（物理化学专业论文）壳聚糖固定化β半乳糖苷酶的研究.pdf

摘要 摘要 以三氯均三嗪为交联剂，实现了p 半乳糖苷酶在壳聚糖载体上的固定化过程，并与 传统交联剂戊二醛进行了比较。在最优化制备条件下，测定了固定化酶的活性回收率为 4 7 。另外，以三氯均三嗪作为交联剂制备固定化b 半乳糖苷酶，反应条件较戊二醛法 温和，操作简单，耗时短。 比较了不同粘均分子量壳聚糖( 5 0 1 0 4 ，1 0 0 x 1 0 4 ，2 0 0 x 1 0 4 ) 的成球情况及壳聚糖分 子量对固定化酶活力、酶活性回收率的影响，确定了5 0 x 1 0 4 的壳聚糖为最适固定化b 半乳糖苷酶载体。自设计方法制备了毫米级壳聚糖小球，方法较传统方法更加简单、快 速。湿润壳聚糖小球直接干燥和采用体积分数为3 0 的甘油处理后干燥对比实验表明， 后者能够保持小球湿态时的结构，既保证了酶的固定化效果，又有利于载体的工业储存。 以硅胶为致孔剂制备了多孔壳聚糖载体，扫描电子显微镜显示，添加致孔剂的载体 表面( 载体i ) 比未加致孔剂的载体表面( 载体i i ) 具有更多的孔结构。上述两种载体 分别固定米曲霉b 半乳糖苷酶，固定化结果表明：载体i 制备的固定化酶具有更好的酶 活性和酶活性回收率。最后我们对固定化酶的性质：最适p h ，p h 稳定性，最适温度， 热稳定性，操作稳定性以及动力学参数等进行了测定，结果表明：以硅胶为致孔剂制备 的固定化酶各项数据良好，具有更广的应用前景。 关键词 壳聚糖小球p 一半乳糖苷酶固定化硅胶戊二醛三氯均三嗪 a b s t r a c t a b s t r a c t 1 3 - g a l a c t o s i d a s ew a si m m o b i l i z e do nc h i t o s a nm i c r o s p h e r ew i t h2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o - 1 ，3 ，5 - t r i - a z i n ea sc r o s s l i n k e r , a n dc o m p a r e d 、 哇t ht h a tu s i n gg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s l i n k e r a f t e rg e t t i n g t h eb e s tc o n d i t i o n so ft h ec a r t i e r , v a r i o u sf a c t o r sw e r ed i s c u s s e dt od e t e r m i n et h ef i n e s t i m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s t h ee n z y m ea c t i v i t yr e c o v e r yd e t e r m i n e dw a s4 7 a tt h eo p t i m a l c o n d i t i o n t h er e s u l t so b t a i n e ds h o w e dt h a tt h ei m m o b i l i z a t i o nw a ss i m p l ea n de f f i c i e n t s o ， 2 ，4 ，6 一t r i c h l o r o - 1 ，3 ，5 - t r i a z i n ew a sa k i n do fg o o dc r o s s l i n k e rt oi m m o b i l i z ee n z y m e c h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t ( 5 0 x1 0 4 ，1 0 0 1 0 4 ，2 0 0 x 1 0 4 ) w a su s e da s m a t e r i a lt oi m m o b i l i z ei b - g a l a c t o s i d a s e ，t h er e s u l t so b t a i n e ds h o w e dt h a t5 0 x10 4c h i t o s a nw a s t h em o s ts u i t a b l et oi m m o b i l z e1 3 - g a l a c t o s i d a s eb e c a u s ei t sa p p r o p r i a t ev i s c o s i t y , e a s y b a l l ，t h e h i g h e s te n z y m ea c t i v i t ya n dt h er e c o v e r y i na d d i t o n ，an e wm e t h o dt om a k ec h i t o s a n m a c r o s p h e r e sw a s o f f e r e di nt h i sp a p e r , a n di tw a sm u c hs i m p l e ra n df a s t e rt h a nt h et r a d i t o n a l m e t h o d f i n a l l y , i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ed r i e dc h i t o s a nm a c r o s p h e r e sc o u l dk e e pn e a r l yt h e s a m es t r u c t u r ea st h ew e to n ea f t e rb e i n gt r e a t e dw i t h3 0 g l y c e r o ls o l u t i o n w h i c hw a sv e r y u s e f u lt ot h ee n z y m ei m m o b i l z a t i o nw i t l lc h i t o s a nm a c r o s p h e r e sa sc a r r i e ri ni n d u s t r y p o r o u sc h i t o s a nm a c r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e db yu s i n gs i l i c ap a r t i c l e sa sp o r o g e na tt h e f i r s tt i m e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) m i c r o g r a p h ss h o w e dt h a tt h es u p p o r t 晰t 1 1 s i l i c aa sp o r o g e n ( s u p p o r ti ) h a dam u c hm o r ep o r o u ss u r f a c es t r u c t u r et h a nt h es u p p o r t w i t h o u tp o r o g e n ( s u p p o r ti i ) ，t h e nb o t hs u p p o r t sw e r ea p p l i e dt oi m m o b i l i z e1 3 - g a l a c t o s i d a s e f r o ma s p e r g i l l u so r y z a e ，m u c hh i g h e rs p e c i f i ca c t i v i t ya n da c t i v i t yy i e l dw e r eo b s e r v e df o r t h es u p p o r ti f i n a l l y , p r o p e r t i e so f b o t hi m m o b i l i z e de n z y m ew e r ed e t e r m i n e da n dc o m p a r e d 、析t 1 1t h ef r e ee n z y m e s a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e di nt h e r m s t a b i l i t y , p ha n do p e r a t i o n a l s t a b i l i t y , m i c h a e l i sc o n s t a n t sk ma n d t h em a x i m u m v e l o c i t y ( ) r e s u l t sa b o v es h o w e dt h a t t h ee n z y m ep r e p a r e db yu s i n gs i l i c ap a r t i c l e sa sp o r o g e ni sv e r yg o o d ，a n di tw i l lh a sm o r e a p p l i z a t i o n k e y w o r d sc h i t o s a nm a c r o s p h e r e si b - g a l a c t o s i d a s ei m m o b i l i z a t i o ns i l i c a g l u t a r a l d e h y d e 2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o 1 ，3 ，5 - t r i a z i n e i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 丛盎 日期：羔盟2 年上月j 三一日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密由 ( 请在以上相应方格内打“4 ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 壳翼稳固娅乡畔致删砣唧缓 的学位论文，是我个人在导师9 j 鹕) 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：盈生整l 一日期：埠年j l 月上日 作者签名：乏丛垒 导师签名： 丕! ! ：盏豸 日期：单年l 月上日 日期：毕年丘月上日 第1 章综述 第1 章综述 1 1p 一半乳糖苷酶的性质及应用 b 一半乳糖苷酶( p - g a l a c t o s i d a s e ) 又称p - d 半乳糖苷半乳糖水解酶( p d - g a l a c t o s i d e g a l c a t o - h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 2 3 ) ，商品名为乳糖酶( l a c t a s e ) 。p - 半乳糖酶能够催化乳糖及其 它p 半乳糖苷的水解反应，将一分子乳糖水解成一分子葡萄糖和一分子半乳糖；另外乳 糖酶还具有转半乳糖苷的作用【l 】，主要用于乳制品加工。 p 半乳糖苷酶来源主要有：植物、细菌、真菌、哺乳动物【2 1 。利用微生物发酵法制 取b 半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置 等因素的影响。 旱在1 9 4 4 年w h i t t e r 3 】就比较全面的讨论了p 半乳糖苷酶的应用。p 半乳糖苷酶在 食品工业的应用十分广泛。首先，在低乳糖乳制品中，乳糖酶将乳糖已经分解成葡萄糖 和半乳糖，增加了产品的甜度和营养价值，也使乳糖不耐症患者可以顺利消化吸收。还 可以防止乳制品冷冻时出现结晶，若在加工中添加2 5 3 0 的乳糖酶水解乳，可防止因 结晶而出现的质量问题f 4 】。乳清中含有乳清蛋白、乳糖、矿物质和维生素等营养成分， 其中乳清蛋白是完全蛋白质。可其中的5 0 当废水排放，不仅造成浪费，而且污染环境。 用p 半乳糖苷酶将乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清饲料的营养价值，同时去除了乳 清浓缩时乳糖结晶析出给饲料加工带来的不便。此外，用此水解物还可生产乳清饮料、 糖浆、食品添加剂等【5 囊】。其次，p 半乳糖苷酶可以生产低聚半乳糖。低聚半乳糖是以牛 乳或乳清中的乳糖为底物，经p 半乳糖苷酶催化作用而得到的。低聚半乳糖的热稳定性 较好，即使在酸性条件下也是如此，并且具有许多生理功能，如作为双歧杆菌增殖因子； 能促进钙质吸收和防止骨质减少；有利于促进有机酸生成，降低肠道p h 值，抑制外源 菌的生长代谢；有利于b 族维生素产生；低能量；低致龋齿性；改善脂质代谢等f 7 8 】。 再次，p 半乳糖苷酶是酶类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、 由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻，由感冒及消化不良等引起的 继发性腹泻。加入牛乳中则可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐症【9 j 。 目前b 半乳糖苷酶并未在中国食品和乳制品工业中得到广泛应用，主要原因是：1 3 半乳糖苷酶的单位产量较低；市场上销售的d 半乳糖苷酶的耐热性差、适用范围窄；直 河北大学理学硕十学佗论文 接将d 半乳糖苷酶加入牛奶中进行水解，酶的需要量较大，成本较高，也成为发展低乳 糖制品的不利因素。 随着研究的不断深入，微生物发酵法生产的d 半乳糖昔酶活性会进一步得到提高。 如果在国内能够实现b 半乳糖苷酶的工业化生产，其制品的生产和应用成本将会大幅度 降低。因此，p 半乳糖苷酶具有广阔的市场前景，并且会取得相当可观的经济效益和社 会效益。 1 2 固定化酶的研究进展 酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质，作为一种生物催化剂，酶参与 生物体内的各种代谢反应，而反应后其数量和性质不发生变化。同一般催化剂相比，酶 具有催化效率高，专一性强，反应条件温和，酶的活性可调节控制和来源广泛等。天然 酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难。因而对于价格 昂贵的酶来讲，使用受到限制。于是通过物理或化学的方法，将酶固定在载体上，形成 固定化酶，不仅保留了酶原有的活性及高度选择性，并克服了天然酶的缺点，还便于反 应的连续化和自动化，因而引起人们的广泛重视i l 0 1 。 固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于固定化制备的物理、化学手 段及材料等多种多样。制各固定化酶要根据不同情况( 不同酶、不同应用目的和应用环 境) 来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原 则：用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。必 须注意维持酶的催化活性及专一性，要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条 件。固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产 量。酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。固定化 酶应有最大的稳定性，所选载体不与底物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成 本要低，以利于工业使用。 迄今为止，寻找合适的固定化方法和载体是固定化酶研究的重要组成部分。近几年 采用的酶的固定化方法的种类显著增加，有吸附法【1 1 1 、包埋法【1 2 1 、载体结合法【13 1 、交 联法【1 4 】等。吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。该法条 件温和，对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，酶易从载体脱落并污染催 化反应产物等。包埋法有凝胶包埋、纤维包埋、辐射包埋法、微胶囊化等。近年来由于 2 第1 章综述 天然高分子化合物固有的无毒性，固定化条件温和、传质性能好的优点，人们开始越来 越多的用这类高分子做包埋剂，尤其是海藻酸钙、卡拉胶和壳聚糖f 9 】等。载体结合法是 将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法，根据结合的形式不同又可分为物理吸附 法、离子结合法和共价结合法三种。交联法是通过双功能或多功能基试剂使酶分子间或 酶分子与载体之间或酶分子与惰性蛋白之间发生交联而形成网状结构的固定化方法。此 法与共价结合法一样，也是利用共价键固定化酶，所不同的是它不使用载体。 综上所述，不同的固定化方法，因它们的固定化机理不同，固定化的难易程度和效 果也大不相同，影响固定化酶效果的两个重要因素是固定化方法和固定化载体。虽然固 定化方法及固定化载体较多，并用于多种酶，但是迄今为止，几乎没有一种固定化技术 或载体能普遍适用于每一种酶，因为各种酶的化学特性和组成差别很大，底物和产物性 质不同，产物的用途也不一样。因此，对任何一种酶的固定化，其载体和方法的选择都 更多的依赖实验结果。 固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。然而，真 正投入工业化应用的固定化酶却不多，原因是固定化使用的试剂和载体成本高、固定化 效率低、稳定性差、连续操作使用的设备比较复杂。进一步开发酶活高、半衰期长的固 定化方法以及性能更加优异的固定化载体，使更多的固定化酶和细胞取得工业规模应 用，仍然是这个领域追求的目标。 1 3 壳聚糖在酶固定化领域的应用 不同的固定化方法，因它们的固定化机理不同，固定化的难易程度和效果也大不相 同，影响固定化酶效果的两个重要因素是固定化方法和固定化载体【l 引。甲壳素在自然界 中广泛存在于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等生 物体中。甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖( 即壳聚糖) ，壳聚糖作为甲壳 素的重要衍生物，被广泛地应用于医药、纺织工业、造纸、印染、日用化工、食品、农 业、环保等领域。壳聚糖在密闭干燥容器中保存，在常温下3 年内不变质；吸湿或遇水 引起分解反应；温度升高会加速分解反应：在干燥状态下，高温也会引起分解反应，但 分解速度缓漫。 由于壳聚糖来源丰富、廉价，结构上具有许多- n h 2 、o h 等反应基团，对蛋白质具 有极高的亲和性，具有良好的吸附性能和生物相容性，而且壳聚糖具有堆积密度低、安 3 河北大学理学硕十学位论文 全无毒等优良特性，近年来，壳聚糖类载体是近年来国内外研究最热门的固定化材料之 一，而以壳聚糖为载体用共价连接法固定化酶是研究最活跃的酶固定化方法。酶分子中 含有游离的氨基、羧基、酪氨酸残基中的酚基、半胱氨酸残基中的巯基等官能团，采用 适当的载体和化学试剂，可以将这些官能团通过化学反应而共价地结合到载体上。由于 共价键键能大，用这种方法固定化的酶一般不会渗漏，因此如何选择载体和交联剂，使 酶固定化后最大限度地保持活力成为此类研究的重点。壳聚糖可通过物理吸附固定化 酶，载体上的游离氨基也可以与戊二醛发生反应，戊二醛再与酶上的氨基发生反应。这 样酶和载体可共价地结合成固定化酶。材料的亲水性主要受其本身的极性、荷电性和氢 键结合能影响。高分子水凝胶如海藻酸、壳聚糖、聚乙烯醇等都含有许多羟基或羧基， 都具有较强的亲水性，适宜于包埋亲水性酶【l 酬。 壳聚糖可以以凝胶、球、膜、粉末、微囊等形式作为固定化酶载体。姜梅等 1 7 。s 】 研究了以壳聚糖膜为载体固定化葡萄糖氧化酶，指出固定化酶、溶液酶的最适p h 值均 为5 5 ：固定化酶、溶液酶的最适温度分别为4 0 ( 2 和3 5 ；固定化酶的米氏常数大于溶 液酶的米氏常数，固定化酶与底物的亲和力较自由酶有所下降；酶的固定化提高了酶的 热稳定性、贮藏稳定性、操作稳定性和重复利用率。蒋挺大1 1 9 】综述了壳聚糖对十几种酶 和活细胞的固定化作用，并且指出用壳聚糖凝胶作载体，会影响物料的流通性，不能较 长时间的连续生产，故需使用交联的珠状壳聚糖凝胶树脂来解决这个问题。目前固定化 酶所用的壳聚糖载体小球粒径多分为三种：纳米级，微米级和毫米级。壳聚糖小球在 p h 3 5 的缓冲液中会带负科2 0 1 。p 半乳 糖苷酶也具有类似的性质，所以实验中在一定量柠檬酸缓冲液中加入适量的壳聚糖小球 和b 半乳糖苷酶进行吸附，然后用一定浓度的戊二醛交联，就可得到固定化酶。 壳聚糖凝胶形成的微球具有网状结构，机械性能良好，化学性质稳定，耐热性好， 特别是其分子中存在的大量氨基使它能在p h6 5 以下的酸性溶液中溶解【2 1 1 ，既易与酶 共价结合，又可络合金属离子，使酶少受金属离子的抑制，同时它又易于通过接枝而改 性口劲，所以，壳聚糖微球的开发前景十分广泛。 x i a n f a n gz e n g 和e l ir u c k e n s t e i n 以硅胶为致孔剂制备了多孔的壳聚糖膜【2 3 】，但是 关于如何制备表面疏松多孔的壳聚糖微球却鲜见报道，尤其是制备储存方便，用致孔剂 来制备多孔的壳聚糖载体国内少见。所以，摸索制备疏松多孔、球形较好的壳聚糖微球， 4 第1 市综述 以便为制备性能良好的可作为固定化酶载体的壳聚糖微球提供理论依据。人们期望制备 多孔的壳聚糖微球以增加微球的表面积，增加酶分子与壳聚糖分子的接触机会，有利于 壳聚糖吸附酶分子及与酶分子交联，从而增加单位载体负载的酶量，增大固定化酶的效 率。如何充分利用天然高分子载体，对其改性，进一步提高转化率和生产能力，必定会 成为研究的热点p 4 。 1 4 本文的研究内容及意义 本文第2 章以二氧六环、甲苯混合物为溶剂( 体积比5 i ) ，探讨了三氯均三嗪和壳 聚糖载体小球在非水溶液中的交联化反应，并且对交联条件进行了最优化摸索。以得到 的三氯均三嗪活化壳聚糖小球为载体，实现了p 半乳糖苷酶的固定化，所得结果和传统 方法一戊二醛交联法进行了比较。 在第3 章，自设计方法制备了干燥不缩孔的壳聚糖载体。壳聚糖小球做固定化酶载 体一般是湿润的，4 。c 下保存，而这样做使载体储存不方便，且浪费能源，不利于工业 化应用。用甘油对制备的壳聚糖小球后处理，得到的干燥壳聚糖小球能够保持湿润小球 的多孔结构。 在第4 章，选择硅胶为致孔剂，制备出多孔的壳聚糖固定化酶载体。制备依据：壳 聚糖能溶解在碱性介质但不能溶解在酸性介质中，而硅胶能溶解在酸性介质中但不能溶 解在碱性介质中。这种相反的性质使我们能够以硅胶颗粒为致孔剂制备多孔壳聚糖小 球。为对比实验效果，我们以硅胶为致：l 齐u 得到的载体( 载体i ) 和未加致孔剂得到的 载体( 载体i i ) 用于固定化b 半乳糖苷酶，并对固定化效果进行了比较。 河北大学理学硕十学位论文 第2 章壳聚糖固定化p 半乳糖苷酶的研究 2 1 前言 p 一半乳糖苷酶广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及动物肠道中，p 半乳糖苷 酶的性质随来源不同而异。d 半乳糖苷酶主要用来治疗乳糖不耐受症，处理加工牛乳、 乳清等含乳糖产品，生产低乳糖牛奶和乳制品，以及生产功能性低聚半乳糖。近几年随 着人们对乳糖不耐受症认识的深入d 半乳糖苷酶在食品和乳制品工业中的作用日益显 著。 为了节约酶用量，使其适用范围更广，可将p - 半乳糖苷酶固定化。固定化d 半乳糖 苷酶载体种类有很多，主要有纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、凝胶材料、有机 合成聚合物、磁性粒子和无机材料等嘲。本文采用研究较成熟的壳聚糖作为固定化酶载 体。壳聚糖作为固定化酶载体除具有机械性能好，化学性质稳定，耐热性好等优势外， 还含有游离氨基，此氨基对各种蛋白质亲和力非常高，易与酶共价结合，又可络合金属 离子，如c d 2 + ，c u 2 + ，n i 2 + ，使酶免受金属离子的抑制，同时又易通过接枝而改性，其 开发前景十分广泛。 本文以自制壳聚糖小球作为载体，以2 ，4 ，6 三氯均三嗪为交联剂，实现了b 半乳糖 苷酶的固定化，确定了制备壳聚糖载体小球的影响因素，摸索了活化壳聚糖载体和8 半 乳糖苷酶固定化的最佳条件，测定了酶的活性回收率。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与仪器 w f z 8 0 0 d 3 a 紫外可见分光光度计( 北京第二光学仪器厂) 、d z f 型真空干燥箱( 北 京中兴伟业仪器有限公司) 、p h s 3 c 精密级数字式酸度计( 上海虹益仪器仪表有限公 司) 、s h a b 水浴恒温振荡器( 金坛市华峰仪器有限公司) 。 甲壳素( 浙江玉环红星生化制品厂) 、d 半乳糖苷酶( 哈尔滨美华生物技术有限公 司) 、邻硝基苯酚p d - 半乳糖苷( o n p g ) ( s i g m a 公司) 、2 ，4 ，6 三氯均三嗪、戊二醛等均 为分析纯。 2 2 2 酶和底物溶液的制备 原酶液：称取5 0 0 0 0g1 3 - 半乳糖苷酶，用适量柠檬酸缓冲溶液溶解，然后定容至2 5 0 6 第2 章壳聚糖同定化$ 一半乳精苗酶的研究 m l 。 底物o n p g ：称取0 0 7 5 1go n p g ，用适量蒸馏水溶解，然后定容至5 0m l 。 2 2 3 壳聚糖制备 参照文献【2 6 】，称耳7 , 2 0g 甲壳素，加入到含有2 0 0m l4 0 n a o h 溶液的烧杯中，沸 水浴中机械搅拌。反应产物经抽滤后，固形物用1 的n a c l 溶液和蒸馏水反复冲洗至中 性，最后将两样品放入通风干燥箱里，于1 0 5 通风干燥至恒重，即得一定脱乙酰的壳 聚糖载体1 和壳聚糖载体2 。 2 2 4 壳聚糖的脱乙酰度测定 准确称取0 1g 左右样品，置于2 5 0m l 三角瓶中，加入0 1 0 5 8m o l l 盐酸标准溶液 1 5m l ( 用基准碳酸钠标定) ，搅拌0 5 1h 至完全溶解。以甲基橙为指示剂，用0 1 0 5 3 m o l ln a o h 标准溶液滴定过量盐酸至终点。另取一份样品置于1 0 5 干燥箱中烘至恒 重，测定试样水分含量。计算方法： d d = ( c l v l c 2 v 2 ) x 0 0 1 6 g ( 1 0 0 - w ) x 0 0 9 9 4 ) x 1 0 0 其中c 1 ，c 2 ，v l ，v 2 分别为盐酸标准溶液浓度( t o o l l ) ，n a o h 标准溶液浓度( m o l l ) ， 滴加盐酸标准溶液体积( m l ) ，消耗n a o h 标准溶液体积( m l ) ；g - 试样重量( g ) ； w ：试样水分百分含量( ) ；0 0 1 6 ：与1m llm o l l 盐酸相当的胺量( g ；0 0 9 9 4 ： 壳聚糖中理论胺基含量( 1 6 1 6 1 ) 。 2 2 5 制备壳聚糖载体 参照文献1 2 7 】，称取一定量的壳聚糖溶于一定浓度的h a c 中，用注射器( 1 0 m l 注射 器，5 号针头) 逐滴滴加到由n a o h 溶液和甲醇溶液组成的固化剂中，壳聚糖立即形成 均匀的小球，用蒸馏水洗涤小球至中性后，于8 5 通风干燥后保存备用。 2 2 6 三氯均三嗪活化壳聚糖载体 取一定量载体小球用p h7 的柠檬酸缓冲液浸泡9 0m i n ，用滤纸吸干表面水分备用。 在适量二氧六环、甲苯混合溶剂中加入定量的三氯均三嗪并使其溶解，不断搅拌下加 入载体小球使之发生反应，控制反应温度，待反应结束后过滤，用甲苯和丙酮彻底洗涤 固形物，除去表面未反应的交联剂，用缓冲溶液洗涤晾干得活化载体小球。 2 2 7p 半乳糖苷酶在三氯均三嗪活化载体上的固定化 取适量酶液( p h 为7 柠檬酸缓冲溶液配制) ，加入适量活化载体小球，在恒温水浴 7 河北大学理学硕十学位论文 a 丫a n v n a n h 2 帕a 巧匦i c h i t o s a n 卜- m c 蝎电 1 吣a h 2 n e n z y m e 一一匣卧 b u f f e r z y m e a 图2 ，1三氯均三嗪法固定化酶过程 f i g 2 1t h ec o u r s eo f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nw i t h2 ，4 ，6 - t r i c h l o r o - 1 ，3 ，5 - t r i a z i n ea sc r o s s l i n k i n gr e a g e n t 2 2 8 戊二醛法固定化p 半乳糖苷酶的过程 称取定量壳聚糖小球，用柠檬酸缓冲液浸泡，取出并用滤纸把表面水分吸干，加 入一定量o 5 的戊二醛，缓缓搅拌3 0m i n ，室温下静置过夜。用缓冲液抽洗除去多余 的戊二醛，然后加入适量酶液( p h7 的柠檬酸缓冲液配制) ，放入4 冰箱过夜，次日 用柠檬酸缓冲液洗去未交联的酶【2 6 】，即得固定化酶。 2 2 9 酶活力的测定 2 2 9 1 邻硝基苯酚标准曲线的绘制 取邻硝基苯酚o 1 4 0 0g ，放入5 0m l 烧杯中，加入适量蒸馏水使之溶解后，定容至 5 0r n l ，充分混匀，吸取该溶液配制浓度分别为1 、0 5 、0 2 5 、o 1 2 5 、0 0 6 2 5 、0 0 3 1 3m m 的溶液，用分光光度计在4 0 5n r f l 处测定吸光度，用蒸馏水作空白对照，测定各溶液的 吸光度。线性关系如图2 2 。 第2 章壳聚糖同定化】3 一半乳糖茚酶的研究 0 0 0 5 10152 0 c o n c e n t r a t i o n ( m g m l ) 图2 2 邻硝基苯酚标准曲线 f i g 2 2t h es p e c i f i c a t i o nc u t v eo fo - n i t r o p h e n o l 2 2 9 2 自由酶和固定化酶的测定 自由酶活力测定：按文献【2 8 】进行操作，吸取酶液0 1m l 于试管中，加一定量的缓 冲溶液，放入4 0 的恒温水浴，恒温2r a i n 后，迅速加入底物o n p g ，摇匀，记时1 5 m i n ，吸取2m l1m o l l 的碳酸钠溶液于试管中终止反应。待反应液降至室温后，在波 长4 0 5i 蚰处测吸光度，用失活酶液作参比。 固定化酶活力测定：称取固定化酶0 0 2 5g 于试管中，其余操作同自由酶活力测定， 参比液为相同量的缓冲溶液，o n p g 和碳酸钠溶液。 酶活力单位的定义：在规定条件下，每分钟能释放出1 岬o l 邻硝基苯酚的酶量称 之为1 个乳糖分解酶单位。 2 3 结果与讨论 2 3 1 壳聚糖脱乙酰度的定性定量研究 碱量法测定壳聚糖载体1 脱乙酰度为7 4 5 1 ，壳聚糖载体2 脱乙酰度为9 1 3 2 ， 实验结果表明反应时间越长，脱乙酰度越高。脱乙酰度高的壳聚糖所含氨基较多，固定 化酶效果较好。 2 3 2 壳聚糖小球制备的影响因素 在壳聚糖小球的制备过程中，以小球的大小、形状和强度来表征各因素的影响。分 别对固化液组成和壳聚糖浓度对壳聚糖颗粒的影响进行了探讨。当壳聚糖浓度为5 ( w v ，用质量分数4 的h a c 配制) 时，固化液( 质量分数2 0 n a o h 与3 0 甲醇混 9 眈 河北大学理学硕十学位论文 合液) 组成对小球的影响如表2 1 所示，结果表明：当2 0 n a o h 与3 0 甲醇比例为1 1 5 时成球效果最好，小球粒径为2m m 。 表2 1固化液组成对小球的影响 t a b l e2 1t h ee f f e c to ft h ec o m p o s i t i o no fc o a g u l a t i o nl i q u i do nt h em a c r o s p h e r e s 崮化液组成 成球效果( 未干燥的小球) ( 2 0 n a o h 3 0 i 手t 醇) 粒径( r a m ) 强度 当固化液组成一定时( 2 0 n a o h 3 0 甲醇为l 1 5 ) 壳聚糖浓度对小球的影响如表 2 2 所示，结果表明：壳聚糖浓度为5 时操作性和成球效果都很好。 表2 2 壳聚糖浓度对小球的影响 t a b l e2 2t h ee f f e c to ft h ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a no nt h em a c r o s p h e r e s 壳聚糖浓度( w v )成球效果 l 2 5 5 6 溶液粘度低，易操作，但不成球 溶液粘度低，易操作，成片状物 溶液粘度适中，易操作，成球且强度适中，不易破碎 溶液粘度高，较难操作，小球强度高 2 3 3 三氯均三嗪法制备活化壳聚糖载体 在活化载体小球的制备过程中，分别摸索了反应温度、反应时间和三氯均三嗪的浓 度对活化载体制备过程的影响。 反应温度是我们固定化酶过程中个非常重要的因素，反应温度不同，三氯均三嗪 上被取代的氯原子数目不同。曾有文献报道【2 9 1 ，当温度达到5 ，一个氯原子被取代， 当反应温度达到2 5 ，两个氯原子参与反应，反应温度达到9 0 时，三个氯原子全 1 0 第2 章壳聚糖同定化b 一半乳糖茁酶的研究 部参加反应。在三氯均三嗪浓度和反应时间均不变的情况下，分别在5 8 ，9 1 2 ， 1 3 1 6 ，1 7 2 0 反应3h ，实验结果表明：5 8 下酶活力达最大，温度升高，酶活 力反而降低，参见图2 3 。原因可能是随温度升高，第二个氯原子参与载体活化反应， 导致固定化酶过程中活性氯原子减少，从而固定化酶活性较低。 零 一 套 ； 芑 n e ，、 n c o 瓮 面 芷 1 0 0 5 0 5 - 8 9 - 1 213 - 1 6 1 7 - 2 0 t e m p e r a t u r e ( 。c ) 图2 3反应温度对载体活化的影响 f i g 2 3e f f e c to fr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo i le n z y m ea c t i v i t y 在反应时间和反应温度一定的情况下，随三氯均三嗪浓度的增加，单位载体上酶活 力不断增加，如图2 4 所示，当2 4m l 混合溶剂中含有0 0 4g 三氯均三嗪时，单位载体 上酶活力达到最大值，继续增加交联剂浓度，酶活力反而下降。这可能是脱乙酰度一定 时，壳聚糖分子中游离氨基( n h 2 ) 的数值一定，当三氯均三嗪浓度较低时，壳聚糖小 球上的活性基团相对较少，载体小球固定的酶量也较少，因而固定化酶活力较低。随着 三氯均三嗪浓度的增加，壳聚糖分子中被活化的氨基数量不断增加，相应的酶量也增加。 但当三氯均三嗪的浓度过大时，壳聚糖小球上过多的活性基团导致酶分子与载体之间形 成多点结合，这样会产生空间结构障碍，且酶分子的活性中心有可能受到多余的活性基 团束缚，使酶活性中心结构发生改变，从而使固定化酶的表观活力下降。因此，选择的 最佳浓度是，在2 4m l 混合溶剂中加入0 0 4g 三氯均三嗪和0 0 2 5g 载体小球。 河北大学理学硕十学位论文 0 0 3 00 0 3 50 0 4 00 0 4 50 0 5 00 0 5 50 0 w e i g h to f2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o 一1 3 5 - t r i a z i n e ( g 2 4m ls o l v e n t ) 图2 4 三氯均三嚎浓度对载体活化的影响 f i g 2 4 e f f e c to f t h ec o n c e n t r a t i o no f2 ，4 ，6 - t r i c h l o r o 一1 ，3 ，5 - t d a z i n eo na c t i v a t e dc h i t o s a n 在三氯均三嗪浓度和温度最优化条件下，分别反应不同的时间，当反应时间为1 5 m i n 时，每单位载体上酶活力达到最大值，反应时间超过1 5m i n ，酶活力反而下降。这 可能是由于随时间的延长，连接到壳聚糖上的三氯均三嗪较多，在固定化酶时导致酶的 多点联接，影响其空间结构，从而使酶活力减小。因此，我们选择1 5m i n 作为制备活 化载体小球的最佳时间。 2 3 4d 半乳糖苷酶的固定化过程 在d 半乳糖苷酶固定化过程中，分别讨论了反应温度、反应时间和酶量三种因素对 固定化反应的影响。 首先，在不同的温度下( 2 5 4 0 ) ，我们分别实现了p 半乳糖苷酶在活化载体小球 上的固定化，并测定了各温度下所得到的固定化酶活力。结果表明：当反应温度为2 5 时，所得到的固定化酶活力最高。这主要是由两种原因造成的：其一，随着反应温度的 升高，固定化速率增加；其二，反应温度升高，酶失活的速率增加，两者的共同作用使 得当反应温度为2 5 时，酶活性回收率最高，因此，选择2 5 为固定化温度。其次， 测定了反应时间对酶活性的影响，如图2 5 所示，当反应时间为6 0m i n 时，固定化酶 活力达到最大值，随着固定化时间的延长，固定化酶活力反而稍有下降。最后，测定了 p 半乳糖苷酶的量对酶固定化过程的影响，如图2 6 。结果表明单位载体上酶活力随着 原酶液的增加而升高，酶液达到一定值后，再增加其量，单位载体上酶活力反而有所下 1 2 一零一备至：i。哪mexnco心ilel9叱 第2 章壳聚糖同定化1 3 一半乳糖苗酶的研究 降。这可能是酶量较少时，固定在小球上的酶量也较少，固定化酶的活力较低；但当酶 量过大时，大量的酶被固定在小球上，酶分子紧密聚集在一起，使酶分子相互之间空间 重叠，造成酶活性中心空间结构发生变化，从而使固定化酶的表观活力下降。对酶活性 回收率而言，随着酶浓度的不断增加，酶活性回收率反而下降，这是由于酶活性回收率 既和载体上可连接的酶量有关，又和加入的总酶量有关，而前者的数目是有限的，在本 实验中，我们选择酶活力和酶活性回收率均很高的原酶液量o 。3m l 作为最适酶量。 2 04 0801 1 2 01 4 0 t i m e ( h ) 图2 5反应时间对酶活性的影响 f i g 2 5e f f e c to f r e a c t i o nt i m eo ne n z y m ea c t i v i t y 0 00 20 40 60 8 1 o e n z y m ev o l u m e ( m l ) 图2 6 酶量对l 迥定化酶活力的影响 f i g 2 6e f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a t i o no ne n z y m ea c t i v i t y 1 3 鹪 舛 昭 一零一参至乞再e裔cm三19叱 阳 加 加 一零一参i右西me奇rum miieia匣 河北大学理学硕十学位论文 2 3 5 三氯均三嗪法与戊二醛法固定化p 半乳糖苷酶的比较 以三氯均三嗪为交联剂，在上述最佳条件下得到的固定化酶与以戊二醛为交联剂， 按文献【2 6 1 中最佳条件下制得的固定化酶相比较，结果表明：戊二醛法制得的固定化酶活 性回收率为3 7 ，而三氯均三嗪法制得的固定化酶活性回收率为4 7 ，远高于戊二醛法 得到的结果，这可能是由于戊二醛发生自交联反应，不能有效的固定化酶而造成的，除 此以外三氯均三嗪法固定化酶反应条件更为温和，操作更为简单。 2 4 结论 本文以二氧六环、甲苯混合物为溶剂( 体积比5 1 ) ，首次实现了三氯均三嗪和壳聚 糖载体小球在非水溶液中的交联化反应，并且对交联条件进行了最优化摸索。以得到的 三氯均三嗪活化壳聚糖小球为载体，实现了p 半乳糖苷酶的固定化，并且对实验条件进 行了最佳化处理。同时，我们以壳聚糖小球为载体，以戊二醛为交联剂，参照文献中的 最佳条件，实现了p 半乳糖苷酶的固定化。结果表明：两种方法固定化p 半乳糖苷酶， 重复性均很好，但三氯均三嗪法固定化p 半乳糖苷酶条件更为温和，得到的固定化酶具 有更高的酶活力和酶活性回收率，除此之外，三氯均三嗪价格便宜，具有更大的应用价 值。 1 4 第3 章干燥不缩孑l 壳聚糖小球的制备 第3 章干燥不缩孑l 壳聚糖小球的制备 3 1 前言 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，甲壳素在自然界中广泛存在于节肢动物、软体动物、 环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等生物体中，是地球上产量仅次于纤维素 的第二大可再生资源壳聚糖是一种网状结构，具有良好的的机械性能、稳定的化学性 质，同时又易通过接枝而改性，再加上其来源丰富、成本低廉、制备简单，是一种很有 开发利用前景的固定化酶载体，近年来受到国内外学者的广泛重视【3 0 。3 2 1 。 脱乙酰度和相对分子质量是表征壳聚糖的两个主要特征参数，其中相对分子质量大 小与壳聚糖的来源及制各方法均有关。作者通过调研文献发现，目前，有关酶的固定化 效果与壳聚糖相对分子质量的有关研究未见报道。 天然状态的壳聚糖大部分是粉末状，比表面积大，作为酶的固定化载体，则使固定 化酶难以回收，从而限制其应用。因此，人们通常把壳聚糖粉末制成小球。毫米级小 球由于其粒径大小适宜，受到人们的青睐。目前，关于毫米级小球的制各，多用注射器 挤压法【2 3 2 4 1 ，操作简单，但浪费人力。 湿润的壳聚糖小球内含