（作物遗传育种专业论文）厚荚相思组织培养与农杆菌介导遗传转化研究.pdf

厚荚相思组织培养与 农杆菌介导遗传转化研究 摘要 本论文主要对厚荚相思进行了组织培养体系的优化、遗传转化受体系 统的建立以及农杆菌介导的遗传转化体系的建立进行了研究。主要试验 结果如下： 1 、通过正交设计和系列试验及方差分析，优化了厚荚相思组织培养 的体系。试验结果表明：厚荚相思种子用9 8 浓硫酸处理3 0 m i n 和沸水浴 处理1 0 m i n ，后用7 5 酒精处理3 0 s 和0 1 升汞处理1 0 m i n 灭菌，接种时采 用胚芽向下的方式接种，用1 2 m s 培养基进行培养，萌发率可达6 9 。在 初代培养中采用m s + 6 b a2 0 m g l + k t1 0 m g l + n a ao 1 m g l 为培养基 配方；第一次继代培养中采用m s + 6 b a1 0 m g l + k t1 0 m g l + n a a o 1 m g l 为培养基配方；第二次继代培养中采用m s + 6 - b a1 5 m g l + k t 1 5 m g l + n a a0 5 m g l 为培养基配方；生根培养中采用m s + i b a 1 0 m g l + n a a1 0 m g l + i a a1 0 m g l 为培养基配方；壮苗培养中采用 m s + k t0 6 m g l + n a ao 1 m g l 为培养基配方。移栽时采用黄泥和育苗介 质( 1 ：1 ) 为基质。 一 2 、通过激素组合试验和抗生素筛选试验，建立了厚荚相思遗传转化 的受体系统。试验结果表明：6 - b a 和i b a 配合使用诱导不定芽的效果比 6 - b a 单独使用和6 b a 分别与n a a 、i a a 配合使用的效果要好，其最佳使 用浓度组合为6 b a1 5 m g l 、i b a0 5 m g l ，叶盘的分化率达到了6 2 。厚 荚相思叶片再生的卡那霉素选择压力为5 0 m g l ，生根选择压为1 5 0 m g l 。 头孢霉素的使用对叶盘分化影响不大，而硫酸链霉素和氨苄青霉素的使 用对叶盘分化有较大影响。因此，确定头孢霉素为主要的抑菌抗生素， 使用浓度为1 0 0 - 2 0 0 m g l 。 3 、通过对根癌农杆菌不同菌株、菌液浓度、浸染时间、预( 共) 培 养时间及筛选培养基的比较试验，建立了农杆菌介导g u s 基因的厚荚相 思遗传转化体系。试验结果表明：采用预( 暗) 培养5 d ，浸染所用根癌 农杆菌菌株为a t 0 6 ，菌液浓度为o d 6 0 0 值取o 5 ，浸染时间1 0 m i n ，共培 养3 d ，共培养培养基中添加a s5 0 m g l ，蔗糖3 0 9 l ，p h 值5 8 ，在共培 养3 d 后转入筛选培养基这个方法对厚荚相思进行遗传转化。在筛选培养 基上培养5 d 后取出外植体进行g u s 基因瞬时表达率的检测，发现瞬时 表达率较高，达到了9 2 。在经过初次筛选培养，芽伸长培养( 二次筛 选) ，生根培养( 三次筛选) 后，从2 0 0 个外植体当中得到了卡那霉素抗 性植株4 株。 关键词：厚荚相思组织培养g u s 基因农杆菌介导遗传转化 s t u d yo n t i s s u ec u l t u r ea n da g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o no fa c a c i ac r a s s i c a r p a q i nx i n ( c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e ，g u a n g x iu n i v e r s i t y ，n a n n i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t t h i sp a p e rc o n c e n t r a t e dt h es t u d i e so nt h eo p t i m i z a t i o no fa c a c i a c r a s s i c a r p at i s s u ec u l t u r es y s t e m ，e s t a b l i s h m e n to fg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n r e c e p t o rs y s t e m sa n da g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n t h e m a i nr e s u l t si n d i c a t e da sf o l l o w s ： 1 t h et i s s u ec u l t u r es y s t e mo fa c a c i ac r a s s i c a r p aw a so p t i m i z e db yt h e o r t h o g o n a ld e s i g na n das e r i e se x p e r i m e n t s t h e t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a t ： a f t e ru s i n g9 8 c o n c e n t r a t e ds u l p h u r i ca c i dt r e a t m e n t e d3 0m i na n db o i l i n g w a t e rb a t ht r e a t m e n t e d10m i na n du s i n g7 5 a l c o h o lt r e a t m e n t e d3 0 sa n d o 1 h g c l 2 t r e a t m e n t e d10m i nt oa c a c i ac r a s s i c a r p a s e e d sf o r s t e r i l i z a t i o n ，a n dt h e nu s i n gt h ew a yo fe m b r y od o w nf o ri n o c u l a t i o na n d1 2 m sm e d i u mf o rt h es e e d sc u l t u r e ，t h eg e r m i n a t i o nr a t eo ft h es e e d sa c h i e v e d t o6 9 i nt h ef i r s tc u l t u r e ，t h em e d i u mf o r m u l aw a sm s + 6 一b a2 0 m g l + k t 1 0 m g l + 】n a ao 1m g l i n t h ef i r s ts u b c u l t u r e ，t h em e d i u mf o r m u l aw a s m s + 6 b a1 0 m g l + k t1 0 m g l + n aao 1m e g t i nt h es e c o n ds u b c u l t u r e ， t h em e d i u mf o r m u l aw a sm s + 6 一b a1 5 m g l + k t1 5 m g l + n a a0 5 m g i i i l i nt h er o o t i n gc u l t u r e ，t h em e d i u mf o r m u l aw a sm s + n a a1 0 m g l + i a a 1 0 m g l i nt h es o u n dp l a n t l e tc u l t u r e ，t h em e d i u mf o r m u l aw a sm s + k t 0 6 m g l + n a a 0 1m g l w h e nt h ep l a n t l e t sw e r et r a n s p l a n t i n g ，s m i t h f i e l d a n dn u r s e r ym e d i u m ( 1 ：1 ) w a su s e da st h em a t r i x 2 t h er e c e p t o rs y s t e mo ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fa c a c i ac r a s s i c a r p a w a se s t a b l i s h e db yt h ee x p e r i m e n t so fh o r m o n ec o m b i n a t i o n sa n dt h e e x p e r i m e n t so f a n t i b i o t i c ss e l e c t i o n t h et e s tr e s u l t ss h o w e dt h a t ：u s i n g6 - b a c o m b i n e dw i t hi b ah a dt h eb e t t e re f f e c to fa d v e n t i t i o u sb u d si n d u c t i o nt h a n t h a to fu s i n g6 - b aa l o n ea n d6 - b ac o m b i n e dw i t hn a a o ri a a ，t h eb e s t u s i n gc o n c e n t r a t i o nc o m b i n a t i o nw a s6 - b a1 5 r a g l + i b a0 5 m g la n d t h e d i f f e r e n t i a t i o nr a t eo fl e a f - p l a t er e a c h e dt o6 2 t h er e c o v e r ys e l e c t i o n p r e s s u r eo fk a n a m y c i nt oa c a c i ac r a s s i c a r p al e a v e ss h o w e d5 0m g l ，t h e r o o t i n gs e l e c t i o np r e s s u r ew a s15 0m g l u s i n gc e p h a l o s p o r i n sa d r i a m y c i n o nt h el e a f - p l a t ed i f f e r e n t i a t i o nh a df e we f f e c t s ，b u tu s i n gs t r e p t o m y c i ns u l f a t e a n da m p i c i l l i na f f e c t e dt h ed i f f e r e n t i a t i o ng r e a t l y t h e r e f o r e ，c e p h a l o s p o r i n s a d r i a m y c i nw a si d e n t i f i e da st h em a i na n t i b a c t e r i a la n t i b i o t i c sa n d t h eu s i n g c o n c e n t r a t i o nw a ss h o w e dl0 0 - 2 0 0 m g l 3 t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o fa c a c i a c r a s s i c a r p ab y a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dg u sg e n e w a se s t a b l i s h e db yt h e c o m p a r i n g e x p e r i m e n t so fd i f f e r e n tb a c t e r i a ls t r a i n ，b a c t e r i a lc o n c e n t r a t i o n ，i n f e s t a t i o n t i m e ，p r e c u l t u r e ( c o c u l t i v a t i o n ) t i m ea n ds e l e c t i o nm e d i u m s t h et e s tr e s u l t s s h o w e dt h a t ：t h ep r e c u l t u r eo rd a r kc u l t u r ew a su s e df o r5 d t h eb a c t e r i a l i v s t r a i nt h a tn a m e da t 0 6 w a su s e df o rt h ei n f e s t a t i o n ，w h i c ht h es t r a i n c o n c e n t r a t i o ns h o w e dt h a to d 6 0 0v a l u ew a s0 5a n dt h ei n f e s t a t i o nt i m ew a s 10m i n t h ec o c u l t i v a t i o nw a st a k e nf o r3 d t h em e d i u mw a sa d d e da s5 0 m g la n ds u g a r3 0g l ，w h i c h t h ep hv a l u es h o w e d5 8 a f t e rc o c u l t i v a t i o n f o r3 d ，t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no f a c a c i ac r a s s i c a r p aw a st a k e nb yt h ew a y o fs l e c t i o nm e d i u m a f t e rt h ec u l t u r eo nt h es e l e c t i o nm e d i u mf o r5 d ，t h e e x p l a n t sw a s t a k e nt od e t e c tt h et r a n s i e n te x p r e s s i o nr a t eo fg u sg e n e ，w h i c h t h et r a n s i e n te x p r e s s i o nr a t ew a sf o n dh i g h e ra n di tr e a c h e dt o9 2 a f t e rt h e f i r s ts e l e c t i o nc u l t u r e ，b u de l o n g a t i o nc u l t u r e ( t h es e c o n ds e l e c t i o n ) ，r o o t i n g c u l t u r e ( t h et h r e es e l e c t i o n ) ，4k a n a m y c i n r e s i s t a n c ep l a n t l e t sw e r eg o tf r o m 2 0 0e x p l a n t s k e yw o r d s ：a c a c i ac r a s s i c a r p a t i s s u ec u l t u r eg u sg e n e a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n v 英文缩略词表 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作 所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含 其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。 对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 l 作者签名：舞仍 日期： 2 0 0 9 年占月够日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保 证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提 交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并 提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保 存论文：在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。口不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口伺意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名： 日期：堡呈笨豳兰兰垦一 导师签名：壶造叠 日期：翟芝墨年鱼2 i l 冯日 厚荚相思组织培养与冶抖于。菌介导遗传捌“匕研究 1 前言 1 1 林木组织培养的研究现状 植物细胞、组织培养是2 0 世纪初以植物生理学为基础发展起来的，即在人工控制 条件下，用无菌方法，把植物体的一个器官、一种组织、单个细胞或原生质体分离后， 置于适宜的营养和环境条件下，使之继续生长、分化并发育成完整再生植株的培养技 术。它从一个纯粹研究植物学基础理论的手段开始，现已成为农林业生产及科研的重 要组成部分，成为生物工程技术应用于林业取得进展最大的领域，也成为通过组织培 养获得各种林木优良品种或纯系，以及用组织培养技术进行优良树种的快速繁殖、突 变的诱导、细胞融合和基因工程操作等方面必不可少的基本技术( 崔德才等，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 快速繁殖 快速繁殖就是利用组织培养快速繁殖植物的方法，包括器官发生型方式和无菌短 枝扦插和体细胞胚胎发生方式。利用优良单株的嫩茎或萌芽枝条，进行组织培养快速 繁殖优质苗木，已成为近代无性系育种和无性系林业的一个关键环节。因林木育成一 个新品种不仅时间很长，而且更换一个品种的周期也相当长。在有性繁殖中只能保持 所选家系的中间性状，用快速无性繁殖技术就有可能在短期内繁殖出大量具有高度一 致而同时具有优良表型的群体，且保持通过有性繁殖不能保持的优良个体或性状，使 优良品种在生产上得到迅速推广。在林木组织培养快速繁殖中，通过器官发生方式产 生再生植株是最成功的离体培养繁殖方式。桉树、杨树等林木己实现组织培养工厂化 育苗，快速繁殖优良种苗提供生产应用( 贺窑青等，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 体细胞胚胎发生与突变体筛选 林木组织培养是林木无性繁殖的一个重要途径，体细胞胚胎发生由于能在更短的 时间里得到更多的营养繁殖体，以及获得更大的遗传增益，并且由于体胚发生培养物 也是分离原生质体的重要来源，可用于林木的遗传转化及体细胞杂交研究，因此利用 林木体胚发生进行林木无性繁殖是未来无性系林业的一种重要手段。植物的体细胞胚 发生首先在胡萝卜的研究中实现。i 扫s t e w a r d ( 1 9 5 8 ) 和r e i n e r t ( 1 9 5 9 ) 差不多同时发现。 林木的体细胞胚发生研究起源于对檀香( s a n t a l u ma l b u m ) 的研究，r a o 等在组织培养过 程中发现体细胞胚结构，但是没有获得再生植株( g a o ，1 9 6 5 ) 。以枸骨叶为外植体材料， 实现了体细胞胚的直接发生( s u s s e x ，1 9 7 2 ) 。 广西大学硕士学位论文季荚相思组够己| 鲁爿u 言弗四：卜菌介导遗传辛 匕研究 1 1 3 原生质体培养与细胞融合 从2 0 世纪7 0 年代初首次从烟草原生质体成功地培养出再生植株以来，至今已有 2 5 0 多种高等植物的原生质体培养获得成功。原生质体是“裸露”的植物细胞，具有全 能性，能在适应的培养条件下诱导再生植株。同时，由于没有细胞壁的障碍，原生质 体能够直接高效地摄取外源d n a 或遗传物质、各种细胞器甚至细胞核；又可以与异 种原生质体经诱导融合而形成体细胞杂种。这些特性不仅大大提高了育种效益，而且 使亲缘关系较远、常规育种不可能进行的许多杂交组合成为可能( 吴延军等，2 0 0 2 ) 。 从而可以培育出自然条件下不可能得到的、具有各种优良经济性状的新品种。植物原 生质体的研究工作始于1 9 世纪4 0 年代。在2 0 世纪6 0 年代初，c o c k i n g ( 1 9 6 0 ) 等人首次从 番茄根尖中获得了大量活原生质体，1 9 7 1 年t a k e b e 等首次从烟草叶片分离原生质体， 经培养获得再生植株，原生质体的研究和应用进入了一个新阶段( 张红梅等，2 0 0 2 ) 。 我国也获得了悬铃木( 卫志明等，1 9 9 1 ) 和白云杉和欧洲冷杉( 王影等，1 9 9 3 ) 等原 生质体再生植株。 1 1 4 转基因植株培育 植物转基因就是利用重组技术，将外源基因导入受体植物染色体，从而产生具有 外源基因表达的植物个体。建立个好的受体系统( 是指用于转化的外植体通过组织 培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源d n a 整合，对转化选择抗生系敏感的再生系统) 是实现基因转化的先决条件，关系到基因 转化的成败。所以要求，外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和形成完整植株的能力， 最好是外植体能直接分化芽，而且芽的分化率达9 5 以上。h o r s h 等( 1 9 8 5 ) 首创根癌 农杆菌介导的烟草叶盘法获得转基因植株后，植物的遗传转化过程大大简化( 席梦利 等，2 0 0 4 ) 。最常使用的外植体为叶片、茎段和叶柄，已在欧洲黑杨、毛白杨、杨树、 黑刺槐、苹果、李、桃、猕猴桃、柑橘等多种林木和果树上得到再生转化植株( 苏晓 华等，2 0 0 3 ) 。 1 2 林木转基因植物的研究现状 植物遗传转化是应用重组d n a 技术、细胞组织培养或系统转化技术，有目的地把 外源基因或d n a 片断插入到受体植物基因组中，并在其后代植株中得到表达的过程 ( 王关林等，2 0 0 2 ) 。自从p a r s o n 等用抗除草剂基因对杨树进行遗传转化，获得抗除草 剂植株并证实外源基因在林木细胞中表达以来，林木植物基因工程研究取得了较大的 2 厚荚相曳组织培养与昂蜥菌介导遗传幸妒化研究 进展( 郑进等，2 0 0 4 ) 。我国也成功地进行了杨树、松树和桉树等树种的遗传转化( 施 季森等，2 0 0 0 ) 。 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌( 导致毛状根的发生) 和根癌 农杆菌( a g r o b a e t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ( 导致冠瘿瘤，冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产 生的冠瘿碱) 。根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒( t i 质粒) ( 高俊山等， 2 0 0 3 ) 。双子叶植物是农杆菌的天然宿主，因而农杆菌介导的基因转移系统首先成为 双子叶植物遗传转化中运用最为广泛而有效的遗传转移系统( 王志华等，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 抗虫基因工程 害虫严重影响林业生产。化学药剂杀虫不仅成本高，且造成严重的环境污染和食 品中的残留。现在利用基因工程可以有效的解决这些问题。目前已发现并用于植物抗 虫基因工程的抗虫基因主要有两类：一类是来源于苏云金芽抱杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ) 的8 内毒素( 6 e n d o t o x i n ) 基因，简称b t 基因；另一类是来自于一些高等植 物的蛋白酶抑$ i ( p r o t e i n a s ei n h i b i t i o n ) 基因，简称p i 基因( 侯丙凯，2 0 0 0 ) 。 迄今为止，经转化表达b t 基因的树种有杨树、核桃、落叶松、花旗松和云杉等。 此外，人们也开始将多个不同类型的基因导入林木的研究。h o w e 等( 1 9 9 4 ) 用农杆菌介 导法将b t 毒蛋白基因导入银白杨大齿杨杂种，获得了含有b t 毒蛋白基因的抗性愈伤 组织。在国内，伍宁丰等( 1 9 9 1 ) 将抗鳞翅目昆虫的b t 嵌合基因导入了欧洲黑杨。郑均 宝等( 2 0 0 0 ) 用农杆菌介导法，将部分改造的c r y a c 基因与慈姑蛋白酶抑制剂基因构 建的双抗虫基因表达载体转入白杨杂种7 4 1 ( i 臣颖川等，2 0 0 0 ) 。李明亮等( 2 0 0 0 ) 用农 杆菌介导二次转化的方法，将蛋白酶抑制剂基因导入含b t 基因的欧洲黑杨。 1 2 2 抗病基因工程 植物病害是农业生产的最大威胁，经常都导致作物减产而造成重大经济损失( 赵 鑫等，2 0 0 4 ) 。克隆的抗病基因主要有两类：抗病毒基因和抗菌基因。抗病毒基因的 研究主要是克隆病毒外壳蛋白基因，通过病毒外壳蛋白基因的导入，并借助交叉保护 作用机理，达到降低病毒侵染的目的( 张艳贞等，2 0 0 0 ) 。抗菌基因主要有几丁质酶基 因、抗菌肽基因和防御素基因。目前已将杨李痘病毒( p p v ) 夕b 壳蛋白基因导入杏中( 林 善枝等，2 0 0 0 ) 。李玮等( 1 9 9 6 ) 已将抗菌肽基因导入杨树。将g l u 和c l l i 基因转入欧 洲板栗( c a s t a n e as a t i r em i l l ) ，提高了对樟疫霉( p h y t o p h t h o r ac i n n a m o m is a c c ) 真菌病 害的抗性。将兔n p 1 基因导入毛白杨，转基因植株组织提取液对枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ( e h r e n b e r g ) c o h n ) 等多种微生物的生长均有不同程度的抑制作用( 赵 3 厚荚相思组岛u 奢养与昂蚪干菌介导遗传麓匕研究 世明等，1 9 9 9 ) 。 1 2 3 抗除草剂基因工程 杂草和苗木竞争养料、水分、空间，严重影响苗木的正常生长，采用机械除草成 本高、效益低，而采用除草剂可以迅速地扑灭杂草，但同时易对苗木和作物造成危害。 因此，有必要通过基因工程将抗除草剂基因导入林木基因组中，使其产生除草剂抗性， 从而大大地降低了除草剂的伤害、降低了成本。 用基因工程手段创造的第一个转基因林木就是2 0 世纪8 0 年代末获得的抗除草剂 杨树( m o f f a t ，1 9 9 6 ) 。在针叶树中，用基因枪法成功地将b a r 基因转入辐射松和挪威 云杉，获得了抗实用除草剂b u s t e r 的转基因的针叶树( b i s h o pe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。抗草甘膦的 转基因欧洲落叶松( s h i n e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。抗膦丝菌素的抗性基因( b a r 基因) 也已被导入辐射 松( p r a d i a t a d d o n ) r 扣，获得了抗实用剂量膦丝菌素的无性系，目前已进入田间试验阶 段，并且正在开展针对磺酰脲类和草甘膦类除草剂的转基因实验( w a l t e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 最近，又获得了抗膦丝菌素的黑挪威云杉( b r u l d i n e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 4 抗逆境基因工程 不少植物生理学家认为，植物体内的小分子化合物如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、 葡萄糖等对于植物忍受环境胁迫的能力具有十分重要的作j 厍 ( d e l u a n e ye ta 1 ，1 9 9 3 ； h u ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 在植物抗寒基因工程方面，a f i s i 等( 1 9 9 8 ) 将拟南芥的f e s o d 基因导入杨树，增加 了杨树抗氧化能力和耐冻性。d o l g o v 等( 1 9 9 9 ) 用根癌农杆菌介导法将抗冻蛋白 ( a f p n a t r f i e e e z ) 导入酸樱桃中，获得转基因植株。在林木的抗盐碱基因研究方面， c e w e r a 等( 2 0 0 0 ) 用根癌农杆菌介导法将耐盐基因h a l z 导入柑桔中，获得转基因植株。 抗旱基因研究方面，洪波等( 2 0 0 5 ) 将转录因子d r e b i a 基因通过根癌农杆菌介导法导 入地被菊花中，提高了地被菊花的抗旱能力，进一步选育出了耐旱节水型地被菊花新 品系。g a l l a r d 等( 1 9 9 9 ) 将松树胞质谷胱甘肽合成酶基因用根癌农杆菌介导法导入杂种 杨株系i n r a 7 1 7 1 b 4 获得表达。温尚昆等( 1 9 9 7 ) 通过根癌农杆菌介导把与抗旱有关的 激素合成基因导入毛白杨，获得再生植株。 1 2 5 材性改良基因工程 木质素是植物细胞次生壁的主要成分，通常占树木干重的1 5 3 5 ，它硬度很大， 在植物生长过程中具有很重要的作用。但是，在制浆的过程中，人们必须去除木质素， 而在这个过程中需要使用一些化学药品和消耗能源，造成很大的环境污染和能源浪 4 厚荚相周巨织培养与农杆菌介导遗传稍匕研究 费。因此，降低林木中木质素的含量和改良木质素的组成，对于提高经济效益和环境 保护都有积极的意义。 加拿大研究者h u 等( 1 9 9 2 ) 从白杨中克隆到4 香豆素辅酶a 连接酶( 4 c l ) 基因，通过 对该基因的反义抑制，使木质素的含量降低了4 5 ，纤维素的含量升高了1 5 ，大大 促进了白杨的生长。t z f i r a 等( 1 9 9 9 ) 用根癌农杆菌介导法将o r l 基因导入欧洲山杨的嫩 茎，研究了茎干生长、腋芽萌发和分枝习性，发现茎干生长速度明显加快。r u g i n i 等 ( 1 9 9 1 ) 用根癌农杆菌介导法将o r l a 基因导入猕猴桃中，明显改变了生长特性。 1 3 厚荚相思研究现状 1 3 1 厚荚相思概况 相思树是热带多年生木本豆科植物，共约1 2 0 0 种，主要分布于热带和亚热带干旱、 半干旱地区，部分分布在湿润、半湿润地区，以澳大利亚昆士兰沿海、巴布亚新几内 亚西南部和印度尼西亚东部等地区分布最为广泛。相思树种喜光照、耐干旱瘠薄、耐 寒能力差：根系发达、具根瘤、萌生力强。多数树种为灌木，少数为乔木。乔木类相 思树生长迅速，年生长高度达1 4 米，属速生型多用途树种。木材为优良的纸浆工业原料， 树皮单宁含量高达4 0 ，是目前发展前途较好的树种之一。我国从7 0 年代开始末开始引 进相思类树种，至今已有2 0 多个品种引进成功，其中大叶相思( a c a c i aa u r i c u l i f o t r o i s ) 、 马占相思( a c a c i am a n g i u m ) , 厚荚相思等在我国南方已开始大规模种植( 潘志刚等， 1 9 9 6 ) 。 厚荚相思( a c a c i ac r a s s i c a r p a ) 又名租果相思，是我国南方新近发展起来的速生 用材林优良树种。其喜湿热气候，最热月平均最高温度为31 3 4 ，最冷月平均最低温度 为1 5 2 2 ，终年无霜，分布区降水1 0 0 0 - - 3 5 0 0 m m ，最低为5 0 0 - 7 5 0 m m , 属夏雨型气候，年 降水日1 0 0 - 1 8 0 天。1 9 8 5 年我国开始引种。厚荚相思具有干形通直、适应性广、耐干 旱瘠薄、病虫害少、能改良土壤和速生丰产等特点，为优质纸浆和用材林树种。厚荚 相思可在砖红壤、红壤及沙地上生长，土质可从粘重壤土至疏松沙土，它耐十分贫瘠且 水土流失严重的土壤，而其他树种几乎很难在此类土壤上生长。厚荚相思到目前为止 尚未发现严重的病虫害，但其存在着抗风、抗寒能力差，生长速度比桉树稍慢等问题 ( 赖家业等，2 0 0 3 ) 。综上所述，厚荚相思所具有的优良特性使其成为我国南方地区 的优良用材林树种和绿化树种。 厚荚相周0 氢够啦奇荞与农杆菌介导遗传转化研究 1 3 2 厚荚相思组织培养体系建立的现状 有关厚荚相思组织培养最早报道的研究是周传明等( 2 0 0 2 ) 作的厚荚相思离体培 养的初步研究，其以厚荚相思种子进行组织培养实验，完成了种子消毒培养、诱导芽的 分化( 用嫩茎在m s 基本培养基中培养，分化率达1 0 0 ) 、丛生芽形成、培养基生根和 炼苗移栽等程序的研究，初步得到了厚荚相思的组织培养体系。尔后蔡玲等( 2 0 0 3 ) 对厚荚相思的外植体组织培养进行了初步研究，初步得到了厚荚相思组培快繁的途径 和方法。与此同时赖家业等( 2 0 0 3 ) 也对厚荚相思的外植体组织培养快速繁殖进行了 研究，获得了较好的实验结果，用n a a 和6 b a 组合对林地采集的嫩茎进行芽诱导，分化 率最高达7 2 2 。 1 3 3 厚荚相思遗传转化体系的研究现状 在遗传转化方面，至今已对杨树、火炬松、花旗松、自云杉、刺槐、桉树等2 0 多个树种进行了遗传转化研究，并已获得许多树种的转基因植株，有的已经进入了田间 试验阶段。而有关厚荚相思的遗传转化研究尚未见报道。本试验旨在优化厚荚相思组 织培养体系的基础上建立厚荚相思遗传转化的技术平台，为进一步转入目的基因改良 树种提供技术依据。 1 4 本研究工作的目的和意义 本研究的目的主要是在前人研究的基础上优化厚荚相思组织培养体系和遗传转 化体系，以建立一个高效的组织培养体系和农杆菌介导的遗传转化体系，为厚荚相思 的遗传改良和苗木的大规模繁殖提供技术支持。 6 厚荚相周0 氢织培养与农杆菌介导遗传转化研究 2 材料与方法 2 1 植物材料 相思品种：厚荚相思( a c a c i ac r a s s i c a r p a ) 组织培养试验材料：厚荚相思种子、无菌苗茎尖和茎段 遗传转化试验材料：厚荚相思的优良无菌组培苗的叶状柄( 叶片) 2 2 试验试剂 2 2 1 植物组织培养用激素 6 苄基氨基嘌呤( 6 b a ) 、激动素( i 汀) 、吲哚丁酸( i b a ) 、吲哚乙酸( i a a ) 、 萘乙酸( n a a ) 。 2 2 2 抗生素和促进转化添加物 卡那霉素( k m ) 、氨苄青霉素( a p ) 、头孢霉素( c e f ) 、硫酸链霉素( s t r ) 用无菌蒸馏水 溶解。乙酰丁香酮( a s ) 用二甲基亚砜溶解，并经0 2 2 u m 的滤膜过滤灭菌，保存在 4 0 c 的冰箱中。 2 2 3g u s 染色液配方 每l o o m l 加入氯霉素1 0 m g ，1 m o l ln a h 2 p 0 45 m l ，1 0 t r i t o nl m l ，甲醇2 0 m l ， x - g l u c8 8 9 m g ，p h 值7 5 ，4 0 ( 2 保存。 2 3 试验方法 2 3 1 厚荚相思组织培养体系的优化 2 311 厚荚相思种子的预处理和消毒灭菌 将厚荚相思的饱满种子装入布袋中，先用洗衣粉搓洗1 0 1 5 分钟，用自来水彻底 洗净，后采用9 8 浓硫酸浸泡处理种子3 0 m i n 和沸水浴处理种子1 0 m i n 。然后把种子洗 净和无菌水一起倒入无菌瓶中浸泡放置2 4 d 时。2 4 d , 时后，转至超净工作台进行灭菌 操作：先用无菌水冲洗一次，后把种子先用7 5 酒精消毒6 0 s ，及用o 1 升汞消毒 1 0 m i n ，最后用无菌水冲洗5 遍后接种在m s 培养基上培养。 2 3 1 2 厚荚相思的接种 厚荚相思种子的接种：灭菌后的种子均匀接入培养基中，每瓶接种2 0 颗。 厚荚相思无菌苗的接种：下胚轴剪成带芽的1 5 2 5 e m 长的小段，每瓶接入l o 段。 2 3 1 3 厚荚相思无菌苗的移栽 7 厚荚相周氢织培爿e j 亨农杆菌介导遗传禁州：研究 当无菌苗主根长至3 c m 左右，苗高4 5 c m 时，即可进行移栽。移栽时先将生根苗连 瓶拿到普通房间内，炼苗3 d 打开瓶盖，向瓶内注入少量水( 在瓶内培养基上面形成大 约3 5 m m 厚的水层即可) ，使瓶苗接触有菌环境，炼苗3 d 后，将生根苗取出，用自来 水洗净根部培养基，栽植到以黄泥为主要成分的基质上。移栽的小苗，浇1 次透水， 然后罩上塑料薄膜袋保湿、遮光，每天通风淋水1 次，淋至叶片湿润即可( 保持湿度 8 0 左右) ，随着幼苗的生长，增加通风时问，2 周后除去塑料薄膜袋。待苗长至3 0 c m 高左右就可以移栽到大田。 2 3 1 4 培养基 厚英相思种子诱导培养基：m s 培养基+ 蔗糖3 0 9 l + 琼脂5 9 l ，p h 5 8 。 继代增殖和生根培养基：以m s 为基本培养基，附加一定种类和浓度的激素。 2 3 1 5 培养条件 本试验均采用光培养，用日光灯以1 5 0 0 2 0 0 0 l x ，1 2 h d 光照，温度为2 5 - 2 8 0 c 。 2 316 数据统计方法 ( 1 ) 不同预处理和清洗消毒方式的影响 接种3 0 d 后观察生长状况，统计不同预处理和清洗消毒方法对种子萌发的影响。 ( 2 ) 腋芽的诱导率 在外植体接种3 0 d 后观察统计结果。腋芽的诱导频率( ) = 诱导出有效芽的外植体数 接种的外植体数x 1 0 0 。每个实验因子重复3 次。有效芽是指长度在1 5 c m 左右，能 进行接种操作的芽。 ( 3 ) 芽的增殖系数 在接种3 0 d 后观察生长情况，统计结果。芽的增殖系数= 再生出的有效芽总数接种 芽个数。每个实验因子重复3 次：有效芽是指长度在1 5 c m 左右，能进行接种操作的芽。 ( 4 ) 芽的生根率 苗接种在生根培养基上3 0 d 后观察生根情况，统计结果。芽的生根率惭户长出 不定根的芽数接种芽数x 1 0 0 。每个实验因子重复3 次。 ( 5 ) 移栽成活率 移苗3 0 d 后统计移栽成活率。移栽成活率= 成活苗数总移苗数x 1 0 0 。 2 3 1 7 数据统计分析软件 采用e x c e l 与s p s sf o rw i n d o w s1 0 0 统计分析软件包对试验观察统计数据进行方 差分析、多重比较等。 8 蕈荚相思翘鸟乏| 鲁爿“穹昂q 干菌介导遗传幸妒化研究 2 3 2 厚荚相思遗传转化受体系统的建立 2 3 2 1 叶盘不定芽的诱导分化与培养方法 从优良株系的苗上选取幼嫩、平整的第1 4 片叶子，由于相思类植物的叶片在生 长过程中会逐渐退化为叶状柄，因才在试验中实际用的是叶片或者叶状柄，叶的色泽、 大小要求基本一致。剪成约o 5 c m 2 的叶盘为外植体，以叶背面距远轴面和培养基接 触的方式接种于各种分化培养基上。 在分化培养基上培养4 0 d 后，开始有不定芽分化出来，将不定芽连着叶盘转接到 伸长培养基上，待芽长到2 c m 左右可转接到生根培养基上。 2 3 2 2 卡那霉素筛选浓度的确定 确定卡那霉素浓度的方法是卡那霉素的浓度能有效抑制非转化细胞的生长，使之 慢慢死亡，而不是直接杀死非转化细胞，因为其周围的非转化细胞对转化细胞有滋养 作用，孤独的转化细胞生长能力很弱，很难形成转化体。本试验采用延迟筛选的方法， 先将外植体接种在不含卡那霉素的分化培养基中预培养5 d ，然后转入含不同卡那霉 素浓度的分化培养基中培养，4 0 d 后观察统计结果。 2 3 2 3 不同抑菌剂使用浓度的确定 在利用农杆菌进行转基因操作之前，需要对受体材料进行抗生素的敏感性测定。 因为在转化过程中，一个很重要的环节就是抑制农杆菌生长，防止农杆菌过度生长而 产生污染，因此，要在培养基中添加既能抑制细菌的生长，又对植物细胞无害的有抑 菌功能的抗生素。本试验采用不同浓度的a p ( 氨苄青霉素) 、c e f ( 头孢霉素) 、s t r ( 硫 酸链霉素) 三种常用的抑菌性抗生素进行试验。 2 3 2 4 培养基 不定芽分化培养基、芽伸长培养基、生根培养基都是采用m s 基本培养基+ 蔗糖 3 0 9 l + 琼n 旨s g l 附加不同浓度的激素和抗生素，p h 5 8 。 2 3 2 5 培养条件 本试验采用暗培养和光照培养相结合的培养方法。暗培养在恒温培养箱中进行， 温度为2 5 0 c 。光照培养时用日光灯以1 5 0 0 , - , 2 0 0 0 l x ，1 2 h d 光照，温度为2 5 - - 2 8 0 ( 2 。 2 3 2 6 数据统计方法 叶盘在不定芽分化培养基上培养4 0 d 后，统计芽的诱导频率和平均芽数。 ( 1 ) 芽诱导频率 芽诱导频率( ) = 长出芽的叶盘数接种的叶盘数1 0 0 。 9 厚荚相月阻岛u 鲁养与弗四干菌介导遗传转化研究 ( 2 ) 平均芽数 平均芽数= 芽的总数诱导出芽的叶盘数。 2 , 3 , 3 厚荚相思遗传转化体系的优化 2 3 , 3 1 菌株和质粒 图2 1 是本试验所用菌株a t 0 6 所含的植物表达载体p b l l 2 1 的图谱，以c a m v 3 5 s 启 动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因