（环境工程专业论文）降解煤矸石的微生物选育.pdf

s u b j e c t ：i s o l a t i o no fg a n g u e - d e g r a d a t i o nb a c t e r i u m s p e c i a l t y ：e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g n a m e：w a n g h a n x i a i n s t r u c t o r ：w a n g y i n g a b s t r a c t ( s i g n a t u r e ) ( s i g n a t u r e ) t h eg a n g u ei st h ef i r s ta b u n d a n c eo fs o l i dw a s t e i t sw h o l eu t i l i z a t i o nr a t i oi sv e r yl o w , i tl e a d sag r e a td e a lo fg a n g u ep i l ei nm i n i n ga r e a , t h a tn o to n l yo c c u p i e sl a r g eg r o u n d ，b u t a l s op o l l u t e st h ee n v i r o n m e n tg r e a t l y i tr e p r e s e n t sa t m o s p h e r e 、w a t e r 、s o i l 、l a n d s c a p e p o l l u t i o na n dr a d i a t eh u m a nb o d i e s 、e n d a n g e rl i f es e c u r i t y a n dd u r i n gt h i sy e a r s ，a sw e s p a r k p l a gd e v e l o p i n ga g r i c u l t u r ee c o l o g ya n dg r e e nf o o d ，m c m o r g a n i s md e v e l o p i n ga n d a p p l i c a t i o nh a v en e wm e a n i n g s ，t h e r ei s l i t t l er e p o r ta b o u tt h eb i o d e g r a d a t i o no fg a n g u e s t u d i e sa tp r e s e n ta th o m ea n da b r o a d f o rr e i n f o r c i n gt om a k eu s eo ft h eg a n g u e t h ea u t h o r t r i e st oc h o o s et h ep r o p e rm i c r o o r g a n i s mi nt h ee n v i r o n m e n tf o rd e g r a d a t i o no nt h eg a n g u e ， a n dd o e se x p e r i m e n ta n do p t i m i z e st h eb i o d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sa n dc h o o s e st h eb e s t b a c t e r i u m i no r d e rt op r o v i d ef o r e e f u lb a s i sf o rd i s p o s i n gg a n g u e ，e s p e c i a l l yi nt h ef i e l do f r e c l a m a t i o na n dp r o d u c em i c r o o r g a n i s mf e r t i l i z e rw i t l lg a n g u e i nt h i s p a p e ric h o o s i n gb a c t e r i u m f r o ms o i l ，w i t h e r e db r a n c ha n dg a n g u e ，d o b i o d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n tw i t h t h eg a n g u eo fh a n c h e n g o nt h eb a s e o fa n a l y s e s c o m p o s i t i o no fg a n g u eb yp h y s i c sa n dc h e m i s t r ym e t h o dif i n df i v ek i n d sb a c t e r i a lf r o m s o u r c eu p w a r d s ：z i ，z 2 1 ，z 2 2 ，c ia n dc 2 o p t i m i z et w om i c r o o r g a n i s mf r o mt h eg r o w t hc u r v e a n dc o n d i t i o n ：c 1f r o mt h eg a n g u ea n dc 2f r o mt h ew i t h e r e db r a n c hr e s p e c t i v e l y t r a i n i n g t i m e 、t h et e m p e r a t u r e 、p hv a l u ea n di n o c u l a t i n ga m o u n t sa r et e s t e da ss i n g l ef a c t o rt oc o n f i r m t h eb e s tv a l u e f i n a l l yo r t h o g o n a lt e s t ss h o wt h a tb l e n d i n gb a c t e r i u ma l eb e t t e rt h a nu n i t a r y b a c t e r i u mi nd e g r a d a t i o n , a n de s t a b l i s hd e g r a d a t i o nk i n e t i ce q u a t i o nu l t i m a t e l yb a s e do n b l e n d i n gb a c t e r i u md e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t r e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 d o m e s t i c a t ea n do p t i m i z ec if r o mt h eg a n g u ea n dc 2f r o mw i t h e r e db r a n c hb y m i c r o o r g a n i s mt e s t s 2 i ti sp r o v e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tt h a tb l e n d i n gb a c t e r i u mi sb e t t e rt h a nu n i t a r y b a c t e r i u m 3 t h eb e s td e g r a d a t i o nc o n d i t i o nf o rb l e n d i n gb a c t e r i u mi s ：p hv a l u e7 1 5 ，t e m p e r a t u r e 3 0 5 1 2 ，i n o c u l a t i n ga m o u n t s5 9m g m l ，d e g r a d a t i o nt i m e2 6 h , a n df i n a l l yi tg e t sh u m i ca c i d c o n t e n t s1 3 3 7 4 b yd e g r a d a t i o nd y n a m i c se x p e r i m e n t ，t h eb l e n d i n gb a c t e r i u md e g r a d a t i o nd y n a m i c s e q u a t i o ni ss i m i l a rw i t ho n e l e v e ld y n a m i c se q u a t i o n k e yw o r d s ：g a n g u e m i c r o o r g a n i s m d e g r a d a t i o n d g g r m a f o f fd y n a m i c se q u a t i o n t h e s i s：t h e o r ys t i l d y 妻料技太季 学位论文独创性说明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导f 进行的研究工作及 其取得研究成果。尽我所知，除了文中加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西安科技大学 或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 1 、 学位论文作者签名：立权葭日期：巩衍；2 一。 学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间 论文工作的知识产权单位属于西安科技大学。学校有权保留并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。同时本人保证，毕业后结合学位论文研究课 题再撰写的文章一律注明作者单位为西安科技大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：立弘锭 指导教师签名 移隽 年月夕日 1 绪论 1 绪论 煤矸石是在煤矿建设、煤炭开采及加工过程中排放出的固体废弃物，包括岩石巷道 掘进时产生的掘进矸石，采煤过程中从顶板、底板和夹在煤层中的岩石夹层里采出来的 矸石，以及洗煤厂生产过程中排出的洗矸石。一般常将采煤过程和洗煤厂生产过程中排 出的矸石叫煤矸石，它是各种工业废渣中排放量最大、占地最多、污染较严重的固体废 物。 我国是煤炭资源及其丰富的国家，煤矿经过多年开采，废弃的煤矸石堆积如山。煤 炭生产和加工中产生的煤矸石，占当年煤炭产量的1 0 1 5 。目前累计煤矸石山达 1 5 0 0 多座，约4 0 亿吨，占地1 3 3 万公顷以上，而且每年约以1 亿吨的速度递增，每年 形成新增占地约4 0 0 公顷【1 l 。而煤矸石的综合利用率尚不到1 5 ，而目前对矸石的利用 仅限于发电、生产建材、开发共半生矿物、无污染复垦、筑路、采煤塌陷区填充等，余 下煤矸石多采用圆锥式或沟谷倾倒式自然松散地堆放在矿井四周【2 】，煤矸石的大量堆积 不仅占用土地，浪费资源，而且对空气、水、土壤以及人民的生命财产等都会造成极大 的危害。辽宁本溪矿区就曾发生因矸石自燃造成人员中毒死亡的事故；2 0 0 4 年以来，先 后发生了安徽省淮南市新集煤矿矸石山塌方、重庆市南桐矿业公司东林煤矿矸石山垮塌 引起滑坡和平煤集团四矿矸石山自燃崩塌等三起重大事故，造成了严重的人员伤亡和财 产损失，引起社会的广泛关注，也受到国务院领导同志的高度重视。在平煤集团四矿 “5 1 5 ”矸石山自燃崩塌灾害事故后，国务委员华建敏提出重要批示，指出要切实搞好煤 矸石的综合利用，变废为宝，坚决防范类似事故的发生。国外曾发生一起煤矸石堆滑坡 事故，以至埋没了山谷下的一所小学校，造成多人伤亡事故。因此，如何解决煤矸石堆 积问题，使这些被废弃的资源获得新生，是煤矿开采和环境保护部门的重要使命。 1 1 煤矸石的来源及危害 煤矸石的主要来源 2 1 有：露天剥离以及井筒和巷道掘进过程中开凿排出的煤石， 约占4 5 ；在采煤和煤巷掘进过程中，由于煤层中夹有矸石或底板岩层的混入，使运 到地面上的煤炭中含有矸石，约占3 5 ；煤炭洗选过程中排出的矸石，约占2 0 。 一、煤矸石对矿区大气环境的污染 煤矿开发和利用，使矿区的大气环境质严重下降，矿区空气污染日益恶化，煤矸石 就是重要的空气污染源。煤矸石在提升、运输、堆放过程中，会形成一种粉尘颗粒，在 风速达4 8 m s 时，颗粒就会飞起并悬浮于大气中。据实测，在距煤矸石山下风方向5 0 0 m 处，总悬浮微粒浓度可达o 8 m g m 3 ，粉尘中含有很多对人体有害的元素，如：h g 、c d 、 c r 、c u 、a s 、m n 、z n 、a i 等。小于5 9 m 的颗粒会被人体吸入肺部，导致各种疾病， 西安科技大学硕士学位论文 如：气管炎、肺气肿、尘肺，甚至导致癌症的发生；大于5 1 a n 的颗粒也会留在人的鼻 腔中，导致鼻腔感染，若进入眼中，会引起各种眼疾。 另外，颗粒悬浮于大气中，使气候出现异常。若矸石含硫量大于l ，在加压、通 风、氧化的条件下会发生自燃。煤矸石山一旦自燃，不但释放出c o 、s 0 2 、c 0 2 、h 2 s 、 n o x 和c m i - i n 碳氢化合物等有害气体，同时还伴有大量的烟尘，严重地污染矿区的大 气环境，损害人体健康。 二、煤矸石对土壤和水体的污染 煤矸石在露天堆放过程中，经雨水淋溶后部分物质被溶解，并随雨水形成地表径流 进入土壤、地表水体或地下水体时，造成土壤、地表水或地下水的污染。当人们饮用被 污染的地下水时，其中的重金属等有害物质会严重危害人体健康，甚至危及生命。地表 水体长期受这种淋溶水污染，会使水质逐渐酸化，当用来养殖时，会造成鱼类和其它淡 水生物的死亡，破坏水生生态环境。当淋溶水随雨水形成地表径流进入土壤，破坏了土 壤中重金属的本底值和平衡关系，同时也破坏了土壤的养分，并对土壤中微生物的活动 产生影响，这些有害成分的存在，不仅有碍植物根系的发育和生长，而且还会在植物有 机体内积蓄，通过食物链危及人体健康。 三、煤矸石对矿区景观的破坏 煤矸石多为黑灰色或黑褐色，影响大自然的风光。煤矸石风蚀扬尘，尘埃着落在建 筑物和植被、树木上，使其失去原来色调，以致矿区环境极不雅观。尘埃还会降低空气 的清洁度和地面的光照度，使矿区空气浑浊不清，严重影响人们的生活和植物的生长。 四、煤矸石对生命财产的危害 煤矸石在受到爆炸震动后或遇暴阿侵蚀时，经常导致滑坡、煤矸石山爆炸等灾难。 煤矸石灰分一般可达6 0 7 0 ，发热量为3 3 5 0 6 2 8 0 k j k g ，当含硫量较高时，经长 期存放，其内部经过一系列的化学变化，形成一个高温高压的环境，当其内部温度和压 力达到一定程度时，就会发生爆炸。特别是雨季时大量降水，洒到燃烧的煤矸石上，并 渗入到煤矸石内部的高温燃烧区域，导致水变成蒸汽并与赤热的碳发生如下的化学反 应： c + h 2 0 壹- h 2 + c o 在标准状况下，上式的化学反应l k g 的水产生1 2 4 m 3 的h 2 和c o 气体，大量的气 体产生，使体积迅速膨胀；气温越高，体积越大，而煤矸石山内空隙有限，孔道狭小， 大量的气体不能及时释放，导致气体压力急剧增加而发生爆炸。 综上所述，煤矸石的大量堆积严重污染大气环境，损害职工健康，严重破坏矿区的 整体形象，导致矿区与周边农村工农关系的紧张【2 1 。随着国民经济的高速发展，煤炭的 需求量也越来越多。伴随煤炭开采和矿井开拓过程煤矸石也愈柬愈成为摆在煤矿决策者 面前亟待解决的问题。在煤矸石综合利用方面，我国的煤炭科技工作者付出了艰辛的劳 l 绪论 动，已在复土造田、矸石发电、提取有用矿物质、制砖瓦等建材上累积了许多成功的经 验。由于受地理位置和原材料的限制，有的矿区上述方案并不适宜，越积越多的煤矸石 加剧了煤矿的负担，煤矿迫切需要一种既能创造较高经济效益，又能根治煤矸石废物的 综合治理新技术。 1 2 国内外煤矸石的利用现状 1 2 1 国内煤矸石的利用现状 我国采煤历史悠久，煤矸石综合利用已有二、三十年的历史。近十几年来，随着煤 矿环保工作的深入开展和科学技术进步，煤矸石应用领域在逐步拓宽，加工技术日趋成 熟，煤矸石的利用率也不断提高，1 9 9 0 年矸石利用率为2 0 、1 9 9 5 年提高到3 0 5 、 2 0 0 0 年上升到4 0 。目前我国对煤矸石综合利用主要在以下几个方面： l 、煤矸石发电、供热、生产沸腾炉燃料； 2 、生产建筑材料制品：烧结砖瓦、免烧砖瓦、空心砖，制作水泥原料( 水泥熟料、 无熟料及少熟料水泥) 、特种水泥、陶瓷、轻骨料等； 3 、生产农田用肥料：有机复合肥、微生物肥料、土壤改良剂； 4 、生产化工原料：合成碳化硅、制备分子筛、制取白炭黑、聚合氯化铝、硅铝铁 合金等； 5 、利用煤矸石筑路、充填采空区、塌陷区、造地复垦； 6 、回收有益矿产品：高岭土、硫铁矿，提取稀有稀土元素等。 随着我国工业技术水平的发展和社会对新产品的要求，矿产资源开发利用工作者认 为煤矸石资源化综合利用，应该在上述利用的基础上，依靠科技进步，开发煤矸石资源 化综合利用新技术、新方法、新产品，尤其是开拓具有高科技含量、高附加值深加工产 品，并使其产业化。这样，在满足社会需求的同时，培育了衰老矿山或资源枯竭型煤矿 城市经济转型接续产业，增加新的经济增长点，创造更多的就业机会，以取得良好的经 济效益、社会效益和环境效益。 1 2 2 国外煤矸石的利用现状 国外对煤矸石的综合利用研究比较重视，对煤矸石的利用率( 不含用于充填铺路材 料等) 一般在2 0 - - 3 0 ，高者可达6 0 0 o - - 8 0 1 4 】。主要用于生产建筑材料产品，如制 矸石砖、生产水泥和混凝土的轻质多孔集料。此外，煤矸石还用于发电供热和生产有机 矿质肥料1 5 1 。 美国的煤矸石利用主要用于生产水泥或轻骨料。对不便利用的矸石山，采用复垦法， 使其变为牧场或果园。美国的做法是：先将矸石山的坡度降到2 0 度以下，利用燃煤电 西安科技大学硕士学住论文 厂的碱性飞灰，按计量均匀播撒，再用拖拉机翻耕使其拌入1 5 e m 厚的表层，中和矸石 中酸性物质，然后铺上约3 0 e r a 厚的土壤盏层并旌肥，便可种植牧草或树木。 在前苏联，除了利用煤矸石和矸石火烧岩生产砖和多孔轻骨料等建材外，还用煤矸 石( 含有机质2 0 以上) 生产有机矿物肥料。这种矸石肥料可提高土壤肥力，特别适用 于非黑土地带使用，生产矸石砖的利用率也可达4 0 。 其他一些国家，如英国、法国、匈牙利等也对煤矸石利用进行了研究，并建立了用 煤矸石、沸腾炉渣、粉煤灰生产建材的工厂。法国、波兰、前苏联、英国、美国、芬兰 等利用煤矸石生产基础材料。法国、英国、前苏联用煤矸石生产烧结实心砖和空心砖， 也都取得成功的经验】。 综上所述，国内外对矸石的资源利用【5 】见图1 1 ： 图1 1 煤矸石的综合利用示意图 4 1 绪论 1 3 微生物的利用现状 微生物是大自然和人类生存和发展不可缺少的生物。微生物的几个显著特点：一是 数量多，繁殖速度惊人；二是对有机物质分解作用或转化作用能力强、速度快；三是能 复制和制造出大量的蛋白质和酶；四是遗传性不稳定，容易发生变异；五是与其他生物 有寄生、共生、抗生等千丝万缕的复杂关系。微生物由于具有以上这些特点，它就为人 类不断开发和利用提供了极其有利的条件，如在生物制药、生物制剂、发酵产品、生产 疫苗、生产除草剂、发酵饲料、生物防治以及作为转基因的工具、改造生物、培育新品 种等方面，使人类开发和利用微生物的前途十分宽广。 1 9 世纪初，人们开始注意到污水中细菌的存在及其对环境的影响，1 9 1 3 年英国的 费拉开创了活性污泥法，并随着欧美各国一些城市先后建立和发展了自来水厂。2 0 世纪 5 0 年代，英美法一些国家的学者陆续发表了微生物研究报掣6 】。 随着社会的发展和科学的进步，微生物在工业、农业、能源、医药、食品等领域中 所发挥的作用愈来愈令人瞩目。尤其是循环经济的建设，将离不开微生物的参与及其应 用技术的发展和创新。在环境治理方面【2 6 1 ，利用微生物降解石油污染，难降解有机物， 白色污染等已有重大突破，微生物作为环境污染物的“清道夫”和污染受损环境的生物修 复者，在环境保护工作中发挥着越来越重要的作用。 图1 2 微生物应用领域 大自然的有机物只有通过微生物才能分解为无机物；有些重要的蛋白质是在微生物 体内合成的；有些微生物在空气净化、污水处理、垃圾处理和有害物质转化中发挥了重 大的作用。正因为微生物在清洁环境、维持物质循环中劳苦功高，才有“大自然的清洁 工”、“生态平衡的清道夫”等美称。 总结微生物在环境治理方面的应用主要有，利用微生物处理废水、进行固体废物堆 肥、进行环境监测、进行废气处理等，尤其在环境问题越来越被重视的当今社会，微生 西安科技大擘硕士学位论文 物将会发挥着更加重要的作用。 1 4 研究内容 1 、通过实验，对煤矸石样品进行化学组成分析，包括金属元素、灰分、挥发份、 腐植酸、有机质、固定碳等含量的测定。 2 、以环境中煤矸石、枯树枝、土壤为菌源，从中培养、驯化、筛选出对矸石有高 效降解作用的细菌。 3 、通过菌株对矸石降解影响因子的正交实验，考察影响因素如温度、p h 值、培养 时间、接种量、矸石粒度对降解效果的影响，优化降解条件。 4 、根掘降解试验，建立相应的降解动力学方程式。 6 2 煤矸石特性分析 2 1 煤矸石的矿物组成 2 煤矸石特性分析 存在于煤矸石中的矿物主要是由成矿母岩演变而来的。按成因类型可将其分为两 类：一类是原生矿物，它们是各种岩石( 主要是岩浆岩) 受到程度不同的物理风化而未经 化学风化的碎屑物，其原有的化学组份和结晶构造都没有改变；另一类是次生矿物，它 们大多数是由原生矿物经风化后重新形成的新矿物，其化学组成和构造都有所改变而有 别于原生矿物。 韩城矿区煤矸石矿物组成主要为粘土矿物，其次为石英、长石、云母等碎屑矿物， 再其次为黄铁矿、碳酸盐等伴生矿物。最常见的粘土矿物有高岭石、伊利石、蒙脱石、 绿泥石，其中以高岭石含量最大，部分矸石中还含有少量的绢云母和黑云母等。矸石山 未自燃矸石样品主要由石英和高岭石组成，其中还含有少量伊利石、方解石和长石。 2 2 煤矸石的外观特征及显微结构 煤矸石实际上是含碳岩石和其他岩石的混合物。依煤层地质年代，地质沉积环境， 地区及开采条件不同，煤矸石的岩石种类也不尽相同，成分复杂，变化也较大。 l 、外观特征 碳质页岩为黑色或黑灰色，层状结构，表面有油脂光泽，不完全理解，不规则块状， 断面参差，易碎，滴入稀盐酸有小气泡缓慢放出；泥质页岩为黄灰色或黑褐色，土状光 泽，有松疏的黑色小粒，片状结构，不完全理解，质软性脆，不规则块状，易碎，滴入 稀盐酸不起反应；砂质页岩为深灰色或灰白色，腊状光泽，结构较泥质、碳质页岩粗糙 坚硬，组成均一，沿层理有草叶状条痕，极不全完解理，滴入稀盐酸有气泡放出，还有 铁锈斑点。 2 、显微结构 碳质页岩以不透明黑色矿物为主，有少量石英和粘土矿物，泥质页岩以石英为主， 有一定量的不透明黑色矿物和少量云母；砂质页岩主要是石英和云母，还有一定量的不 透明矿与碳酸盐矿物，石英颗粒较粗。碳质页岩和泥质页岩在出煤井时含有较多的碳质， 往往还含有胶质有机物、树脂，孢子以及其他植物残体，随着含量的增加岩石颜色加深， 经长期堆积，内部发热自燃，大部分已起一定煅烧作用，使表面形成一层很厚的硫酸铝 或其他复盐。 2 3 煤矸石的理化性质 西安科技大学硕士学位论文 矿区不同层段以及不同来源的矸石，其物理性质也不一样。一般来说，掘进矸石主 要是砂岩、砾岩、页岩、泥岩和石灰岩等，其硬度大，无热值或热值很低，颜色多样。 采煤矸石一般多为泥岩、粉砂岩或炭质泥岩，也有细砂岩，其硬度较低，岩石多呈灰黑 色或黑色。 宏观观察，大部分煤矸石为灰黑色、致密状、块状构造，贝壳状断口，破碎后呈规 则的块状和棱角状，有滑面。 化学成分是评价矸石性质、决定利用途径的重要指标，煤矸石的化学成分随其地层 岩石的种类和矿物组成不同而变化，煤矸石的主要化学成分有：s i 0 2 ，a 1 2 0 3 ，f e 2 0 3 ， c a o ，m g o 等。 表2 1 煤矸石的化学成分分析( ) 堕坌! ! 垒垒! 里! ! 生垒竺塑鉴! q型丝q! 塑! 垒坚鲤 组成( ) 4 3 2 5 3 5 8 20 1 80 3 20 3 20 1 60 6 90 2 30 2 本文在韩城矿区的象山矿、下峪口、桑树坪采样，样品编号分别为x s 一1 、x y 0 2 、 s h 3 。 金属元素的测定：煤矸石中金属元素的测定是根据g b t 4 6 3 4 - - 1 9 9 6 煤灰中钾、钠、 铁、钙、镁、锰的测定方法进行测试。原理：样品经强氧化性酸( h n 0 3 h f _ h c l 0 4 ) 分解，在酸性介质中，加入释放剂( 镧或锶消除铝钛等对钙镁的影响) 消除干扰，消解 容器必须用聚四氟乙烯坩埚，以防止对实验的干扰，用乙炔一空气火焰原子吸收测定其 吸光度，再配制标准溶液，绘制标准曲线，根据标准曲线得到矸石样品中金属元素的含 量，测定结果见下表： 表2 3 金属元素的测定结果( g a n g ) 元素m g f ec uz n c rn i x s 1 1 5 7 9 9 0 3 60 1 9 12 6 10 4 90 0 6 3 x y - 24 “56 0 1 40 1 4 81 8 30 5 l0 0 3 9 s h 33 0 0 78 11 30 1 5 31 6 70 7 30 11 9 此外，煤矸石中的固定碳、水分、灰分、挥发分等因素对煤矸石的可用性也带来影 响，本文还分别用缓慢灰化法、隔绝空气加热法、容量法、重铬酸钾氧化法等对各矸石 2 煤矸石特性分析 样品的狄分、挥发份、腐植酸、有机质、固定碳进行了测定，测试结果见下表： 表2 4 煤矸石样品的工业分析 由金属元素以及煤矸石的工业分析测试数据知，韩城矿区煤矸石中含有金属元素， 如m g 、f e 、c u 、z n 、n i ，其中f e 、m g 、z n 的含量较高，c u 、n i 的含量较低；而且 矸石中有机质的含量在2 0 左右，最高达2 6 9 ，矸石中不含腐殖酸。 9 西安科技大学硕士学位论文 3 微生物的选育 一般微生物的选育主要包括：菌源的选择与预处理；培养基的选择；所需菌种的培 养、驯化、菌落的筛选和纯化。在选择菌种来源时，存在一些选择标准。对于天然材料， 如土壤的选择，来源越是广泛的样品越有可能获得新的菌种；此外，寻找已适应苛刻环 境压力的微生物类群。材料的预处理是为了提高分离效率。通常采用热处理方法减少材 料的细菌数，采用膜过滤法浓缩水中的细胞。也有在分离前添加一些固体基质( 如把几 种基质加在土壤中) 或洒些可溶性养分来强化培养基。菌落的选择常常是分离步骤中最 易受挫折和最耗时间的阶段。应采用什么方法取决于筛选的最终目的。基于以上认识， 设计了降解煤矸石菌种的选育实验方案。 3 1 实验方案 3 2 实验过程 图3 1 菌种选育流程 3 2 1 实验仪器及设备 实验所用仪器：y b 2 8 0 b 型高压蒸汽灭菌锅、p h s - 3 c 型精密p h 计、s p x 1 5 0 b 型 生化培养箱、d k 9 8 i 型万用电炉、p b 2 0 3 - n 型电子天平、电热鼓风干燥箱、显微镜、 分光光度计、恒温振荡摇床、奥林巴斯电子显微镜，原子吸收分光光度计、恒温生化培 养箱，恒温水浴锅、高速离心机、冰箱、酒精灯、接种环、1 0 0 m l 锥形瓶、无菌培养皿、 试管、移液管、1 0 0 0 m l 烧杯若干。 0 3 微生物的选育 3 2 2 茵源与培养基的选择 菌源与培养基的恰当选择直接关系到整个实验的成功进行，所以本着菌源和培养基 尽量多选的原则。 一、菌源的选择 本实验所采用的菌种源主要来源于煤矸石、腐烂树枝和土壤。土壤采于学校花坛潮 湿地层，约地下1 2 e m 左右；枯树枝采于地面以下2 0 c m 的潮湿土壤之中的腐烂树枝； 矸石采于韩城下峪口煤矿的矸石堆周围与地面接近处，分布于地表以上5 c m 及地面以下 5 c m 的矸土混合层。 选择煤矸石、腐烂树枝和土壤作为菌种的来源，主要考虑以下因素：由于从自然环 境中采集的煤矸石样品中就携带有微生物菌种，所以首先就从煤矸石样品中选择合适的 微生物做菌种；另外土壤中含有大量的微生物，这些微生物有广泛的适应性，所以也可 以自土壤中选取微生物菌种；树枝中含有的难降解高聚合物，在微生物的作用下会腐烂， 所以考虑从腐烂的树枝中选取微生物菌种。因此，本实验主要试图从煤矸石、土壤和腐 烂树枝中选取适合于煤矸石环境下生长的微生物菌种，作为菌种源。 二、培养基的选择 微生物的培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖，或积累代谢产物的营养基 质。广义上说，凡是支持微生物生长繁殖的介质或材料，均可作为微生物的培养基。其 中必须含有各种菌丝生长所需要的养分、水分和适宜的酸碱度。 培养基的制备主要有以下几个原则： ( 1 ) 目的明确； ( 2 ) 营养协调，营养物浓度太低，不能满足微生物生长的需要；浓度太高，又会抑 制微生物生长； ( 3 ) 控制p h 、渗透压等条件； ( 4 1 经济节约。 天然培养基是采用化学成分很复杂的天然物质配制而成的。配制天然培养基常用的 原料有三类：一是农副产品，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠、豆饼粉等；二是动植物 组织的加- r 制剂，如蛋白胨、牛肉膏、麦芽汁、血清等；三是微生物制品，如酵母粉、 酵母膏等。天然培养基具有营养丰富、原料易得、培养微生物效果好等优点，因而本论 文选择牛肉膏蛋白胨培养基和淀粉培养基。 马铃薯、葡萄糖、琼脂作为各类母种的培养基最为普遍，菌丝都能正常生长。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普 通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和n a c l 。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷 酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而n a c i 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定 西安科技大学硕士学住论文 量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下9 6 ( 2 时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫 以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在4 0 。c 时凝固，通常不被微生物分解利用。固 体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用 于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其p h 调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁 殖。 三、培养基的制备 培养基的制备有称量、熔化、调p h 、过滤、分装、灭菌和无菌检查等主要步骤。 ( 1 ) 称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中，对于不是粉状应用烧杯称量。 ( 2 ) 配调 向上述烧杯中加入所需要的水量( 可视情况不同，一次或多次加入水) ，搅拌，使 其溶解( 可加热助溶) 。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并 控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分，如果配方中含有淀 粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品， 待完全熔化后补足所失水分。 ( 3 ) 调节p h 值 培养基配方为自然p h 时，不用调节，否则必须调节才能满足需要。一般做法是： 培养基溶解均匀并冷却至室温时用精密p h 计测p h ，然后根据需要加酸或碱( 质量分数 为3 0 的n a o h 或h c i 调节p h ) ，要缓慢少量且多加搅拌。 ( 4 ) 分装 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管( 瓶) 口塞上棉 塞。固体培养基要趁热分装，分装时要避免培养基粘染管( 瓶) 口，引起污染。 ( 5 ) 灭菌 塞棉塞，包扎，采用高压蒸汽锅在1 2 1 、0 1m p a 的条件下进行高压灭菌2 0 3 0 m i n 。 ( 6 ) 无菌检验 将第一次灭菌的培养基分出少量于培养皿中，放入3 0 c 恒温培养箱中培养2 4 4 8 h ， 培养基表面无杂菌生长则可使用，若有杂菌则要再次灭菌。 四、本实验所用培养基的配置方法： 1 、无机盐培养基：以k h 2 p 0 4 ：5 0 0 m g ，k 2 h p 0 4 ：5 0 0 m g ，m g s 0 4 7 h 2 0 ：2 0 0 m g ， c a c l 2 ：2 0 0 r a g ，n a c h2 0 0 m g ，n h 4 n 0 3 ：1 0 0 m g ，微量l l n s 0 4 h 2 0 ，微量f e c l 2 ，水 10 0 0 m l 。 2 、牛肉膏蛋白胨培养基( 培养微生物) ：牛肉膏50 0 0 m g ，蛋白胨1 00 0 0 m g ，氯化 钠50 0 0 m g ，琼脂2 00 0 0 m g ，水l0 0 0 m l 。 3 微生物的选育 3 、马铃薯葡萄糖琼脂培养基( p d a 培养基) ：马铃薯( 去皮) 2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂 2 0 9 ，水l0 0 0 m l ，p n 值自然。具体制作方法是：将2 0 0 9 马铃薯去皮，去芽眼，切成小 条放入铝锅中，加入l0 0 0 m l 水，煮沸2 0 3 0 分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6 8 层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至l0 0 0 m l ，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁 热分装于锥形瓶中。 4 、富集培养基：牛肉膏50 0 0 m g ，蛋白胨1 0 0 0 0 m g ，氯化钠50 0 0 m g 。 5 、缓冲液的制备：o 0 2 m o l l k h 2 p 0 4 k 2 h p 0 4 ，调节p h 值到7 0 ，在1 2 1 、o im p a 的条件下进行高压灭菌2 0r a i n 。 3 2 3 菌种培养 将枯树枝、矸石和土壤粉碎，分别称取矸石、腐烂树枝和土壤1 0 9 溶于5 0 m l 无基 盐培养基中浸泡2 4 h ，利用平板划线法将上清液分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基和淀粉 培养基中，在3 2 1 2 培养箱中培养7 2 h 后观察微生物的菌落形态。 图3 2 牛肉膏蛋白胨培养基中菌种培养照片图3 3 淀粉培养基中菌种培养照片 从培养的微生物照片可以明显看出；牛肉膏蛋白胨培养基中的微生物繁殖迅速，长 势好，而在淀粉培养基上长势不好，生长速度慢且有腐烂迹象。由照片可见牛肉膏蛋白 胨培养基中菌落形态为：菌落颜色为乳白色，土壤中的菌落较大，大小从l m m l c m 不 等，但菌落数量较树枝中的少，且有同心菌，表面都较为光滑，而矸石中的菌落既有表 面光滑的，也有表面有褶皱的，形如荷叶，大小均一，平均直径约0 8 c m 。因此本论文 的后续实验均采用牛肉膏蛋白胨为菌种培养基。 3 2 4 菌种驯化 将上述牛肉膏蛋白胨培养基上生长的微生物用无机盐培养液分别冲洗至3 个1 0 0 m l 锥形瓶中，定容至1 0 0 m l 。本论文通过逐渐加量、大剂量冲击以及静止三种驯化方式进 行驯化，驯化条件均在厌氧条件下进行【柏】。 一、逐渐加量驯化方式 西安科技大学硕士学住论文 1 、取上述上清液l o m l 至三个l o o m l 锥形瓶中，分别加入o 5 9 煤矸石，矸石粒度 为o 2 m m ，再加入无机盐培养液5 0 m l ，加棉塞，在温度为3 0 ，转速为1 4 0 r m i n 的条 件下振荡培养2 4 h ，取振荡培养后的培养液l o m l 转接至装有5 0 m l 新鲜无机盐培养液的 锥形瓶内，加入矸石1 0 9 ，与上述相同的条件，继续振荡培养2 4 h ，之后顺次加至矸石 至5 0 9 ，共l o 个周期，2 4 0 h 。 2 、同样取上述上清液l o m l 至三个l o o m l 锥形瓶中，分别加入0 5 9 煤矸石，矸石 粒度为0 2 m m ，再加入无机盐培养液5 0 m l ，加棉塞，在温度为3 0 。c ，转速为1 2 0 r m i n 的条件下振荡培养2 4 h ，随着震荡时问的增长，瓶内液体会减少，继续加入矸石1 o g ， 补加无机盐培养液，总体积保持在6 0 m l 左右，直至加入矸石量至5 o g ，如此重复1 0 个 周期，2 4 0 h 。 二、大剂量冲击驯化方式 同样取上述上清液l o m l 至三个l o o m l 锥形瓶中，分别加入5 o g 煤矸石，矸石粒度 为0 2 m m ，再加入无机盐培养液5 0 m l ，加棉塞，在温度为3 0 * ( 2 ，转速为1 2 0 r m i n 的条 件下振荡培养2 4 h ，取振荡培养后的培养液l o m l 转接至装有5 0 m l 新鲜无机盐培养液的 锥形瓶内继续振荡2 4 h ，如此1 0 个周期，2 4 0 h 。 三、静置驯化 取上述上清液l o m l 至锥形瓶中，分别加入5 o g 煤矸石，矸石粒度为o 2 m m ，再加 入无机盐培养液5 0 m l ，加棉塞，在室温( 当时为3 0 。c ) 下静止培养2 4 h ，取培养液l o m l 转入装有5 0 m l 新鲜无机盐培养液的锥形瓶内继续培养2 4 h ，如此1 0 个周期，共2 4 0 h 。 图3 4 驯化液电子显微照片 驯化过程中在显微镜下观察上清液中微生物的形态和数量，均可见黑色球状菌，形 如米粒，且数量最多，还有杆状、圆形状细菌，细菌均为运动的。 3 2 5 菌种筛选与菌种特征 从混杂微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用无菌的接种环取培养物少许在平板上进 3 微生物的选育 行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、 方格法、放射法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释， 最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。 经过四种方法，1 0 个周期的驯化，将最终的驯化菌液分别在无菌操作下通过平板画 线接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，在培养箱中培养7 2 h 后，经过3 次平板分离，分离出 5 种长势较好的菌株，根据驯化方式分别标记为z l 、和z 2 卜z 2 2 ( 逐渐加量l o 周期) ，c 1 和c 2 ( 大剂量冲击l o 周期) 。 图3 5 培养细菌 表3 1 菌株形杏特征 3 2 6 菌种的保藏 菌种的保存是以后实验顺利开展的有力保证。常用的菌种保藏方法有：斜面或半固 体穿刺菌种的冰箱保藏法、石蜡油封藏法、砂土保藏法、冷冻干燥法和液氮保藏法。 本实验选择斜面冰箱保藏法：低温4 保存，贫营养基( 少量培养基) ，冰箱保存。 将待保存菌种接种到营养贫瘠的培养基上( 葡萄糖培养基) ，这样可以使其生育的代谢速 度降低，从而降低菌种的变异频率，为以后对该微生物的降解实验做好准备。 分别以无菌操作琼脂平板划线分离，置3 2 电热恒温箱中培养7 2 h 后，挑取单一菌 西安科技大学硕士学位论文 落接种于牛肉膏蛋白胨斜面上同一条件继续培养7 2 h 后4 冰箱保存。 3 3 生长曲线的测定 生长曲线是测定微生物绝对生长数的常用方法，也是判定微生物活力的重要指标， 是培养微生物学特性的基本参数之一。一般微生物传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁， 随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在微生物达到饱和密度后， 停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中微生物数目的动态变 化，需连续对微生物进行计数。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的 指教生长期，呈平台状的平项期及退化衰亡4 个部分。以存活微生物数对培养时间作图， 即得生长曲线。 测定微生物生长曲线的方法很多，有直接法和间接法。每种方法都有其特定的适用 范围，不同的反应体系要根据其性质选择不同测定方法，对于培养液没有固体颗粒和色 素产生的体系，浊度法是最直接快速的方法。而生理指标法精确度很高，实验室条件很 难达到测定技术要求，所以本实验分别采用两种方法测定，一是比浊法，由于细菌悬液 的浓度与混浊度成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓 度，并将所测得的光密度值( o d 值) 与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定 条件下的生长曲线；二是称重法，以细菌湿重直接表示细胞数。由于光密度和细胞湿重 表示了培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因而所测生长曲线的衰亡期不明显。 菌生长量测定波长的选择方法：精密吸取菌悬液摇匀，测定时以o h 的培养液为空 白对照( 钱存柔，黄义秀，1 9 9 9 ；牛天贵2 0 0 2 ) ，在1 0 0 n m 7 0 0 n m 进行光谱扫描，根据 扫描图谱逐渐缩小扫描波长的范围，最终在4 7 0 5 1 0 n m 波长范围内重新扫描，并打印 出紫外图谱( 图3 6 ) 。分析图谱并经实验证实，在4 8 0 h m 波长处不同浓度的供试液其吸 收度较稳定，故选 二 j - 4 7 0 4 8 04 9 0 5 0 0 5 1 0 嗽帆 图3 6 菌液扫描图谱 如上图反映的扫描参数设定：波长5 1 0 _ _ 4 7 0 ；范围1 6 o 一1 7 5 ；采样间隔1 o n m 。 1 6 3 微生物的选育 具体方法是取5 8 个1 0 0 m l 锥形瓶( 高压灭菌) ，分别标明0 、3 、5 、1 1 、1 3 、1 8 、 2 3 、3 0 h ，即培养时问，用无菌吸管吸取5 m l 待测菌株的过夜培养液( 培养2 4 h ) 转入 盛有4 0 m l 新鲜富集液体培养基的上述锥形瓶中，将其置于摇床中3 0 c 震荡培养( 振荡 频率1 4 0 r m i n )