（作物遗传育种专业论文）甘蓝型油菜自交不亲和保持性的遗传分析及其连锁分子标记.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授仪书 学位论文 仟为 如需保密，解密时间 沙知年月夕日是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研牲戥厣撕帆砖年占月，7 日 | 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张帚弘锄鼢碥崔 签名日期：加唷年1 月夕日签名日期：知、堵年多月7 日 。| 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略语表v l 文献综述1 1 1 自交不亲和性的概述1 1 2 自交不亲和的分类1 1 2 1 异型性自交不亲和和同型性自交不亲和l 1 2 2 配子体自交不亲和和孢子体自交不亲和2 1 3 自交不亲和的表现。3 1 4 自交不亲和性的生理机制4 1 4 1 配子体自交不亲和性的生理机制4 1 4 2 孢子体自交不亲和性的生理机制5 1 5 芸薹属孢子体自交不亲和的分子机制5 1 5 1s l g 5 1 5 2s r k 6 1 5 3s c r s pl l 7 1 5 4s 位点非连锁的功能分子8 1 5 5 自交不亲和反应9 1 6 芸薹属孢子体自交不亲和性的鉴定9 1 6 1 亲和指数( s e l f - c o m p a t i b i l i t yi n d e x ，s c i ) 法9 1 6 2 荧光显微法( p o l l e n - t u b ef l u o r e s c e n c em i c r o x c o p y ) 1 0 1 6 3 等电聚焦电泳( i s o e l e c t r i cf o c u s i n ge l e c t r o p h o r e s i s i e f ) 法1 0 1 6 4 免疫测定法1 1 1 6 5 分子标记鉴定法1 l 1 7 芸薹属自交不亲和系的繁殖1 2 1 7 1 剥蕾授粉法1 2 1 7 2 盐水处理法1 2 1 7 3 利用保持系繁殖自交不亲和系13 2 本研究的目的和意义1 5 3 材料和方法1 7 3 1 试验材料1 7 3 2 亲和指数的调查和亲和性的鉴别1 7 3 3d n a 的提取l7 蓝型油菜自交不亲和保持性的遗传分析及其连锁分子标记 3 4p c r 扩增1 8 3 5p c r 检测18 3 6c a p s 乡 析1 9 3 7 引物设计1 9 3 8p c r 扩增产物片段回收、克隆、测序1 9 4 结果与分析2 l 4 1 甘蓝型油菜自交不亲和保持性的遗传分析21 4 1 1 亲本及其f l 的亲和性2 l 4 1 29 1 8 0 6 保持性的遗传分析2 2 4 1 3 丙4 0 9 保持性的遗传分析。2 3 4 2 甘蓝型油菜自交不亲和保持系的s 位点分布2 4 4 2 1s 位点的特异引物2 4 4 2 29 1 8 0 6 和丙4 0 9 的s 位点分布2 4 4 39 1 8 0 6 和丙4 0 9 的s 位点分布与保持性的关系2 5 4 3 19 18 0 6 的s 位点分布与保持性的关系2 5 4 3 2 丙4 0 9 的s 位点分布与保持性的关系2 6 4 4 丙4 0 9 保持性连锁分子标记的发展2 8 4 4 1c a p s 标记2 8 4 4 2s c a r 分子标记2 9 4 4 3 双重p c r 标记3 0 4 4 4 丙4 0 9 保持性的连锁分子标记31 5 讨论。3 3 5 1 自交不亲和保持系3 3 5 2 甘蓝型油菜自交不亲和性的遗传3 3 5 3 甘蓝型油菜自交不亲和性的分子标记3 4 5 4 分子标记鉴定自交不亲和性和辅助改良自交不亲和保持系3 5 5 5 甘篮型油菜自交不亲和性的利用前景3 6 参考文献3 9 致谢。4 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 捅要 甘蓝型油菜自交不亲和性具有恢复源广、制种产量高等优点，是杂种优势利用 的重要途径之一，但不能大量繁殖自交不亲和系限制了自交不亲和杂种的大面积推 广。甘蓝型油菜自交不亲和保持系与自交不亲和系杂交，f l 仍然为不亲和，可用来 大量繁殖白交不亲和系。缺乏对其遗传机制的了解，不能简便、快速地鉴定自交不 亲和性增加了改良自交不亲和保持系的难度。本研究以自交不亲和系s 1 3 0 0 和两个 自交不亲和保持系丙4 0 9 和9 1 8 0 6 为材料，通过观察f 2 和b c i 群体亲和性的分离、 分析亲本s 位点分布及其与保持性的关系，对甘蓝型油菜自交不亲和性遗传机制的 进行了研究，并发展了与丙4 0 9 保持性连锁的分子标记。主要结果如下：1 甘蓝型 油菜自交不亲和保持性的遗传分析 ( s 1 3 0 0 x 9 1 8 0 6 ) x s 1 3 0 0b c l 亲和性有分离，不亲和和亲和植株数分别为6 4 和4 l ，说明9 1 8 0 6 的保持性符合李春艳( 2 0 0 6 ) 提出的遗传模式，即受两对基因控 制。s 1 3 0 0 x 丙4 0 9f 2 中3 3 l 株为自交不亲和，1 0 5 株为自交亲和，符合3 ：l 的理 论比例( x 2 = o 1 4 9 8 ，p = 0 7 5 0 9 ) ，( s 1 3 0 0 x 丙4 0 9 ) 丙4 0 9b c l 不亲和植株和亲 和植株分别为6 3 和6 9 ，符合1 ：l 的期望值( x 2 = o 1 4 9 8 ，p = 0 7 5 0 9 ) ，( s 1 3 0 0 丙4 0 9 ) s 1 3 0 0b c i 全部为自交不亲和，说明丙4 0 9 的保持性由单基因控制。 2 亲本s 位点分布 在四对s 位点特异引物中，p s 3 + p s 2 1 扩增一条父母本间无差异的带，p s 5 + p s l 5 没有扩增带，$ 4 0 5 + $ 6 0 2 仅在母本s 1 3 0 0 中扩增，s p l1 1 l + s p l1 i r 检测到一条 父母本间有差异的扩增带，说明父母本s l g 基因无差异，s r k 和s p l l 基因有差异。 3 亲本s 位点分布与保持性的关系 用共显性标记s p l l 1 l + s p l l 1 r 分析个体的基因型，( s 1 3 0 0 x 9 1 8 0 6 ) s 1 3 0 0 群体检测到了a ( 母本) 、h ( 杂合) 两种带型，但与表现型不能完全对应；s 1 3 0 0 x 丙4 0 9 的f 2 群体和两个b c l 群体及其3 个后代株系的基因型和表现型完全吻合，且 符合一对基因的分离比例。表明丙4 0 9 的保持性由s 位点单基因控制，9 1 8 0 6 的保 持性不仅受s 基因、还受其它基因的控制。 4 丙4 0 9 保持性的连锁分子标记 克隆了s p l l 1 l + s p l l 1 r 的扩增产物，s 1 3 0 0 和丙4 0 9 的s p l l 序列长度分别为 4 3 5 b p 和4 2 4 b p 。除部分单碱基差异外，丙4 0 9 的妒j ，在第1 7 4 1 7 5b p 处有一个 2b p 的缺失突变，在第2 8 7 2 9 5b p 处有一个9b p 的缺失突变，在2 2 6 b p 处有一 个丙4 0 9 有而s 1 3 0 0 无的t a q i 酶切位点。根据酶切位点发展了一个共显性的c a p s 标记，根据丙4 0 9 缺失位点发展了2 个与丙4 0 9 保持性完全连锁的s c a r 标记 s p l l 1 l + s p l l 1 r 和s p l l 1 r + s p l l 1l ，。将s p l l 1 l + s p l l 1 r 和$ 4 0 5 + $ 6 0 2 结合 发展了一个双重p c r 标记。 r 蓝型油菜自交不亲和保持性的遗传分析及其连锁分予标记 利用s p i1 i l + s p l l 1 r 标记、c a p s 标记、s c a r 标记和双重p c r 标记分析了 s 1 3 0 0 x 丙4 0 9f 2 、( s 1 3 0 0 x 丙4 0 9 ) x s 1 3 0 0 和( s 1 3 0 0 x 丙4 0 9 ) 丙4 0 9 的个体基 因型，s p i1 i l + s p i1 1 r 、c a p s 、s c a r 和双重p c r 标记都是对s 1 3 0 0 和丙4 0 9s 位点的扩增；s c a r 标记为显性标记，仅能区分纯合s 1 3 0 0 的s 位点； s p il i l + s p l l i r 、c a p s 、双重p c r 标记能区分母本、父本、f l 三种基因型。 关键词：甘蓝型油菜，自交不亲和性，保持系，遗传分析，c a p s 标记， s c a r 标记，多重p c r 标记 华中农业大学2 0 0 8 届硕一 学位论文 a b s t r a c t s e l f - i n c o m p a t i b i l i t yi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tp o l l i n a t i o ns y s t e m sf o rh y b r i ds e e d p r o d u c t i o ni nbn a p u $ ，a n ds e l f - i n c o m p a t i b i l i t yh y b r i d sh a v eh i g h e rf t s e e dp r o d u c t i o n ， n oo b v i o u sn e g a t i v ec y t o p l a s me f f e c ta n da na b u n d a n c eo fr e s t o r e r s h o w e v e r , i ti s d i f f i c u l tt op r o p a g a t es il i n e so nl a r g es c a l e s ，s oe x t e n s i o no fs ih y b d d si sl i m i t e d m a i n t a i n e r sc a nb eu s e df o ra m p l i f y i n gs il i n e sf o rfif r o mc r o s s i n ga ns il i n ea n da m a i n t a i n e rd i s p l a y s s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，b u ti m p r o v e m e n t o fs im a i n t a i n e r sf a c e s d i f f i c u l t i e sd u et ol a c k a g eo fi t sg e n e t i cm e c h n i s ma n dl a c k a g eo fm e a n st op r o p a g e t es i l i n e s i nt h i ss t u d y ，g e n e t i ca n a l y s i so fm a i n t a i n e r sb i n 9 4 0 9a n d918 0 6a r es t u d i e db y o b s e r v a t i o n so fs e l f - c o m p a t i b i l i t yo ff 2a n db cip l a n t s ，a n db ya n a l y s i so fsh a p l o t y p e d i s t r i b u t i o no fp a r e n t sa n di t sr e l a t i o n s h i pw i t hm a i n t e n a n c e m o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e d t om a i n t e n a n c eo fb i n 9 4 0 9a r ed e r i v e db a s e do ns pn s e q u e n c e s r e s u l t sa r el i s t e da s f o l l o w i n g s 1 g e n e t i ca n a l y s i so fm a i n t e n a n c eo fs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y sp h e n o t y p e so f ( s 一1 3 0 0 x 9 1 8 0 6 ) x s - 1 3 0 0b c ta r es e g r e g a t e d t h es ip l a n t sa n d s cp l a n t sa r e6 4a n d41 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o wt h a tm a i n t e n a n c eo f9 18 0 6i s c o n t r o l l e db yt w og e n e s ，t h es ip l a n t sa n ds cp l a n t so fs 一13 0 0xb i n 9 4 0 9f 2a r e3 3la n d 1 0 5r e s p e c t i v e l y , c o r r e s p o n d i n gt oe x p e c t e dr a t i oo f3 ：l 2o 1 4 9 8 ，p = 0 7 5 - 0 9 ) i n ( s - 13 0 0 x b i n 9 4 0 9 ) xb i n 9 4 0 9 ，6 3p l a n t sa r es ia n d 6 9p l a n t sa r es c ，f i t t i n gs e g r e g a t i o n r a t i oo fl ：1 = o 1 8 9 4 ，p = o 7 5 0 9 ) a nt h ep l a n t so f ( s 一1 3 0 0 x b i n 9 4 0 9 ) x s 一1 3 0 0 a r es i t h er e s u l t ss h o wt h a tm a i n t e n a n c eo fb i n 9 4 0 9i sc o n t r o l l e db yo n eg e n e 2 sh a p l o t y p ed i s t r i b u t i o no fp a r e n t s o ff o u rs - l o c u s s p e c i f i cp r i m e rc o m b i n a t i o n s ，p s 3 + p s 21p r o d u c e so n eb a n dw i t hn o d i f f e r e n c ea m o n gs - 13 0 0 ，918 0 6a n db i n 9 4 0 9 ，p s 5 + p si5h a sn oa n ya m p l i f i c a t i o n o n l y s 一1 3 0 0s h o w so n ef r a g m e n tb y $ 4 0 5 + $ 6 0 2 p r i m e r ss p l1 一l l + s p l l 一1 ra m p l i f yo n e p o l y m o r p h i cb a n d a l lt h e s ei n d i c a t e st h a ts l gi sn od i f f e r e n c ea n ds r ka n ds pni s p o l y m o r p h i ca m o n g t h r e ep a r e n t s 3 r e l a t i o n s h i p b e t w e e nd i s t r i b u t i o no fs h a p l o t y p e a n dm a i n t e n a n c e o f s e l f - i n c o m p a b i l i t y b ys p 1l - il + s pil - 1r ，t w oa m p l i f i e dp a t t e r n sw e r ep r o d u c e d ，a ( f e m a l e ) a n dh ( f0 ， b u tsg e n o t y p e sw e r en o tc o i n c i d e dw i t hsp h e n o t y p e sc o m p l e t e l y , s h o w i n gt h a t m a i n t e n a n c eo f918 0 6i sc o n t r o l l e dn o to n l yb ysl o c u sg e n e s sg e n o t y p e so ff 2a n d t w ob c if r o ms 一13 0 0xb i n 9 4 0 9w e r ee x a c t l ya c c o r d a n c ew i t hsp h e n o t y p e s ，i n d i c a t i n g t h a to n eg e n ec o n t r o l st h em a i n t e n a n c eo fb i n 9 4 0 9 i i i 盱蓝型油菜自交不亲和保持性的遗传分析及其连锁分子标记 4 m o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e dt om a i n t e n a n c eo fb i n 9 4 0 9 s p l lg e n e so fs 一1 3 0 0a n db i n 9 4 0 9w e r ec l o n e d t h e i rl e n g t hw e r e4 3 5 b pa n d4 2 4 b p r e s p e c t i v e l y b e s i d e sd i f f e r e n c e si ns e v e r a ls i t e s 、s pllg e n eo fb i n 9 4 0 9h a st w od e l e t e d m u t a t i o n s ，o n e2b pi n s i t eo f1 7 4 1 7 5b pa n do n e9b p i n2 8 7 - 2 9 5b p ，a n do n e e x t r a r e s t r i c t i o nl o c u si ns i t eo f2 2 6 b p c o m p a r i n gw i t hs pll g e n eo fs 一1 3 0 0 c a p s m a r k e r sa n ds c a rm a r k e rw e r ed e v e l o p e db a s e do nt h e s e q u e n c ed i f f e r e n c e s c o m b i n i n gt h es c a rm a r k e ra n d $ 4 0 - 5 + $ 6 0 2m a r k e r , t w om u l t i p l e xp c rm a r k e r s w h i c hc o u l dd i s c r i m i n a t et h eh o m o z y g o u sa n d h e t e r o z y g o u sg e n o t y p e sw e r ed e r i v e d sg e n o t y p e so ff 2a n dt w ob c zf r o ms 一13 0 0xb i n 9 4 0 9 ，d i f f e r e n t i a t e db ym a r k e r s s pil - ll + s p1 l 一1r ，c a p s ，s c a ra n dm u l t i p l e xp c rm a r k e r sw e r ec o i n c i d a n c ew i t h t h e i rsp h e n o t y p e se x a c t l y s c a rm a r k e ri s d o m i n a n t ，o n l ys h o w e di nb i n 9 4 0 9 s pii - il + s p1l ir ，c a p sa n dm u l t i p l e xp c rm a r k e r sc a nd i s t i n g u i s hsg e n o t y p e so f f e m a l e ，m a l ea n df 1 k e y w o r d s ：b r a s s i c an a p u sl ，s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，m a i n t a i n e r ，g e n e t i ca n a l y s i s ，c a p s m a r k e r ，s c a rm a r k e r ，m u l t i p l e xp c rm a r k e r 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 缩略语表 v 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 l 文献综述 1 1 自交不亲和性的概述 在自然界中，有超过7 0 植物的花为完全花，由于这些完全花雌雄蕊很近，所 以极有可能进行白花授粉而结实，导致近亲繁殖、后代生活力降低。植物在长期自 然进化过程中采取多种生殖机制来避免自花授粉，促进异花授粉，使物种内最大限 度的异交和重组( 傅廷栋等1 9 9 5 ) ，从而防止近交衰退，增加遗传变异，增强对环境 的适应性，其中很重要的一种防止自交的机制就是自交不亲和性 ( s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y , s i ) 。 最早观察到自交不亲和性并有详细记载的是达尔文d a r w i n ( 1 8 7 6 ，1 8 7 7 ) ，他 认为自交不亲和相当于自交不育，即自交不能繁殖后代。m a t h e r ( 1 9 4 3 ) 提出自交 不亲和是在交配或授粉之后，雄性配子不能与雌性配子结合，但在相似的交配或授 粉条件下，这些雄性配子能与其他的雌性配子结合。薛勇彪和孟金陵( 1 9 9 5 ) 认为 自交不亲和是植物雌蕊的柱头或花柱可以辨别自体和异体花粉，并抑制自体花粉萌 发或生长的一种特性。 自交不亲和性在植物界普遍存在，广泛地存在于十字花科、菊科、旋花科、茄科、 罂粟科、蔷薇科、禾本科等许多植物中。已在7 4 科2 5 0 属约3 0 0 0 种以上的显花植 物中发现了自交不亲和现象( r a m d l x i te t ，2 0 0 1 ) 。十字花科芸薹属( b r a s s i c a ) 及其 近缘野生种组成的芸薹族( b r a s s i c a c a e ) ，在其5 9 类植物中，有5 0 类是自交不亲和 的。人们还发现，在裸子植物和蕨类植物中也存在自交不亲和现象( t a k a y a m ae t ， 1 9 8 7 ) 。在栽培植物中，也有植物表现出自交不亲和性，但比野生植物要少，而且常 常表现假自交不亲和性。n e t t a n c o u r t ( 1 9 7 7 ) 报道，栽培植物中至少有2 2 个属表现出 自交不亲和性，主要分布在异花授粉和常异花授粉植物中。 1 2 自交不亲和的分类 n e t t a n c o u r t ( 1 9 7 7 ) 在其“被子植物自交不亲和”一书中，对被子植物自交不亲和 性的分类进行了比较系统的阐述：根据其花器形态的不同可将其分成同型性自交不 亲和( h o m o m o r p h i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ) 和异型性自交不亲和( h e t e r o m o r p h i c s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ) ；根据自交不亲和的遗传机理，可将其分成配子体自交不亲和 ( g a m e t o p h y t i cs e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，g s i ) 和孢子体自交不亲和( s p o r o p h y t i c s e l f - i n c o m p a t i b i l i t y ，s s i ) 。 1 2 1 异型性自交不亲和和同型性自交不亲和 在异型性自交不亲和物种中，其单株的花器形态存在分离，花与花之间的形态 明显不同，它们在花柱长度与雄蕊水平高度相对不同。根据花中柱头与花药的相对 r l 旌型油菜自交不亲和保持性的遗传分析及j e 连锁分子标记 位置不同，可进一步将其分成二型花柱( d i s t y l e ) 和三型花柱( t r i s t y l e ) 。二型花柱是 指单株中柱头与花药的相对位置有两种，三型花柱指柱头与花药的相对位置有三种。 异型性自交不亲和存在于2 4 个科的1 6 4 个属中，如亚麻属和报春花属。异型性自交 不亲和一般表现为饱予体自交不亲和。在显花植物中，一半以上的物种表现出同型 性自交不亲和( e a s t ，1 9 4 0 ) 。在同型性自交不亲和中，花器的形态结构表现一致，即 单株中花的形态没有分离。 1 2 2 配子体自交不亲和和孢子体自交不亲和 成熟花粉粒包括：外壁、内壁和花粉细胞的原生质体，成熟花粉粒是由花粉母 细胞经减数分裂后产生的小孢子发育而来的，因此成熟花粉粒只含花粉母细胞一半 的染色体，即成熟花粉粒都是配子体的。成熟花粉粒周围的蛋白质有外壁蛋白和内 壁蛋白两种。外壁蛋白由花粉在成熟时花粉囊壁的绒毡层细胞分泌，并被储存在花 粉外壁的腔隙内，由于绒毡层是孢子体的，带有两个s 单元型，因此，由绒毡层分 泌的外壁蛋白具有孢子体的特性，是两个s 单元型共同表达产物，而内壁蛋白是花 粉在成熟时由花粉细胞本身产生的，并沉积在花粉内壁上，近萌发孔的区域更为丰 富，由于花粉细胞本身是配子体的，只带有一个s 单元型，因此由花粉细胞本身产 生的内壁蛋白具有配子体的特性，是花粉细胞自身一个s 单元型的表达产物。 配子体自交不亲和性是植物界最普遍的一种自交不亲和性，几乎一半的显花植 物属于此类，其花粉的表现型，即自交不亲和性，取决于配子体( 花粉) 的基因型， 与孢子体( 母体植株) 的基因型无关。例如，花粉孢子体的基因型是s ，& ，花柱的 基因型分别为研岛，研岛，岛& ，授粉后，表型分别是不亲和，半不亲和，亲和。花 粉识别蛋白由花粉本身所携带的基因合成，然后分泌到花粉的内壁( i n t i n e ) 上。当 花粉萌发后，柱头不表现出抑制作用，直到进入花柱组织，由卵细胞产生识别蛋白 到达花柱组织细胞或胚囊组织后，才表现出抑制作用，所以配子体自交不亲和是雌 雄配子之间的相互抑制。配子体自交不亲和的花粉粒常常表现二核型花粉 ( b i n u c l e a t i cg r a i n s ) ，不管亲和还是不亲和的花粉粒，都能在自己植株柱头表面正 常水合萌发，但不亲和的花粉粒不能形成正常合子。 孢子体自交不亲和性仅存在于六个科中( c h a r l e s w o r t h ，1 9 8 8 ) ，孢子体自交不亲 和是指其花粉的表型取决于孢子体基因型，与花粉的基因型无关。在花粉的成熟过 程中，花粉识别蛋白由绒毡层转移到花粉粒外壁上。自交不亲和体现在花粉外壁上 的识别蛋白与雌蕊柱头乳突细胞( s t i g m a p a p i l l a e ) 表面糖蛋白之问的识别与抑制。 例如，花粉孢子体的基因型是毋，花柱的基因型分别为研& ，& ，授粉后，表 型分别是不亲和，亲和。花柱的基因型s ，& ，表现型就不一定。孢子体自交不亲和 的花粉粒常为三核型( t r i n u c l e a t i cg r a i n s ) ，抑制作用发生在柱头表面，花粉粒不能 j f 常水合萌发，花粉管般不伸入柱头，如表1 ( 牛俊海等，2 0 0 6 ) 。 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 表1 部分自交不亲和植物分类和特征 t a b l elt h e c l a s s i f ya n dc h a r a c t e ro fs o m es e l f - i n c o m p a t i b i l i t yp l a n t s 1 3 自交不亲和的表现 一般而言，植物自交不亲和性有四种表现形式：花粉在柱头上不能正常萌发； 花粉萌发后花粉管不能进入柱头；花粉管进入柱头后，在花柱中不能继续延伸； 花粉管到达胚囊后精卵不能结合。g s i 具有双核花粉和湿性柱头，自体花粉经过 萌发和初期生长后，在花柱中被抑制。而芸薹属植物是s s i 型，具有三核花粉和干 性柱头，花粉的抑制作用发生在花粉和柱头作用的初期，自交抑制并非花器形态学 上或时间上的障碍，而是花粉和柱头相互作用后，花粉管生长受到抑制而发生，受 抑制的部位是柱头表面。其中白菜( b r a s s i c ac a m p e s t r i s ) 等花粉在柱头上能萌发， 但不能穿透柱头乳突细胞；而甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e a ) 等，花粉在柱头上不能正常 萌发，花粉与柱头接触后，花粉和柱头乳突细胞胼胝质不断积累。s o o d 等( 1 9 8 2 ) 研究表明，不仅成熟的花粉能在不亲和柱头表面刺激胼胝质不断沉积，而且花药原 基、减数分裂前的花药、四分体、减数分裂前期i 、前期i i 和后期i 的小孢子都能引 起胼胝质沉积，随着小孢子的发育与成熟，其诱导胼胝质的沉积量显著增加。斯平 ( 1 9 8 5 ) 认为：胼胝质沉积量与花粉粒和柱头之间的亲和反应有密切关系，柱头与 花粉的亲和性越强，胼胝反应越不明显；相反，它们之间的不亲和性越强，胼胝质 沉积量越大。k e r h o a s ( 1 9 8 3 ) 认为胼胝质沉积量，与花粉在柱头表面的黏附程度及花 制子模型能够解释竞争性互作现象。而且l u u 等通过免疫细胞化学实验，用s 1 2 纯 合体花粉给s i l s l 2 基因型的花柱授粉，通过被标记的s l i r n a s e 的抗体反应，发现 花粉管中s l i r n a s e 的量比胞问质中的大，说明s r n a s e 进入花粉管不依赖于s 基 因型，从一个侧面证实了抑制子模型。l u u 等通过对茄科植物的研究发现，含有s l i s 1 3 嵌合蛋白的植株与含有s l l 或s 1 3 花粉的植株是亲和的，但是与s l l s l l s l 3 s 1 3 的四 倍体植株是不亲和的。为了解释这个现象，他们提出了第三种模型，即修正抑制子 模型。他们预测花粉s 基因蛋白以同型四倍体形式存在时才会有活性。该四聚体和 与之同型的雌蕊s r n a s e 的特异识别区结合，使雌蕊的催化区活化，完成对花粉r n a 的降解，导致自交不亲和。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕：e 学位论文 1 4 2 孢子体自交不亲和性的生理机制 作为孢子体自交不亲和性，芸薹属植物自交不亲和性得到了广泛的研究。关于其 生理机制有多种假说，最具代表性的是免疫学说、乳突隔离假说以及角质酶假说等 ( 汤青林等2 0 0 1 ) 。免疫学认为：植物柱头和花粉管具有相同的基因型时，会产生 “抗原一抗体”系统。表现不亲和时，从花粉管分泌出“抗原”，刺激花柱组织形成 抗体，从而阻止花粉管的伸长。乳突隔离假说则认为：柱头的表皮层具有乳突细胞， 外面覆盖有角质层，它可能是自交不亲和植物阻止花粉萌发的物质。角质酶假说解 释自交不亲和性，认为花粉的角质酶在不亲和的柱头上失活，而亲和的柱头可活化 角质酶，被激活的角质酶使柱头角质层水解而有利于花粉管的生长。l i n s k e n 等在萌 发的花粉中发现角质酶而支持这一假说。 1 5 芸薹属孢子体自交不亲和的分子机制 芸薹属的自交不亲和性受单位点( s - l o c u s ) 、复等位基因( s ，、船s n ) 控制， 为孢子体控制型( b a t e m a n1 9 5 5 ) 。在柱头中，已鉴定出两个啦点基因：啦点糖 蛋白( s - l o c u sg l y c o p r o t e i n ，s l g ) 基因( n a s r a l l a he ta 1 ，1 9 8 5 ) 和啦点受体激酶 ( s - l o c u sr e c e p t o rk i n a s e ，s r k ) 基因( s t e i ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。在花粉中，鉴定出一个 作为s r k 配体的啦点富含半胱氨酸蛋白( s - l o c u sc r y s t e i n e r i c h ，s c r ) 基因( s c h o p f e r e ta 1 ，1 9 9 9 ) 偈位点蛋白l l ( s - l o c u sp r o t e i n1 1 ) 基因( s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。芸薹属 自交不亲和性的研究过程可以说是一个从s l g 一s r k s c 刚s p l l 的历程。 s 单元型之间存在复杂的显隐关系，是芸薹属自交不亲和性的一个重要特征 ( t h o m p s o na n dt a y l o r ，1 9 6 6 ；o c k e n d o n ，1 9 7 4 ) 。s 单元型之间的显隐关系是非线 性的，在花粉中与柱头中的表现不同，在柱头中对特定s 单元型表现显性的s 单元 型，在花粉中不一定对特定s 单元型表现显性。柱头中以共显性比较普遍，由s r k 基因本身决定( h a t a k e y a m ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，花粉中则多为显性关系，由艘j j 基因的 m r n a 水平控制( s h i b ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 或d n a 甲基化控制( s h i b ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。f u j i m o t o 等( 2 0 0 6 ) 认为在甘蓝和白菜的i i is 单元型杂合体中，无功能的i 类s 单元型的 s p l1 能够抑制i i 类有功能的s p ll 的表达。o k a m o t o 等( 2 0 0 7 ) 在甘蓝型油菜中证 实了这一结论，认为普通甘蓝型油菜包含两个s 单元型，a 基因组上的i 类s 单元 型是无功能的，但能抑制c 基因组上有功能的i i 类s 单元型，导致自交亲和。n a i t h a n i 等( 2 0 0 7 ) 认为s r k 的同源二聚体与柱头上s r k 的共显性有关，异源二聚体与显 隐性有关。 1 5 1s l g 6 0 - - 一7 0 年代，生物免疫化学研究表明：柱头乳突细胞的主要蛋白质成分是一 种碱性糖蛋白，即s 位点特异糖蛋白( s - l o c u ss p e c i f i cg l y c o p r o t e i n ，s s g ) ，又称s 位 码基因，该基因与s l g 基因一样与s 位点连锁并且能在柱头中特异表达。1 9 9 3 年 g o r i n g 等发现芸薹属s r k 缺失体表现为自交亲和；2 0 0 0 年t a k a s a k i 等对s r k 2 8 0 与 s l g 2 8 0 转基因植物的研究表明对自交不亲和性起决定作用的是s r k ，即对相同s 单 元型花粉表现拒绝反应的是s r k 而不是s l g 转基因植物。s i l v a 等2 0 0 1 年将s r k 9 i o 导入自交亲和的甘蓝型油菜中则发生自交不亲和。这些证据证明s r k 是自交不亲和 反应中的核心因子，它不仅是雌蕊的决定因子，在花粉的识别中扮演重要角色，而 且当同源的s c r 授粉结合时，其胞内激酶区被激活s e r 和t h r 残基发生磷酸化，从 而产生级联反应，使信号在乳突细胞中传递和放大，最终导致花粉萌发受阻。 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕： ：学位论文 尽管s l g 和s r k 之间的d n a 物理距离超过2 0 0k b ，但大规模的遗传重组分析 没发现重组( b o y e s a n dn a s r a l l a h ，1 9 9 3 ；b o y e se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。s 位点基因作为一个 分离单元，与自交不亲和性共分离，因此将传统的sa l l e l e 统称为s 单元型( s h a p l o t y p e ) ( n a s r a l l a ha n dn a s r a l l a h1 9 9 3 ) 。目前在白菜中鉴定出来的s 单元型大约 1 0 0 多个( n o ue ta 1 ，1 9 9 3 ) ，甘蓝中约5 0 多个( o c k e n d o n ，1 9 8 0 ) 。根据s r k 和s l g 的核甘酸序列之间的同源性以及s