（环境科学与工程专业论文）ectoine合成酶基因重组表达研究.pdf

s t u d yo nr e c o m b i n a n te x p r e s s i o no f e c t o i n es y n t h a s eg e n e at h e s i ss u b m i t t e dt o d a l i a nm a r i t i m eu n i v e r s i t y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h e r e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g b y m a h o n g ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n gc o l l e g e ) d i s s e r t a t i o n t h e s i ss u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r z h a n gl i n g h u a j u n e2 0 1 l k 【 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成博硕士学位论文 = =星煎i 盟金盛酶基国重组麦达硒究 ：。 除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体 已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：二啦 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密西( 请在以上方框内打“ ) 论文作者签名：为杠 导师签名：弓袄答艳 日期：劢f 7 年矽月易驴日 1 本论文研究内容由国家自然科学基金项目( 2 0 7 7 6 0 2 1 ) 资助 一l 中文摘要 摘要 某些微生物在环境渗透压胁迫下合成渗透压补偿溶质，e c t o i n e ( 四氢嘧啶， 1 ，4 ，5 ，6 四氢2 甲基- 4 - 嘧啶羧酸，l ，4 ，5 ，6 t e t r a h y d r o - 2 - m e t h y l - 4 - p y r i m d i n ec a r b o x y l i c a c i d ) 是细菌中分布最广泛的渗透压补偿溶质之一。e c t o i n e 在脱水、辐射、冷冻 等逆环境下非特异性的保护细胞、蛋白质、核酸等生物及生物大分子活力的特性。 目前e c t o i n e 已经用于护肤品中的保湿剂，在许多商业中，比如酶的稳定剂、微生 物的保护剂、化疗中健康细胞的保护剂等，也都在研发中。目前e c t o i n e 由细菌发 酵制备，因为e c t o i n e 是胞内物质，受胞内浓度阈值限制，产量低，成本高，是工 业化生产的技术瓶颈。 为了提高e c t o i n e 的制备效率，本文拟采用基因工程技术异源表达c o b e f f ：a m a r i n a 的e c t o i n e 合成酶基因e c t a b c ，并考察表达条件对e c t o i n e 表达量的影响。 采用步移p c r 方法扩增cm a r i n a 的e c t a b c ；构建e c t a b c 表达载体p p e t e c t 和 p e t e c t ，转化至大肠杆菌e c o l ib l 2 1 中，通过抗生素抗性筛选、e c t a b c 基因p c r 鉴定、e c t o i n e 合成表型鉴定，获得e c t a b c 重组子；考察重组方式和重组子诱导 表达条件对e c t o i n e 表达量的影响。 cm a r i n a 的e c t o i n e 合成酶基因e c t a b c 由5 5 8b p 、1 2 6 3b p 和3 9 3b p 组成的 三个开放阅读框架组成，它们共用一个启动子p e c t 。cm a r i n a 的e c t a b c 基因和 表达载体p e t 4 3 1 a 通过限制性内切酶b a m hf s a li 切割并用t 4d n a 片段连接试 剂盒连接，分别获得了携有和没有p e c t 的重组表达载体p p e t e c t 和p e t e c t 。重组 表达载体p p e t e c t 和p e t e c t 分别转化至e c o l ib l 2 1 中，获得了e c t a b c 重组子 p p e t e c t b l 0 6 和p e t e c t b l 2 2 。考察重组子p p e t e c t b l 0 6 和p e t e c t b l 2 2 诱导 表达条件对e c t o i n e 合成的影响，实验结果表明，cm a r i n ae c t a b c 转化e c o l i b l 2 1 ，在特定的诱导条件下能够表达e c t o i n e 。n a c i 浓度为1 时，当培养基中存 在其它渗透压补偿溶质时，重组子p p e t e c t b l 0 6 和p e t e c t b l 2 2 能够生长，但 是自身不合成e c t o i n e ；不加i p t g 、l a e 启动子不工作，n a c l 作为诱导物诱导表达 1ij， k 一 - t 时，e c t a b c 基因的上游启动子p e c t 启动e c t o i n e 诱导表达，但是表达量较l a c 启 动子与p e c t 启动子协同作用的表达量低；n a c l 浓度在1 6 的范围内时，重组子 p p e t e c t b l 0 6 的e c t o i n e 合成量随n a c l 浓度升高而提高。 关键词：e c t o i r e 合成酶；基因重组；诱导表达 1 i 英文摘要 a b s t r a c t s o m e m i c r o o r g a n i s ms y n t h e s i z e s s o l u t eo s m o t i c p r e s s u r ec o m p e n s a t i o n m e c h a n i s mu n d e re n v i r o n m e n t a lo s m o t i cp r e s s u r e e c t o i n e , ( 1 ，4 ，5 ，6 - t e t r a h y d f o 一2 一 m e t h y l - 4 - p y r i m d i n ec a r b o x y l i ca c i d ) a so n e o ft h em o s tc o m m o n l yf o u n do s m o l y t e si n n a t u r e ，i sn o to n l yah i g h l ye f f i c i e n ts t a b i l i z i n ga g e n to fo s m o t i cs t r e s s ，b u ta l s o p r o v i d e se n e r g yf o rc e l l s a n di t c a l lp r o t e c tc e l l s ，p r o t e i n , n u c l e i ca c i d s ，a n do t h e r m a c r o m o l e c u l ea c t i v i t yu n d e rd e h y d r a t i o n , r a d i a t i o n , f r e e z e t h a w i n g ，a n do t h e ri n v e r s e e n v i r o n m e n t i tc a na l s os t a b i l i z et h eh y d r a t i o nl a y e ro fn a t u r a lp r o t e i n ，a n dp r o t e c t e n z y m ea n dd n aa g a i n s tf r e e z e - t h a w i n g , h e a t i n g , d r y i n gh i g l ls a l i n e ，r a d i a t i o na n d o t h e ri n v e r s ee n v i r o n m e n t n o w a d a y s ，e e t o i n eh a sb e e na p p l i e di ns t a b i l i z i n go fe n z y m e ， p r o t e c t i v eo fm i c r o o r g a n i s m ，m o i s t u r i z e rf o rs k i nc a r ep r o d u c t sa n dt h ep r o t e c t i v eo f h e a l t h yc e l l si nc h e m o t h e r a p y c u r r e n t l y , e c t o i n ei sp r o d u c e db yb a c t e r i a lf e r m e n t a t i o n t h i sp r o d u c i n gp r o c e s si st h et e c h n i c a lb o t t l e n e c ki nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o nb e c a u s e e c t o i n ei st h ei n t r a c e l l u l a rs y m b i o s i sa n dr e s t r i c t e db yi n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o n t h r e s h o l dr e s u l t i n gt ot h el e s so u t p u ta n dh i g h e rc o s t i n g i no r d e rt oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fe c t o i n ep r e p a r a t i o n , c o b e t i am a r i n ae c t o i n e s y n t h a s eg e n ee c t a b cw a sh e t e r o l o g o u se x p r e s s e db yg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n i q u e s ， a n dt h ee x p r e s s i o no fc o n d i t i o n so nt h ee x p r e s s i o no fe c t o i n ew a si n v e s t i g a t e d t h e e c t a b cd n af r a g m e n t so fcm a r i n aw a sa m p l i f i e db yg e n o m ew a l k i n g , a n dt h e n c o n s t r u c t e de x p r e s s i o nv e c t o rp p e t e c ta n dp e t e c tw h i c hw e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l i b l 21 w i t ht h es e l e c t i v eo fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c e ，p c ri d e n t i f i c a t i o no fe c t a b ca n d p h e n o t y p eo fe c t o i n es y n t h e t i c ，e c t a b cr e c o m b i n a n tw e r eo b t a i n e d t h ee f f e c to f r e c o n s t r u c t i o nm e t h o da n dr e c o m b i n a n ti n d u c t i o n e x p r e s s i o n c o n d i t i o no nt h e e x p r e s s i o no fe c t o i n ew a ss t u d i e d e c t o i n es y n t h a s eg e n ee c t a b co fcm a r i n ac o n s i s t e do ft h r e eo p e nr e a d i n g f r a m e so f5 5 8b p ，12 6 3b pa n d3 9 3b pw h i c hs h a r e do n ev o m o t e rp e c t t h ee c t a b c g e n eo fcm a r i n aa n de x p r e s s i o n v e c t o rp e t 4 3 1aw e r ec o n f i r m e db yd o u b l e r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dl i g a t e dw i t ht 4d n ac o n n e c t i o nk i ta n dt h e n r e c o m b i n a n tg e n ee x p r e s s i o nv e c t o rp p e t e c ta n dp e t e c tw h i c hw a sw i t ha n dw i t h o u t 一 l c a r r y i n gt h ee c t a b co fcm a r i n aw e r eo b t a i n e ds e p a r a t e l y r e c o m b i n a n tp p e t e c ta n d p e t e c tw e r eo b t a i n e df r o mec o l ib l 2 1w h i c hi st r a n s f o r m e df r o mr e c o m b i n a n tg e n e e x p r e s s i o n v e c t o r p p e t e c t a n d p e t e c t s t u d y t h e i m p a c t o fr e c o m b i n a n t p p e t e c t b l 0 6a n dp e t e c f f b l 2 2i n d u c e de x p r e s s i o no ne c t o i n es y n t h e s i sc o n d i t i o n s ， t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：e c t a b co fem a r i n at r a n s f o r m e di n t oec o l ib l 21 c a l l e x p r e s se c t o i n eu n d e rp a r t i c u l a rc o n d i t i o n s n oe c t o i n ew a ss y n t h e s i z e dw h e nl b m e d i u mi n c l u d i n g1 n a c li n d u c e de x p r e s s i o n i tw a sm o r ea p p r o p r i a t ef o rg r o w t ho f r e c o m b i n a n tp p e t e c t b l 0 6a n dp e t e c t b l 2 2i nl o w s a l te n v i r o n m e n t , b u tt h eh i g h e r s a l tc o n c e n t r a t i o nw a sb e n e f i c i a lt o e x p r e s s i o no fe c t o i n es y n t h e s i so fr e c o m b i n a n t p p e t e c f f b l 0 6 cm a r i n ae c t o i n es y n t h a s eg e n ee c t a b cu p s t r e a mp r o m o t e rp e c ti s n e c e s s a r yi ni n d u c t i o ne x p r e s s i o nu n d e rh i g hs a l te n v i r o n m e n t w h e nw i t h o u ti p t g ， l a cp r o m o t e rd o e sn o tw o r k n a c la st h ei n d u c e rt oi n d u c e de x p r e s s i o n ，t h eu p s t r e a m p r o m o t e rp e c to fe c t a b cg e n e si n d u c ee c t o i n ei n d u c e de x p r e s s i o n , b u tt h ee x p r e s s i o n o fl a cp r o m o t e ri sl o w e rt h a nt h ep r o m o t e rw i t hp e c te x p r e s s i o no fs y n e r g y n a c i c o n c e n t r a t i o ni si n 1 - 6 r a n g e s ，t h eh i g h e rn a c lc o n c e n t r a t i o ni s ，t h em o r e f a v o r a b l er e c o m b i n a n t sp p e t e c t b l 0 6t h ee x p r e s s i o no fe c t o i n es y n t h e s i s k e yw o r d s ：e c t o i n es y n t h a s e ；g e n er e c o m b i n a t i o n ；i n d u c t i o ne x p r e s s i o n r 目录 目录 第l 章绪论1 1 1 渗透压补偿溶质概述l 1 1 1 渗透压补偿溶质简介1 1 1 2 渗透压补偿溶质的分类1 1 1 3 渗透压补偿溶质的作用机制3 1 2e c t o i n e 概述4 1 2 1e c t o i n e 的基本性质4 1 2 2e c t o i n e 的生理功能6 1 2 3e c t o i n e 的应用8 1 3e c t o i n e 制备技术9 1 3 1 高密度发酵9 1 3 2 细菌挤奶l o 1 3 3 生长细胞和静息细胞两阶段联合制备e c t o i n e 。1 1 1 4e c t o i n e 生物合成及其合成酶基因1 2 1 4 1e c t o i n e 生物合成途径l2 1 4 2e c t o i n e 合成酶基因1 3 1 5e c t o i n e 合成酶基因重组表达及其调控1 4 1 6 本论文的目的、内容及意义一1 7 第2 章cm a r i n a 的e c t o i n e 合成酶基因克隆1 9 2 1 实验材料和试剂1 9 2 1 1 实验菌株19 2 1 2 试剂19 2 2 实验方法19 2 2 1 基因组d n a 的提取19 2 2 2 染色体步移p c r 技术获取e c t a b c 基因19 2 2 3 琼脂糖凝胶电泳分析2 0 2 2 4 核苷酸序列测定2 0 2 3 实验结果2 0 第3 章e c t o i n e 基因重组表达载体的构建2 4 3 1 材料和试剂2 4 3 1 1 实验材料2 4 3 1 2 培养基2 4 3 2 实验方法2 4 3 2 1p c r 方法及引物设计2 4 3 2 2p c r 产物精制2 5 3 2 3e c t a b c 重组表达载体构建。2 5 3 2 4 重组表达载体转化e c o l ib l 2 1 2 6 3 2 5 重组子鉴定2 6 3 3 实验结果。2 7 3 3 1cm a r i n a 的重组目的d n a 片段扩增2 7 3 3 2 重组表达载体的构建2 7 3 3 3 转化e c o l ib l 2 1 2 8 第4 章e c t o i n e 合成酶基因e c t a b c 的诱导表达3 2 4 1 材料和试剂3 2 4 1 1 实验菌株和试剂3 2 4 1 2 培养基和溶液的配制3 2 4 2 实验方法3 3 4 2 1 重组子诱导表达。3 3 4 2 2e c t o i n e 浓度测定3 3 4 2 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 3 4 4 2 41 h n m r 鉴定3 4 4 3 实验结果与讨论3 5 4 3 1 重组表达3 5 4 3 2 诱导表达对e c t a b c 表达的影响。3 6 结论4 0 参考文献4 l 附录1cm a r i n ac i c c10 3 6 7 核苷酸序列4 8 附录2 质粒p e c t 4 3 1 a 结构图5 2 攻读学位期间公开发表论文5 3 致谢5 4 一 e c t o m e 合成酶基冈重组表达研究 1 1 渗透压补偿溶质概述 第1 章绪论 1 1 1 渗透压补偿溶质简介 “渗透压补偿溶质 ( c o m p a t i b l es o l u t e ) 一词最早是由澳大利亚人b r o w n 和 s i m p s o n 于1 9 7 2 年提出的【。当某些微生物处于高渗环境下时，细胞内的水溢出引起 膨压减小，相应地细胞内所有代谢物浓度均升高而造成细胞内水活度下降。这时微生物 通过在细胞内积累几种有机小分子溶质，主要包括氨基酸及其衍生物、多元醇、糖类、 甲胺、甲基锍化合物等以提高细胞内水活度，使细胞的体积和膨压达到正常水平，并避 免细胞内所有物质浓度升高【2 1 。由于这些有机小分子溶质在细胞内的高浓度( l m o l k g ) 积累可使细胞内外渗透压达到平衡，并且不影响其他大分子功能及细胞代谢活动，因而 被称为渗透压补偿溶质。通常，它们具有高度水溶性、生理p h 范围内不带静电荷、高 浓度积累也不干扰细胞的正常代谢等特性。渗透压补偿溶质机制是一种逐级的变化反 应，随外界渗透压的变化而变化，在高渗条件下，细胞内积累高浓度的渗透压补偿溶质， 执行渗透保护功能；而在低渗条件下，渗透压补偿溶质又能很快被释放到细胞外，或者 被分解代谢。 1 1 2 渗透压补偿溶质的分类 某些中度嗜盐菌积累的渗透压补偿溶质的种类常常有选择性，是在不同生长时期和 培养条件下发生变化的混合物。以以色列盐单胞菌( h a l o m o n a si s r a e l e n s i s ) 为例，在盐 浓度低于3 5 的条件下培养时，积累的主要物质是海藻糖；而在高盐条件下，积累的 主要物质则是e c t o i n e ( 四氢嘧啶，l ，4 ，5 ，6 四氢2 甲基- 4 嘧啶羧酸，1 ，4 ，5 ，6 t e t r a h y d r o 一2 - m e t h y l - 4 一p y n m d i n ec a r b o x y l i ca c i d ) 【3 】。目前，在中度嗜盐菌中发现的渗透 压补偿溶质主要包括：糖类和糖苷类( 如海藻糖、葡萄糖苷等) 、氨基酸类( 如谷氨酸、 脯氨酸和谷氨酰胺等) 、甜菜碱类( 如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱等) 、e c t o i n e ，以 及乙酰二氨基酸( 如乙酰鸟氨酸、乙酰赖氨酸等) 。 第1 章绪论 糖类和糖苷类：目前已发现的主要有蔗糖和海藻糖。此外，在一些中度嗜盐的蓝细 菌中还发现了葡萄糖苷【4 1 。然而，这些物质对中度嗜盐菌的渗透保护功能作用有限，仅 依赖糖类和糖苷类物质还不足以来抗衡细胞外界的高盐环境。因此，高盐条件下中度嗜 盐菌还需要一些其它渗透压补偿溶质来同时执行渗透保护功能。糖类浓度过高对某些酶 有抑制作用，因而，糖类和糖苷类被认为是一类较低级的渗透压补偿溶质。 氨基酸类及其衍生物：游离氨基酸作为渗透压补偿溶质已有很多报道【5 ，6 】。大部分革 兰氏阴性细菌积累的主要是谷氨酸 7 1 ，而其它氨基酸积累很少。脯氨酸是革兰氏阳性细 菌最常见的氨基酸类渗透压补偿溶质之一2 8 】。常见的其他氨基酸类渗透压补偿溶质主要 有：甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸；氨基酸类衍生物主要有：乙酰鸟氨酸、谷氨酰胺及谷氨 酰胺衍生物。 甜菜碱类：甘氨酸甜菜碱广泛存在于许多生物的细胞中，是一种四价铵类化合物。 甜菜碱不但能作为渗透压补偿溶质，还能作为碳源和能源物质。早在1 9 世纪8 0 年代初， 甜菜碱就被发现是一类在光合紫细菌和蓝细菌的渗透压调节中起重要作用的有机渗透 压补偿溶质【9 1 。由于甘氨酸甜菜碱广泛分布于自然界中，所以，中度嗜盐菌在受到高盐 冲击时，能利用甜菜碱转运基因从外界环境中快速地摄入甜菜碱，执行渗透保护功能。 另外，在该过程中还能够节约中度嗜盐菌积累渗透压补偿溶质所消耗的能量，从而最大 程度地在不利环境中生存繁殖。细胞内的甜菜碱浓度通常由外界环境中n a c i 和胆碱的 浓度决定，随着外界浓度的增加而增加【1 0 , 1 1 】。甜菜碱的累积是具有盐依赖性的，换句话 说，在无n a c l 的环境中，嗜盐菌通常并不累积甜菜碱。中度嗜盐菌不仅可以通过体内 合成还可以直接从外界环境中吸收进行累积。 e c t o i n e ：e c t o i n e 是由中度嗜盐菌在高浓度盐诱导下合成的一种环形氨基酸衍生物， 由于兀电子云的存在及不稳定，其氨基酸功能一直未被显示出来，因此该氨基酸在很长 时间内一直未被发现【1 2 1 ，1 9 8 5 年g a l i n s k i 等【1 3 】第一次在极端嗜盐外硫红螺菌属 ( e c t o t h i o r h o d s p i r a ) 的光合细菌h a l o c h l o r i s 中发现了e c t o i n e 这种物质。e c t o i n e 具有 渗透调节功能并且只在某种特殊生理条件下才能够生成，含量也会随着环境条件的变化 而改变。起初认为e c t o i n e 是相当特殊的渗透压补偿溶质，但是高效液相色谱( h p l c ) e c t o i n e 合成酶基因重组表达研究 和核磁共振( 1 3 c n m r ) 波谱法方法体系建立后的短短2 0 年中，越来越多的实验证明 四氢嘧啶类物质不仅是大多数中度嗜盐菌和耐盐菌主要的渗透压补偿溶质【1 ，1 4 】，在产放 线菌素的微小链霉菌s t r e p t o m y c e sp a r v u l u s 这样的非嗜盐菌中也检测到它们的存在【1 4 1 5 】，e c t o m e 被认为是目前在细菌中分布最广泛的一类渗透压补偿溶质【1 6 1 。已经发现在 嗜盐微球菌( m i c r o c o c c u sh a l o b i u s ) 、肋生盐弧菌( v i b r i oc o s t i c o l a ) 、嗜盐海球菌 ( m h a l o p h i l u s ) 、嗜盐芽孢杆菌( h h a l o p h i l u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 及盐单胞菌 科( h o l o m o n a s ) 中累积阱，1 7 1 。由于目前e c t o i n e 的制备技术产量低、成本高，所以研究 开发受到重视。 其它：在中度嗜盐菌中，除上述几种重要的渗透压补偿溶质外，还发现了乙酰鸟氨 酸和乙酰赖氨酸等。它们主要存在于盐水球菌属、喜盐芽孢杆菌属和芽孢杆菌属等低 g c 含量的革兰氏阳性菌中。例如，在喜盐喜盐芽孢杆菌和柠檬色动性球菌中，积累的 乙酰鸟氨酸和乙酰赖氨酸都与盐渗透相关【2 , 1 8 】。然而，目前还没有关于这两种渗透压补 偿溶质合成途径以及调控机理的报道。 1 1 3 渗透压补偿溶质的作用机制 渗透压补偿溶质作为细胞的渗透压保护剂，能够和新陈代谢相容，有很好的稳定生 物大分子空间结构的功能，对细胞内的蛋白酶和其它大分子物质起着抗早、抗热、抗冻 和抗变性等稳定作用。虽然渗透压补偿溶质的这种保护作用一直受到普遍的关注，然而， 至今仍没有建立一个可以解释所有有关现象的物理化学理论。目前关于渗透压补偿溶质 的作用机制有两种假说，都是基于渗透压补偿溶质具有稳定生物大分子表面结合水，维 持生物大分子空间结构的能力而提出的。 ( 1 ) 水替代假说( p r e f e r e n t i a lh y d r a t i o n ) 渗透压补偿溶质与蛋白质表面特别是疏水表面结合，提高蛋白质表面的水化程度。 蛋白质表面的疏水区域是非常脆弱或敏感的部分，因为结合在这里的水分子结合能力非 常弱，细胞在水分胁迫环境中将首先脱去这部分水。相反，蛋白质亲水区域结合的水， 其相对结合能力较强，不易受水分亏缺的影响。因而，高渗环境将主要造成蛋白质疏水 表面区域的不稳定【1 9 1 。渗透压补偿溶质( e c t o i n e 、甜菜碱、脯氨酸) 和亲水物质( 如 多元醇) 对蛋白质结构的保护可能涉及两种机制：渗透压补偿溶质通过它们结构中的疏 第1 章绪论 水部分与蛋白质的疏水表面结合，将其转化为亲水表面，可以使更多的水分子结合在蛋 白质原来的疏水区域，参与稳定疏水表面的作用。这种转化意味着细胞在水分欠缺的条 件下能保持蛋白质结构的完整性。而多元醇主要替代疏水表面附近的水分子，当水分欠 缺时，蛋白质表面疏水区域附近的水丧失，其位置由多元醇替代。这假说从渗透压补 偿溶质的结构特征入手，特别强调胁迫条件下渗透压补偿溶质对蛋白质分子敏感区域的 稳定，非常直观，一直被用于解释渗透压补偿溶质稳定生物大分子功能的机制。 ( 2 ) 优先排阻假说( p r e f e r e n t i a le x c l u s i o nm o d e l ) 在蛋白质溶液中，渗透压补偿溶质主要优先溶解在大量的自由水中，而不是溶解在 蛋白质或其他生物大分子表面的结合水中，不参与生物大分子的直接作用。渗透压补偿 溶质最大程度地从蛋白质的水化层排除，从而使蛋白质优先水化，增强了蛋白质的稳定 性，防止了其因热、冻和旱等条件导致表面区域扩大而变性。相反，易于结合在蛋白质 分子表面的物质，如尿素，会降低蛋白质表面水化程度，使蛋白质分子解折叠。8 0 年 代中期，a r a k a w a 和t i m a s h e f f 将这种渗透压补偿溶质从蛋白质和其它大分子的表面排 除的现象称为优先排阻假说b 9 。a r a k a w a 和t i m a s h e 1 9 1 通过测定添加有糖类、氨基酸 及氨基酸衍生物的球蛋白质溶液的密度发现，这些渗透压补偿溶质都使球蛋白质分子密 度降低，也就是说蛋白质表面水化作用增强，为优先排阻假说提供了实验证据。 蛋白质分子表面水化程度的提高，将使蛋白质分子必须处于高折叠的构象状态( 即 天然状态) ，换句话说，就是天然状态的蛋白质分子与变性的蛋白质分子的平衡式将趋 向于左侧。相反，易于结合在蛋白质分子表面的物质如尿素，会降低蛋白质表面水化程 度，蛋白质分子解折型2 0 1 。细胞渗透压补偿溶质都具有很好的相容性。在蛋白质溶液中， 渗透压补偿溶质都溶解在自由水中，但并不能完全排除它们与蛋白质结合的可能性，特 别是在生理条件下，尤其是在受渗透胁迫的细胞中，蛋白质与渗透压补偿溶质之间的相 互作用，可能要比a r a k a w a 等研究的简单体系中的情况复杂得多。 1 2e c t oi1 3 e 概述 1 2 1 e c t o i n o 的基本性质 e c t o i n e 是由中度嗜盐菌在高浓度盐诱导下合成的一种环形氨基酸衍生物，分子量 一 e c t o i n e 合成酶基冈重组表达研究 1 4 2 2 ，分子式为c 6 h l o n 2 0 2 ，结构式如图1 1 。1 9 8 5 年g a l i n s k i 等第一次在极端嗜盐 外硫红螺菌属( e c t o t h i o r h o d s p i r a ) 的光合细菌h a l o c h l o r i s 中发现了e c t o i n e 这种物质。 图1 1e e t o i n e 结构式 f i g 1 1f o r m u l ao fe c t o i n e e c t o i n e 作为渗透压补偿溶质主要分布在好氧、化学异养的耐盐或者嗜盐微生物中； 一部分极端嗜盐菌，以及大部分中度嗜盐菌和部分耐盐菌均以e c t o i n e 为主要渗透压补 偿溶质【2 1 1 。越来越多的实验证明四氢嘧啶类物质不仅是大多数中度嗜盐菌和耐盐菌主要 的渗透压补偿溶质【l 1 4 1 ，在产放线菌素的微小链霉菌s t r e p t o m y c e s p a r v u l u s 这样的非嗜盐 菌中也可以检测到它们的存在【1 5 1 6 1 ，被认为是目前在细菌界分布最广泛的一类渗透压补 偿溶质【l 】。研究发现这种物质主要存在于三个分支中【2 2 】：( 1 ) 放线菌门：主要有放线 多胞属( a c t i n o p o l y s p o r a ) 、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、拟诺卡氏菌属( n o c a r d i o p s i s ) 和链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) ；( 2 ) 硬壁菌门：主要有芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、盐水杆 菌属( s a m b a c i l l u s ) 、喜盐芽胞杆菌属( h a l o b a c i l l u s ) 、海球菌属( m a r i n o c o c c u s ) 、 芽胞八叠球菌属( s p o r o s a r c i n a ) 和v i r g i b a c i l l u s ； ( 3 ) 变形细菌门：色盐杆菌属 ( c h r o m o h a l o b a c t e r ) 、外硫红螺菌属( e c t o t h i o r h o d o s p i r a ) 、盐单胞菌属( h a l o m o n a s ) 、 甲基细菌属( m e t h y l o b a c t e r ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、小红卵茵属( r h o d o v u l u m ) 和s a l i n i v i b r i o 2 3 】。除了嗜硫小红卵菌( r h o d o v u l u ms u l f i d o p h i l u m ) 和r h o d v i b r i o s a l i n a r u m 属于a 变形细菌，其它所有能够产生e c t o i n e 的细菌都属于y 变形细菌。羟基 四氢嘧啶在拟诺卡氏菌属( 踞) 、亚麻类短杆菌属( 曰1 i n e n s ) 、灰色链霉菌( s g r i s e o l u s ) 、 喜盐海球菌( m h a l o p h i l u s ) 等革兰氏阳性菌中更为常见【2 洲。目前还没有在蓝细菌、古 菌和真核生物的种中发现能够自身合成e c t o i n e 的生物【2 5 1 。 第1 章绪论 1 2 2e c t o i n e 的生理功能 作为渗透压保护剂和能量物质存在外，渗透压补偿溶质还具有诱导某些渗透压基因 的表达，以及在热击、冷冻、脱水、辐射和氧自由基等逆环境下非特异性的保护生物大 分子活力的特性。其中，e c t o i n e 表现出了较好的稳定效果。 ( 1 ) 渗透压基因诱导剂 在像苜蓿中华根瘤菌这样的菌株中，e c t o i n e 并不是真正的渗透压保护剂，而是被 分解利用的同时，诱导此菌株一系列与渗透压有关的基因的表达，从而使其合成自身的 渗透压补偿溶质，海藻糖和谷氨酸盐等【2 6 1 。 ( 2 ) 对酶稳定性的作用2 7 】 乳酸脱氢酶和磷酸果糖激酶在冻融、加热和冷冻干燥时极易失活。然而，e c t o i n e 能够在这些情况下保护这两种酶的活性【2 8 】。在冻融和尿素处理条件下乳酸脱氢酶结构的 变化，以及e c t o i n e 对这种酶的保护被观察到，因此提出e c t o i n e 通过调整溶剂性质导致 了一种更紧凑的酶构象【2 9 1 ，支持优先排阻假说【1 9 】。 棉花籽油中甘油酯酶的改变是生产生物柴油的一种新方法【3 0 1 。通过乙醇发酵方面提 升e c t o i n e 的功能可能与渗透压下的酶活性保护有关【3 1 1 。e c t o i n e 已经被作为藻青素合成 酶的稳定剂，用于体外生产藻青素的生产【3 2 1 。植酸酶( 在饲料制粒中，水解植酸并释放 无机磷的一种磷酸单酯酶) 的活性通常由于高温降低【3 3 1 。还有研究表明，e c t o i n e 明显 地稳定了这种植酸酶在高温下的催化能力，与高温下同不添加e c t o i n e 相比较，催化能 力提高7 倍f 3 4 1 。 ( 3 ) 抗逆保护作用 - 在逆环境下