免疫组化染色的常见问题及定量分析PPT课件.ppt

免疫组化染色的常见问题、激光显微切割及冰冻切片,1,.,免疫组化原理和方法,定义：组织化学HistochemistryDealingwithidentificationofchemicalcomponentsincellsandtissues.,2,概念：,利用已知的特异性抗体与抗原能特异性结合这一特点，通过化学反应，使标记于特异性抗体上的显示剂显色，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构，了解抗原表达情况的一门组化技术。,3,原理：,利用抗原抗体能够特异性结合这一原理，从而在组织细胞水平进行抗原抗体反应。,4,一抗的类别,蛋白质肽类酶类激素类糖类脂质类抗原,5,显示剂,酶金属离子同位素荧光分子,6,底物,DAB(3,3-二胺基联苯胺)AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)坚牢蓝核固红,7,免疫组化的优点,特异性强：抗原与抗体的“一对一”的特异结合，仅当组织细胞中存在交叉抗原时会出现交叉反应。敏感性高定位准确、形态与功能相结合,8,免疫组化技术操作上的优点,方法简单，易掌握在组织切片原位显示抗原的表达情况试验条件要求不高，绝大多数实验室都可满足其需要。不需要特殊、贵重的仪器。,9,免疫组化染色的缺点,为半定量分析，不能进行定量分析。受实验者技术水平影响较大。结果判定主观性较强。,10,步骤,二甲苯脱蜡302梯度酒精复水（100%2，95%，90%，85%，每次5，蒸馏水）双氧水阻断非特异性过氧化物酶（0.3%-3%）抗原修复（酶，微波，高压锅）二抗同种属血清封闭抗原非特异性表达（BSA，山羊血清）一抗4过夜复温二抗DAB显色苏木素复染，盐酸酒精分色，流水返蓝脱水、透明，中性树胶封片,11,染色中各步骤注意事项及原理,前期处理染色后期处理,12,前期,不可控制因素：取材、固定、脱水、透明、浸蜡，包埋可控制因素：捞片：注意不要太靠近一侧，必要时用镊子压住组织片控水,13,染色过程中的影响因素,阻断非特异性过氧化物酶抗原修复封闭抗原非特异性表达一抗二抗DAB显色,14,内源性HRP的消除,分布:脑，脾，中性WBC，巨噬细胞。血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟啉具有内源性HRP活性,15,内源性HRP的消除:,3%H2O2,5-100.3%H2O2甲醇溶液,15-600.1%HCl酒精溶液,300.2%醋酸甲醇溶液,300.01%过碘酸5-10,0.1%硼酸钠10,16,抗原修复,甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定簇甲醛在保存进程中会形成羧甲基，而封闭抗原决定簇在用固定剂固定时，会使蛋白与蛋白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定簇,17,抗原修复方法,化学方法物理化学方法,18,化学方法,一.胰蛋白酶(tyrpsin)消化方法：1.配制：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1,PH78的无水氯化钙水溶液中，溶解即可用。2.消化条件和时间：将切片放置在湿盒内，3710一40min，一般为20min即可。,19,二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法1.配制：0.4胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。2.消化时间：3720min。3.用途：主要用于细胞间质抗原的显示，如纤粘素、胶原酶等,20,三链霉蛋白酶消化方法四无花果蛋白酶消化方法五.菠萝蛋白酶消化方法六尿素消化方法,21,物理化学方法,单纯加热方法：将片子放入盛有抗原修复液的容器中，置电护上加热至沸腾，并持续10min。微波方法：将片子放入盛有抗原修复液的容器中，置微波炉加热使温度保持在92100。总时间10min，但必须有间隔。,22,高压锅免疫组化抗原修复程序,切片放在染色架上(不宜太密)高压锅加入0.01M枸橼酸钠缓冲液3L，染色放在枸橼酸钠缓冲液内，加盖，煮沸，冒气后，加上限压阀加压1-5（通常选择2分钟）晾凉取出,23,柠核酸盐缓冲液的配制,A液：称取2101g柠檬酸溶于1000ml蒸馏水中。B液：称取2941g柠檬酸钠溶于1000ml蒸馏水中。工作液：取9mlA液和41mlB液，加入450ml蒸馏水，调PH6.0士0.1。,24,抗体的保存和配制,25,.,抗体的保存,*分装,低温,避免反复冻融*硅化,防止蛋白吸附*防止交叉污染和细菌污染,26,分装,按5l或10l分装，并注明标记(批号、名称、效价、量)，密封。故入-20一-40冰箱中保存备用，一般可保存12年。PBS稀释的抗体不能长时间保存，在4可放13天，超过7天效价显著降低。避免反复冻融而使抗体效价降低,27,即用型抗体,一般4保存效价稳定在一年以上,28,抗体的配制,根据说明书推荐浓度，进行倍比稀释自制抗体根据酶标结果，进行倍比稀释。最好采用抗体稀释液进行稀释，如无抗体稀释液，可采用PBS进行稀释。,29,其他准备工作中的注意事项,盖玻片需过酸3-5分钟，流水冲洗1小时以上盖玻片的储存：浸泡于95-100%的Alc中，随用随擦，注意冲洗好的盖玻片呈无色或淡蓝色，如发黄请重新冲洗干净。用废白衣擦盖玻片效果较好配制缓冲液注意桌面和湿盒的情况，如不平可用纸垫平,30,免疫组化染色不理想的处理,31,32,33,34,非特异性染色的消除,最大限度稀释抗体,35,修改封闭方法,*二抗同种属正常血清阻断，很多背景染色深的原因是正常动物血清使用不合理，如第二抗体为羊抗鼠IgG，应该用羊的正常血清。*羊血清*BSA阻断*羊血清+BSA*5%脱脂奶,36,DAB显色过程中的问题,DAB显色：一般2-5分钟，最多不要超过10分钟DAB显色过快，少于一分钟时，注意一次显色的片子不要超过5张。注意DAB渣子的问题，配好的DAB显色液应为清亮，微带烟色，如看到颗粒样物或呈棕色，应予以过滤,37,抗原的“例外”表达,细胞的分化不同阶段其抗原性有相应变更，可解释这些抗原的“例外”表达。,38,出现背景着色的其他几种原因,内源性过氧化物酶没有完全阻断。脱蜡不够彻底。组织粘贴剂使用不当或太浓。PBS冲洗不够。抗体稀释不合理，浓度太高底物显色时间太长。,39,染色背景过深的处理,采用不同的封闭方法，直至5%的脱脂奶。梯度稀释一抗，降低一抗浓度，选择最适的抗体稀释度。,40,特异性差的处理,选择相应比较合适的抗体稀释度，延长一抗4孵育时间，必要时可以采用42-3天。,41,假阳性的原因,抗体与多种抗原有交叉反应抗体与组织中某些成分的非特异性结合内源性酶的显色肿瘤或病变中有其他组织残留，尤其是肿瘤中残余极少的正常组织，而正常组织此时又有一定程度的增生或萎缩时，易将其误认为肿瘤成分抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原在不该出现的部位出现，如何杰金病Rs细胞中的免疫球蛋白异位抗原的表达，,42,假阴性的原因,(1)抗体己失活、浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度，不论是自产抗体、国外赠送的抗体还是商品化的抗体，都会有抗体不能显示相应抗原的现象(2)抗原丢失或减弱，当标本处理不当时更容易出现，如固定不良、温度过高(3)操作步骤不当，即纯技术上的失误，如反应时间不够或过久、洗脱不够等。,43,阴性染色的处理,抗原修复方法是否正确一抗浓度是否过低，适当提高一抗浓度一抗是否可靠固定和温度。许多抗体不适合用于福马林固定的组织，仅适合于冰冻切片,44,注意：整个操作过程中注意一定要避免干片！免疫组化的精髓是低浓度，长时间！,45,复染,每次复染前需用报纸清洁苏木素染液表面的浮渣，如苏木素已使用时间较长可用滤纸过滤。复染时间一般1-2分钟即可。必须进行复染，否则会影响结果的观察。,46,47,分色的问题,分色液通常采用0.5-2%的盐酸酒精，分色时间应根据切片脱色程度而定，但最长不超过1分钟，如果一分钟分色仍无效果，建议更换分色液。复染后的免疫组化切片必须经过分色，否则会影响阳性结果的判断。,48,封片的问题,手工封片一定要注意封片胶的用量，切勿使用太多。,49,50,对照,阳性对照，阴性对照空白对照，替代对照自身对照，平行对照,51,结果判断,背景干净,定位准确,52,53,54,55,判定标准,纪小龙在1996年版的诊断免疫组织化学P25提出：间质清晰，无背景着色，同时阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。目前通常以阳性细胞占所有细胞的10%以上定为阳性，仅散在表达或表达量低时，才选择5%阳性为阳性标准。根据染色的强度，分为+，+，+。,56,乳腺癌Her2染色结果判读,乳腺癌必须满足细胞膜染色形态、强度及百分比阳性肿瘤细胞（超出10%）阈值标准，才被视为Her2蛋白过表达阳性。染色必须定位于细胞膜与圆周（完整染色）。,57,罗氏公司VENTANAHER2判读指南,58,切片的观察,阅片忌先用高倍镜。一定要遵循先低倍后高倍的原则,59,贴签,注明病理号，所用一抗名称，抗体稀释度，染色日期,60,PALM激光显微切割系统是由德国PALM公司研发的一套高级精确的实验室设备。利用337纳米的紫外激光对显微镜下的生物样本(组织、细胞簇、单细胞、染色体及染色体片断等）进行切割和分离。在病理学、遗传学和肿瘤学等多个科研领域得到非常广泛的应用。,PALM激光显微切割系统简介,61,62,63,64,65,1、精确其切割精度可达1个微米,完全可以胜任染色体级别的切割操作,是同类产品中唯一可以切割染色体的系统。2、安全由于采用了337纳米的安全紫外激光,不会对生物样本造成损害和变异,同时避免了红外光的热效应。,PALM激光显微切割系统的优点:,66,3、高纯度采用了PALM公司的LPC(激光弹射收集）技术,对目标先进行切割,然后发射一个激光脉冲,把目标向上弹射,进入收集装置。整个过程简单,没有任何机械接触,无污染,不需要特殊耗材。4、人性化操作一个好的工具在操作上应该是简单合理的。PALM通过一个智能化软件PALMRobot可以完成所有的切割工作,也就是说所有的工作都用鼠标完成。一个熟练的操作者完成一个操作只需要几十秒的时间。,67,5、灵活PALM的操作可以将整个片子上所有感兴趣的区域标记出来,然后点击切割按钮,从切割到收集一切工作可以自动完成。此外还可以用不同颜色标记出不同种类的细胞,软件会自动分次收集同类细胞。可以自动计算出每个区域的面积。所有的区域都可以以文件的形式储存在电脑中,配合上位置记忆功能,这样同一张片子在任何时候都可以拿出来进行分析,而无需进行繁琐的重复性劳动。可以随时将屏幕上的画面存档。可以用快捷键或鼠标随时调节激光的能量和聚焦位置。,68,激光显微切割的缺点,未封片的组织切片组织结构较模糊，会影响显微切割的准确性。在做单细胞显微切割或亚细胞显微切割时，易出现邻近非目的细胞碎片的污染。切片脱水不彻底，或是设定的激光的能量太低，有时会造成目的细胞无法从切片上弹射下来。,69,激光显微切割技术的应用,DNA分析基因表达分析蛋白质分析单细胞分析,70,DNA分析,杂合性缺失（LOH）DHPLC比较基因组杂交（CGH，comparativegenomichybridisation）,71,基因表达分析,RT-PCRrealtimequantitativePCRcDNAarray序列基因表达分析（serialanallysisofgeneexpression）,72,单细胞分析,基因突变病毒DNA序列的插入免疫球蛋白基因序列重排蛋白质分析cDNAarray可用如全基因组扩增的模板，得到表达文库,73,A,B,C,A:镜下选择病变区域B：标出所要切割的病变区域C：切割完毕后镜下所见,74,冰冻切片的制作及其注意事项,75,.,冰冻切片,冰冻切片（frozensection）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。,76,用途,因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，多应用于手术中的快速病理诊断。显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。对某些物质所进行的免疫荧光的研究。,77,冰冻切片的优点：,简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。快速，用时短。组织变化不大。能很好保存脂肪，类脂等成分。能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。,78,冰冻切片的缺点,不容易做连续切片。切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。不容易制作较薄的切片。组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。,79,组织冰冻切片OCT包埋剂,OCT(optimumcuttingtemperature)是由高分子聚合物组成的无色透明粘稠液体，骤冷时固化，其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近，因而能保证优化的OCT温度，并具有支持填充、减少皱褶和断裂等作用。可任意添加于切片机的样品架以支持和固定样品。,80,骤冷剂,组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：CO2干冰（78）丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（80）液氮（190）液氮冷却的丙烷（19）液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。,81,切片前准备,提前至少一天预约。联系电话：6737/6715，联系人：董彬，张宏。准备切片刀片一片，小镊子2个，泡沫