毕业设计（论文）-利用ISSR分子标记对39份莲藕种质的遗传多样性分析.doc

本科毕业论文设计 题目 利用ISSR分子标记对39份莲藕 种质的遗传多样性分析姓 名 指导教师 2010年5月18日利用ISSR分子标记对39份莲藕种质的遗传多样性分析摘要：本研究首先优化了莲藕DNA的提取方法，采用正交设计方案对莲藕ISSR-PCR反应体系从4因素3水平进行了优化，用优化后的反应体系对引物进行了筛选，然后用得到的引物对39份莲藕DNA样品予以扩增，并对莲藕的遗传多样性进行了系统分析。通过正交实验得到了莲藕PCR扩增的最佳反应体系，利用该体系从设计的18条引物中筛选出了8条适合莲藕ISSR-PCR扩增的引物，共扩增出59条DNA条带，其中多态性条带37条，多态比率（PPT）为62.71%，平均每条引物扩增出7.36条带。利用NTSYS-pc软件对扩增的莲藕的遗传多样性分析表明，39份莲藕的遗传系数在0.63-0.98之间，用UPGMA聚类分析，在遗传系数0.74处可以把39份莲藕样品分为2大类，在0.80处可以分为5大类。表明莲藕的遗传差异较小，与传统的分类结果相似，为莲藕分类鉴定和优良品种选育作参考。关键词：莲藕； DNA提取；正交设计；ISSR分子标记；遗传多样性Analysis of genetic diversity of 39 Lotus root cultivars by using ISSR markersAbstract: This research optimized the DNAs extraction method of lotus root. Used the orthogonal design scheme to optimize lotus ISSR - polymerase chain reaction (PCR) system from four factors and three levels, then used the optimized reaction system to screen primers and amplified the 39 samples of lotusDNA with the seleted primers. The genetic diversity of the lotus were analysed. In the research, We obtained the best reaction system of lotus PCR amplification through the orthogonal experiment, using this system pick out eight of those lotus ISSR-PCR amplification primers from 18 designed primers. obtained 59 DNA bands totally, and there are 37 polymorphic bands, polymorphism ratio is 62.71%, every primers can amplify 7.36 bands on average. Using the NTSYS-pc software to analyse the lotus genetic diversity, result shows that genetic coefficient of 39 samples of lotus are between 0.63 and 0.98, use the UPGMA for clustering analysis, we can divide the 39 lotus samples into two types at the 0.74, and in 0.8 place they can be divided into 5 types. This papper provides the reference for identification , classification and fine varieties breeding of lotus.Key words: Lotus root; germplasm resources; extraction of DNA; ISSR; genetic diversity目 录文献综述1 1 莲藕的生物学特性12 ISSR分子标记及其在植物中的运用22.1 ISSR在品种鉴定和种质资源收集中的应用32.2 ISSR在遗传多样性和系统进化关系中的应用32.3 ISSR在遗传作图、基因定位及标记辅助选择中的应用41 前言52 材料和方法52.1 实验材料52.2 实验药品、仪器及试剂的配制72.3 莲藕DNA的提取及检测82.4 引物设计与PCR反应体系的优化92.5 ISSR-PCR引物筛选 122.6 不同莲藕样品的ISSR-PCR扩增122.7 数据统计分析123 结果与分析123.1 DNA质量检测123.2 ISSR-PCR反应体系的优化143.3 ISSR-PCR引物筛选163.4 不同莲藕样品的ISSR-PCR扩增173.5 莲藕ISSR遗传多样性分析184 讨论和小结234.1 莲藕基因组DNA的提取234.2 莲藕ISSR-PCR 反应体系的优化234.3 不同莲藕品种间的遗传关系与多样性分析23参考文献 25致谢27IV文献综述1 莲藕的生物学特性莲属是历史悠久的古老植物，至今莲属由于历史原因只幸存两种，一种是开红花和白花的亚洲莲（N. nucifera Gaertn），另一种是开黄花的美洲莲（N. lutea Pers）。莲藕原产于印度，很早便传入我国，在南北朝时代，莲藕的种植就已相当普遍了1。藕是莲藕的地下茎的膨大部分，莲藕属睡莲科。莲藕主要分布于长江流域和南方各省，秋、冬及春初均可采挖。藕呈短圆柱形，外皮粗厚，光滑为灰白色或银灰色，内部白色；节部中央膨大，内有大小不同的孔道若干条，排列左右对称；体较重，质脆嫩，在我国食用栽培的莲藕，可分为两大类：第一类为藕用种。其根茎较肥大，外皮白色，肉质脆嫩，味甜，产量高，结莲子不多；第二类为莲用种，莲较小，肉质稍带灰色，品质较差，但结果多，主要采收莲子。作为蔬菜食用以藕用种为主。莲藕微甜而脆，可生食也可做菜，而且药用价值相当高2，它的根、茎、叶、花须、果实，无不为宝，都可滋补入药。莲藕是营养成分为；水分77.9克、蛋白质1.0克、脂防0.1克、碳水化合物19.8克、热量84千卡、粗纤维0.5克、灰分0.7克、钙19毫克、磷51毫克、铁0.5毫克、胡萝卜素0.02毫克、硫胺素0.11毫克、核黄素0.04毫克、尼克酸0.4毫克、抗坏血酸25毫克。用莲藕制成粉，能消食止泻，开胃清热，滋补养性，预防内出血，是妇孺童妪、体弱多病者上好的流质食品和滋补佳珍，在清咸丰年间，就被钦定为御膳贡品了。传统对它的研究主要是从形态方面进行的研究，根据莲藕属的外形特征将其分类。1736年瑞典植物学家林奈把莲属列入睡莲科。经典植物学认为，莲属双了叶植物，毛茸目(Ranales)、睡莲科(Nymjphaeaceae)、莲属(Nelumbo)。但上世纪末以来，植物学家们对莲属在分类中的位置提出了种种不同的看法：如耿以礼的中国种子植物检索表就赞同成立莲科3。倪学明等人认为将睡莲科提升为睡莲目，分为三个科，莲科、水盾草科、睡莲科4。倪学明提出了一个新的莲品种分类系统，即把它们归纳为22个品种群。土其超5等人利用二元分类法认定美国黄莲为中国莲的亚种后重新确定其分类地位，对我国荷花品种图志制定的荷花品种分类系统作出了若干调整，将中小株型品种并列，与大株型品种分开，补充重台型，增设新类型和问色品种，调整后制定的荷花品种分类新系统检索表，包括3种系，6群，14类，38型，共278个品种。2 ISSR分子标记及其在植物中的应用近年来，以分子标记为重点的植物分子生物学研究迅猛发展，为研究品种之问的遗传多样性提供了新的方法和手段。对遗传多样性的研究可以揭示一个物种居群间的遗传结构和遗传关系，揭示居群与环境及地理分布之间的相关性，因而对保护区地点的选择、保护区面积和形状的确定具有重要的指导意义。另外，对于经济生物资源遗传多样性的研究，对指导育种实践具有重要意义。自从20世纪80年代中期PCR技术的出现，使得涌现出一大批基于PCR的分子标记技术，这些技术简便快捷，而且只需少量的DNA即可。新的分子标记技术已经在很多研究领域体现出它的优势，尤其是遗传多样性和基因图谱构建。其中运用最广泛的三种技术分别是DNA随机扩增多态性(randomlyamplified polymorphism DNA, RAPD)，扩增酶切片段多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)。每种分子标记方法各有优点，但都有其局限性。RAPD技术由于引物是随机序列，所以操作十分简单快速经济，但可重复性不够理想。AFLP技术的多态性和重复性都不错，但对实验器材和技术要求稍高，因此较为复杂和花费更多。SSR技术拥有高度特异性和丰富多态性并且为共显性标记，但它需要预先知道基因组的序列来设计引物，因此限制了它的应用范围。ISSR技术的出现克服了这些局限性，并很快被运用到许多植物研究领域。ISSR技术以短重复序列(simple sequence repeat, SSR)作为引物，来扩增两个序列相同但方向相反微卫星重复序列之间的DNA片段。短重复序列或微卫星(mi-crosatellite)是一串1-4个碱基的基序重复排列而组成的。他们广泛分布于基因组，只是各自基序或重复次数有所不同罢了。ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz6等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。ISSR技术以单引物的PCR为基础，扩增两个序列相同但方向相反SSR之间的一段DNA序列前提是这段序列的长度在可扩增范围内才能被扩增出来。设计ISSR引物不必像SSR技术那样需要预先知道基因组序列。引物通常是16-25个碱基，其主体是2-4个碱基的基序重复串联而成，然后在其5端或3端加上1-4个锚定碱基。 ISSR综合了其他分子标记高多态性、可重复性、低成本易操作以及无需知道基因组序列等优点。由于微卫星广泛分布在基因组中，且等位变异特别丰富，因而ISSR具有比RFLP、RAAPD、SSR更高的多态性7，能反应整个基因组的一些特征，并成孟德尔式遗传特点。Nagaoka和Ogihara (1997)在同时用ISSR和RAPD研究小麦时发现，ISSR技术的多态性明显高于RAPD技术.ISSR一般呈显性孟德尔遗传 ，然而在有些情况下也会表现为共显性标记 ，共显性标记有个优势就是能够区分纯合体和杂合体。另外，由于ISSR的引物(16-25碱基)比RAPD的引物(10碱基)更长，可以使用更高的退火温度(45-60)，所以ISSR比RAPD拥有更高的重复性和可靠性。然而ISSR技术同样具有RAPD技术的易操作性和引物设计随机性，这使得它在这些方面比AFLP技术和SSR技术更具优势。已广泛应用于遗传多样性检测、亲缘关系及分类研究、品种鉴定和基因定位8,9,10等方面。2.1 ISSR在品种鉴定和种质资源收集中的应用DNA指纹图谱分析(DNA fingerprinting)是植物育种和种质资源收集里一个非常重要的技术手段，可以用来对种质资源进行评估和变种、杂种及亲本的鉴定。运用分子生物学的方法来辅助大规模的种质资源收集和品种鉴定显示出极大的价值，但运用的分子方法必须具备快速、经济和易操作等特点，当然最重要的是能够提供充足的信息来区分大量的不同品种。Charters和Wilkinson (2000)运用ISSR技术来辅助可可(Theo6roma cacao)种质资源的收集。仅用6条引物就能将62个样品中的56个区分开，证明快速、简单和重复性强的ISSR技术在可可种质资源评估方面存在巨大的潜力。Petropoulos等用两个ISSR引物(UBC818和UBC849)来区分31个油橄榄(Oleo European L.)栽培种，结果发现仅凭UBC818就能区分所有31个栽培种，而UBC849也能区分其中27个栽培种。黄光文等用4条ISSR引物对18个水稻新材料进行分析，利用所得18条特异性条带构建各个材料的分子指纹，可以将供试材料区分开来。可见ISSR技术在品种鉴定方面的巨大优势11。2.2 ISSR在遗传多样性和系统进化关系中的应用ISSR技术已经被广泛的应用于植物种间和种内的遗传多样性分析，例如小麦、红树、小豆、番薯、水稻、黑豆和花椰菜 等。Joshi等(2000)用ISSR技术研究稻属(Oryza L.)的42个品种，包括28个野生品种(9个基因型)，11个栽培种以及3个相关属的品种。发现在种间和种内均表现出很高的多态性，并且得到了很多特异性条带，特别是有些特异性条带可以将亲缘关系很近的种区分开。Huang和Sun同样发现用15个引物对40个样品进行扩增得到62.2%的多态片段，由于多态性高，故可以在种间水平将40个品种很好的区分开。Nagaoka和Ogihara研究两倍体、四倍体和六倍体小麦的遗传多样性时发现，对于来自同一个种的样品也能产生ISSR多态性片段。Wolfe等用8个引物对玄参科钓钟柳属(Pentagon L.)杂种复合体进行ISSR分析，结果清楚地支持物种P. clevelandii是二倍体杂种起源的说法。国内也有许多这方面的报道，例如杨淑达等应用ISSR标记对中国西南地区特有植物滇牡丹(Peoria deemlaye L.)的遗传多样性进行了研究，结果表明滇牡丹遗传多样性水平较高，居群间遗传分化较大。2.3 ISSR在遗传作图、基因定位及标记辅助选择中的应用在遗传学领域最激动人心的重大进展之一莫过于利用DNA分子水平上的变异作为遗传标记进行遗传作图。遗传作图的研究需要寻求足够多的分子标记来密集图谱。由于ISSR标记遍及于整个基因组，而且呈高度多态性，因此成为绘制遗传连锁图的理想标记。构建遗传连锁图的步骤一般如下：第一，选择可用于遗传作图的分离群体(通常采用F2群体和BC群体)。第二，对亲本和群体进行分子标记，分析筛选出符合孟德尔遗传规律的可用于作图的遗传标记。第三，利用计算机软件(例如MAPMAKER)来绘制遗传连锁图，确定遗传距离。自从Kojima等首次将ISSR标记应用于小麦遗传作图以后，目前已用于落叶松、柑桔、西瓜，葡萄等植物的遗传作图。一般应用几种分子标记方法来共同构建遗传连锁图，以达到相互参照、相互补充的作用。例如Douche等(2004)就使用了RAPD，AFLP，SSR和ISSR四种分子标记方法来构建连锁图。1 前言莲藕是一种重要经济作物，用莲藕、莲子、荷叶、荷花甚至藕节等制作的莲类食品，集营养和药用于一体，它是一类药食同源、具有很好保健功能的食品。孝感市是其主产地之一，境内广泛种植，其汈汊湖汈莲被列为全国六大名莲，焦湖莲藕是孝感市的传统土特产品，汉川建有“莲藕绿色高效生产科技创新示范基地”。目前，孝感莲藕栽培种多为自繁自留，存在品种退化，品质缺乏竞争力等制约莲藕产业化发展的技术瓶颈。传统对莲藕多样性的分类主要集中在性状表型方面，而表型区分度不大，并受环境作用很显著，因而有很大的局限性。ISSR技术具有引物较长，退火温度较高，实验有很强的可重复性、稳定性，并可揭示比RFLP、RAPD、SSR更高的多态性，能反应整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗传等特点。该技术已在品种鉴定、遗传作图、居群遗传学、遗传多样性和亲缘关系的研究中有极为广泛应用。本研究通过ISSR分析鉴别出不同莲藕品质表现与遗传特性间的关系，筛选出适合在孝感地区产业化种植的优良莲藕品种。2 材料和方法2.1 实验材料 莲藕是一种有着悠久历史的栽培作物，在中国各地区均有栽培。武汉市有全国品种齐全的莲藕种质资源，本实验所用的样品材料分为两部分；一部分是采自武汉植物园的食用型莲藕，一部分是采自孝感市地区的食用型莲藕，在采集过程中，取每种莲藕的幼嫩叶片置于塑料袋种，封口，然后立即放入所带的冷藏箱中，样品编号及详细情况如下表1表1 供试莲品种及来源样品编号No.材料名称Species拉丁文Latin name来源地Origin1白袍Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Baipao湖北孝感 HubeiXiaogan2三五Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Sanwu湖北孝感 HubeiXiaogan3武植二号Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Wuzhierhao湖北孝感 HubeiXiaogan4青毛节Nelumbo. Nucifera Qaereu.CV.Qingmaojie湖北武汉 HubeiWuhan5西施Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Xishi Lotus湖北武汉 HubeiWuhan6西洋杯Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Wine cap湖北武汉 HubeiWuhan7长节六月报NelumbonuciferaGaertn,CV.LongJone.Enarty湖北武汉 HubeiWuhan8娇阳Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Beautiful Sun湖北武汉 HubeiWuhan9长瓣小桃红Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Changbanxiaotao hong湖北武汉 HubeiWuhan10台阁寿星Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Birthdays House湖北武汉 HubeiWuhan11六月雪Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Liu yue xue湖北武汉 HubeiWuhan12红楼Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Hong lou湖北武汉 HubeiWuhan13绍兴红莲Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Shaoxing.pinle湖北武汉 HubeiWuhan14毛节Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Maojie湖北武汉 HubeiWuhan15凤舞 Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Dancing phoenix湖北武汉 HubeiWuhan16新加坡莲Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Xinjiapo Louts湖北武汉 HubeiWuhan17新红Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.New.Red湖北武汉 HubeiWuhan18青鹤Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Green Hei湖北武汉 HubeiWuhan19美中红Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.American-ChineseRed湖北武汉 HubeiWuhan20醉杯Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Wine.Cup湖北武汉 HubeiWuhan21小节白Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Little white湖北武汉 HubeiWuhan22千瓣莲Nelumbo.nuciferaGaertn, CV.Thousand petals湖北武汉 HubeiWuhan23红千叶Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.RedThousand petals湖北武汉 HubeiWuhan24鸾凤玉Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Nanfengyu湖北武汉 HubeiWuhan25飞虹Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Flying Rianboud湖北武汉 HubeiWuhan26牡丹种Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Peony湖北武汉 HubeiWuhan27泡子Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.White sea湖北武汉 HubeiWuhan28金辉Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Jin hui湖北武汉 HubeiWuhan29州藕（食用）Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Zhou ou湖北武汉 HubeiWuhan30西安红莲Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Xi an hong lian湖北武汉 HubeiWuhan31赛菊Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Surpassmgchryanthemam湖北武汉 HubeiWuhan32点绛红Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Pink Lips湖北武汉 HubeiWuhan33太真出洛Nelumbo.nuciferaGaertn, CV.Tai zhen chu luo湖北武汉 HubeiWuhan34大满江红Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Big River Red湖北武汉 HubeiWuhan35嘉旦红Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Happy Red湖北武汉 HubeiWuhan36爪红碗莲Nelumbonucifera Gaertn, CV.Zhao hong Bowi湖北武汉 HubeiWuhan37赛佛座Nelumbo.nuciferaGaertn,.Buddhas Superseat湖北武汉 HubeiWuhan38彩虹Nelumbo.nuciferaGaertn,CV.Colour Rianboud湖北武汉 HubeiWuhan39三色莲Nelumbo .nucifera Gaertn, CV.Three colour Lotus湖北武汉 HubeiWuhan2.2 实验药品、仪器及试剂的配制2.2.1 实验药品十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 湘中化学试剂采购站 -巯基乙醇 武汉市华顺生物技术有限公司三羟甲基氨基甲烷(Tris-base) 上海山浦化工有限公司聚乙烯吡咯烷酮（PVP K-40） 武汉市华顺生物技术有限公司乙二胺四乙酸二钠（分析纯） 天津市河北区海晶精细化工厂氢氧化钠（分析纯） 天津市凯通化学试剂有限公司 氯化钠（分析纯） 成都临江化工厂无水乙醇（分析纯） 江苏强盛化工有限公司氯仿（分析纯） 天津市恒学化学试剂有限公司异戊醇（分析纯） 天津大茂化学仪器供应站盐酸（分析纯） 武汉市江北化学试剂有限公司 琼脂糖（Agrose） 上海生工生物工程有限公司 溴化乙锭 上海生工生物工程有限公司 Taq酶 上海生工生物工程有限公司10buffer 上海生工生物工程有限公司 dNTP 上海生工生物工程有限公司 100bp Ladder-DNA Marker-L Bio Basic Inc PCR扩增引物 上海英俊生物技术有限公司合成 2.2.2 仪器 PCR仪 PTC-100 thermocycler DYY-7C型电泳仪 北京六一仪器厂 DYY-水平电泳槽 北京六一仪器厂 FM-40雪花制冰机 北京长流科学仪器公司 PL-203型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司 高精度全自动交流稳压器 上海华东稳压设备厂 FR-200A全自动紫外与可见分析装置凝胶 上海复日科技有限公司 HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 WD9008型微波炉 顺德市格兰仕电器实业有限公司 DW-ML型超低温冷冻储存箱 中科美菱低温科技右下公司 BCD-19DW型容生冰箱 中国广东科龙电器有限公司 16-2型高压灭菌锅 沈阳依专医疗器械厂 XH-C型漩涡混匀器 金坛市国旺实验仪器厂 冷冻离心机 Eppendorf 微量移液器 Eppendorf 2.2.3 主要药品的配制12 0.5 M EDTA ： 乙二胺四乙酸二钠 1860.1g，溶于700mL蒸馏水中，用NaOH调至pH值8.0左右，加蒸馏水定容至1L; 1 M Tris-HCl ： 121.4 Tris-base，溶于800ml的蒸馏水中，用浓盐酸调至pH值8.0左右，加蒸馏水定容至1L； 2.5 M NaCl ： 29.25g NaCl溶于蒸馏水中，定容至200ml; 氯仿-异戊醇（24：1）：异戊醇21ml加入到500ml的氯仿试剂瓶中，摇匀； 5TBE : 54.0g Tris-base ;27.5g硼酸；20ml 0.5 M EDTA ；将pH值调至8.0，加去离子水至1000ml； CTAB-free：20ml 1mol/L Tris-HCl；10ml 0.5mol/L EDTA ；10ml 2.5mol/L NaCl，加蒸馏水至100ml; 2CTAB 提取缓冲液；2g CTAB;10ml 1mol/L Tris-HCl ; 4ml 0.5mol/L EDTA; 56ml 2.5mol/L NaCl; 1g PVP;加热并搅拌，加蒸馏水定容至100ml。2.3 莲藕DNA的提取及检测2.3.1 莲藕DNA的提取13,14,15,16由于莲藕成熟组织中酚类、多糖等次生代谢物质较多，所以从中提取高纯度的，能供分子标记使用的DNA比较困难，本研究这些代谢物质未大量合成的莲藕幼嫩叶片，参照王经源等高多糖含量植物莲DNA的提取方法，采取改良的CTAB方法提取莲藕幼叶中的DNA。改良的CTAB法，具体步骤如下： 去一定量的样品叶片，加入少量的石英砂和PVP在冰上研磨至匀浆，去少量（大约0.6g）的匀浆移到1.5ml的已灭菌好的EP管中。 加入600ml的CTAB-free和6L -巯基乙醇震荡混匀，冰上静置10min，在4，10000 r/min时离心5min，小心弃去上清。重复两次。 加入500L事先预热至65 3CTAB缓冲液，和5L -巯基乙醇，震荡摇匀在65 下水浴30min（每隔10min左右摇动一下）。 加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒混合5min，在4，8000 r/min时离心5min，取上清。重复3次。 加入2倍体积（1000L）的95%的无水乙醇（-20），颠倒混合后静置5min（此时可以看到絮状的DNA沉淀）。 用细管将絮状DNA挑人EP管中，用70%的乙醇洗沉淀两遍，吸去乙醇，风干（可在37烘干10min），以100L的无菌蒸馏水（或TE）溶解DNA，备用。2.3.2 莲藕DNA的检测 琼脂糖凝胶电泳检测 将上面提取的DNA，用0.9%琼脂糖（含有0.1%EB）凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5TBE，在120V稳定电压下，电泳1.5h，然后用凝胶成像系统照相保存。 紫外光光度计检测 将上面提取的DNA，用紫外光光度计检测在波长为在260nm、280nm处的吸收值，记录数据，然后计算OD260/OD280的比值。2.4 引物设计与PCR反应体系的优化2.4.1 ISSR引物设计表2 ISSR 引物序列编号 NO.引物序列 primer sequencesU807(AG)8TU811(GA)8CU834(AG)8YTU836(AG) 8YTU840(GA) 8YTU841(GA) 8YCU842(GA) 8YGU844(CT) 8RC注：Y=(C , T) R=(A , G)用于实验的ISSR引物选自加拿大British Columbia大学公布的关于植物ISSR的100条引物，由上海英俊生物有限公司合成，随机筛选18条引物，用DNA提取质量最好的样品（15号）对这18条引物进行扩增，筛选，选取扩增出可重复性、高效性的条带引物8条，它们分别是U807、U811、U834、U835、U840、U841、U842、U844，引物序号和序列见表2； 2.4.2 ISSR-PCR反应体系的正交设计与PCR扩增采用L9（34）正交试验设计，对dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度进行4因素3水平筛选，方案如表3，表4。表3 ISSR-PCR反应体系的因素与水平因素Factors水平（体系终浓度）Levels（Final concentration）1 2 3dNTP（mol/L）150 200 250Primers（mol/L）0.3 0.6 1.2Mg2+（mmol/L）1.0 1.5 1.9Taq DNA polymerase(U/20L)1.0 2.0 4.0根据表1和表2配制总体积为20L的PCR反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有10PCR buffer2.0L和20ng模板DNA，引物选用826，每个处理设2次重复。 PCR反应条件： 94预变性5min，40个热循环，每个热循环包括94变性45s，52退火45s，72延伸90s。结束循环后72延伸8min，4保存。PCR产物检测： PCR扩增完成后，以100bp Ladder-DNA Marker-L为分子标记，用1%的琼脂糖（含有0.1%的EB）凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5TBE，在120V稳定电压的条件下，电泳1.5h，用凝胶成像系统照相保存。表4 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计处理 dNTP / Primers/ Mg2+ / Taq DNA polymerase/组合 （mol/L） (mol/L) （mmol/L） (U/20L)1 150 0.3 1.0 1.02 150 1.2 1.5 2.03 150 0.6 1.9 4.04 200 0.3 1.5 4.05 200 0.6 1.9 1.06 200 1.2 1.0 2.07 250 0.3 1.9 2.08 250 0.6 1.0 4.0 9 250 1.2 1.5 1.0 2.4.3 ISSR-PCR反应体系中模板DNA浓度的优化 根据正交试验结果选出最佳反应体系组合后，再对模板DNA浓度进行梯度试验，优化筛选合适的模板DNA浓度。20L反应体系中模板DNA设5ng、10ng、20ng、30ng 、50ng 、60ng 、80ng 、100ng 8个处理，每个处理设2次重复，其他反应程序和体系组合均与正交试验设计中最佳反应体系相同。2.4.4 ISSR-PCR反应体系中退火温度的优化 在上述试验确定的最佳反应体系基础之上，对退火温度进行梯度试验。在优化筛选最佳退火温度，根据在引物理论退火温度上下波动2-4的原则，在PCR仪上设置8个温度梯度，即48、48.7、49.9、51.7、54.1、56、57.2、58每个梯度设2次重复，其他反应程序和体系组合均与试验确定的最佳反应体系相同。2.4.5 ISSR-PCR反应体系的稳定性检测选择另外6个ISSR引物840、807、844、834、811、842、841对优化确定的莲藕ISSR-PCR反应体系的稳定性进行检测，每个引物设2次重复。2.5 ISSR-PCR引物筛选根据正交实验确定的最佳的条件，选用DNA提取质量最好的样品（15号）对随机筛选的18条引物进行扩增，选取扩增出可重复性、高效性的条带引物。2.6 不同莲藕样品的ISSR-PCR扩增2.6.1 PCR单管反应体系：20L反应体系中，10buffer 2.0L；MgCl2 1.2L；dNTP 0.4L；primer 0.6L；Tap酶0.4L；Templete（模板）0.6L；去离子水14.8L。2.6.2 反应条件： 94预变性5min，43个热循环，每个热循环包括94变性45s，53退火45s，72延伸90s。结束循环后72延伸8min，4保存。2.6.3 PCR产物检测： PCR扩增完成后，以100bp Ladder-DNA Marker-L为分子标记，用1%的琼脂糖（含有0.1%的EB）凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5TBE，在120V稳定电压的条件下，电泳2.0h，用凝胶成像系统照相保存。2.7 数据统计分析ISSR产生的系列谱带，属于多位点、非特异性标记。电泳中的条带根据迁移率考带，有条带的用“1”记录，没有条带的用“0”记录，从而把图形资料转换成数据资料，形成原始数据矩阵，根据Nei-Li相似系数法求得品种i和品种j之间的相似系数GSij(genetic similarity)18；GSij=2Nij/(Ni+Nj)其中，Ni表示品种i中条带数目；Nj表示品种j中条带数目；Nij表示品种i，j共有的条带数目。相似系数GS(genetic similarity),遗传距离GD(genetic distance),GD+GS=1遗传距离GD也叫遗传差异GD。根据ISSR扩增的结果，用NTSYS-PC 2.117分析软件统计39份莲藕资源之间的遗传相似系数，采用算术平均数的非加权组成配对法(unweighted pair group with arithmetic average UPGMA),对其进行聚类分析，并构建聚类图。3 结果与分析3.1 DNA质量检测3.1.1 DNA质量的电泳检测采用改良的CTAB法提取莲藕幼叶DNA的凝胶电泳图如3.1所示。从中我们可以看到，点样孔均稍微有点亮，主条带明亮、清晰而且完整，无RNA带，有稍许拖尾现象，说明蛋白质、RNA等杂质去除得不是很干净，DNA的量大，但略有降解。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 图1 1-16号部分样品基因组DNA的电泳图谱3.1.2 DNA质量的紫外分光光度计测定根据样本在260nm、280nm处的吸收值可以对样品的核酸的浓度和纯度作出分析。利用260nm、280nm两处的吸收值的比较值可以估计核酸的纯度，若OD260/OD280值介于1.8- 2.0之间，则表明DNA的纯度较好；若OD260/OD2801.6表明有蛋白质、酚等污染；若OD260/OD2802.0表明有RNA污染。本实验通过测定、计算得出如表5，由表可以得出， 30和34号样品OD260/OD280大于2.0，表明样品有轻微的RNA杂质，其他样品中DNA的纯度较好。表5 紫外光光度计检测结果样品编号OD(260)OD(280)OD(260) /OD(280)250.9160.4582.000270.2590.1491.738280.3370.1721.959290.2490.1471.694300.3070.1512.033310.2400.1391.727320.2900.1452.000330.3000.1661.807340.0540.0212.5713.2 ISSR-PCR反应体系的优化3.2.1 反应体系中dNTP 、Primers、Mg2+ 、Taq酶浓度的正交优化 参照何正文等（1998）的方法20，对PCR扩增结果依据谱带的强弱和杂带的多少进行直观分析。由图3.2可以看出，不同处理之间，由于dNTP 、Primers、Mg2+ 、Taq DNA 聚合酶的浓度不同，其扩增结果存在明显差异。组合1效果最差，可能是Primers、Mg2+ 、Taq DNA 聚合酶浓度较低所致，导致扩增产物少。组合6、9可能是反应体系中Taq DNA 聚合酶浓度本来较低，而且反应体系中dNTP浓度较高，结合了较多的Mg2+致使该组合的Mg2+浓度偏低，从而影响Taq DNA 聚合酶的活性，导致反应不充分所致。组合8可能是dNTP浓度较高，引物浓度较低导致其与模板结合位点少，产物减少。组合2、4、5、7基本能扩增出主谱带、但清晰度低。组合2、5是由于反应体系中引物浓度和Taq DNA 聚合酶浓度较低，扩增产物减少；组合4、7可能因为反