（微电子学与固体电子学专业论文）微流控电泳芯片的原理、制备及应用研究.pdf

微流控电泳芯片的原理、方法和应用研究 摘要 f l 微流控电泳芯片( m i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p l 在2 0 世纪九十年代以来 在常规的毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 原理和技术的基础上发展 起来的一种新的微量分析装置。它主要利用微电子机械系统( m e m s ) 技术在硅、 玻璃、有机聚合物等基片上获得预设计好的微管道网络，并在其中进行样品的电 泳分离，然后利用光学或者是化学等的方法进行检测。因此，它是建立在传统的 毛细管电泳的基础上与微电子机械系统、生物化学、分析化学等多学科交叉的研 究领域，已经开始在生命科学、药物化学、医学等领域得到了应用，具有广阔的 发展前景。 微流控电泳芯片大多采用硅、玻璃等材料，他们的价格昂贵并且在实际应用 中会产生不少问题。而以有机聚合物作为基片则是解决这些问题的途径。本论文 在阐述了毛细管电泳原理以及微流控电泳芯片原理和发展的基础上，利用塑料和 硅橡胶( p d m s ) 作为基体材料，开展了微流控电泳芯片的制备和应用方面的研究 工作，成功的找到了实现了低成本、大批量生产微流控电泳芯片的方法，并在研 制的芯片上实现了荧光素、维生素b 2 、d n a 片段的分离检测 、 围绕着微流控电泳芯片的原理、方法和应用研究工作，本论文主要包括以下 几个内容： 1 、阐述了毛细管电泳的原理，以及微流控电泳芯片的原理和研究状况，在 此基础上，提出了自己的研究思路。 2 、对微流控电泳芯片的分离分析理论进行了总结，以更好的指导研究工作。 3 、根据微流控电泳芯片的理论以及相应的应用要求设计芯片，并利用微细 技工技术如s u 8 厚胶技术、d e e pr i e 以及d e m 技术，以塑料( p m m a 、 p s 、z c o n o o 和硅橡胶( p d m s ) 作为芯片材料制作芯片，并对制作工艺参数 进行优化，成功的制得了满足试验要求的微流控电泳芯片。 4 、利用制得的微流控芯片，我们进行了一系列的应用研究工作。通过伏安 特性测试，证明了制得的芯片性能稳定，随后对荧光素、维生素b 2 、d n a 片段的分离检测，进步证明了我们制得的微流控电泳芯片可成功的应 用于生命科学和医学的研究。 本论文的研究表明，利用塑料和硅橡胶等有机聚合物作为芯片的基片材料， 也可以成功的制作出性能良好的微流控电泳芯片，具有工艺简单、成本低廉、易 实现大批量生产的优点，具有广阔的应用前景。 微流控电泳芯片的研究已经取得了很大的进展，随着各项技术的发展，微流 控电泳芯片将会给化学、生物、医学等领域带了革命性的变化。 关键词：微流控电泳态片，s u - 。8 , i c p ，d e 奴技术，模压，浇铸，d n a 片断分 一 离 s t u d yo np r i n c e p l e f a b l u c a t i o na n da p p l i c a t i o no f m i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p a b s t r a c t m i c r o f l u i d i c e l e c t r o p h o r e s i sc h i p i san e w a n a l y s i se q u i p m e n t , w h i c h i s d e v e l o p e df i o mt r a d i t i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss i n c e19 9 0 s t h em i c r o c h a n n e l n e t w o r ko nt h e c h i p i sm a n u f a c t u r e d b yt h et e c h n o l o g y o fm i c r oe l e c t r o n i c s m e c h a n i c a ls y s t e m ( m e m s ) o nt h es u b s t r a t eo fs i l i c o n ，g l a s s ，p o l y m e re t c s a m p l e s e p a r a t i o ni sp e r f o r m e di nt h em i c r o c h a n n e la n dd e t e c t e db yo p t i c a lo rc h e m i c a l m e t h o d s b a s e do nt r a d i t i o n a l c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ，m i c r o f l u i d i c e l e c t r o p h o r e s i sc h i pi s am u l t i d i s c i p l i n a r yt e c h n o l o g y , w h i c hh a sr o o t si nm e m s ， b i o c h e m i s t r ya n da n a l y t i c a lc h e m i s t r y 。i th a sb e e na p p l i e df o rl i f es c i e n c e ，d r u g c h e m i s t r y a n dm e d i c i n ea n dh a sa p r o m i s i n gp r o s p e c t m i c r o f l n i d i ce l e c t r o p h o r e s i s c h i p sm o s t l yu s e s i l i c o no rg l a s sa ss u b s t r a t e s m a t e r i a l ，w h i c hi st o oe x p e n s i v ef o ra c o m m e r c i a lp r o d u c ta n da l s oi n d u c e dp a r t i c u l a r p r o b l e m s l i k ep r o t e i ns t i c k i n gt os u r f a c e s h o w e v e r , p o l y m e ri st h ek e yt os o l u t et h e s e p r o b l e m s i n t h e d i s s e r t a t i o n ，t h ep r i n c i p l e s o f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a n d m i c r o f l m d i ce l e c t r o p h o r e s i s c h i p a r ed i s c u s s e d t h e nm i c r o f l u i d i c e l e c t r o p h o r e s i s c h i p s ，w h o s e s u b s t r a t e s m a t e r i a la r e p l a s t i c s a n dp d m s ，a r ef a b r i c a t e da n d s u c c e s s f u l l ya p p l i e di ns e p a r a t i n ga n dd e t e c t i n gf l u o r e s c e n c e ，v i t a m i nb 2 a n dd n a s e g m e n t s t h e t o p i c so f t h e d i s s e r t a t i o na r ep m s e n t e db d o w ： 1 t h ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sp r i n c i p l e a n dt h e d e v e l o p m e n t s o f m i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sa l er e v i e w e d o nt h eb a s eo fi t , t h er e s e a r c h t h o u g h t so f t h e d i s s e r t a t i o na r e p u tf o r w a r d 2 t h es e p a r a t i n gt h e o r yo fm i c r o n u i d i cd e c t r o p h o r e s i sc h i ph a sb e e n r e v i e w e d 3 o nt h eb a s eo ft h et h e o r yo fm i c r o f l n i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，u s i n g s u - 8r e s i s tt e c h n i q u e ，d e e pr i ea n dd e mt e c h n i q u e ，t a k i n gp l a s t i c s ( p m m a ，p s ，z e o n o r ) a n dp d m sa s s u b s t r a t e s m a t e r i a l ，o p t i m i z i n g t e c h n i q u e s p a r a n l e t e r , w e s u c c e s s f u l l y f a b r i c a t e dm i c r o f l u i d i c e l e c t r o p h o r e s i sc h i p s 4 u s i n gt h em i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p s ，w ep r o c e s s e das e r i e s o f r e s e a r c h v ap r o p e r t yt e s t i n gh a v ep r o v e dt h a tt h es e p a r a t i n gf u n c t i o no f t h em i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i pw ef a b r i c a t e dw a ss t a b l e t h e n s u c c e s s f u la p p l i c a t i o ni ns e p a r a t i n ga n dd e t e c t i n gf l u o r e s c e n c e ，v i t a m i n b 2a n dd n a s e g m e n t sp r o v e d t h ec h i p sc o u l db e a p p l i e d f o rl i f es c i e n c e a n dm e d i c i n e t h e s t u d yo f t h ed i s s e r t a t i o ns h o w e dt h a tt a k i n gp l a s t i c sa n dp d m s a ss u b s t r a t e s m a t e r i a lm i c r o f l u i d i c e l e c t r o p h o r e s i sc h i p c a l lb ef a b r i c a t e d s u c c e s s f u l l y t h e f a b r i c a t i o nm e t h o d sa r es i m p l e , l o w c o s ta n df i tf o rb i o c h e m i c a la p p l i c a t i o n s ，w h i c h h a sp r o m i s i n ge c o n o m i cf u t u r e w i t hg r e a t p r o g r e s si n s e v e r a lr e l a t e dt e c h n i q u e s ，m i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i s c h i pw i l lm a k e an o t a b l ei m p a c to nt h ec h e m i c a l ，b i o l o g i c a la n dm e d i c a lf e l d s k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，s u - 8 ，i c p ，d e mt e c h n i q u e ， e m b o s s i n g ，c a s t i n g ，d n as e g m e n t ss e p a r a t i o n 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 f 不保密融 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：洳嘞砜 指导教师签名：i 朦迎 日期：w l 、年明诞日日期：。7 年z ，月2 s 日 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 狃立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论爻- 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 叁7 、允全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 彤彩l 虱 日期：w 机年砂月i 日 1 1 前言 第一章绪论 当前许多发达国家己把现代科学仪器当做信息社会的源头和基础纳入未来发展的战略 重点，而分析仪器又是其中最蓐要的组成部分之一。最近，人类基因组计划的提前完成充分 说明了先进的分析仪器与技术在现代高科技发展中的重要甚至关键作用。面临着2 l 世纪科 技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分柝科学也正经历着深刻的变革，其中一个日益明显 的发展趋势就是化学分析设备的微型化、集成化与便携化。当前，分析仪器的发展正在出现 一个以微型化为主要特征的，带有革命性的重要转折时期。在当前发展较快的微分析系统中， 以1 9 9 0 年由瑞士的m a n z 和w i d m e r 首先提出的“微全分析系统 ( m i c r o t o t a l a n a l y s i ss y s t e m s 即吨s ) 和目前媒体报道较多的“生物芯片”( b i o c h i p s ) 或称“微阵列芯片”( m i e r o a r r a y c h i p s ) 的发展势头最为猛烈。在p - t a 8 中，微流控芯片系统( m i e r o f l u i d cc h i ps y s t e m s ) 也通俗地称 为“建在芯片上的实验室”( l a bo l lac h i p ) 或简称芯片实验室( l a bc h i p ) ，正处于当前发展的 前沿，也最具广阔的发展前景。 4 0 年前微电子技术在信息科学的发展中引发了一场革命，并对2 0 世纪的科技发展起了 重要的推动作用。最近的发展表明，2 0 世纪9 0 年代开始的以微机电加工技术为基础的 u - t a s ，预计在未来1 0 年内也将对分析科学乃至整个科学技术的发展发挥相似的作用。 l - t a s 是为了适应信息时代的需要，最早在1 9 9 0 年提出的。其最终目的是通过化学分析设 备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，实现分析 实验室的“个人化”和“家用化”。当前的微分析系统可分为芯片式与非芯片式两大类( 图 1 1 ) ，目前芯片式是发展重点，其中依据芯片结构及工作机理又可分为微阵列( 生物) 芯片和 u - t a s 中的微流控芯片，这两种技术间虽有少量交叉，但基本经历了各自独立的发展过程， 所依托的基础学科与技术以及应用领域也不尽相同。微阵列( 生物) 芯片主要以生物技术为基 础以亲和结合技术为核心，以在芯片表面固定一系列可寻址的识别分子阵列为结构特征。 它使用方便，测定快速，但一般是一次性使用，并有很强的生物化学专用性。这类芯片在前 几年发展较快，在国外已实现深度产业化，生产技术已趋于成熟，生产生物芯片的企业数以 百计。微流控芯片则主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以 微管道网络为结构特征，是当前微全分析系统发展的重点。它把整个化验室的功能，包括采 样、稀释、加试剂、反应、分离、检铡等集成在微芯片上，且可多次使用，因此具有更广泛 的适用性。微芯片分析系统的出现不仅可使珍贵的生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至 纳升级，而且使分析速度成十倍百倍地提高，费用成十倍百倍地f 降，从而为分析测试技术普 及到千家万户创造了条件。微流控芯片分析系统除涉及到大量的微加工技术和芯片材料的知 识外，还涉及到广泛的基础理论和应用基础知识，例如微米通道中的传质、导热、吸附及微 区反应规律等。这些都对相关的研究提出了挑战。 图1 1 微分析系统及微流控芯片的分类 f i g 1 1 t h e 母p e o f m i c r o a n a l y t i c a ls y s t e m sa n d m i e r o f l u i d i cc h i p s 毛细管电泳芯片是微流控芯片中最主要的一种，我们称之为微流控电泳芯片，它在2 0 世纪九十年代以来在常规的毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 原理和技术的基础 上发展起来的一种新的微量分析装置。毛细管电泳序列分析法是建立在原有的高分辨率变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳序列分析法的基础上的，其基本装置是在充满电解质的毛细管两端施加 高压，由于不同分子量大小和带不同电荷的分子在其中具有不同的泳动速度，从而达到分离 的目的吐在序列分析时，先用末端终止或化学裂解法获得序列中不同长度的d n a 片段，然 后用毛细管电泳检测这些片段，得到序列信息。由于微细加工技术的发展，制得的毛细管电 泳芯片，由于其毛细管柱内径小，具有较高的表面积体积比，因此有利于产生能量的散失， 使分离装置可以在更高的电场强度下工作，从而使分离效率在以下两个方面得到提高。首先， 可以减小焦耳热。降低因流体对流引起的区带展宽。第二并且是最基本的优点是在更高的电 场强度工作，使分离速度加快0 1 。由于毛细管电泳芯片具有如上优点，使它有广阔的应用前 2 景。到目前为止，毛细管电泳芯片已经用于寡核苷酸的分离叶d n a 测序吼d n a 片段分离6 】 等。因此毛细管电泳芯片的研究是一项极其有意义的工作。 毛细管电泳芯片的基体材料，有硅、玻璃、塑料、陶瓷、硅橡胶等几种。其中以硅、玻 璃和石英居多，原因在于这些材料的微加工方法已在过去四十年里在微电子领域得到了成熟 发展。但对于许多应用( 特别在生化领域) ，这些材料并不合适，原因在于：由于典型装置 的尺寸比集成电路的尺寸大得多，因此这些材料和其产品制作方法对于商业化来说太贵；材 料特性导致一些特殊问题例如蛋白质粘附在表面。 克服这两个问题的途径在于选用廉价的聚合物作为芯片材料。聚合物提供了较宽范围的 物理和化学材料参数，材料成本较低，微复制方法成本也很低。因此可望在商业上取得广泛 的应用，因此本论文研究的重点是选择聚合物作为基片，研究在不同的聚合物材料和不同的 制作方法下，制备所得的微流控电泳芯片性能差异，寻求最佳制作方法，并进行应用研究。 1 2 毛细管电泳及其特点7 】【8 】 由于微流控电泳芯片是在常规毛细管电泳的原理和技术的基础上发展起来的，其电泳原 理与毛细管电泳的原理基本上一致。因此，有必要阐述一下毛细管电泳的基本原理和概念。 电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷极性相反的电极方向迁移 的现象，利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分析的技术统称为电泳技术。电泳技 术有多种，通常按照电泳条件中的某一特征来命名。若按照电泳所使用的载体来命名，可以 分为自由溶液电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、滤纸电泳等：若以电泳支持物的形状 或位置命名，则分为u 型电泳、柱状电泳、板状电泳等；还有按照原理命名的，如等电聚 焦电泳、等速电泳、免疫电泳等。毛细管电泳( c a p i l l a r y e l c c t x o p h o r e s i s ，缩写为c e ) 是指在 极细的毛细管中实现的电泳技术，是电泳技术和色谱技术相结合的产物。 1 2 1 毛细管电泳原理 毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或和分配系数不 同进行高效、快速分离的一种电泳技术 常规的毛细管最基本的仪器结构如图1 2 示，主要包括直流高压电源、毛细管、进样装 置、检测器和记录仪等主要部件。高压电源可对毛细管施加5 5 0 k v 电压，操作电压一般控 制在5 3 0 k v 范围。c e 通常使用内径1 0 - 1 0 0 p m ，长1 2 1 2 0 c r n ( 外涂聚酰亚胺) 融凝石英 3 毛细管。毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的背景电解质溶液( 缓冲溶液) 。在毛 细管的出口端前装有在线检测器，如果采用光学检铡方式，就将毛细管一端的聚酰亚胺涂层 除去- - b 段( 0 5 c r n 左右) 作为检测窗口。被分析样品可以采用重力法、抽真空法或电迁移 法等多种进样方式由毛细管一端进入。在应用广泛的毛细管区带电泳中( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 中，当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝着与其电荷极性 相反的电极方向移动。由于样品组分的淌度不同，它们的迁移速度不同，因而经过一定时间 后，各组分将按其速度( 或淌度) 大小顺序依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳 谱图。用谱峰的迁移时间( f m ) ，或类似于色谱学的术语保留时间( t r ) 作定性分析，按其谱 峰的高度( ) 或峰面积( 爿) 作定量分析。 图1 _ 2 毛细管电泳基本仪器结构示意图 h v 高压电源( 0 - - - 3 0 k v ) ：c 毛细管：e 电极槽；p t 铂电极：d 在柱监测器 s 样品；d a 擞据采集和处理系统 f i g 1 2t h e s c h e m a t i c p i c t u r eo f c a p i ll a r y d e c a o p h o r e s i sb a s i ce q u i p m e n t ss t r u c t u r e 与平板凝胶相比，毛细管具有更好的散热性能，允许在毛细管两端加上高至3 0 k v 的高 电压，分离毛细管的纵向电场强度可达到4 0 0 v c m 以上，因而分离操作可以在较短的时间 内( 多数- - 4 时内) 完成，达到非常高的分离效率( 理论塔板数可达到4 0 0 ，0 0 0 m 以上，最 高达1 0 7 m 数量级) 。因为毛细管内径小，对内径为5 0 p m ，长度为5 0 e m 的毛细管，其容积 不足i g m ，进样体积在纳升级，样品浓度可低于l o 4 m o l 1 。因此，毛细管电泳达到了仪器分 析所要求的高效、快速、样品用量少等最基本和最优异的特点。此外，毛细管电泳还有易自 动化，操作简便，溶剂消耗少，环境污染小等优点。正因为c e 技术具有如此诱人的优点， 使它在短短的十几年中，受到了分离分析科学家的极大关注，成为生物化学和分析化学中备 受瞩目，发展迅速的一种分离分析技术。 4 1 2 2 毛细管电泳的基本概念 1 、双电层 由界面化学可知，当固体与液体接触时，固体表面分子离解或，和表面吸附溶液中离子， 在圃液界面上形成双电层。在水溶液中，多数固体表面带负电荷。按照近代双电层模型， 在双电层溶液一侧有两层组成。第一层为吸附层，称为s t e m 层或紧密层( c o m p a c tl a y e r ) 。 在s t e r n 层中与固体表面接触的吸附离子是部分脱水的，它可以是异号离子，也可以是同号 离子，其外面主要是由静电力吸附的水化离子对。通过水化离子对中心连线构成的面成为 s t e m 面。第二层是扩散层( d i f f u s el a y e r ) ，由s t e m 面外的剩余离子对构成，其电荷密度随 着远离表面而逐渐与体相溶液的接近。图1 3 表示出了双电层结构的图像及其电势随距离x 的变化。 曩齄腰薯鲁震r 靛盛 图1 3 双电层模型( a ) 和相应的电势分布( b ) f i g u r e 1 3d o u b l e i o n i cl a y e r ( a ) a n dp o t e n t i a ld i s t r i b u t i n g ( b ) 2 、z e t a 电势 图1 3 b 中的l ；，。为表面电势，在s t e m 层，表面电势线性地降低至，它是s t e m 面与 溶液内部的电势差，与特性吸附离子的性质和数量有关。剪切面( s h c a xp l a n e ) 位于s t e r n 面外侧很近的地方，紧贴固相表面粘度迅速变化的区域。剪切面上的电位称为z e t a 电势 ( ) ，它略低于，一般可认为两者相等，但在表面吸附了非离子型表面活性剂或大分 s 子后，剪切面外移， 和y 。差别变大。当表面吸附了大量离子或表面活性离子时，z e t a 电 势会发生明显变化，甚至会改变符号。 毛细管壁表面上的z e t a 电势正比于它表面上的电荷数与粒子对层厚度的乘积，但这些 又受到离子对的性质、缓冲溶液的p h 、缓冲溶液中阳离子等因素的影响”1 。毛细管壁上的 z e t a 电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流，优化c e 分离条件具有实际指导 意义。 3 、电泳 电泳的基本概念是：在半导电流体中，荷电粒子在外电场的作用下的泳动现象叫电泳 ( e l e c t r o p h o r e s i s ) “1 。当一荷电粒子置于电场中时，它受到一个正比于它的有效电荷( q ) 和 电场强度( e ) 的力( d 作用， f = q e ( 1 1 ) 在电场的作用下，荷电粒子以速度( v ) 作平移运动，同时它又受到一个与其速度成正比 的粘滞阻力伊) 的作用，即 f = f v ( 1 2 ) f 为比例常数，称为平动摩擦系数，与粒子的大小和形状有关。当这两个作用力相对平衡时， 辟f ，粒子以稳态速度( v ) 运动，于是 v = q e f ( 1 3 ) 对于球形粒子，f 由s t o k e s 定律给出， f = 6 z c r l r ( 1 4 ) 式中”为介质粘度，r 为表观液体动力学半径，因而 v l = q e 6 z r l r ( 1 5 ) 因为f 。= g g r ，用荷电粒子的电势来表示，式成为 v t ：照e( 1 7 ) 6 n ”r l 对于棒状粒子 v t _ 曳e( 1 8 ) 4 w r l 6 由此可见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和介质特性有关外。还与粒 子的有效电荷及其大小和形状有关。因此，粒子的大小与形状，以及其有效电荷的差异，就 构成了电泳分离的基础。 因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度( m o b i l i t y ，“) 而不用速 度来描述荷电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度定义为单位场强粒子的平均电泳速度，即 卢。= v e ( 1 ，9 ) 4 、电渗流 在毛细管中，电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，简称e o f ) 指的是体相溶液在外加电场的作用 下整体朝一个方向运动的现象。如图所示，处于扩散层中的阳离子，在负电荷表面形成一个 阳离子鞘，在外加电场的作用下，以剪切面为分界面，朝向阴极与s t e r n 层作相对运动。由 于这些阳离子是溶剂化的，当它们沿剪切面作相对运动时，携带着溶剂一起向阴极迁移，便 形成e o f 。 + + + + + + + + 、+ d 二 + + + + + + + + ，+ 图1 4 由毛细管壁引起的电渗流 f i g 1 4t h e e l e c t r o o s m o s i sf l o wc a u s eb yt h ec a p i l l a r yw a l l e o f 速度( v 。) 与 。电势有关。由v o ns m o l u c h o w s k i 方程给出： v 矿一华e n 式中s 。为真空介电常数。 类似于电泳，常用电渗流系数或电渗淌度( 以。) 表示e o f 大小， _ u 。= v 。e ( 1 1 1 ) 由式1 1 0 可以看出，影响e o f 速度的主要因素有电场强度、管壁的z e t a 电势和溶液特 性。而z e t a 电势受管壁材料及其表面特性和溶液性质的影响，因此，归纳起来，影响e o f 7 的因素有电场强度、泳道壁材料、溶液的p h 值、电解质溶液成分与浓度、添加剂、温度等。 e o f 在c e 中起着重要的作用，有效的控制e o f ，对提高分离效率，改善分离度，特 别是提高c e 分离重现性具有非常重要的意义。 1 3 微流控电泳芯片 把现代微加工技术应用于分析化学领域开辟了一个跨学科、快速发展的领域。基于微流 控芯片的毛细管电泳分析( c a p i u a r ye l e c t r o p h o r c s i s ) 于其高效、快速、耗量少而在分析化学 领域占有重要地位。虽然其商业化产品直到1 9 8 8 年才出现，但发展迅速。毛细管的内径在 2 5 1 0 0um 之间，是一般微加工技术易得的尺寸，因此利用微加工技术进行微流控电泳芯 片的加工在过去几年中成为一个热点。 微流控电泳芯片利用微细加工技术，在硅、玻璃、塑料、橡胶等为材料的基片上形成微 细管道，然后用盖片将管道封闭。在电场的作用下，通过不同的管道、反应器、检测单元等 的设计和布局，实现样品的进样、反应、分离和检测。整个过程可以在一块几个平方厘米的 基片上得以实现。 微流控电泳芯片与传统毛细管相比具有以下优点： a )减少了样品、缓冲溶液用量，可节约试剂用量，减少废液产生量，降低环境污染。 b )分析性能改善，比传统的毛细管散热能力强，可进一步提高电场强度，达到高速高效分 离。 c )可制得高性能、连通的管道网络。 d )采用m e m s 技术可以将反应器、过滤器甚至检测器等集成在一个芯片上，使得进样、 反应、分离、检测等过程能在一个芯片中进行，即所谓的芯片实验室( 1 a b o l l - a c h i p ) ， 达到小型化、系统化、集成化的目的。 e )可得到并联系统阵列的装置。利用m e m s 技术可以在一个基片上制作微管道阵列，可 同时对一系列样品进行分离和分析，具有并行处理的能力。 f )利于低成本大规模生产。 1 3 1 微流控电泳芯片的工作原理 图1 5 为微流控电泳芯片的最简单的原理图f 9 】，通常设计有进样管道和分离管道，进 样管道与分离管道交叉成“十”字型，交叉处为样品进样口。在管道的顶端设计了四个储 嚣 液池，s ( s a m p l e ) 为样品池，b ( b u 插神为缓冲液池，w l ( w a s t c r l ) 为样品废液池，w 2 ( w t c r 2 ) 为废液池。微管道一般长度为3 - 2 0 c m ，宽为1 0 1 0 0 ，l ，深为1 0 - 一1 0 0 p 川左右。检测口 设在距离w 2 1 2 c m 处。 进行电泳前，微管道内壁经过修饰处理，以减少内壁对样品的吸附，同时也降低电渗 流的影响。将缓冲介质或筛分介质注入微管道，在样品池中加入样品，先在s 和w l 端加 上电压。样品便在电场作用下从s 端向w l 端迁移。完成进样后，在b 和w 2 端加上电压， 进样口处的样品便沿分离管道迁移，在筛分介质的作用下，样品得到分离，在检测口检出 分离结果。进样过程如图1 6 所示，就工作原理而言，微流控芯片与传统的毛细管的最大 区别是进样方法不同，进样可以通过改变进样管道的宽度或交叉口截面的形状，就能够控 制进样量，从而达到更好的分离效果。 图1 5 微流控电泳芯片原理示意图 f i g 1 5s c h a a t i cd i a g r a mo f m i e r o f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i p sp r i n c i p l e i n t r o d u c j n g a 进样前； i n j e c t i o n b 进样时1 9 s e p a r a t i o n c 分离时 图1 6 进样过程示意图 f i g 1 6s c h e m a t i cd i a g r a mo f g r a t e d 蝎e c t i o n l 3 2 微流控电泳芯片的材料性能 微流控电泳芯片所用的材料应该满足以下的要求： ( 1 ) 易加工性 ( 2 )分析条件下的惰性 ( 3 )合适的热和电性质 ( 4 )材料表面的可修饰和可密封性 常用的材料有晶体硅、普通玻璃、石英、聚合物等。晶体硅具有强度好、透光性好、价 格适中、纯度高、耐腐蚀等优点，但硅是半导体，实验表明，用于绝缘外加电压和硅之间的 绝缘薄膜在不到l0 0 0 v 时便会被击穿，此外，深度刻蚀困难、硅基片的粘合成功率低也影响 了硅的应用。玻璃和石英则是应用最多的基片材料。原因在于： ( 1 )玻璃和石英的微加工技术较为成熟。 ( 2 )它们的光学、电学和化学性能较好。 ( 3 )有较多的表面键合技术，封装较容易。 这两种材料的微流控芯片的制作一般是先掩膜光刻，再用化学湿法刻蚀所得，最后用 热键合的方法进行封装。盖片含有存储用空孔与管道相连。玻璃的退火温度在5 0 0 6 0 0 c 之 间，而石英装置的退火温度则高达1 1 0 0 。 这两种材料的缺点是成本昂贵、基片易碎；难以得到深宽比大的管道；另外在实际应用 中，也会碰到不少问题，如由于湿法刻蚀形成的管道内壁粗糙度比较大，蛋白质分子会发生 粘附在管道内壁的现象。 克服这些问题的途径在于采用聚合物作为芯片材料。聚合物能够提供较宽范围的物理和 化学参数，材料成本低廉。聚合物微复制成本也很低，有利于商业化。聚合物还具有良好的 生物兼容性，适合生化领域的应用。由于聚合物的这些优点，近年来对聚合物微流控芯片的 研究成为一个极大的热点。 我们采用了四种聚合物作为基底材料，分别为聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 、聚苯乙烯 ( p s ) 、z e o n o r 、聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 。下面分别介绍一下这几种材料的特性。 聚甲基丙烯酸甲酯：分子式为 斗c h 2 一b s h 3 c = o c h 3 俗称“有机玻璃”，具有较强的的抗碱力，耐老化性和较高的强度和优良的光学特性，白光的 穿透性商达9 2 ，密度1 1 9 9 c m 。，玻璃化温度1 0 5 c 左右。在1 0 0 c 以下尺寸稳定，易于 加工成型，能够进行锯、锉、热焊和粘结等二次加工，可广泛应用航空、汽车、船舶、照明、 电子、光学仪器、仪表、医疗器械、建材、文化用品等领域。近年来，随着m e m s 的不断 发展，特别是l i o a 技术的发展，p m m a 由于其优良的性能而被广泛用作同步辐射x 光光 刻胶、三维元器件电铸掩模和热模压塑料。我们选用p m m a 除了上述优点外，还考虑到 p m m a 基本上不产生荧光，因此很适合于微流控芯片应用。 蝌一一为：r 。 1 3 3 微流控电泳芯片的发展历史和研究状况 1 9 9 0 1 9 9 1 年间，h a r r i s o n 和m a n z 首先利用微细加工技术在平板玻璃上刻蚀出微管道， 研制出了微流控电泳芯片装置，成功地实现了荧光标记的氨基酸的分离，这一成果在1 9 9 3 年8 月的s c i e n c e t i l l 上发表，引起了学术界的广泛关注。随后有报道利用电泳芯片技术实 现了荧光燃料、快速分离d n a 片段、氨基酸等的有效分离i ”i 。 但直到1 9 9 4 年之前，这一新领域的发展前景并不十分明朗。1 9 9 4 年始，美国橡树岭国家 实验室r a r a e y 等在m a n z 的工作基础上发表了一系列论文，改进了芯片毛细管电泳的进 样方法，提高了其性能与实用性，引起了更广泛的关注。在此形势下，该年首届p tas 会议 以工作室的形式在荷兰e n c h e d e 举行，起到了推广微全分析系统的作用。1 9 9 5 年美国加州 大学b e r k e l e y 分校的m a r b l e s 等人“1 在微流控电泳芯片上实现了高速dna 测序，微流控电 泳芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵列型的生物芯片已进入实质性豹商品开发阶 段。同年9 月首家微流控芯片企业c a l i p e r t e c h n o l o g i e s 公司在美成立，虽然只有3 0 多名雇员， 但一年即集资近千万美元。1 9 9 6 年m a 也i e s 等【1 4 1 又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反 应( pcr ) 扩增与毛细管电泳集成在一起，展示了微全分析系统在试样处理方面的潜力，次年 他们又实现了微流控芯片上的多通道毛细管电泳dna 测序，从而为微流控芯片在基因分析 中的实际应用提供了重要基础。与此同时，有关企业中的微流控芯片研究开发工作也在加紧 进行，1 9 9 8 年之后专利之战日益激烈，一些微流控芯片开发企业纷纷与世界著名分析仪器 生产厂家f 其中包括惠普、pe 、岛津、日立等) 合作，利用各自的优势技术平台抢先推出首台 微流控分析仪器。1 9 9 9 年9 月惠普与c a l i p e r 联合研制的首台微流控芯片商品化仪器开始在 欧美市场销售，至2 0 0 0 年8 月已可提供用于核酸及蛋白质分析的5 6 种芯片。其他几家厂 商也于2 0 0 0 年开始将其产品推向市场。 图1 7 为1 9 9 9 年a g i l e n t 公司推出的商品化仪器b i o a n a l y z e r2 1 0 0 测定d n a 的ce 芯 片。其中间通道为分离通道，仅长约1 5 r a m 。片上4 个较大的孔为缓冲液及标准梯形条带 试样池，1 2 个较小的7 l 为试样池，分别通向分离通道并与之交叉。当每个液池同时插入电 极，并按一定次序通以高电压或切断时，1 2 个试样按十字通道进样的相似原理，相继注入 分离通道，仅用2 0 多秒，dna 片断即达到分离，并立即在通道终端用激光诱导荧光法进 行检测。全部1 2 个试样的测定约需3 0m i n 。芯片价值数美元，为一次性使用，测定1 2 个 试样后即弃去。加州大学伯克利分校m a t h i e s 的研究组曾在1 9 9 9 年提出了集9 6 个分离通道 于1 个如cd 光盘的微流控阵列毛细管芯片上( 见图1 8 ) ，此芯片仅用2 r a i n 便可平行测定9 6 个d n a 试样的片段。 图1 7 美a g i l e n t 公司的d n a 毛细管电泳微流控芯片 面积1 7 m i t i 1 7 m m ，每个芯片可测1 2 个试样 f i g 1 7d n ac a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sm i c r o f l u i d i cc h i pp r o d u c e db ya g i l e n tc o m p a n y 图1 8 微流控阵列毛细管芯片 f i g 1 8m i c r o f l u i d i ca r r a ye l e e t r o p h o r e s i se l l i p 1 3 用于平行d n a 测定的9 6 通道阵列毛细管电泳微流控芯片，检测区靠近芯片中心由激 光束作圆周扫描。图下部为进样部分的通道细部，抽样时，两个试样共用一个出口。 微流控芯片微型化的目标是向纳米芯片进军，在美国加州m o n t e r e y 召开的第五届2 0 0 1 年的u - t a s 国际会议上科学家们提出将来的u - t a s 将向着微型化和纳米量级发展。美国橡 树岭国家实验室的研究专家已经研制出一种纳米微流控芯片实验室装置。这种纳米微流控实 验室能快速无误地诊断人体内无论是细菌还是病毒引起的癌肿瘤，