（环境工程专业论文）高效苯酚降解菌的分离选育及其固定化处理含酚废水的研究.pdf

硕士研究生学位论文 abstract iii abstract in recent years，with the increasing level of industrialization in china，phenol wastewater on peoples daily lives seriously affected. therefore，effective treatment of phenol wastewater imminent. phenol wastewater by biological than physical and chemical methods of low cost， high efficiency and no secondary pollution benefits，and general microbial degradation of phenol can not be effective or not higher concentrations of phenol degradation. the purpose of this study， through the separation of phenol degradation bacteria breeding and cell immobilization technology research，to further improve the stability and degradation of phenol strain the ability to make them more suitable for industrial production. in this study，phenol as sole carbon source，on the northern shenyang activated sludge sewage treatment plant domestication and selection， are capable of degrading high concentrations of phenol in phenol bacteria sger2，followed by uv mutagenesis of the strains，breeding out of a high phenol degrading bacteria strains sgeru40.the sem identified as cocci，gram negative. the effects of bacterial phenol and phenol sgeru40 growth characteristics，and environmental factors，nutrition and other factors influence its growth. the results showed that the growth of strain sgeru40 and phenol degradation is basically synchronous，the end of exponential growth showed a greater ability to degrade phenol. degradation and sgeru40 strains was significantly higher than the reported phenol concentration (2200 mg/l) higher，a shorter degradation time. by orthogonal experiments，the optimum conditions for phenol： temperature 35，liquid volume is 50ml，ph is 7.0，nh4no3 concentration was 1.0 g/l.in addition，the present study，found that the best nitrogen source for the nh4no3，and heavy metal ions on the phenol also has a great influence，cu2+ on the most virulent strains，strains of mn2+，zn2+，pb2+ have a certain resistance，relative to look， mn2+，zn2+ is weaker than the toxicity of the strain pb2+ and so on. immobilized cell technology embedding method were used sodium alginate (sa) method and polyvinyl alcohol gel entrapment (pva) gel embedding fixed phenol degrading bacteria， phenol strain rate observed sgeru40 size. come sodium alginate act“ pva embedded act” free bacteria. and at the same time，the alginate gel entrapment method and polyvinyl alcohol gel embedding method was significantly higher than the degradation rate of free bacteria. focus on the alginate gel entrapment method. orthogonal experiments fixed the optimal embedding conditions：biomass0.4 g，cacl2 concentration of 4%，4% sodium alginate concentration， cross- linking time was 8h.of several major environmental factors on iv abstract 硕士研究生学位论文 immobilized phenol ability. obtained， the optimum temperature of immobilized strain 35， the best ph is between 7- 8.in addition， the heavy metal ions on immobilized strain phenol influence and on free bacteria of trends broadly consistent are cu2+ of the most toxic of mn 2+，zn2+，pb2+ have a certain resistance，relative terms， mn2+，zn2+ its toxicity is weaker than pb2+.additional nitrogen sources on the effect of phenol immobilized strain change is obvious. do not add any nitrogen source case，free bacteria almost no degradation of phenol，phenol immobilized strain rate is not high. added nh4cl、(nh4)2so4 and nh4no3 on the immobilized and free bacteria strains promoted degradation of both phenol and phenol and phenol rate of 95% or more. keywords：phenol，degradation，microbiology，orthogonal，immobilized 声 明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下独立完成的。论文 中取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包括本人为获得其它学位而使用过的材料。 与我共同工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 作者签名： 日 期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳建筑大学有关保留、使用 学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳建筑大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 （如作者 和导师同意论文交流，请在下方签名；否则视为不同意。 ） 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 不限? 半年? 一年? 一年半? 两年? 作者签名： 导师签名： 日 期： 日 期： 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 1.1 苯酚的性质、用途及危害 苯酚 oh 是酚类化合物中结构最简单，也是毒性最大的一种酚。外观为无色结晶 或结晶熔块，有特殊气味和一定的腐蚀性，呈酸性。该化合物是 1834 年龙格（lungef） 在煤焦油中发现的，故也叫石碳酸。置露于空气中或日光下易被氧化成粉红色，相对密度 1.071 g/cm3，熔点 4243、沸点 182，燃点 79，室温微溶于水，能溶于苯及碱性溶 液，易溶于乙醚、氯仿、丙三醇、甘油和二硫化碳，几乎不溶于石油醚1。苯酚能腐蚀橡 胶和合金，与碱作用生成盐，与三氯化铝+硝基苯，丁二烯，过二硫酸，过一硫酸发生剧 烈反应，引起燃烧爆炸。也能与氧化剂发生反应。 苯酚主要用于制造酚醛树脂，双酚 a 及己内酰胺。其中生产酚醛树脂是其最大用途， 占苯酚产量一半以上。此外，有相当数量的苯酚用于生产卤代酚类。从一氯苯酚到五氯苯 酚，它们可用于生产 2，4- 二氯苯氧乙酸和 2，4，5- 三氯苯氧乙酸等除草剂；五氯苯酚是 木材防腐剂；其他卤代酚衍生物可作为杀螨剂、皮革防腐剂和杀菌剂。由苯酚所制得的烷 基苯酚是制备烷基酚- 甲醛类聚合物的单体，并可作为抗氧剂、非离子表面活性剂、增塑 剂、石油产品添加剂。苯酚也是很多医药（如水杨酸、阿司匹林及磺胺药等） 、合成香料、 染料（如分散红 3b）的原料。此外，苯酚的稀水溶液可直接用作防腐剂和消毒剂。酚类 化合物是一种原生质高毒物质，对一切生物个体都有毒害作用2。 1.1.1 苯酚对人类的危害 苯酚对人类有极大的危害，有研究报告表明苯酚是苯中毒的直接原因。 苯酚的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性，使用时要特别小心，如果不慎沾到皮肤上应立即用酒精洗涤，沾 到衣服上也需要用大量水冲洗。如若苯酚量较大或是混有氯仿，则需要马上上医院进行急 救。 苯酚可经呼吸道、皮肤和消化道被人体吸收。低浓度酚能使蛋白变性，高浓度酚能使 蛋白沉淀。苯酚对皮肤、黏膜有强烈的腐蚀作用，也可抑制中枢神经系统或损害肝、肾的 功能。 水溶液比纯酚易经皮肤吸收， 而乳剂更易被吸收。 吸入的酚大部分滞留在人体肺内， 停止接触后，很快会排出体外。吸收的酚大部分以原形或与硫酸、葡萄糖醛酸或其它酸结 合随尿排出，一部分经氧化变为邻苯二酚和对苯二酚随尿排出，使尿呈棕黑色（酚尿） 。 人口服致死量报道不一，ld 为 215 g，或 mld 为 140 mg/kg，14 g/kg。国外报道酚 液污染皮肤面积为 25%，10 min死亡，血酚为 0.74 mmol/l。 苯酚中毒的临床表现为：当人体吸入高浓度苯酚蒸汽时可引起头痛、头昏、乏力、视 物模糊、肺水肿等急性中毒症状，误服可引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼出带酚气味， 呕吐物或大便可带血，可发生胃肠道穿孔，并可出现休克、肺水肿、肝或肾损害。一般可 2 第一章 绪 论 硕士研究生学位论文 在 48h内出现急性肾功能衰竭。血与尿酚量增高。若皮肤被苯酚灼伤，创面初期为无痛性 白色起皱，继而形成褐色痂皮。常见浅度灼伤，可经灼伤的皮肤吸收，经一定潜伏期后 出现急性肾功能衰竭等。眼接触可致灼伤。如若出现上述急性中毒情况，应立即脱离现场 至新鲜空气处。 皮肤污染后， 应立即脱去污染的衣着， 用大量流动的清水冲洗至少 20 min； 面积小也可先用 50%的酒精擦拭创面或用甘油、聚乙二醇或聚乙二醇和酒精混合液（7： 3）抹皮肤后立即用大量流动的清水冲洗，再用饱和硫酸钠溶液湿敷。口服者给服植物油 1530 ml，催吐后，温水洗胃至呕吐物无酚气味为止，再给硫酸钠 1530 mg。消化道已 有严重腐蚀时勿给上述处理，早期给氧，合理应用抗生素。防治肺水肿、肝、肾损害等对 症、支持治疗。糖皮质激素的应用视灼伤程度及中毒病情而定。病情（包括皮肤灼伤）严 重者需早期应用透析疗法排毒及防治肾衰。口服者需防治食道瘢痕收缩致狭窄。 慢性中毒 可引起头痛、头晕、咳嗽、食欲减退、恶心、呕吐等症状，严重者可引起蛋白尿，可致皮 炎。 1.1.2 苯酚对动植物的危害 苯酚不仅给人类生活带来严重威胁，而且也给动植物带来严重危害。当水中酚浓度大 于 0.1 mg/l时，水中的鱼肉有酚的气味且不能食用；当酚浓度大于 1 mg/l时，水中的鱼 类会出现中毒症状；而当水中酚浓度大于 10 mg/l时，水中大多数生物都受到严重威胁， 甚至死亡。此外，如果使用含酚废水灌溉农田，则会使农作物减产或枯死，对农作物产生 极坏的影响。含酚废水的毒性还可抑制水体中其它生物的自然生长速度，破坏生态平衡。 因此，苯酚对动植物的危害是非常严重的。 综上所述， 正因为苯酚类化合物是实际工业废水中的目标污染物，给人类及动植物带 来严重危害。因此，有效处理含酚废水迫在眉睫。酚类化合物是美国国家环保署列出的 129 种优先控制的污染物之一，含酚废水在我国水污染控制中叶被列为重点解决的有害废 水之一3。进入二十一世纪以来，全球更加倡导人类与自然的和谐共存，所以治理含酚废 水势在必行，不仅要在限制排放方面多下功夫，更要在处理含酚废水方面有更大的突破。 为了能够经济高效的处理含酚废水， 国内外许多学者大量研究如何利用微生物法降解污水 中的酚类化合物。 1.2 含酚废水常用处理方法及存在的问题 对含酚废水的治理，首先应该严格控制企业的排污量，使其自觉采取有效措施处理含 酚废水，二是合理选择工艺流程、开发无公害工艺、无公害催化剂、使用无公害试剂的反 应，实现清洁工艺技术，减少废水量或降低废水中的含酚浓度4。例如，中国的一些煤气 站采用闭路循环系统后，消除了对江河的酚污染；苏联把焦化厂含酚废水掺入其他工业冷 却循环用水系统；美国道氏化学公司把酚和氯碱的生产合为一个“闭路生产圈” ，不排出 废水。三是选用有效的生产设备和操作条件，开发密闭循环酚类化合物系统，尽量避免或 减少污染物排入环境中，基本实现“零排放”的清洁生产。四是加强企业的自律，企业需 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 3 自觉对工业生产过程中产生的含酚废水进行有效的处理、回收和再利用。酚是重要的化工 原料。从废水中提取酚物质，是酚的一个重要来源。德意志联邦共和国每年从焦化厂、煤 气厂含酚废水中回收的酚达 1 万吨。 随着人们对苯酚污染现状及其危害性的不断认识以及污水处理技术的不断发展， 苯酚 的处理技术也日益提高。工业含酚废水处理方法一般可分为二类：一类是用某种方法把废 水中的污染物质分离出来，另一类是将污染物分解成无毒无害的物质两种方法。由于废水 中的污染物种类、数量各不相同，因而，废水处理的具体技术也不相同5。目前，对于废 水中的苯酚类物质的处理方法主要有三大类：物理法、化学法、生物法。伴随着技术的不 断发展，各种处理方法之间相互渗透，处理效果更加明显。 1.2.1 含酚废水的物理处理方法 物理法处理含酚废水6- 10有盐析法、混凝沉降或气浮法、吸附法、溶剂萃取法等等。 吸附法是最常见的含酚废水物理处理方法，即可用于一级处理回收废水中的苯酚，也可用 作废水的后继深度处理，以保证回用水的质量。萃取法由于可以回收酚，且萃取剂可回收 反复利用，也得到了较为广泛的应用。另外近年来更新开发了乳状液膜法技术。 1.2.1.1 吸附法 吸附法是一种简单易行的处理方法， 是利用多孔性固体物质作用为吸附剂， 目前广泛 应用的吸附剂有活性炭、硅藻土、磺化煤、交换树脂等，以吸附剂的表面（固相）吸附废 水中的酚（液相）污染物的方法。根据吸附剂与酚类化合物之间的作用力不同，其吸附机 理兼有物理吸附、化学吸附和交换吸附。在含酚废水的处理过程中，主要是物理吸附，有 时是几种吸附形式的综合作用。选用吸附性能好，吸附容量大，容易再生，经久耐用的吸 附剂是保证分离效果的关键。 1.2.1.2 溶剂萃取法 溶剂萃取法是工业上常用的含酚废水处理方法之一，是利用化合物在两种互不相溶 （或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂 中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来的方法。 萃取法处理含酚废水有两 种途径，第一种是选用高分配系数的萃取法，采用特定的萃取工艺及装置，利用酚类化合 物在有机相和水相中不同的溶解度及两相互不相溶的原理，达到分离酚的目的；第二种是 根据可配位反应原理，经单一萃取操作使废水中的含酚量低于国家排放标准。 溶剂萃取法其优点是设备投资少，操作方便，能耗低，同时能有效回收废水中的酚类 物质，适用于高浓度含酚废水；缺点是萃取过程中“返混”严重，易造成溶剂损失和二次 污染。使用较多的传统型溶剂萃取剂有苯、n- 503 煤油、异丙醚、磷酸三丁酯（tbp） 、 803#树脂等。 1.2.1.3 乳状液膜法 乳状液膜法处理含酚废水是采用油包水型液膜，内相试剂为氢氧化钠溶液， 现已采用 的表面活性剂有 span系列、 lms 系列、 兰- 113 等。 液膜法处理含酚废水可以采用间歇式、 4 第一章 绪 论 硕士研究生学位论文 半连续式、连续式、顺流式、逆流式等不同操作方法，所用设备与溶剂萃取设备相似，在 我国已进入工业应用阶段。乳状液膜法是一种崭新的化工分离技术，从工艺工程来看，它 类似于溶剂萃取法， 但萃取工艺是由萃取和反萃取两步组成，而液膜法把萃取和反萃取合 成一步完成。与生物法相比，处理含酚废水的浓度可以提高，废水中含有悬浮物及油也无 多大影响， 它既可以连续式又可以间歇式处理废水， 它的处理设备和工艺流程都比较简单， 其费用也低。因此，乳状液膜法作为一种很有希望的新工艺而受到石油、化工、环保等方 面的重视。但作为一项新技术，仍需进一步使其臻于完善。 1.2.2 含酚废水的化学处理方法 化学法处理含酚废水11- 15主要以氧化法为主，包括湿式氧化法，化学氧化法，超临界 水氧化法，光催化氧化法等。 1.2.2.1 化学氧化法 化学氧化法是使用高锰酸钾、过氧化物、氯系氧化剂、臭氧等氧化物将废水中的酚类 化合物氧化去除。该氧化法具有氧化能力强，净化能力高和分解速度快捷等优点，而且酚 类化合物的氧化终产物是水和二氧化碳， 不会对环境造成二次污染，但是所得的酚类化合 物不能够回收再利用。若要选用高锰酸钾作为氧化剂，需要固体进料装置，且单元氧化能 力的消耗量相对较大， 而选用氯系氧化剂的缺点在于有可能形成氯酚类有毒物质且过剩的 氯会和废水中的其他物质结合。 1.2.2.2 湿式氧化法 湿式氧化法是使液体中悬浮或溶解状有机物在油液香水存在的情况下进行高温高压 氧化处理的方法。氧化反应在压入高压空气，反应温度 300条件下进行。可用于高浓度 （46%左右）有机物的粪便、下水污泥以及工厂排液等的处理和药剂回收。用于处理粪 便及下水污泥时，反应后进行固液分离，再用活性污泥法等对分离液进行处理。此法优点 是：流出物被完全杀菌；使下水污泥及粪便等具有良好的沉淀分离性能；装置尺寸 小；不污染大气。缺点为：易腐蚀反应器；排放水有色度；有烧焦气味。 湿式氧化法是在高温（125320 ） 、高压（0.520 mpa）下通入空气，使废水中的 有机物直接氧化降解。在此基础上，加入适宜的催化剂能够有效降低反应的温度和压力， 提高氧化分解能力，缩短反应时间。用湿式催化氧化法处理高浓度含酚废水，当催化剂存 在时，温度可降至 150，压力降为 0.5 mpa，同时加入 h2作氧化剂时，酚的去除率可达 99%。但由于湿式催化氧化法对设备要求高（耐高温、耐高压、耐腐蚀） ，且催化剂的损 耗大，因而需寻找适合温和反应条件下高效、经济的催化剂。 1.2.2.3 超临界水氧化法 超临界水氧化技术是（scwo）是近年来兴起的一种新型高效的废水处理技术。在水 的超临界状态下，即 t373.85，p22.1mpa 时，有机物在超临界水中与氧化剂发生强 烈氧化反应，在很短的时间内将难降解的、危险的有机物彻底转化为 co2和 h2o，将氮 转化为 n2和n2o 等无害物质，将水体中的磷、氮和硫等元素氧化，以无机盐的形式从超 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 5 临界水中沉积下来，实现有机有毒污染物的无害化。超临界水氧化法操作简单、反应速率 快且可回收再利用，是一项有发展前景的技术。 1.2.2.4 光催化氧化法 光催化氧化法是近年来兴起的一种新型废水处理技术，由于其具有效率高、价格低、 对环境无污染、可以循环再利用等优点，备受研究者们的关注。该法是以半导体粉末为光 催化剂，在光照条件下产生电子空穴对，表面羟基或水吸附后形成氧化能力极强的羟基自 由基，通过一系列的氧化反应分解有机物。光催化氧化中常用的催化剂有 tio2、zno 等 半导体材料。苯酚的光催化氧化是直接光解与催化氧化共存在同一个体系中并相互竞争， 两种反应的途径和产物不同。催化氧化更有利于有机物分子的解体，在有机分子的降解过 程中，随着碳链的断裂，毒性减小，可生化性提高，符合水处理要求。提高光催化氧化速 度的方法有：适量投加催化剂、提高溶液中氧气的浓度，同时适量提高光强度及光子的利 用率。 1.2.3 含酚废水的生物处理方法 生物法是目前应用比较广泛的废水处理技术， 也是中国含酚废水无害化处理的主要方 法。与物理、化学方法相比，生物法具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现无害化， 无二次污染且处理量大。该法对浓度较低的含酚废水处理效果好，对含酚浓度较高、毒性 较强的废水， 由于存在毒性物质对微生物活性的抑制作用， 采用传统的生化法处理效率低。 为此，国内外学者对生物处理技术进行了大量研究。一般来说，含酚废水的生物处理方法 包括活性污泥法和固定化细胞法。 1.2.3.1 活性污泥法 活性污泥法是目前应用最为广泛的生物处理法。据报道，活性污泥法优于其他的生 物处理法。因为它具有较高的处理效率，同时又易于操作16。由于活性污泥具有较强的 吸附能力，因此污水中的酚类化合物被吸附在活性污泥表面。在溶解氧充足的情况下，活 性污泥中的微生物聚合在一起，形成菌胶团，以酚类化合物为食物进行新陈代谢，获得能 量的同时菌体自身不断繁殖，最终达到去除废水中酚类化合物的目的。 活性污泥的驯化对含酚废水的处理有着重要的作用，目前，多采用就地培养的方法， 使工业废水及生活污水中的微生物菌群成为优势菌种，进而达到净化废水的目的。 一般采 用逐量分批驯化法，即在适宜的条件下，将活性污泥接种于废水中进行曝气，当微生物大 量生长繁殖后，逐量加入含酚废水，使微生物经历一个定向变异与自然淘汰的过程，从而 适应于处理含酚废水17。 活性污泥处理系统以其设备操作简单易行，去除率高，受气候影响小等自身优点， 备受研究者们的青睐。但是活性污泥也有其自身的缺点，例如，反应池占地面积大，对难 降解的有机物处理率较低，处理效果不稳定等。 1.2.3.2 固定化细胞法 固定化细胞法是应用物理、化学的手段使游离菌固定的方法， 主要应用于污水处理方 6 第一章 绪 论 硕士研究生学位论文 面。按照细胞的制备方法大致可分为包埋法、载体结合法和胶联法。s.r.guiot 等人研究 了 uasb 工艺，发现用藻脘酸盐凝胶包埋甲烷细菌联合后，苯酚及其衍生物的去除率提 高 2 倍以上。 朱柱等用红碎粒为载体固定脱酚菌，可将该菌种 24h最大耐酚能力由游离细 胞的不足 180 mg/l提高到固定细胞的 820 mg/l 左右，脱酚菌经固定后，反应速率增大， 降解酚的能力大大增强18。因此，与活性污泥法相比，固定化细胞法明显提高了其降酚 的能力。但固定化细胞技术目前还处于实验室的研究阶段，还有许多实际问题亟待解决。 1.2.4 存在的问题 综上所述，采用物理、化学法处理含酚废水不仅存在二次污染的隐患，而且还面临着 高能耗、溶剂成本高、治理不彻底、操作复杂等诸多问题。相反，生物法体现出自身的优 势：溶剂成本较低、处理彻底、操作简单、不会对环境造成二次污染、出水水质好等特点， 在目前的工业废水处理中占有十分重要的地位。但同时生物法也存在一些不足，在 工业废 水处理过程中极易受到周围环境因素（如 ph 值、温度等）的影响，所以对操作条件的要 求更为严格。 而且微生物的降解能力受到高浓度污染物毒性的强烈制约， 因此限制了含酚 废水生物法的应用与推广。 但是由于含酚废水的难降解的特性， 所以引入的菌种要有较强 的降解酚能力，并且要能较好地适应冲击负荷的变化。于是，近几年很多科研工作者致力 于高效酚降解菌株并将其固定化的研究。 固定化细胞技术在废水处理的应用研究上显示出 良好的前景。 1.3 苯酚降解菌的研究现状和代谢途径 1.3.1 苯酚降解菌株的研究现状 关于微生物降解苯酚的研究已有许多报道，目前已分离鉴定出的微生物包括：假单胞 菌（pseudomonas） 、酵母菌（yeast trichosporon） 、根瘤菌（rhizobia） 、真养产碱菌 （alcaligeneseutrophus） 、反硝化菌（denitrifying bacteria ） 、藻类（alga ochromaonas） 、 醋酸钙不动杆菌（a.calcoaceticus）等降酚菌，它们的降解能力各有不同。假单胞菌 （pseudomonas）和不动杆菌（acinetobacter）是最常见的降酚菌株19- 21。 陈明等22从炼油厂污水中分离的醋酸钙不动杆菌在 24h内能够完全降解 300 mg/l 的 苯酚。吴培诚等23从含酚废水污染的土壤中分离到一株苯酚琼氏不动杆菌，能以苯酚为 唯一碳源生长，16h 内可以完全降解 600 mg/l 的苯酚。唐贇等19分离出的嗜热菌 bf80 降解 6 mol/l（约为 564 mg/l）的苯酚需要 120h。章杰等24分离出的苯酚降解菌 jf- 2 降 解 600 mg/l的苯酚需要 13d。刘广金等25分离出的一株假单胞菌（pseudomonas sp.）降 解 500 mg/l 的苯酚需要 60h。目前已经获得的降酚菌有假单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄 球菌属、产碱杆菌属和瓶形酵母属等，它们的降酚能力有所不同。假单胞菌是最常见的降 酚菌株，常存在于炼油厂、焦化厂等酚类污染物排放企业所排出的废水、污泥以及被污染 的土壤中。沈齐英等26从炼油污水厂活性污泥中获得了四种假单胞菌，它们对 2000 mg/l 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 7 浓度的酚降解能力不同。宋波等27从炼油厂生化曝气池中以及钱奕忠等28从焦化厂被污 染土样中都分离筛选出可以降解 600 mg/l苯酚的假单胞菌降酚菌株。酵母菌也是一大类 比较重要的降酚菌。周治等29用生物流化床驯化活性污泥，经富集筛选出一株酵母菌， 但其降酚浓度只有 1000 mg/l。bastosaer 等30在亚马孙河流域的土壤中分离得到一株假 丝酵母，可以降解浓度为 1504 mg/l 的苯酚。其它降酚菌种也有相关报道，吕荣湖等27 对活性污泥进行筛选、驯化，得到由假单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属产碱杆菌属等 四种降酚菌株组成的混合体系，其降酚浓度为 1700 mg/l，高于其中任何一种单菌株的降 酚能力。 anli geng 等31从活性污泥中成功分离出一种新的苯酚降解菌 edp3，可以在含有苯 酚，苯甲酸钠，对羟基苯甲酸，苯乙酸，苯，乙苯，苯甲醇等等的有氧环境中生长，在室 温 25时可以降解 1000 mg/l的苯酚，在以苯酚作为唯一碳源和能源时进行的生长动力 学分析表明 max = 0.28/h，ks = 1167.1 mg/l，ki = 58.5 mg/l。 一般热带假丝酵母菌在苯酚浓度为 500 mg/l时降解所用时间为 72h，当浓度升高为 1000 mg/l 时，降解所用时间超过 150h，当苯酚浓度提高到 1500 mg/l 时，降解率只有 13%。chen kc 等32分离出的热带假丝酵母菌 ce017 降解苯酚浓度为 500 mg/l 所用时间 缩短为 48h。 m.rigo 和 r.m.alegre33从工业含酚废水中分离出来的热带假丝酵母菌可以处理 浓度为 1000 mg/l 的苯酚，并对其的生长进行了动力学分析结果表明在参数为 max = 0.174/h，ks = 11.2 mg/l，ki = 298 mg/l，生长最佳。 a.a.makarenko 等34从西西伯利亚受油气和含油物质污染的土壤中分离出假单胞菌 32- i，以苯酚作为唯一碳源和能源，处理含酚废水的范围为 5m300m，当添加糖类物质 （除了葡萄糖和木糖）降解时间 23 倍慢于添加了小分子量的醇类（甲醇，乙醇等） 。另 外将这种菌投加于生物传感器，控制操作条件 ph 7.4，温度为 35时，降解苯酚浓度为 5m 所用时间为 30h。 seung- hun baek 等35在有氧环境中分离出的产碱杆菌 p5 在有氧气和硝酸盐存在的 条件下最大降酚浓度为 0.29 mm，但是在只有氧气存在的条件下却只有 0.16 mm。 d. kotresha 等36从受纸浆废水污染的土壤里分离得到假单胞菌 mtcc4996 可以在 156h内降解浓度高达 1300 mg/l 的苯酚废水，完全降解的ph 变化范围是 6.07.0，温度 范围是1545， 最佳降解条件是ph值为7.0， 温度为37， 振荡速率为100rpm125rpm 时完全降解需要 66h，而静止状态则需要 84h，低浓度的葡萄糖和蛋白胨可以提高苯酚处 理效果，苯酚的降解速率与添加的金属离子有关，低浓度的 fe、cu、pb、zn、mn、hg 可以提高降解速率。 经过菌株的分离选育能够得到高效苯酚降解菌， 且含酚废水的降解率明显提高，但如 何使这些优良菌株长期在生物处理过程中占优势， 并保持其高效性是研究者们面临的主要 问题，而且提高降酚率是生物法的一个关键问题，因此有必要进行高效苯酚降解菌的分离 选育，研究高效菌种的降酚特性，确定其最佳的生长条件37。 8 第一章 绪 论 硕士研究生学位论文 1.3.2 苯酚生物降解的基本途径 近年来， 国内外许多学者对苯酚降解菌的特性进行了大量的研究，总结出以下降解菌 降酚的可能途径，如图 1- 138所示： 苯酚降解菌降解苯酚的过程是将苯酚分解为邻苯二酚， 邻苯二酚由邻位和间位途径经 环裂解，最后形成三羧酸循环（tca）中间物：乙酰 co- a、丙酮酸等等。邻位和间位途 径是两个独立的代谢系统。邻位途径产生 - 酮基己二酸中间产物，间位途径产生 a- 酮基 己二酸中间物。在好氧菌中，苯酚羟化酶是降解苯酚的关键酶，是编码苯酚降解途径的第 一个酶，负责将苯酚转化为邻苯二酚。邻位和间位酶负责将邻苯二酚开环裂解为三羧酸 （tca）产物。在微生物降解苯酚的过程中，需要其多酶系统和氧的辅助来共同完成。尽 管微生物降解苯酚类物质具有不同的途径和酶系统，却均产生同一类酶邻苯二酚 2，3- 双 加氧酶（c23o，间位裂解）或 1，2- 双加氧酶（c12o，邻位裂解） ，将中间产物- 邻苯二 酚进行开环裂解39。由图 1- 1 可以看出，在位于该图上侧的邻位途径中，邻苯二酚开环裂 解产生黄色的 2- 羟基粘糠酸半醛；而位于下侧的邻位途径中，邻苯二酚开环裂解产生内 酯和琥珀酸等无色的中间物。 由上述途径中形成的乙酞辅酶 a、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环（tca） ， 继续被微生物利用。一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供 微生物新陈代谢所需的能量。在微生物降解苯酚的过程中，需要其多酶系统和氧的辅助来 共同完成。 图 1- 1 苯酚的降解途径 fig.1- 1 metabolic pathway 1.苯酚；2.邻苯二酚；3.2- 羟基粘糠酸半醛；4.2- 羟基粘酸；5.4- 氧代己二酸（a- 酮基己二酸） ；6.2- 氧代戊烯酸；7.己二酸；8.内脂；9. - 酮基- 2- 烯己二酸；ho：苯酚羟化酶；c23o：邻苯二酚 2，3 加氧 酶；c12o：邻苯二酚- 1，2- 加氧酶；hmsd：2- 羟基粘糠酸脱氢酶；4- ot：4- 氧代己二酸异构酶；4- od： 4- 氧代脱酸酶；te：顺- 顺粘糠酸内酯酶 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 9 1.4 紫外诱变的概述 由于紫外线电磁波带能量低、穿透力弱，辐射过程中不足以引起电子发生电离，但可 以诱发基因突变，所以紫外线诱变属于非电离辐射诱变，对植物和微生物诱变时有效的波 长为 265266 nm。与其它生物体一样，菌体经紫外线诱变处理后，其染色体上一定位点 基因内部发生化学变化而引起了突变，继而引起了遗传物质的改变。 紫外线诱变机理有三种： （1）形成胸腺嗯咤二聚体，阻止 dna正常识别，造成 dna 复制错误或转录和翻译出错； （2）胞嚓睫与水分子发生水合作用； （3）化学键发生断裂， 主要是配对的碱基化学键断裂或糖和磷酸之间的键断裂。 紫外线可以引起菌体死亡并与照 射剂量成正比，但经光复活、切除修复、重组修复或 sos 修复后部分菌体又能再生。 利用紫外线诱变菌种以求获得预期目的是常见的菌种选育方法，诸如获得抗生素、酶 类高产菌株；筛选低耗氧、低营养消耗、经济型菌株；培养生长、繁殖优良的菌株等。 1.5 固定化细胞技术 固定化细胞技术（imc）是 20 世纪 60 年代发展起来的一项新技术，70 年代后期开 始进行工业废水处理领域的应用研究，并显示出良好的发展前景。 与传统的活性污泥法相 比，固定化细胞技术体现出自身的优势：溶剂成本较低、处理彻底、操作简单易行、不会 对环境造成二次污染、出水水质好等特点，因此在目前的工业废水尤其是高浓度的有毒废 水、难降解的废水处理中占有十分重要的地位。 细胞固定化的原理是将微生物活细胞利用物理或化学的方法， 使细胞和固体的水溶性 支持物相结合，使其既不溶于水，又能保持微生物的活性。可见，高效苯酚降解菌的选择 是研究的关键。一般来说，自然界的微生物最初并不具有降解酚类化合物的能力，只有经 过人为的驯化培养后， 微生物才能对酚类物质进行降解。一般可以通过以下的相互作用将 微生物固定化40： （1）带电荷酶或细胞和带电荷的载体之间的静电相互作用。 （2）细胞表面的氨基（- nh2）和羧基（- cooh）与载体表面上的反应基团之间形成 离子键。 （3）细胞表面的氨基或羧基和载体表面羟基等形成部分共价键。 （4）包埋载体的孔径比生物催化剂更小，因而使生物催化剂保留在内，同时，底物 可以进去，反应物可以出来。 （5）细胞表面的基团和载体上经过化学修饰而特异结合上去的基团形成共价键。 1.5.1 固定化细胞技术的方法 固定化细胞的制备方法有很多种， 只要能限制细胞的流动方法， 均可用来对该细胞进 行固定化。研究表明，理想的制备方法应具有以下几个特点： （1）固定化方法操作简单且 能够有效控制固定化细胞颗粒的孔隙度和大小； （2）固定化系统具有良好的稳定性，固定 10 第一章 绪 论 硕士研究生学位论文 化细胞的载体对细胞无损害； （3）固定化所需的材料成本较低； （4）固定化系统中含有较 多的微生物细胞，能够更好地发挥生物降解作用； （5）固定化系统能使底物、产物和其他 代谢物质自由扩散41。国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可分为物 理固定法和化学固定法两大类。物理固定法主要有吸附法、包埋法，化学固定法主要有共 价结合法和交联法等42。 1.5.1.1 吸附法 吸附法是根据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，而使 微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法43。吸附法是一种价格低廉、有效 且较常用的细胞固定化方法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法一般选 用吸附能力较强的吸附剂，如硅胶、碎石、活性炭、硅藻土、多孔砖、多孔玻璃等，使微 生物吸附在吸附剂表面使其固定化。离子吸附法是在解离状态下， 利用微生物离子健合作 用固定在带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有 cm- 纤维素、deae- 纤维 素等。吸附法操作简易，且固定过程对细胞活性的影响较小，但所固定的微生物数量受所 用载体的种类及其表面积的限制44。 1.5.1.2 包埋法 包埋法是近些年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，是目前应用最广泛的方法， 在国内外取得了喜人的成就45- 46。包埋法是使微生物扩散到多孔性的载体内部， 或是将微 生物包埋在半透明的膜内的一种固定化细胞技术。 包埋法大致可分为两种方法：微胶囊包 埋法和凝胶包埋法。 微胶囊包埋法是使微生物细胞包埋在半透性薄膜内， 从而形成微胶囊。 微胶囊包埋法又可分为液膜法、液体干燥法和界面聚合法。有人用此法制成的固定化细胞 用于处理工业废水47，也有人用于固定动物胰岛组织，进行治疗糖尿病的研究48。凝胶 包埋法是将微生物细胞包埋在凝胶内部而使细胞固定的方法。 具体做法： 将微生物细胞液、 聚合物和交联剂混合在一起，搅匀，然后加入适量的催化剂使其发生聚合反应。常用的凝 胶包埋剂有海藻酸钙凝胶、聚乙烯醇凝胶、卡拉胶以及聚丙烯酸铵凝胶等。由于包埋法具 有操作简单易行，稳定性好，条件温和，包埋菌量大，对细胞影响小等优点，所以本实验 选用包埋法进行固定化的研究。 1.5.1.3 共价结合法 共价结合法是微生物细胞表面上的功能团（如氨基、羟基、羧基、巯基等）和固相支 持物表面的反应基团（如氨基、羟基等）之间形成化学共价键连接，成为固定化细胞。共 价结合法可分为两种： 一种是将载体有关基团活化， 然后与酶有关基团发生共价偶联反应。 另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去。共 价结合法具有细胞与载体之间结合紧密，稳定性好，细胞活性损失小等优点，但同时有操 作较复杂，反应条件比较剧烈，控制条件苛刻等缺点。有研究者使用此法固定卡尔酵母 （saccharomyces luteus）于已活化的多孔玻璃上49，虽然细胞已死亡，但生产尿酐酸的活 性仍然存在。 1.5.1.4 交联法 硕士研究生学位论文 第一章 绪 论 11 交联法，是使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基等进 行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细胞与载体结合紧密， 但制备麻烦，活力损失较大，常用的交联剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双偶氮联苯等。 交联法中常用的固定化酶载体是牛血清白蛋白（bsa） ，也有人用酪蛋白代替 bsa。 常见的固定化方法如表 1- 1： 表 1- 1 几种固定化方法的比较50 tab.1- 1 comparison of various immobilization 性 能 吸附法 包埋法 共价结合法 交联法 制备的难易 易 适中 难 适中 结合力 弱 适中 强 适中 活性保留 高 适中 低 强 固定化成本 低 低 高 适中 存活力 有 有 无 无 适用性 适中 大 小 小 稳定性 低 高 高 高 载体的再生 能 不能 不能 不能 空间位阻 小 大 较大 较大 1.5.2 固定化细胞载体的研究 从以上固定化细胞的制备方法可知， 固定化细胞技术的关键在于所采用的固定化载体 材料的性能。 微生物固定化的理想载体应该具备以下特性：（1） 载体可再生并可重复使用； （2）载体具有较高的机械强度，传质阻力小； （3）载体与微生物的固定结合强度高，能 耐水力波动的冲击； （4）载体对微生物无毒，抗微生物分解； （5）载体价格低廉。目前所 采用的固定化载体材料主要有：有机高分子载体、无机载体和复合载体三类51。 1）有机高分子载体又可分为天然高分子载体，如琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶等和合 成有机高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺（acam）聚乙烯醇（pva）光硬化树脂等。其中， 天然高分子凝胶对微生物无毒， 传质阻力小， 但结合强度小； 有机合成高分子凝胶强度高， 影响微生物生物活性，同时传质阻力大。为了提高其机械强度，有人用聚乙烯亚胺处理凝 胶颗粒52。scannellag m 等53制备的双层海藻酸钙凝胶具有较高的机械强度。琼脂凝胶 具有较大空隙，对细胞无毒性，聚合不需离子，不带电荷，不会与底物或产物形成离子键， 但强度不够。甲苯、四氯乙烯、戊二醛、醋酸丁酯等可作为琼脂载体制备的交联剂。 2）无机载体