（环境工程专业论文）高效过氧化物酶基因工程菌的构建.pdf

摘要 巨大芽孢杆菌表达系统在高温等极端环境中有着较强的耐受性和广泛的底 物特异性，木质素过氧化物酶基因的成功转入对其在农副产品废弃物的处理和 资源化中的应用有着极为重要的意义。 关键词：黄孢原毛平革菌巨大芽孢杆菌木质素过氧化物酶几丁质酶 i i a b s t i 。a c t a b s t r a c t l i g n i np e r o x i d a s e ( l i p ) i sam o n o m e d ch a e m 0 9 1 y c o p r o t e i np e r o x i d a s es e c r e t e db y p 矗d 玎p ，d c 口p f pc 7 ”) 哼d 妒。厂f “m h o 、v e v e r 1 i g i l i i lp e r o x i ( i a s ep r o d u c t i o ni sh 锄p e r e d b ys e v e r a lf 砬t o r ss u c ha se x p r e s s i o no fm e s ee n z y m e su n d e rn 砌e n tl i m i t a t i o na i l d l l i l b a l 锄c e dm e d 斌卸dt 1 1 es e n s m v 时o ft 1 1 i sb a s i d i o m y c e t ef i l n g u st o1 1 i 曲s h e a r f b r c e si nt l l ef b n n e m o r ，b e s i d e r st h cr 印i di n a c 廿v a t i o no f 1 e s ee m 可m e se v e ni nt 1 1 e a b s e n c eo f m y c e l i a t h ee x p r e s s i o no fl i 酗i np e r o x i d a s eg e n ei nb a c i l l u sm e g a t 谢u r nw a si n v e s t i g a t e d t h ec d n ae n c o d i n g l i g i l i np e r o x i d a s e w a sc l o n e db yi h 二p c ru s i l l gr n ao f p c h r y s o s p o r i u ma st e r r 巾l a t e t h cl i 凹i np e m x i d a s ec d n a w a sm s e r t e di n t op l a s m i d p h y 3 0 0 p l ka 1 1 d 廿a n s f o n n e di m o 肋c 肼螂埘唧耙r f 跏 p c rm e t l l o d o l o g yw a sd a d o p t e df o rc l o i l i n go fl i 印_ i i lp e r o x i d a s ee n c o d i n gg e n e s b a s e do nm es e q u e n c e so fl i g n i np e r o x i d a s eg e n e 丘d mg e n e b a i l k ，t h ep r i m e r sf o r l i 卿np e m x i d a s eg e n ea m p l 访c a t i o nw e r ed e s i 口e d p c r 丘a g m e n t 、v a sl i g a t e d 、v i t l l d u c l 8v e c t o ra n dt r a l l s f b m e di n t oe c 0 1 ij m l 0 9 f o u rc o l o i l i e so ft m s f b r n l e d e c 0 1 ij m l 0 9 埘t hc l e a rh y d r o l y z i n gz o n eo nt h el b 、e r eo b t a i l l e d n l eg e n e f h g m e n ti n 山e s ei s o l a t e sw a si d e n t i f i e d n l er e c o m b i n a n tp l a s i i l i dl i p h 8a 1 1 de c o l i b a c i l l l l ss h 叫l ev e c t o rp h y 3 0 0 p l kw e r e d i g e s t e db ye c o r ia n db 眦h ic o m p l e t e l y ，a n d 1 ei i g n i l lp e r o x i d a s eg e n e 、v a sl i g a t e d 讪t l ls h u t t l ev e c t o la 1 1 d 也er e c o m b i n a n tv e c t o rw a su s e dt o 衄s f o n nb m e g a t e r i u m b mc o m p e t e n tc e l l p c ra 1 1 de n z ) 皿ea c t i v i t yc h e c ko nc h j t i na g a rs h o w c dt l l a tt h e l i g n i np e m x i d a s ec d n aw a si n s e n e di m oe c o l i b a c i l l l l ss h u m ev e c t o rp h y 3 0 0 p l k a n dt r a n s f o 肌e di n t ob a c i l l u sm e g a t e r i u mb m c o i n p a r e d 、i t l lt h el i g l l i np e m x i d a s ea c t i v 时a i l dt h ec h i t i n a s ea c t i v 时o fb 口c f ，淞 i i i a b s t ，c t m 唧把r f “m ，m en e wg e n e t i c a l l ye n g i i l e e r e db a c t e r i a b m 4 1 3w a sm o r ea c t i v eb y 1 0 8 a n d1 9 8 n u 曲t l l i ss t t l d y ，im a k ef u r t l l e ru n d e r s t a l l d 州t i lt r a d i t i o n a lm e t h o d so fc u l t i v a t e a i l dc r e e no u td e g r a d i n gm i c r o o 唱a i l i s m s m o r c o v e r ，is t i l d i e dh o wt oc o n s t n 】c ta g e n e t i c a l l ye n g 抽e e r e db a c t e r i at od e g r a d ep 0 1 l u t a l l t so n t h es i d eo f m o d e mm 0 1 e c u l a r b i o l o g yt h u s ，ih a v em o r er e c o g l l i t i o nt oe n v i r o 姗e n t a lb i o t e c l u l o l o g yt l l e o r ya n d e x p e r i m e n t a l t e c l l l l i q u e s k e yw o r d s ：尸而口胛p ，d c 矗口p 胞c 厅，弘。印d ，f 姗，b 口c f 螂埘p g 口耙，f “m ，i i 删np e r x i d a s e ， c 1 1 i t i n a s e i v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年。月 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 一槲 学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名 年月 日 第一章前言 第一章前言 第一节木质素的生物降解 1 1 1 木质素生物降解的研究现状 木质素( l i 印i n ) 是自然界中含量最丰富，并可以回收利用的有机资源。木 质素降解在自然界碳氧循环中具有极其重要的作用，木质素的降解是木质纤维 利用的重要处理环节。 近年来，环境保护和资源利用问题受到前所未有的关注，传统的利用化学药 剂脱除植物纤维原料木质素的制浆或漂白方法带来了能耗高，污染重等一系列 严重的问题，因此各国都采取措施，加大科研投入，以寻求最佳的木质素降解 工艺，减轻木质素降解过程中废水污染环境带来的巨大压力。因此，利用生物 技术脱除木质素的研究以成为国内外开发利用植物纤维原料的热点课题【l j 。 木质素的降解机理的研究主要包括两个方面：( 1 ) 比较降解反应前后原料木 质素或木质素模型物的结构变化，推断降解过程可能发生的化学变化；( 2 ) 根 据木质素降解反应产物，判断木质素降解过程与降解途径。关于木质素生物降 解研究，有可分为利用微生物直接处理原料木质素和利用微生物分泌的木质素 降解酶处理原料木质素或木质素模型物1 2 j 。 木质素降解在自然界碳氧循环中具有极其重要的作用，过去仅知少数真菌 能降解木质素，自从应用了“c 标记的木质素和松柏醇的去氢聚合物( d h p s ) 做底物后，新发现了不少具有木质素分解能力的微生物口】。另外人们借助现代仪 器( 如电子光谱，喇曼光谱，核磁共振谱【4 】等) 对木质素生物降解产物进行了鉴 定，使生物降解途径逐渐明确，为低污染造纸业( 生物制浆) 的发展奠定了基 础。为了在降低能耗，控制环境污染的前提下持续地发展纸浆造纸工业，人们 不断地进行着探索和努力。 生物制浆由于具有所需设备简单，工业原料和能耗廉省，纸浆品质好，废液 污染小等优点引起了人们地广泛兴趣和高度重视，有关研究日趋活跃。近十几 年来，国际上围绕木质素生物降解进行了大量基础研究工作。主要集中在如下 几个方面f 5 】：( 1 ) 微生物( 主要是白腐菌) 对模型化合物，合成木质素和天然木 第一章前言 质素的降解机理，生物条件对生物降解作用的影响：( 2 ) 木质素降解酶的分离， 提纯，特性分析和作用机理研究；( 3 ) 木质素降解过程中植物内部组织及纤维 细胞的微观结构变化。这些研究成果，给生物制浆，生物漂白，制浆漂白废液 的生物处理等提供了重要依据和潜在途经。 1 1 2 木质紊生物降解研究的目的和意义 随着国家可持续发展战略的实施，环境保护越来越受到人们的重视。制浆造 纸，农药，印染等国民经济发展必不可少的行业，每年都会向自然界排放大量 有剧毒，制癌的工业废弃物1 6 】。 木质素是制浆造纸工业的主要剩余物，同时也是地球上碳循环的重要组成部 分，人们对其进行深入的研究，会使其代谢机理更明朗，应用前景更广阔。通 过生物降解有可能使木质素转化为重要的化工产品，微生物蛋白饲料或有机肥 料，使其变废为宝。从自然资源合理利用和可持续发展的战略的角度考虑，对 木质素的生物降解进行充分研究具有重要的现实意义1 7 j 。 木质素生物降解的研究工作范围十分广泛，除了早期发现的能够自然降解纤 维原料的白腐真菌类1 8 jr 砌妇- ，0 f 加培f ，担子菌纲( b 珊触d m ，哆w 把s ) 的黄孢 原毛平革菌( p 口n e m o c a p 把c r 归d 印d ，f “m ) 和杂色云芝f c b r f o ，淞w 憎f c o f o r ) 外，具有降解木质素能力的极少部分细菌和一些放线菌也正在不断被筛选和研 究。对于以黄孢原毛平革菌和杂色云芝为代表的木质素降解机理在研究生物制 浆，生物漂白等工作中具有重要的理论意义。 第一章前言 1 1 3 木质素降解体系 木质素是一种由类苯丙烷亚单位组成的天然聚合物，与其他的生物聚合物在 结构上很不相同。像蛋白质，纤维素，淀粉和核酸等，大多数的生物聚合物都 是线性的，由一种重复的相同的键将亚单位连接起来。然而，木质素的亚单位 的连接却是一种非线性的随机方式。这种随机性的产生源于木质素的合成本身 就是一种自由基的调控。在植物细胞壁增厚期间，木质素的类苯丙烷前体物在 一种细胞壁上的过氧化物酶的催化下，经历单电子氧化，生成苯氧基自由基。 这些自由基发生各种共振，并彼此偶联缩合形成聚合物。因此这样产生的木质 素含有各种类型的连接亚单位的键。 木质素的部分结构见图1 1 图1 1 木质素的部分结构示意图 木质素中单元结构间连接键的生物降解主要是非专一性氧化反应，其初始降 解为胞外过程。具有降解木质素能力的微生物包括真菌，细菌和放线菌。目前 研究和应用较为广泛的菌种大多为真菌门担子菌纲的白腐菌p j 。 微生物对纤维原料的降解反应的实质是多种酶协同作用下发生的酶促反应， 据报道【1 0 】，微生物分泌的与木质素降解直接有关的胞外酶有木质素过氧化物酶 第一章前言 ( ，忉加弘，锨池船p ，f p 土锰过氧化物酶( m d ，蜓弦n e s ep e ，似f 如e ，肺妒) 和漆 酶( c 础e ，三日c j 。1 9 8 6 年，又有人发现【l l 】葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶，可 以彻底氧化底物产生h 2 0 2 ，与l i p 和m n p 共同构成木质素降解体系。 黄孢原毛平革菌是能够分泌胞外酶l i p 和m i l p ，具有h 2 0 2 发生系统的微生 物【1 2 】。 黄孢原毛平革菌降解木质素的过程中，不能被真菌直接吸收的木质素大分子 在胞外酶m i l p ，l i p 和乙二醛氧化酶催化反应得到h 2 0 2 共同作用下形成阳离子， 随后在产烷菌作用下分解可被菌丝直接吸收利用的小分子物质，最终在菌体内 氧化为c 0 2 和h 2 0 ，完成木质素的代谢过程【1 3 l 。在实际反应中，l i p 需要藜芦醇 构成降解体系；m i l p 需要m n ”形成木质素降解体系。在这一过程中，木质素并 非菌体生长所需的直接碳源，菌体降解木质素需要首先代谢碳水化合物获得所 需的h 2 0 2 ，然后木质素降解成为可能，因此，木质素降解是菌体次生代谢的结 果。 第一章前言 第二节木质素过氧化物酶 木质素过氧化物酶( l i p ) 【1 4 】是一种来源于真菌的过氧化物酶，是降解木质 素的过氧化物酶的主要成分。l i p 是一系列含有血红素辅基的同功酶，相对分子 质量为3 8 4 3 1 0 4 ，其中约1 5 为糖基组分；它由3 4 3 个氨基酸残基，以及血 红素，糖和钙离子组成i l 卯。l i p 显示了典型的过氧化物酶的空间折叠情况，而且 血红素有一个和在其他过氧化物酶中一样的封闭环境( c l o s ee n v 曲m e n t ) 。单个 l i p 分子有8 个主要的螺旋，8 个小螺旋和3 条短的反平行折迭片【1 “。 鼬r k 等在限氮条件下，培养黄孢原毛平革菌时发现了1 0 种过氧化物酶同功 酶，即：h 1 ，h 2 ，h 3 ，h 1 0 【1 ”；它们是按在高效液相色谱分离柱中洗脱顺序命 名的，在这些同功酶中，6 种为l i p 。l i p 同功酶在相对分子质量很相近，且这 些同工酶可能是由同一基因编码，经转录后修饰( 包括糖基化或磷酸化的数量 和类型) 造成结构上的差异。 1 2 1 木质素过氧化物酶同功酶的物理及酶学特性 l i p 的活力与其一系列的同功酶密切相关。l e i s o l a 【幅】等人收集p d h e r o c 向口p 把 c r 坶d 印d r 胁川b k m 一1 7 6 7 在不同培养时间和不同培养条件下的发酵液，利用等电 点聚集的方法分析出了1 5 种l i p 同功酶。 通过离子交换高效液相色谱( ，l c ) 分析该菌株在最优发酵条件下的发酵浓 缩液，于2 8 0 n m 出检测出1 2 个吸收峰，在4 0 9 衄处至少有1 0 个强吸收峰【1 9 】。在 这1 0 个血红蛋白定义为h 1 h 1 0 其中有6 个( h 1 ，h 2 ，h 6 ，h 7 ，h 8 和h 1 0 ) 属于l i p ， 在h 2 0 2 存在时能够氧化藜芦醇，而h 2 和h 8 是影响l i p 活力的两个主要同功酶 【2 0 。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 可知这些同功酶有不同的等电点 ( p 1 4 7 3 3 ) 和相关分析质量( 3 8 4 3 1 0 4 ) 。通过免疫印迹分析和部分蛋白质水解消 化模式表明，l i p 同功酶具有高度的同源性1 2 “。 l i p 不耐高温，当温度高于3 5 时，l i p 就开始失活。其最佳p h 为4 5 ，在p h 3 o 以下极不稳定。l i p 活力越高越不易失活，加入藜芦醇可以极大的增加l i p 的稳定 性【矧。 第一章前言 t i e n 和k 酞等人利用藜芦醇木质素模型等底物来检测同功酶的动力学特性 发现，底物不同，k m 值变化比较显著，对于藜芦醇同功酶的k m 值范围为8 6 4 8 0u m o l l 【2 3 】。这些同功酶的活力范围随底物的变化而发生变化，其原因可能是由于底 物的亲和力或与活性中心的结合力不同所致。 1 2 2 木质素过氧化物酶发酵条件的研究 胞外木质素降解酶系的发现是利用黄孢原毛平革菌降解木质素研究的重大 进展。木质素过氧化物酶系一般产生于限氮或限碳培养的次生代谢阶段在整个 合成阶段l i p 的合成量要比m n p 大得多，而且l i p 能降解木质素得模型物，因此 l i p 在木质素的降解中起主导作用，成为后来的主要研究酶。 由于l i p 最初被发现时的合成量很低( 约2 0 u l ) 【2 4 】，为了提高酶产量，人们从 培养方式、木质素模型物的诱导、氧浓度的影响、细胞固定化培养、痕量元素 浓度的作用等方面进行了大量的研究。 目前国内报道用黄孢原毛平革菌生产木质素过氧化物酶最高酶活为 1 5 0 0 u l 【2 ”。研究表明利用黄孢原毛平革菌进行限氮培养时，必须通过纯氧才能合 成l i p ，通氧强度大，游离菌丝球尺寸小，有利于产酶。而限碳培养，在空气环境下就 能合成l i p 。利用细胞固定化培养时，用聚氨酯泡沫固定细胞可增加菌丝的比表面 积，降低剪切力，能够促进l i p 的合成。 由于采用木质素模型物进行白腐真菌降解特性研究，很难反映出降解过程，为 此，中科院化工冶金所陈洪章等人以汽爆处理的麦草为原料进行了固态发酵l i p 的初步研究，结果表明固态发酵产生的l i p 活力远远高于液态发酵【2 。 山东大学高培基等人用h p l c 分析不同培养条件下l i p 的同功酶组分，结果 表明不同培养基成分对l i p 同功酶组分的影响方式不同【2 7 】。改变培养条件时，l i p 同功酶的数量及酶组分的合成量均发生显著变化，进而影响l i p 的总合成量，这说 明了l i p 合成调控的复杂性。 第一章前言 1 2 3 木质素过氧化物酶的降解机制 l i p 在h 2 0 2 为辅助底物时，可氧化酚型木质素型化合物为苯氧自由基，氧化非 酚型木质素模型化合物为芳香正离子自由基，在经过一系列非酶催化的自由基反 应后使木质素质侧链上的c 。c 。键断裂，产生c 。c ，片断和c 1 c 6 片断。l i p 中的 f e 离子是三价的正f e 态的( 常表达为f e i i i ) ，h 2 0 2 使血红素发生2 个电子的氧 化，导致其变为c o m p o u n di 。“pi 的2 电子氧化的血红素是种四价f e ( f e ) 。 从本质上讲，l i pi 是发生2 电子氧化的l i p 酶中间体，含有一个氧化的高f e 。 l i pi 对各种还原性化学物质具有很高的反应性，在将它们1 电子氧化成自 由基的同时自身成为c o m p o l l i l d 。同样是l i p 的中间体，l i p i i 再与另一些化学 物质反应，被还原成f ei i i 的静止酶。 从静止态酶到l i pi ，再从l i pi 到l i pi i ，又恢复到静止态酶，这样就形成 了l i p 的循环；同时伴随着对作为底物的化学物质( a h 2 ) 的氧化性催化。这就 是l i p 的降解机制。 如图1 2 所示为木质素质过氧化物酶的降解机制：其中r h 为催化的底物。 图1 2 木质素质过氧化物酶的降解机制 图1 2 中，自然状态下的l i p 含有自旋f e ”，被h 2 0 2 氧化失去两个电子后形成 l i p i ( o = f e 4 + 一a + ) ，l i p i 含有一个o = f e 4 + 中心和一个有机阳离子自由基( a + ) ，该自由 基依酶的种类和来源不同或定位于血红素或定位于蛋白质多肽链中；随后，l i p i 氧 化一分子外源底物( r 均，得到一个氢原子和一个电子，产生底物自由基限+ ) 和l i p i i ， 而有机阳离子自由基( a + ) 则被还原为初始态，接着l i p i i 被另分子外源底物还原 第一章前言 为初始态形成f e 3 + 但又形成一个r + ；最后，两个r + 或结合成r 2 或歧化为r 2 h 4 。 上述过程中如果l i p i i 与过量的h 2 0 2 之间还会形成另外一种l i p 的中间物一 l i p i i i 。它是亚铁过氧化物酶的加氧形式( f e “+ 0 2 ) ：更确切地说，是一种氧化 复合体( o x y c o m p l e s ) 。当底物与l i pi 发生反应要比与l i pi i 更容易时，就会形 成l i p i i i 。 从本质上讲，l i p 催化的降解过程是一个由菌的细胞所产生的h 2 0 2 启动的一 系列自由基的链反应，实现对底物的部分和彻底的氧化。 1 3 1 l i p 基因的结构 第三节“p 基因的研究 黄孢原毛平革菌中l i p 由一个至少含1 0 个密切相关的基因家族编码。l i p 基 因具高的保守性，其氨基酸序列有5 3 9 8 9 的相似性【3 0 】。研究认为，与过氧化物 酶活力相关的残基是保守的，包括近端的亚铁血红素配基( l i p a 中的h i s 2 0 4 ) ，末端 的a 唱( m 9 7 5 ) 和h i s ( h i s 7 5 ) 川。许多黄孢原毛平革菌中的l i p 基因有c 一端富 含脯氨酸的特点，其意义不祥。黄孢原毛平革菌中的l i p 基因含8 9 个短的内含 子，大小4 9 7 6 b p ，其中6 个内含子的位置是高度保守的【”】。 “p 基因编码的成熟蛋白包括3 4 3 3 4 5 氨基酸残基。m r n a 剪接位点与其他 真核基因类似的顺式调控元件短序列，如应答元件( c r e ) ，转录激活蛋白2 ( a p 2 ) 及 非极性碳应答元件f 汪) 等。它的基因家族大多数成员在基因组中成簇排列。其 他白腐真菌也发现与黄孢原毛平革菌的基因同源的l i p 基因，而且克隆测序了几 个l i d 基因【j “。 对l i p 信号肽断裂位点分析表明l i p 最初是作为一种前体酶合成，前体酶含有 一个2 7 2 8 氨基酸残基的先导序列，先导序列中则含有一个2 l 氨基酸的信号肽， 由前体酶先导序列a l a _ 2 l 位点断裂产生，该信号肽含有一个带正电的n 端区域， 一个中央疏水区域和一个极性的c 端区域，由此决定了l i p 是典型的分泌型蛋白 【3 4 1 。 第一章前言 一t 1 3 2l i p 基因表达调控 用p o l y ( a ) 一i a 反转录和n o r 山e m 印迹分析法已经证明l i p 是在m r n a 翻 译水平上受碳源或氮源营养调控，有证据表明l i p 同功酶受碳源和氮源的调控是 有差异的【”】，如对于b k m 。f 1 7 6 7 菌株，在限氮条件下可诱导产生h 2 同功酶的基 因( g 1 9 4 ) 在限碳条件下转录水平最高，比在富碳或限氮条件下转录水平高约一千 倍【3 6 】。 编码h 1 0 同功酶的g 1 9 5 基因转录只在限氮条件下才可检测到。而h 8 的基 因在限碳和限氮条件下转录水平基本相同。 c a ，芳香化合物对l i p 的合成也有一定的调控作用。黄孢原毛平革菌的l i p 活力和胞内c a m p 水平密切相关。c a m p 抑制剂抑制或延缓l i p 的产生是通过降 低胞内c a m p 水平实现的。 芳香化合物对l i p 活性的影响是多方面的f 3 ”，如藜芦醇的作用既能诱导酶合 成，又能保护l i p 在高浓度h 2 0 2 条件下不致失活，但苯乙醇则无此作用。另外，有 些芳香化合物是l i p 的底物，但却不能作为诱导物；而另一些芳香化合物既是l i p 的底物，又是其诱导物。目前对于芳香化合物产生的l i p 诱导机制有待于进一步 的研究。 第四节木质素过氧化物酶的异源表达 由于利用黄孢原毛平革菌产生“p 受到许多因素的限制。例如：此菌发酵周期 长，并且只有在限氮或其他不均衡的培养基中才能分泌l i p ，并且酶活较低，同时其 菌丝在发酵罐中易受高剪切力的损伤【38 1 。因此研究l i p 的异源表达具有重要的 现实意义。 近年，l i p 的异源表达的研究受到许多学者的重视，在大肠杆菌( e c d ，f ) 中，将 黄孢原毛平革菌的l i p 同工酶h 2 的c d n a 置于t 7 启动子的控制下，所得到的是 不具有生物活性的包涵体，其活性在离体后才获得。将其在含尿嘧啶，c a 2 + 血晶素 的介质中进行重新折叠，获得了活性蛋白。这一重组蛋白与原蛋白有相同的光学 和反应动力学特点【3 9 】。而且同天然酶一样，它也有一些m n p 活力。最近在 触p e r g i l l u si l i g c r 中实现了l i p 同工酶h 8 的异源表达，h 8 基因被置于植物胭脂碱 合成酶( n o p a l i n es y i 曲a s e ，n o s ) 的启动子和终止子控制之下，在这一异体系统中， r l or ir， 第一章前言 一 合成了m r n a 。w e s t e m 印迹分析表明，这种重组蛋白与天然蛋白大小极为相似， 但胞外l i p 的活力比较弱。 此外，在黄孢原毛平革菌中还实现了重组l i p 同工酶h 8 同源表达。3 一p 一甘油 醛脱氢酶以痧c p 阳地砂出j 一3 节 d 印 口耙出砂d 硇酽 已叻) 启动子被用于促进 l i p h 2 的表达( l i p h 2 编码l i p 同工酶h 8 ，产生于初级代谢) 。将g d p 启动子和l i p h 2 连与表达载体p u g l 上，以尿嘧啶为选择性标记，转化尿嘧啶营养缺陷型的黄孢原 毛平革菌。在高氮高碳的培养条件下，转化子产生了过氧化物酶活力( 原l i p 基因 在这种情况下不表达) 【4 0 】。 重组的l i p ( r e c o m b i n a l l tl i p ，r l i p ) 的相对分子质量，等电点，吸光值均与原 l i p h 8 相同。表明血红素的插入、折叠、分泌在转座子中均正常。原l i p h 8 与重 组l i p h 8 氧化藜芦醇的动力学特点也相同。1 9 9 6 年w e n d y a d o y l e 和a n d r e w ts m i t h 研究了l i p h 8 在大肠杆菌中的表达，表达结果为无活性的包涵体形 式的脱辅基蛋白。1 9 9 1 年j o l l l l s o n 等人研究了l i p 和m n p 在杆状病毒中的表达， 得到了有活性的三咖。p k 6 f 砌m 的l i p 基因在乃f c o 虎r 研口，e p s e f 中表达只 在m r n a 水平上可检测到，未发现任何胞外l i p 【4 2 j 。同样，l i p h 8c d n a 的克隆在 一株突尼斯黑曲酶中的表达可检测到l i p 转录物但是胞外活性很弱。 第五节受体细胞巨大芽孢杆菌的研究 芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热，抗化学药物，抗辐射和 抗静水压等方面更是首屈一指。一般细菌的营养细胞不能经受7 0 以上的高温， 可是它们的芽孢却有惊人的耐高温能力【4 。 巨大芽孢杆菌( 肋c 订胁川p 朋阳r f “埘j 是应用最广和最早的一种解磷芽孢杆 菌。细胞大小( 1 2 1 5 ) 岬( 2 5 ) 岬，芽孢1 1 “m 1 7 岬，革兰氏阳性，好 氧，微兼性，细胞大，椭圆形杆状，老龄菌体一端由圆形变为尖形，细胞单独 或成对排列，细胞内有颗粒状内含物，幼龄菌菌体可见运动，老龄无运动性。 在琼脂培养基上生长是菌落呈白色，边缘整齐，有光泽或较暗，老龄时略带黄 色，长期培养菌苔可由灰色变褐色。最适宜生长的温度为3 7 。该菌的g + c 含量为3 6 5 _ 4 7 4 ( 摩尔分数) ，芽孢囊不膨大，中生，芽孢为卵圆形，但是 巨大芽孢杆菌遗传稳定性差，常发生遗传变异。 般研究认为该种为异源，菌株可分为二组及一些中间型菌株。d n a ：d n a 第一章前言 杂交研究表明有4 个同源组存在。 模式种为a t c c l 4 8 5 l ，属同源a 组。我国从东北分离的巨大芽孢杆菌编号为 b a 5 。巨大芽孢杆菌d n a 同组的区别特征见表1 1 。 表1 1 巨大芽孢杆菌同源族区别特征 直链淀粉苯胺蓝裂解 + 几丁质水解 1 1 一8 9 都是阳性 巨大芽孢杆菌芽孢的抗辐射能力比大肠杆菌的营养细胞强3 6 倍 州。可以利 用这种较强的抗逆性使得它们在高温等极端环境下仍然发挥作用。不仅如此巨 大芽孢杆菌还具有代谢磷的能力，对于农副产品废弃物的处理与资源化的应用 前景更加广泛。 巨大芽孢杆菌作为表达系统有以下优点： ( 1 ) 它能够把有功能的蛋白酶直接分泌到胞外； ( 2 ) 具有非致病性。 1 5 1 芽孢杆菌几丁质酶的研究 几丁质( c l l i t i n ) 又称甲壳素或甲壳质，广泛分布于自然界中，在天然聚合物中 其储量仅次于纤维素，占第二位4 5 1 。现今，己经确定有三种以氢键相连的结晶 体：q 一几丁质，由两条反向平行链组成，结构如图1 3 所示，其中r 代表n h 2 ； b 一几丁质，由两条同向平行链组成；y 一几丁质，由三条链组成，两条同向， 第一章前言 一条反向。 图1 3 几丁质结构图 在生物体中几丁质常与其它结构物质交联，真菌细胞壁中的几丁质与b 一葡 聚糖共价结合。几丁质酶是催化降解几丁质的一类糖基水解酶，它可将由b 一， 4 - n 一乙酰一d 一葡聚糖( n a g ) 残基组成的几丁质降解为低分子量的n a g 。 几丁质酶广泛存在于有机体中，顾真荣曾报道三种产几丁质酶的芽孢杆菌 ( 短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌) 对病原菌的抑菌作用1 4 “，尤其是枯 草芽孢杆菌，在开发研制生防制剂以防治多种土传植物病害方面具有很大的潜 力。 芽孢杆菌的几丁质酶具有多样性，不同的芽孢杆菌产生的几丁质酶的类别、 组分、性质不尽相同，如地衣芽孢杆菌阻f f c p 咖，m 例可产生五种几丁质酶， 环状芽孢杆菌倍c f 憎“肠坶阮一乃则产生六种几丁质酶，巨大芽孢杆菌 ( 且m e 即f p r f “州能产生三种脱乙酰几丁质酶，大多数产几丁质酶的芽孢杆菌对真 菌都具有拮抗作用，而且多数几丁质酶在离体情况下也能抑制真菌的生长。 根据几丁质酶催化区域氨基酸序列相似性，在糖基水解酶分类系统中将几丁 质酶分为两类：f 锄i l v1 8 和f a r n i l v l 9 。同时，可根据几丁质酶水解几丁质底物类 型的不同，可以分为内切酶和外切酶。内切酶的水解产物一般分为几丁二糖、 三糖、四糖或寡聚几丁多糖，外切酶的水解产物常为单糖，微生物产生的几丁 质酶一般多为外切酶，也有一些微生物产生内切酶，植物几丁质酶多为内切酶。 m i d d e l s e n 【47 】等根据几丁质酶氨基酸序列的不同，将植物几丁质酶分为三类，第 一类为碱性多肽，第二类几丁质酶缺少富含半胱氨酸的氨基末端，但它的其他 结构与第一类几丁质酶很类似，第三类几丁质酶主要是木瓜、三叶橡胶、爬山 虎等具有裂解酶、几丁质酶这种双重活性的蛋白质分子，同时还包括黄瓜，拟 南芥的酸性几丁质酶等。 几丁质酶为一诱导酶，当培养基中含有几丁质，脱乙酰几丁质，几丁质二糖 时，可以诱导某些真菌、细菌、放线菌等产生几丁质酶。许多研究挣f c d 如r 聊口卿 第一章前言 的几丁质酶的表达调节表明几丁质酶的合成和活性表达是在转录水平上受到调 节的，几丁质可以诱导微生物中的几丁质酶的高水平的合成一“。b 口c f 盯搬 c f r c “肠矗醛耽一2 在以几丁质为碳源时，在培养的悬浮液中至少能够检测到1 0 种 几丁质酶，己克隆了三种几丁质酶的编码基因：c h i a ，c l l i c 和c l l i d 。c l l i n m i n 等【4 5 1 在b 们f f f 姗n c t u 2 中纯化了一种胞外几丁质酶，这种几丁质酶的酶活性很 稳定，改变p h 和温度很难引起其相关的酶活性变化，以几丁质为底物诱导表达， 当几丁质含量超过o 5 时，酶活性变化也很小，不仅如此，如果向培养基中加 入额外的营养物质( 例如2 蛋白胨) ，酶活性也没有什么意义上的变化。通过几 丁质酶氨基酸的n 一端序列( a n n l g s k l l g y 克隆了此酶的编码基因。 微生物的几丁质酶的分子量变化很大。& ，r 甜妇坍口阳e j c p 船是目前产几丁质 酶比较丰富的一类菌，它可产生五种具有不同分子量的几丁质酶，分别是2 1 ，3 2 ， 3 6 ，4 8 和5 7 k d a 。1 9 9 6 年，l e s y aa t 等发现丑z f 如e n 的删括b 6 8 9 3 也有五种不 同分子量的几丁质酶，分别是6 6 ，6 2 ，6 3 ，4 9 和4 2 k d a ，而从山t h m b a c t e r s t a d 2 0 中得到的c l l i a 和a r j h i b 的分子量分别是1 l o k d a 和8 0 k d a 【4 。植物的几丁 质酶的分子量一般在2 0 - 4 0 k d a ，例如烟草的四种几丁质酶，其中两种酸性几丁 质酶的分子量是2 7 5 k d a 和2 8 5 k d a ，碱性蛋白酶的分子量分别是3 2 k d 和 3 4 k d 。几丁质酶具有很高的热稳定性，4 ，f 枷6 日c 把，印t a d 2 0 在最适p h 6 1 的 条件下，温度在5 5 左右，其a r c h i a 和a r c l l i b 的酶活力表现最大。h o g e 皿 等于2 0 0 0 年从一嗜热性肋c f 砌s 印。克隆到脱乙酞几丁质酶的编码基因c h o k ， 该基因编码的酶在6 0 一1 0 0 酶活性表达较高。几丁质酶的p h 一般在3 - 7 5 时具 有酶活性，d h 为6 时达到最大值。 关于芽孢杆菌几丁质酶的研究始于1 9 0 5 年，b e n e c k e 就首次分离到了能够 利用几丁质作为营养物质的微生物，并定名为b 口c f 盯“5 c ff 加d v f r 0 淞( 溶几丁质 芽孢杆菌) ，但当时没有关于几丁质酶活性方面的直接证据【5 。 随后，其基因的克隆研究较多的是矗曲c “肠脚。1 9 9 0 年，t 酞e s l l i 利用载体 质粒p q 3 3 3 从且c 肌“肠珊w l 1 2 中克隆了几丁质酶m 的编码基因c 1 i a ， d n a 序列揭示几丁质酶正常表达的部位含有2 0 9 7 b p 的开放阅读框架，编码几丁 质酶a 1 的前体，此前体含有一个很长的信号序列( 4 1 b p ) ，n 一端催化部位为1 5 个氨基酸，c 一端为几丁质的结合部位f c j l b d ) 。随后几年中对该酶及其编码基因 研究的较多。 m a s 哪k i 等，对几丁质酶a j 的几丁质结合区域的特性和表达作一研究。利 第一章前言 用p e t 表达系统在大肠杆菌中大量产生c l l i a l 的c 1 1 b d ，并通过几丁质亲和层析 柱得到纯化，纯化后的( c 1 1 b d ) 可以特异性的结合各种非溶解性的几丁质，但不 能结合其余的多聚糖类，例如壳聚糖，纤维素等【5 “。c l l b d 的结合活力的p h 范围在2 1 1 之间，当p h 接近于p i 时，其酶活性最高，表明c h b d 的结合主要 是以疏水作用为主。缺失c 1 1 b d 的c h i a l 水解b 一几丁质，发现只是在最初的短 时间内水解，6 0 分钟以后，水解速度变慢甚至停止，底物的消耗量明显少于完 整的c h i a j 对底物的消耗量，所以c h b d 在b 一几丁质的降解中具有重要的作用。 郑洪武曾于9 粥年从b 硪r c “肠rc - 2 中克隆了一个几丁质酶编码基因c h t l ， 大小为3 0 k b ，其中各有一个k p l l i ，s a c 工和s s p i 酶切位点，将该片段反向插入到 质粒载体上进行活性检测，同样具有几丁质酶基因的表达活性，说明该片段含 有一个完整的几丁质酶的编码基因，其自身的启动子可被大肠杆菌的转录系统 所识别 5 2 】。比较酶切图谱，发现几丁质酶基因同从丑c 咖“肠r 珊耽j 2 中克隆到 的c l l i a l 和c l l i p 有很大差别，c b j a l 和c 1 1 i p 功能区内的p s t l 和b a t r l h i 位点均未在 c h t l 的功能区中发现，而c h t l 中的k p i l i 和s s p i 位点在c h i a j 和c l l i p 的功能 区中也没有发现。 所以初步判定c h t l 是一个别于c h 卸和c h i p 的新的几丁质酶。b c 抛“肠r 琊 w l 一1 2 中除了克隆到的c 1 1 i a 基因外，w 眦m a b e t 于1 9 9 2 年克隆了c h 认的同 工酶c 1 1 i d 的编码基因，该基因位于c b j a 基囚的下游区域。序列比较认为该基因 编码4 8 8 个氨基酸，c i l i a 和c 1 1 i d 之间相距1 0 8 b p ，而且几丁质酶dn - 端的三分 之一处和几丁质酶a 的c 端三分之一处相似程度很高。同时w 靠m a b e t r i u e l 、t a n a b e t 还认为s e r _ 1 6 0 a s p 2 0 0 ，g 1 u 2 0 4 这三个氨基酸是丑c 泐“切ww l 一1 2 的几丁质酶a l 水解部位的重要因子，缺失这三个氨基酸中的任何一个，尤其是 a s p 2 0 0 ，g l u 2 0 4 ，几丁质酶a 1 的表达都会受到影响【”j 。 1 5 2 巨大芽孢杆菌感受态细胞形成机制5 4 】 巨大芽孢杆菌的自然感受态是在对数生长后期开始形成的，其中培养物中感 受态细胞约占5 一1 5 这种生理状态的形成受到感受态信息素的调节，只有当 细胞达到一定的数目( 一般在对数后期而由细胞所分泌到培养基中的感受态信息 素的浓度达到一定临界值时) 才能诱导感受态的形成。 在巨大芽孢杆菌中有两种与感受态有关的信息素，一种是c o m x ，即早期的研 1 4 第一章前言 究中所说的感受态因子；另一种是c s f 即感受态刺激因子。c o m x 编码含有5 5 个氨基酸残基的信息素c o m x 前体物，经过c o m 的编码产物，c o m q 蛋白的修饰 处理后，产生了由1 0 个氨基酸残基组成的具有活性的信息素。c o r r l ) ( 细胞通过一 种特殊的转运系统将c o m x 分泌到胞外，随后c o r r l ) ( 与跨膜的信号感应蛋白( 一种 组氨酸激酶) 发生相互作用而激活了该酶，使其发生自磷酸化，随后该酶将相应的 应答调节蛋白c o m a ( 由c o i n a 编码) 磷酸化，磷酸化的c o r r a 和s r n 操纵子结合， 激活该操纵子的转录而产生了c o m s 蛋白。在巨大芽孢杆菌中有一种同c o m s 蛋白和感受态转录因子c o m k 特异结合的m e c a 蛋白，m e c a 同c o m k 或c o m s 结合后进一步和蛋白水解复合体c 1 p c 2 c l p p 结合而使c o m k 或c o m s ，被水解当 m e c a 和c o m s 结合后，其构象发生改变而不能有效地和c o m k 结合，从而避免 c o m k 被