括形态、 生理和主要生活史特性；另一方面的证据则来自不受选择直接作用的同工酶位点 曲南人+ 研十，f 审论文 的研究。t u r e s s o n 、c l a u s e n 等最早研究表明1 8 1 ，不管是来自天然选择的观察还 是来自田问的实验证据都充分证明了自然选择在群体变异和分化中的重要作用。 1 2 3 遗传多样性研究的意义 遗传多样性具有重要的理论和实际意义。 首先，物种和居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，是生命进化和适应 的基础。一个居群种内遗传多样性或变异性越丰富，物种对环境变化的适应能力 也越大。理论推导和大量试验证据表明，生物居群中遗传变异的大小与其进化速 度成正比，因此，对于遗传多样性的研究，可以揭示物种或居群的进化历史，也 能为进一步分析其进化潜力提供重要资料1 1 9 】，尤其有助于物种稀有或濒危原因及 过程的探讨。遗传多样性还和物种的活力、繁育有着密切的关系。种内遗传性的 保持也有助于保持物种和整个生态系统的多样性，或可以减慢由于适应和进化所 导致的灭绝过程而遗产的均一性将威胁群体或物种的生存。 其次，遗传多样性是保护生物学研究的核心之一。生物多样性保护最终要保 护遗传多样性，因为一个物种的稳定性和进化潜力要依赖其遗传多样性【2 0 】。掌握 物种遗传多样性的空间分布是遗传多样性保护的根本要求。因此，了解各种群遗 传多样性和相互关系，有助于确定种群保护和利用的优先级。 再次，对遗传多样性的认识是生物各分支学科重要的背景资料。对遗传多样 性的研究无疑有助于更清楚地认识生物多样性的起源和进化，尤其能加深人们对 微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供有益的资料，进而为动植物育 种和遗传改良奠定基础。 1 2 4 遗传多样性的研究方法 1 2 4 1 形态标记 形态标记是指生物的外部特征特性，即可以观察到的性状。它是最早被使用 和研究的遗传标记，利用表型性状来研究遗传变异具有简便、易行、快速的特点， 结合野外调查、标本采集、移栽和子代测定等手段，采用严密的数量遗传学方法， 就可以在短期内对所研究物种的遗传变异水平有一个基本的认识。通常采用的表 型性状有两类，一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状，如质量性状、稀有突变 等：另一类是由多基因决定的数量性状，如大多数形态性状、生活史性状【9 】。但是 由于表型性状易受环境因素的影响而发生变化，有些情况下表型变化并不能真实 反映遗传变异，要更加准确、细致地了解居群的遗传变异情况，仅仅依赖表型性 状是不够的，还必须进行更深层次的研究，并加以比较和验证。 1 2 4 2 细胞标记 染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者与形态学变异不同，染色体变异 4 文献综述 ( 畸变) 必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源，在任何生物类群 的天然居群中都存在或大或小的染色体变异，这些变异在进化过程中起着十分重 要的作用。 细胞标记主要是指染色体核型和带型。核型染色体的数目、大小、随体、着 丝点位置等，是代一个物种的染色体特征。带型如g 带，c 带，n 带等。染色体分 带技术的产物，可明确鉴别许多物种型中的任意一条染色体。目前在遗传多样性 的测中主要采用的是带技术，有关染色体分带征在遗传多样性研究中的应用有许 多报道 2 1 , 2 2 1 。此外，染色体的缺失、易位、倒位或非整倍的缺体、单体、三体等均 有其特定的细胞学特，也可作为一种细胞标记。 细胞学标记虽然可以克服形态标记的某些不足，但是细胞学标记材料需要花 费较大的人力和较长的时间来培育，同时，某些物种对染色体数目和结构变异的反 应敏感，有些则适应变异的能力较差。对染色体数目相等、形态相似的物种或类 群，或同一居群的不同个体来说，单纯用染色体资料研究遗传多样性就失去了分 辨能力。而对一些不涉及染色体数目，结构变异或带型变异的性状，难以用细胞 学方法检测。同时，到目前为止，可利用的细胞学标记仍屈指可数【2 3 1 。 1 2 4 3 生化标记 生化标记主要包括同工酶、等位酶标记等。蛋白质( 酶) 的凝胶电泳，从电泳 的技术和方法来讲，目前主要采用水平切片淀粉凝胶电泳( s g e ) 和聚丙烯酰胺凝胶 电泳( p a g e ) 两种方法，而且技术手段也相当成熟。从研究的蛋白质种类来讲，植 物主要是种子蛋白和各种酶的等位酶、同工酶【2 4 - 2 6 。与形态标记、细胞学标记相 比较，生化标记鉴定可以通过直接采集组织、器官等少数样品进行分析，首次突 破了把整株样品作为研究材料进行分析的方式，并可以直接反映基因产物的差异， 且受环境影响较小。基于这些优点，生化标记在过去的二三十年中受到相当的重 视与发展。 等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同分子形式。由 于等位酶酶谱与等位基因之间的明确的对应关系，使之成为一种十分有效的遗传 标记，等位酶技术是根据不同等位酶电荷性质的差异，在一定的电泳系统中将不 同基因编码的酶蛋白分开，来对植物基因型进行分析。等位酶技术比其他分子标 记技术更简单，如水平切片淀粉凝胶等位酶技术可以在同一块胶上同时进行多种 等位酶的染色分析，一次能检测大量个体的多个特征，方便、省时、经济。而且 不同的物种可以在同一基础上进行比较。 等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律，便于遗传学分析。可以直接用孢子体 或配予体的酶谱来进行等位基因的遗传学分析，这是形态学方法、细胞学方法和 分析方法所不能替代的。另外它可以不用人工杂交而迅速地确定亲本来源关系【2 ”。 阳南夫学硕十产付论文 但此种标记也有其内在的局限性，由于翻译后的修饰作用、组织特异性和发育阶 段性，特别是相对较少的多态性位点，以及其染色方法和电泳条件因酶而异需逐 个掌握与调整，使其在应用上受到一定的限制【2 ”。 1 2 4 4 分子标记 分子标记是指d n a 或r n a 标记 2 9 】。目前分子标记技术已有r f l p ( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性内切酶片段长度多态技术) 、r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机引物扩增多态d n a ) 、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i c ，扩增酶切片段多态性技术) 、简单重复序列s s r ( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t s ) 、染色体或基因组原位杂交( g 锄o m i ci n s i t uh y b r i d i z a t i o n , g i s h ) 、m r n a 差别显示( m r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a y , m r n a d d ) 等。 ( i ) r f l p 技术 r f l p 即d n a 限制性片断长度多态性，它是指应用特定的核酸内切酶切割有 关的d n a 分子所产生出来的d n a 片断在长度上的变化。这类标记是发展最早的 分子标记技术，g r o d z i c k e r 等1 9 7 4 年最早应用r f l p 作为遗传分析的工具【3 0 l 。随 着r f l p 的技术的推广应用，该技术的一些缺陷也逐渐显示出来：所需样品的d n a 量较大：对d n a 多态性检测的灵敏度不高；r f l p 连锁图上有较大较多的间隔区； 必须经过滤膜转移、s o u t h e r n 杂交；费时、费力、周期较长等。针对这些缺点，研 究者对此做了许多改进如用尼龙膜代替了硝酸纤维膜，用荧光素标记或化学标记 代替放射性同位素标记等，使其便于操作1 2 9 1 。 ( z ) 卧p d 技术 r a p d 技术是1 9 9 0 年由美国杜邦公司的科学家j g k w i l l i a m s 和加利福尼亚生 物研究所j w e l s h 分别领导两个小组几乎同时发展起来的一种分子标记技术3 1 j 2 1 。 r a p d 技术建立于多聚酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术基础上，它是 利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链( 通常为1 0 各核苷酸左右) 为引物，对所研究的基因组d n a 进行p c r 扩增，这些引物在一定的退火条件下， 与基因组d n a 中互补顺序配对，通过d n a 聚合酶的作用能启动d n a 合成，扩增产 物通过电泳分离，经染色后检测。这些扩增产物( d n a 片断) 的多态性可以反映基 因组相应区域的d n a 多态性。虽然p a r d 具有一些缺点( 如无法鉴定杂合子) ，但 由于它有许多优点，如检测容易、易实现自动化、实验成本低、速度快等，得到 了广泛的应用。 r a p d 分子标记是检测种质遗传多样性的有效工具，目前主要用于以下4 个方 面的研究：研究种质资源的亲缘关系和遗传背景；种质资源的分类；种质 的遗传变异评价：核心种质的筛选 2 9 , 3 3 , 3 4 】。 程中平等用r a p d 技术对桃不同类群的遗传多样性及其遗传结构进行了分析 6 文献综述 1 3 5 1 。徐秋华等利用r a p d 标记从分子水平上对在生产上有较大影响的5 1 个抗枯萎 病陆地棉品种进行了遗传多样性分析f 3 ”。罗素兰等利用r a p d 技术研究了中国野生 葡萄的遗传多样性，并将中国野葡萄资源的1 8 个种、变种和类型分为1 0 组，种 内不同花型株系问的遗传变异较大d 7 1 。周志钦等用r a p d 技术对苹果属小金海棠的 遗传关系进行了研究d s 。吴卫等应用r a p d 技术对9 2 份鱼腥草种质资源进行检测， 分析鱼腥草种质资源在分子水平上的遗传多样性1 ”l 。杨瑞武等利用r a p d 技术对小 麦族披碱草属、鹅观草属和猬草属3 个属的模式种进行了基因组d n a 多态性分析 i 柏1 。夏铭等用r a p d 技术分析了分布于中国东北3 个红松天然群体的遗传多样性及 群体间的遗传分化1 4 1 1 。周涵韬等以红树、红海榄、秋茄、角果木、木榄、海莲、 尖瓣海莲等7 种红树科植物为材料进行r a p d 分析，探讨了7 种红树植物问的亲缘 关系，得出的7 个分类群的d n a 分子分类系统图，与传统的分类进行比较，发现结 果相符，同时获得一个o p g 0 5 - - 9 0 0 的差异片段可作为区分海莲和尖瓣海莲的分子 标记【4 2 】。李钢对杜氏藻属中6 个嗜盐种的基因组d n a 进行r a p d 分析脚l 。王建林对 来自西藏高原地区1 0 7 份白菜型油菜种质资源材料的p a p d 分析，探讨了西藏白菜 型油菜品种之间的遗传分化关系m 1 。马小军等用r a p d 标记对4 个入参栽培群体3 2 个个体进行遗传多样性分析，证明在人参栽培群体中存在较丰富的遗传多样性1 4 5 l 。 陈云鹏等用r a p d 技术，对芸苔类蔬菜作物的3 3 个品种进行了遗传多样性检测m 。 海林等对小麦耐盐种质遗传多样性的进行了r a p d 分析【4 7 1 。夏铭等利用4 8 个引物 对蒙古栎天然群体进行r a p d 研究，结果表明，蒙古栎种内的d n a 多态水平是较高 的【4 s l 。项卫东等对8 个居群空心莲子草的遗传多样性及分化程度进行分析，结果 表明，空心莲子草居群具有较高的遗传多样性，镇江及南京地区是空心莲子草遗传 变异程度最高的中心区，应该作为外来种空心莲子草防治及根除的重点地带 4 9 1 。金 文林等用r a p d 标记方法对来自中国、日本、韩国、不丹、尼泊尔、越南6 国1 6 3 份小豆种质资源d n a 的传多样性进行检测【5 0 1 。虞泓等采用r a p d 技术对3 种6 个 居群5 9 个红景天样品进行了遗传关系研究【5 i 。王中生等用r a p d 方法分析了舟山 群岛濒危植物舟山新木姜子6 个居群的遗传多样性及分化程度【5 2 1 。 ( 3 ) a f l p 技术 a f l p 是1 9 9 2 年由荷兰k e y g e n e 公司科学家z a b e a um a r e 和v o sp i e t e r 发明并 发展起来的一种选择性扩增限制性内切酶切片段的方法【5 3 5 4 】。它是r f l p 和r a p d 相结合的产物，其原理是选择性地扩增基因组d n a 限制性酶切片断。植物基因组 d n a 经限制性内切酶消化形成相对分子质量大小不等的随机限制性酶切片断，随后 将特定的接头连接在这些d n a 片断的两端，接头序列和邻近的限制性酶切位点序 列作为引物结合位点，然后用特定引物进行p c r 扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离扩增的特异限制性片断。 7 曲南夫誓硕卜宁何论文 a f l p 指纹图谱多念性丰富，重复性好，结果町靠，但其所需仪器和药品价格 昂贵，实验成本高，银染检测过程繁琐。 ( 4 s s r 技术 简单蕈复序列也称为微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e ) ，是一种由2 5 个核苷酸为 单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。s s r 指纹的先驱工作是 a l i 、s c h a f e r 、e p p l e n 等进行的 5 5 5 6 】。s s r 标记已经在许多研究领域展示出较大的 应用潜力，如基因组作图、群体和进化遗传研究、种质资源遗传多样性分析、构 建指纹图谱、品种鉴定和基因诊断研究等【2 。 ( 5 ) g i s h 和f i s h 技术 基因组原位杂交和荧光原位杂交，在基本原理上是一致的，只是实验步骤或 方法有所特指。基因组原位杂交( g i s h ) 是指用某物种的基因组总d n a 进行标记 制备成探针，然后与被测物种经变性后的染色体进行原位杂交，采用特定检测系 统进行检测，其结果可揭示被测物种染色体的来源、结构变异及功能等。荧光原 位杂交( f i s h ) 是指用荧光素直接标已核酸探针，与被测物种染色体原位杂交后， 在荧光显微镜下直接观察杂交结果：或者是对生物素以及地高辛标记的探针原位 杂交后，用相应的荧光素抗体( 如抗生物素一德州红和抗地高辛一荧光素等) 进 行免疫反应，在荧光显微镜下观察。发出特定颜色荧光的位点即为杂交信号。其 结果不仅可揭示被测物种染色体的来源、进化机制、结构变异及其功能，还能对 单拷贝或低拷贝d n a 序列、重复d n a 序列进行定位，有助于对基因组的高级结构、 基因活性、遗传重组及植物的基因转化等方面的研究【5 ”。徐琼芳等用生物素标记 的中间偃麦草基因d n a 探针，与抗黄矮病小麦一中间偃麦草染色体异附加系z 6 进 行原位杂交，鉴定出附加的一对中间偃麦草染色体【5 ”。 1 3 植物起源及进化研究 植物的起源与进化研究，是基础生物学的一个基本问题，也是种质资源研究 的一个重要方面。 早在1 9 6 2 年，李家文就从历史文献的记载和栽培植物进化的自然规律两方面 来探讨了白菜的起源和进化问题【5 9 1 。祁建民等研究了黄麻的起源及进化，认为中 国南部一印度一缅甸地区为世界黄麻属两个栽培种的起源中心，中国南部地区为 圆果黄麻栽培种的演化中心，印度一缅甸地区为长果黄麻栽培种的演化中，l , 6 0 l 。 傅廷栋对油菜的起源进化与雄性不育三系选育进行了研究，发现油菜的起源进化 与三系选育有密切关系【6 ”。谷茂等对马铃薯栽培种的起源及进化进行了研究，利 用詹克森等对马铃薯原产地的调查资料，分析了起源地栽培种的进化情况和进化 机制【6 2 】。邵启全等首次证明我国西南地区有六棱野生大麦，认为二棱野生大麦、 文献综述 瓶形野生大麦、六棱野生大麦是野生大麦由野生向栽培方向进化过程中所经历的 几个进化阶段，我国是栽培大麦的起源中心之- - 1 6 3 l 。崔洪霞等认为丁香属起源于 中国西南，并以此为中心主要沿中国西南一西北一华北一东北一朝鲜半岛一日本和 中国西南一中亚一欧洲的路径散布【6 4 1 。周俊辉根据大陆漂移理论，分析各有关大 陆的古生态气候和地史变迁，推测柑桔类植物祖先可能起源于四川、康滇和江南 古陆以及印度支那半岛一带地域，然后传播至印度、非洲和澳洲【6 , s l 。陈之瑞等根 据植物类群演化的时空统一观点，利用古植物学、地理分布和系统发育三个方面 的研究结果，讨论了桦木科植物的起源和早期演化1 6 6 l 。李烨等根据对蜡梅科植物 的系统发育和分布规律的研究，结合古地理、古气候