（微电子学与固体电子学专业论文）集成式连续流pcr芯片及制造技术的研究.pdf

e 海交通大学博七学位论文 集成式连续流p c r 芯片及制造技术的研究 摘要 聚合酶链式反应( p c r ) 是微全分析系统( m i c r ot o t a l a h i ss y s t e m , p - t a s ) 的一个关 键组成部分，这使p c r 芯片在微流控领域中成为晟为活跃的研究方向之一目前，p ( = r 芯 片可以分为连续流( c o n t i n u o u s - f l o w ) 和微室( c h a m b e r ) 两种方式。本论文设计制造了具 有新型流体布局的集成式连续流p c r 芯片，将m e m s 制造技术与控制技术相结合，运用数 值模拟方法，围绕芯片的仿真，制造和实验分析进行了研究，论文的主要研究内容与结论如 下： 针对目前连续流p c r 芯片在流体布局上存在的不足，提出了两种新型流体布局结构， 与目前主流连续流p c r 芯片的逶逸布局模式相比，。t ”型和“o ”型布局使温度区的分布 更加合理，避免了p c r 反应循环中，模板变性后每次都需要跨越延伸医才能进入退火阶段， 有效防止已经解旋的d n a 链与同在反应试剂中的模板链和其它互补链形成非特异性产物， 最终提高了芯片上d n a 扩增反应的效率。 国内外在连续流p c r 芯片的计算机仿真上缺乏系统深入的研究，本文在理论分析基础 上，利用有限元方法，对芯片的稳态和瞬态温度特性进行了模拟仿真，对于其在不同环境和 干扰下的工作能力进行了分析，对于微通道内流体，制冷器和风冷装置进行了完整的流体模 拟，在芯片三个温度区的分布、温度差异和传热特性研究基础上，优化了关键参数，并通过 实验验证，得到了与实验结果统一的结论 针对目前连续流p c r 芯片集成度不高，制造困难的问题，利用m e m s 技术，选用以 p d m s 和玻璃为基础的低成本、易加工的材料，在一块芯片上集成了微加热器、温度传感器、 微致冷器以及p c r 微通道等功能单元，可以完成对试剂样本控制、混合以及d n a 聚合酶扩 增反应。 芯片制造过程中，基于软光刻等技术，对芯片及片上集成器件的一系列相关工艺进行了 优化，提高了制造过程的可靠性和成品率。调整了标准s u - 8 工艺中的相关参数和条件，改 进了反面曝光等方法，制造便于重复使用和脱模的高深宽比模具，提高了s u - 8 在制造微流 器件制造中的可重复性；在微加热器和微传感器的制造上，改良了传统l i f t - o f f 制造方法， 提高了边缘图形精度和成品率；优化了干法刻蚀工艺参数，实现了具有复杂图形的微加热器 和微传感器的制造。微通道封装是微流控芯片制造中的关键步骤。本文分别采用紫外光和氧 等离子方法进行了芯片键合，对紫外光照键合，研究了光照时间、放置时间和温度对p d m s 表面的改性的影响，优化了键合参数。 设计制造了连续流p c r 芯片温度控制系统，调整了控制策略，使控温系统的性能得到 了改善，控温的精度达到了0 4 c ，给出了参数整定的方法，借助虚拟仪器技术设计出p c r 芯片温控系统的软件部分，包括系统方案、程序代码和人机界面。 对设计制造的集成式连续流p c r 芯片进行了全面的性能测试，采用正交实验和a n o v a 分析方法，对影响芯片p c r 上d n a 扩增的关键因素进行了优化，并通过实验验证了p c r 芯片的功能。选取优化的条件完成了模板( h e p a t i t i scv i r u sd n a ) 和( e s c h e r i c h i ac o l is k 1 6 sg e n o m i cd n a ) 上的靶序列p c r 扩增实验，成功扩增了2 4 4 b p 、1 8 3 b p 基因片断，并通 过与标准p c r 扩增仪的比较，证明了“t ”型和o 型流体布局对非特异条带产生有一定 的抑制作用。 关键词：m e m s 微全分析系统微流控芯片聚合酶链反应芯片s u 8p d m s a b s t r a c t r e s e a r c ho ni n t e g r 棚dc o n t i n u o u s - f l o w p c rf p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) c h i p s a n df a b c 棚o nt e c h n i q u e s a b s r r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) i sav e r yi m p o r t a n tu n i ti nm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ( p - t a s ) w h i c hm a k e sp c rc h i pb e c o m eo n co ft h eh o t t e s tr e s e a r c ha r e a si nm i c r of l u i d i cr e s e a r c h a tp r e s e n t , p c rc h i p sh a v et w om o d e s ：c o n t i n u o u s - f l o wp c ra n dc h a m b e rp c r 1 1 i i sp a p e r p r e s e n t sa ni n t e g r a t e dc o n t i n u o u s - f l o wp c rc h i pw i t hn o v e lf l u i d i cl a y o u t s b a s e do nm e m s a n d c o n t r o lt e c h n o l o g y , n u m e r i c a ls i m u l a t i o na n df a b r i c a t i o np r o c e s sf o rt h i sn o v e lp c rc h i pa r e c a r e f u l l ys t o d i e d t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ef i s t e db e l o w ： f i r s t , 叮- s h a p e ”a n d “o - s h a p e ”f l u i d i cl a y o u t sa r ep r o p o s e d c o m p a r e dw i t hc u r r e n tm o s t u s e dc o n t i n u o u s - f l o wp c rl a y o u t , t & ol a y o u t sh e l pp r e v e n tr e a g e n t sf r o mp a s s i n gt h ee x t e n s i o n z o n eb e f o r ea n n e a l i n g t h i ss t r a t e g ya v o i d sm e l t e d ，s i n g l e - s t r a n d e dd n af r a g m e n t sf o r m i n g n o n s p e c i f i cp r o d u c t sb yb i n d i n gw i t ht h et e m p l a t es t r a n d so rt h e i rc o m p l e m e n t a r yf r a g m e n t s t h u s t & ol a y o u t sc 姐i m p r o v et h ef m a ls p e c i f i cp r o d u c te f f i c e n c y n u m e r i a ls i m u l a t i o na n da n a l y s i sa r ea p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h ep r o p e r t i e so fn o v e ll a y o u t p c rc h i p s a l li n t e g r a t e dp a r t ss u c ha s ：s e n s o r s a c t u a t o r sa n dp e l t i e ra r ea n a l y s e db yf e a c o m p l e t e l y n o to n l yt h es t a t i ca n dt r a n s i e n tt h e r m a ld i s t r i b u t i o np r o p e r t i e so fc h i p s ，b u tt h e f l u i dc h a r a c t e r i s t i ca n dp r o f i l ea r ei n v e s t i g a t e dw i t hv a r i o u sh u e n tt o o l st oo p t i m i z ep r i m a r y p a r a m e t e r s 1 r h er e s u l t sa r ep r o v e db ye x p e r i m e n tf i n a l l y t h ec h i pi n t e g r a t e sm i c r os e n s o r ，h e a t e r sa n dc o o l e r s h y b r i dm a t e d a lp d m s - g l a s si su s e dt o f a b r i c a t et h ec h i p ，w h i c hb r i n gav e r yl o wc o s to nc h i p a l s o ，h i g hi n t e g r a t i o no fc h i pm a k e si t p o s s i b l et oi n d e p e n d e n t l yr e a l i z eas e r i e so ff u n c t i o n s ：r e a g e n tc o n t r o l ，m i x t u r ea n dd n a p c r s o f tl i g h o g r a p h ya n dr e l a t e d t e c h n o l g i e sa r ei n v e s t i g a t e dt oo p t i m i z ec r i t i c a ls t e p si n f a b r i c a t i o n s u - 8r e l a t e dp a r a m e t e r sa n dc o n d i t i o n sa r ea j u s t e dt om e e tm o l d i n gr e q u i r e m e n t s t e c h n i q u e ss u c ha sb a c k - s i d ee x p o s u r ea r ei m p r o v e dt om a k i n gas o l i dm o l d i ti m p r o v e st h e r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yi nd e m o l d i n g c o n v e n t i o n a ll i f t - o f fi si m p r o v e dt og e tab e t t e ry i e l d a n de d g ep a t t e r n d r ye t c hp a r a m e t e r sa g ea l s oo p t i m i z e dt of a b r i c a t es e n s o r sa n da c t u a t o r sw i t h c o m p f i c a t e dp a t t e r n g l a s sa n dp d m sa r cb o n d e dt of o r mam i c r oc h a n n e la r o u n dp c rc h i pb y p l a s m ao ru vr a d i a t i o n d e p e n d e n c eo fb o n d i n gs t r e n g t ha n dd u r a b i l i t yo nu ve x p o s u r et i m e d e p o s i tt i m ea n dt e m p e r a t u r ei ss t u d i e d b a s e do ut h e s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，b o n d i n g p a r a m e t e r sa r eo p t i m i z e d h a r d w a r et e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e mo fp c ri sa s s e m b l e d a na d j u s t e dc o n t r o la l g o r i t h i n b a s e do nt h i ss y s t e mi sp r o p o s e dt oi m p r o v et h et e m p e r a t u r ec o n t r o lp r e c i s i o na t o 4 t e m p e r a t u r ec o n t r o ls o f t w a r eb a s e do nv i r t u a li n s t r u m e n tj sp r o g r a m m e d i ta l s op r o v i d e sa n i n t e l l i g e n th u m a n m a c h i n ei n t e r f a c e t h er e l a t e dt e s ta r ec a r r i e do nf a b r i c a t e dc h i p st ov e r i f yt h e i rp e r f o r m a n c e s o m ei m p o r t a n t f a c t o r sa r eo p t i m i z e db yu s i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n da n o v a b a s e do no p t i m u mc o n d i t i o n s , t w od i f f e r e n td n a t a r g e tf r a g m e n t sf r o m ( h e p a t i t i scv i r u sd n a ) 2 4 4 b pa n d ( e s c h e r i c h i ac o l i s k1 6 sg e n o m i cd n a 、1 8 3 b pa r es u c c e s s f u l l ya m p l i f i e d b yc o m p a r e dw i t hs t a n d a r dp c r i n s t r u m e n t ，t h er e s t r a i ne f f e c to f t & o f l u i d i c l a y o u to f t h ec h i o nn o n - s p e c i f i c p r o d u c t s i s p r o v e d k e y w o r d s ：m e m s ，m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，m i c r o f l u i d i c c h i p ，p e l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o nc h i p ，s u 一8 ，p d m s i i 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：雯睹 日期：年月日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：誊拓字 日期：年月日 指导教师签名：降文丸 日期：年月日 p 海交通大学博+ 学位论文 1 1 引言 第一章绪论 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s cc h a i nr e a c t i o n ，p e r ) ，又称无细胞克隆技术( f r e eb a c t e r i a c l o n i n gt t c h n i q u e ) ，是一种对特定的d n a 片段在体外进行快速扩增的新方法。此前，d n a 扩增一 般采用分子克隆法：将含有靶基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，涉及到d n a 酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，分子克隆法不但操作时间长，并且难度大。不利于 普及，而p c r 技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能 在一个试管内将所要研究的靶基因或某一d n a 片段于数小时内扩增至需要的数量，可从一根毛发、 一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的蜊a 供分析研究和检测鉴定，以前需几天时闯才能做到的 事情，用p c r 技术几小时便可完成。 早期p c r 所使用的d n a 聚合酶( d n ap o l y m c r a s cd 于1 9 5 5 年被a r t h u rk o r n b e r g 等人发现 1 儿2 。此后，h k l e n o w 博士于7 0 年代的初期发现具有实验价值及实用性的酶( x l e n o w f r a g m e n to fe c o | i ) 3 ，由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不适合高温的聚合酶链 式反应。现今所使用的酶( t a q p o l y m e r a s e ) ，于1 9 7 6 年从温泉中嗜热水生菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 分离出来的 4 ，它能耐高温，被广泛运用则于8 0 年代之后的p c r 反应中。p c r 的原始雏形概念 是基因修复复制，它是于1 9 7 1 年由k j e l lk l e p p e 博士和k h o r a n a 提出，他们发表了第一个类似 p c r 前两个周期反应的实验 5 3 。而现今的p c r 于1 9 8 3 由美国p e - c e t u s 公司的人类遗传研究室 k a r yb m u l l i s 博士发展出来，它使体外无限扩增核酸片段真正成为现实，m u l l i s 博士于1 9 8 5 年与s a i k i 等人正式表了第一篇相关的论文 6 7 】，m u l l i s 也因此获得了1 9 9 3 年诺贝尔化学奖。 随后，_ i u l l i s 所在的p e - c e t u s 公司推出了第一台p c r 热循环仪，使p c r 技术的操作程序大大简 化，p c r 技术很快在世界各国被广泛应用于基因研究的各个领域，它对分子生物学及其相关学科 的基础研究和诊断应用等方面产生了革命性的影响。 1 1 1 细胞内d n a 的半保留复制 p c r 技术的根源是细胞内d n a 的半保留复制合成，d n a 主要存在于细胞核染色质内，1 9 5 3 年，( c r i c k ) 克里克与美国科学家( w h t n ) 沃森在英国剑桥的一家实验室合作，揭示了dn a 的双 螺旋结构1 8 。d n a 伴随细胞的自身繁殖而得以复制，细胞繁殖是一个不断有丝分裂的过程，其 l 第一章绪论 分裂有一个细胞周期( c e uc y d e x 匡d1 - 1 a ) ，连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分 裂结束，一般可分为间期( i n t e m i n c n tp h a ) 和细胞分裂期( m 硒cp h a s e ，m ) 两个阶段【9 】。d n a 半 保留复制发生在细胞间期，根据d n a 的复制合成情况，间期可分为d n a 合成前期( g 1 ) ，d n a 合成期( s ) 和d n a 合成后期( g 2 ) ；在细胞分裂期( m ) ，经半保留复制合成的，具有完全相同结构的 d n a 被分配到两个不同的细胞中。 ( a ) ( b ) 图1 - 1 ( a ) 细胞周期；( b ) 染色质结构 f i g u r e1 - 1 ( a ) c e l lc y c l e ；( ”s t r u c t u r eo fc h r o m a t i n d n a 在细胞问期进行了半保留复制，在这一工程中，d n a 与蛋白质构成了染色质 r c h r o m a t i n ) ，其基本形态如图1 1 b ，染色质可以看作是由核小体( n u c l e o - s o m e ) 为基本单位构成。 核小体直径1 0 r i m ，每个核小体包含2 0 0 b p 的d n a 和8 个分子的组蛋白。组蛋白是真核生物特有 的碱性蛋白，组蛋白有5 种，分别为h 1 , h 2 a , h 2 b , h 3 , h 4 ，在核小体中，组蛋白核心是8 聚体 ( h 2 a , h 2 b ，i - 1 3 , h 4 各2 个分子) ，d n a 分子围绕组蛋白核心将其包裹，含有1 4 6 个碱基对。两个 核小体之间，也有一段d n a 连接，约5 4 个碱基对，另外在连接部位还有一个h i 组蛋白分子， h 1 富含赖氨酸，很容易从染色体中除去，它的作用是将相邻的核小体包装在一起，同时d n a 是 连续的，所以许多核小体形成了染色质丝。 d n a 的这个复制合成过程是一个遗传信息的编码和复制过程，其机理与其结构有着密不可 分的关系。 2 上海交通大学博+ 学位论文 图1 2d n a 分子结构和半保留复制原理 f i g u r e l - 2 m o l e c u l a r s t r n c t a r e o f n u c i e i c a c i d s a n ds e m i - c o n s e r v a t i v e m o d e l d n a 分子由两条螺线缠绕的分子链组成，链由糖和磷酸碱基交错连接形成( 图1 2 ) ，每条链 都有糖- 磷酸主链和碱基向内突出相连的脱氧核苷酸。脱氧核苷酸的碱基共有四种：胸腺嘧啶， 胞嘧啶( c ) ，腺嘌呤( a ) ，鸟嘌呤( g ) ，互连的碱基，在配对上严格互补：a 与t 配对，c 与g 配对， 两条链的碱基通过a ：t 和g ：c 之问的氢键联结在一起。在d n a 半保留复制过程中，两条链间的 氢键在胞内特殊酶作用下，破裂并使d n a 双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补 配对原则( a ：t ，g ：q ，由d n a 聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链， 这样新形成的两个d n a 分子与原来的d n a 分子的碱基序列完全相同。此过程中，每个子代d n a 的一条链来自亲代的d n a ，另一条链则是新合成的，1 9 5 8 年m e s c l s o n 和s t a h l 的实验f l o 】首次证 明了胞内半保留复制方式。 d n a 半保留复制，还是半不连续复制( s c m i - o n d i s c t i n u o u sr e p l i c a t i o n ) ，因为d n a 链合成的单 链存在磷酸基端和羟基端，所以两条d n a 链合成双链有磷酸基端对磷酸基端羟基端对羟基端和 磷酸基端对羟基端两种方式，实际采用的就是后一种的方式组合，正常d n a 双链的5 端的是磷 酸基，3 t 端是羟基，在复制起点处两条d n a 链解开成单链时，一条是5 l 3 方向，另一条是3 l 5 方向以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3 l 5 ，另一条为5 l 3 。但生物细胞内所有 催化d n a 聚合酶都只能催化5 一3 延伸，这是一个矛盾。冈崎片段( o k a x a k if r a g m e n t s ) 的发现使 这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复s t j 泡( r e p l i c a t i o nb u b b l e s ) ，d n a 向两侧复制形 成两个复制叉( r e p l i c a t i o nf o r k s ) 。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3 l 5 t ，以此为模板 而进行的新生d n a 链的合成沿5 l 3 劣向连续进行，这条链称为前导链0 e a d i n gs t r a n d ) 。另一条 模板链的方向为5 t 3 。，以此为模板的d n a 合成也是沿5 。- 3 方向进行，但与复制叉前进的方向 相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链( 1 a g g i n gs t r a n d ) ，合成的片段即为冈崎片 段，这些冈崎片段以后由d n a 连接酶连成完整的d n a 链。 3 第一章绪论 1 1 2 体外d n a 扩增的p c r 技术 - - _ 抽- _ _ _ - ：震= = = 田盆蕾墨毒蕊勰 摹援赫绰 _ _ - - m _ _ - _ 4 - _ _ - - _ - _ ：二_ * _ 一 图1 3 d n a 片段的p c r 扩增 f i g u r e1 - 3d n aa m p l i f i c a t i o nb yu 硝n gp c r 胞内d n a 的半保留复制是由套复杂的酶系统来完成的，起主要作用的是d n a 聚合酶，它 负责催化核酸的聚合，合成与原先d n a 具有互补序列的d n a 。原核及真核细胞中的d n a 聚合 酶都不止一种，有些专司d n a 复制，有些则参与d n a 的修补，此外，许多d n a 聚合酶除了具 有聚合的活性外，还具有3 l 一5 i 夕 切酶( e x o n u c l e a s e ) 的活性，可以将聚合错误的核营酸去除 ( p r o o f r e a d i n g ) ，以维持d n a 复制的正确性。有些聚合酶也具有5 l 3 夕 切酶的活性，用于水解 引子序列或参与d n a 修补等。 p c r 与体内细胞中d n a 半保留复制有相似之处，同样遵循碱基互补配对原则( a ：t ，g ：c ) ， 然而，在双链d n a 分子的解旋分解上，与细胞内通过酶作用来分解的方式不同，它利用了体外 d n a 分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，通过人为控制体外合成温度，促使双 链d n a 变成单链d n a ( 变性) ，接着单链d n a 与人工合成的引物( 一小段与模版d n a 序列 互补的单链d n a 或r n a ) 相连接( 退火) ，最后在脱氧核苷三磷酸d n t p 存在条件下，耐高温 的d n a 聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链d n a ( 延伸) 。高温变性、低温退火、适温延伸 三步反应循环进行( 图1 3 ) ，使靶序列d n a 得以迅速扩增( 表1 1 ) 。p c r 与胞内半保留复制的另 一个不同之处，是其通常不具备复制过程的纠错能力，这是因为p c r 反应中缺乏胞内那种可以 去除错配核苷酸的外切酶，因此p c r 的错配和非特异产物问题比较突出。 4 三一 一 t 海交通大学博十学位论文 p c r 反应要点 p c r 的反应步骤 p c r 的基本要素包括 d e n a t u r a t i o n ：加热至9 4 或9 6 c d n a 模板( m m p l a m ) 使双链模版d n a 打开为单链单链引物，两个寡核苷酸作合成的引物 a n n e a l i n g ：温度降至5 0 c 或6 5 c ，使引物 合成d n a 的原料4 种脱氧核苷酸( d n t f ) 能专一性的附着至模版上 e x t e n s i o n ：温度提高剑7 5 c 左右，t a qd n ad n a 聚合酶，常用t a q d n a p o l y m e r a s e 进行d n a 合成 表1 1p c r 反应的主要步骤和基本要素 t a b l e1 - 1p r o c e s so ft h ep c ra n dp i r yf a c t o r s 3 5 循环 6 仁拷贝 图1 4 d n a 分子片段在p c r 中的指数递增 f i g u r e1 - 4e x p o n e n t i a la m p l i f i c a t i o no f t h eg e n ei np c r 上述这三个步骤每进行一回合，就可使d n a 量增加为两倍，从( 图1 - 3 ) ( 图1 4 ) 可以看 出，初级延伸产物是在第一次循环时从原始模板扩增而来的，在下一次循环时，初级产物变性作 为模板，线形扩增而成为长度不定的次级产物，当p c r 进入第三次循环时，次级产物变性成为 模板，扩增出具有确定长度的靶( t a r g e t ) 片段，在最初的4 次循环之后，靶片段的扩增即进入指 数扩增阶段。此后，反复进行n 次后，理论上d n a 量可接近? 倍佃1 - 4 ) 。然而，通常在正常的 反应条件下，经三十多次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，【1 1 】产物的 量不再增加，因此实际上，p c r 的扩增倍数为( 1 十x ) - ，x 退火一，延伸) 序列相比，并不 完全相同。从( 图2 - 7 b ) 的温度分布图中可以看出，在p c r 反应的二十次左右循环过程中，每 次循环，p c r 反应试剂在芯片上的流动实际上都以( 变性- 延伸1 ( t a c ) 一 退火- 延伸2 ) 的顺 序完成，试剂内的待扩增d n a 片段完成变性反应区解旋后，无法直接进入退火区，需要绕过图 吣鲫街钟舯船拍沁o 雾一荧龙盔魔 r 海交通大学博十学位论文 示的“t a c ”这一阶段才能进入退火阶段，降低了效率。更为重要的是，在这一过程中，由于温 度没有迅速降至退火点解旋的d n a 链容易与反应试剂中的模板链，或其它中间互补产物链合 成，形成各争争中间产物和次级产物一长产物片断，导致非特异性产物总量增加 1 7 , 1 8 ，降低芯片 的效率。经过二十次左右的循环后，t a c 作用时间也变成二十多倍，非特异性产物量也成倍递增， 无法最大程度的发挥芯片p c r 扩增的效率。 图2 7 ( a ) 主流连续流p c r 反应芯片的布局模式；彻温度变化曲线 f i g u r e2 - 7 ( | ) c u r r e n tp c rc h i pl a y o u t ；( b ) t h e r m op r o x y 目前，d n a 的p c r 扩增多是按着三个温度区来完成，然而，对于特定d n a 扩增应用，存 在不少双温区的应用，以减少扩增时间和提高产率，然而，这样一种布局也不利于温度区的合并， 因此，在d n a 扩增的适用性层面上缺乏广泛性。 针对这些问嚣，本文设计了两种新型流路布局的p c r 芯片，其温度区分布方式采用了不同 的布局( 图2 - 8 a ) ( 图2 - 8 b ) ，通过改变芯片的通道的空间结构，将变性温度区与退火温区直接衔 接起来，扩增顺序成为：( 变性一退火延伸) ( 图2 - s o ) ，避免了( 图2 - 7 a ) ( 图2 - 7 b ) 的“t a c ” 部分，与d n a 扩增所需的温度顺序完全相同，因此能够有效的降低( 图2 - 7 ) 布局所带来的非特 异产物此外，与逶逸式通路不同，采用这两种p c r 芯片的设计，通道内试剂在流动时，分散 性也较小，因此在最终检测时也有利于出峰。在适用性方面。所设计的这种布局方式。可以很方 便的调整为双温度区的工作模式，适用于不同类型的d n a 片断扩增，有更为实际的使用性。 第二章集成式连续流p c r 芯片结构设计分析 ( a )c o ) ( c ) 图2 8 ( a ) t 型p c r 芯片温度区分布；c o ) o 型p c r 芯片温度区分布；( c ) 温度变化曲线 f i g u r e2 - 8 ( a ) t - s h a p ei c rc h i pl a y o u i ；c o ) o - s h a p ep c rc h i pl a y o u t ； ( c ) t h e r m op r o x y 两种连续流p c r 芯片设计在通道的布局上采用了不同的管径以控制试剂在管道的实际流速， 如图2 - 8 a 所示的t - s h a p e 芯片矩形通道尺寸为8 0 x 1 0 0 _ t m ，而在入口和出口部分的通道尺寸为 1 6 0 x 1 0 0 t m ，同样在( 图2 - 8 b ) 的o - s h a p e 芯片通道尺寸为1 0 0 x 1 0 0 卜m ，而在入口和出口部分的 通道尺寸为1 6 0 x 1 0 0 p m ，制造误差在5 “m 。通道变截径设计目的，是为了保证试剂在首次进入 芯片反应系统时在变性区有充分的预热和d n a 解链，而在出口延伸区的特别延长部分和加大的 通道则可以保证产物具有足够的聚合时间。( 图2 - 8 a ) t - s h a p e 芯片通道全长3 6 1 0 m m ，而( 图2 - 8 b ) 的o - s h a p e 芯片的通道全长为3 7 2 0 m m ，设计循环为2 5 次。 芯片的流体布局流体通道及模型如图2 - 9 ，完全吻合( 变性- 退火- 延伸) 三个温度点顺序，其 中，模板d n a 的变性区温度控制在9 4 ，根据模扳的不同温度有所变化，如果扩增片段产物较 短，则变性温度可以稍低，但不能太低，否则不完全变性的模板序列在稍微冷却时将会立即折回， 阻止了引物融合。退火区温度是影响p c r 特异性的较重要因素，变性后温度快速冷却至6 0 ， 可使引物和模板发生结合，由于模板d n a 比引物复杂得多，引物和模板之问的碰撞结合机会远 远高于模板互补链之间的碰撞，退火区温度与时间，取决于引物的长度，碱基组成及其浓度，还 有靶基序列的长度，对于2 0 个核苷酸，g + c 含量约5 0 的引物，5 5 c 为选择最适退火温度的起 点较为理想，延伸区温度一般选择在7 4 ，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合，p c r 延 伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 k b 以内的d n a 片段，延伸时间l m l n 是 足够的，3 4 k b 的靶序列需3 4 m i n ；扩增1 0 k b 需延伸至1 5 r a i n ，延伸进间过长会导致非特异 性扩增带的出现，对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 p 海交通大学博十学位论文 ( a ) ( c ) 图2 - 9 ( 曩) t 型p c r 芯片流体通道；c o ) o 型p c r 流体通道；( c ) o s h a p ep c r l 芯片模型 f i g u r e2 9 ( 的c h a n n da r o u n dt - s h a p ec h i p ； 1 0 ”o n l ，涂覆在加热器和传感器薄膜上不会引发短路，介电常数在室温1 m h z 下，是半导体模 块电路及大功率器件的理想散热材料，是提高高分子材料热导率和力学性能的最佳添加料，如环 氧树脂和导热硅脂中加入氮化铝粉体可以明显地提高其热导率，广泛应用于大功率模块的散热和 热均匀化。 图2 1 l 两个连续流p c r 芯片的集成薄膜加热器与传感器 f i g u r e2 - nh e a r t e r sa n d 咖s o 礴o nt w oc o n t i n u o u s - f l o wp c rc h i p s 本文所设计p c k 芯片的加热器和温度传感器的示意图如图2 - 1 1 ，其尺寸设计主要遵循两个 规则，第一个规则是加热电阻要满足一定的功率，另一个规则是薄膜电阻承受的电流密度不能过 大，当加在加热器上的最大电压由外部电源确定时，加热器的电阻服从欧姆定律，可以由下式计 算： r 。丛 ( 2 1 ) a p 溅射薄膜的电阻率，f 传感器或加热器的全长4 是其截面积，根据( 2 - 1 ) 可以得出： 如- 凡专 ( 2 - 2 ) 这里嘞是加热器或者传感器电阻，这里r 是铂( p t ) 的表面电阻，l 和缈分别是加热器电阻 线的长度和宽度。 r 海交通大学博+ 学位论文 对于加热执行器而言，除了必须满足加热功率的要求之外，其上最大电流密度还受制于p t 的电迁移极限，以溅射或沉积法技术制造的金属薄膜而言，由于溅射或者沉积制造的金属薄膜具 有多晶结构，其电迁移极限( s 。一i o * a m 2 ) ，超过这一极限，加热薄膜会发生断裂1 1 9 】，作为判 定，电阻线条的电流密度，。和最大电功率j ，眦可以由下式计算： ，一- 訾 c ：刁， 只。一r h ( s 。晰) 2 ( 2 - 4 ) y 是加热器上的电压，t 是电阻线条厚度，本文设计的加热器电阻线条宽度为4 0 0 z m ，阻值 为5 0 0 左右。 在设计温度传感器电阻线条尺寸时，应该考虑下述方程： av一rnat(2-5) 这里a v 是数据采集卡的最小电压分辨率，是数据采集卡的激励电流，a t 是最小可检测 温度变动量。还须注意温度传感器最大电阻值受数据采集卡饱和输入电压限制。在此前提下，选 取较大的测温电阻可以保证较好的测量分辨率。本文设计的加热器和传感器，室温2 3 - 2 5 下， 其基本特性依据上式计算如( 表2 - 1 ) 所示，其中s e r p e n t i n ep c r ，o - s h a p ep c r 2 是作为对比p c r 芯片的，s e r p e n t i n ep c r 芯片与传统连续流p c r 芯片布局相同，o - s h a p ep c r 2 芯片在流路的设 计上与o s h a p ep c r l 有所不同，具体区分在后续章节有详述。 膜厚t r s lr s 2r s 3r h l眦 n 吼l ( o )( q ) ( q ) ( q ) t o l s e r p e n t i n ep c r 2 6 0 n m5 0 0 33 2 1 73 5 9 13 3 61 9 7 t - s h a p ep c r 2 6 0 n m4 6 5 4 5 4 3 24 4 5 83 5 6 2 4 4 o s h a d ep c r i 2 6 0 r i m4 1 7 63 5 0 13 1 5 81 9 51 1 2 o - s h a p e p c r 2 2 6 0 h m3 2 0 41 7 1 92 2 1 71 27 4 o 1 0 6 1 0 4 0 h m m ；r s l 延伸区传感器电阻； r 矗2 变性区传感器电阻：r s 3 退火区传感器电阻； p h l 延伸区加热器电阻：r h 2 变性区加热器电阻 表2 - 1 集成薄膜加热器和传感器的特性 t a b l e2 1p a r a m e t e r so fi n t e g r a t e dh e a t e r sa n ds e l l $ o l s 利用有限元软件对计算结果进行了验证，如图2 - 1 2 ，对三个温度区进行了电阻分析，从模拟 分析结果( 图2 - 1 2 a ) 可以得出，两个结果最大差异在r h l 处，为0 2 0 ，这个差异主要来自手算 3 1 第二章集成式连续流p c r 芯片结构设计分析 时采用了几何图形近似，计算采用了s h c u l 5 7 单元来模拟三个金属薄膜传感器和两个加热器分别 在5 v 和2 v 电压下所发生的情况。模型采用了映射网格( 图2 - 1 2 b ) 划分，可以保证运算精度， ( 图2 - 1 2 c ) ( 图2 - 1 2 d ) 的两幅图为计算结果的等势图，反应了其上电压和电流密度的分布。 图2 1 2 连续流p c r 芯片传感器和加热器的热电分析 f i g u r e 2 - 1 2 t h e r m o e l e c t r i c f e a o f s e n s o r s a n d h e a t e r s o nc o l l t i n u o u s - f l o w p c r c h i p 在本文的实验章节，对设计与模拟仿真结果进行进一步的