（环境科学与工程专业论文）几种荧光分子探针的设计、合成及其性能研究.pdf

几种荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 a bs t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fi n d u s t m o r ea n dm o r et o x i ca n dh a n n 如l p o l l u t a l l t sa r eb r o u g h ta b o u t ，s u c ha sh e a v ym e t a l s ，p e s t i c i d e s ，o 玛a n i cc o m p o u n d s ，e t a 1 a n a l y z i n ga n dm o n i t o r i n gt h et r a c ep o l l u 伽1 t sb e c o m e sm o r ea i l dm o r ei m p o r t a i l ti n t h ef i e l d so fe n v i r o i l r n e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g t a k ea d v a n t a g eo f h i g hs e n s i t i v i t y a n ds e l e c t i v i t y ，n u o r e s c e n c ea n a l y s i sw a sd e v e l o p e d ，a n dn u o r e s c e n tp r o b eh a sb e e n w i d e l ya p p l i e di ne n v i r o r l i i l e n t a la n a l ) r t i c a lc h e m i s t r y i nt h i sm e s i s ，n e wf l u o r e s c e n c ep r o b e sa r en o to n l ys i m p l eb u ta l s oe x c e l l e n ti n s e l e c t i v e i t y ；s t d b i l i t ya n ds e n s i t i v i t y ，w h i c hw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h e nt h e a n a l y t i c a lp r o p e r r t i e sa n da p p l i c a t i o n so ft h en u o r e s c e n c ep r o b e sw e r es t u d i e d t h r e e d i f f e r e n tn u o r e s c e n c ep r o b e sp r e p a r e di nt h ee x p e r i m e n tw e r es t u d i e d ( 1 ) n 一( p y r i d y l - 2 - m e t h y l ) 4 - b r o m o - 1 ，8 - n 印h t h a l i m i d e ( p m a n ) w a ss y n t h e s i z e d a n di t sn u o r e s c e n c ep r o p e r t i e sw e r es t u d i e di nt e t r a h y d r o m r a i ls o l u t i o n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo fp m a nd e c r e a s e dr e m a r k a b l yw i t ht h ei n c r e a s i n go fp hf r o m1 0 0 4 0 7 t h ee f - f e c t so fd i 腩r e n tm e t a l i o n so nt h en u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw e r ei n v e s t i g e t e da n d t 1 1 e n u o r e s c e n c e i n t e n s i t y w a s o n l yq u e n c h e db y f e ”t h el i n e a r e q u a t i o n ( y = - 10 31 x + 2 4 2 5 ) f o rf e j 十d e t e m i n a t i o nw a so b t 出n e dw i t he x c e l l e n t r e l a t i v i t ya n dt h el i n e a rr a n g ew a s1 0 1 0 5 2 0 1 0 7 m o l l t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 3 5 10 - 8m o l l t h en u o r e s c e n c ep r o b ew a s 印p l i e dt od e t e m i n a t i o no ff e 3 + i nw a t e r s a m p l e sa n dt h er e c o v e 巧w a s9 6 1 - 1 0 2 8 。 ( 2 )n 一( d i 锄i n o e t h y l ) - 4 - b r o m o 一1 ，8 - n a p h t h a l i m i d e ( d b n ) w a ss y n t h e s i z e d s t r o n g a n ds t a b l er o o mt e m p e r a t u r ep h o s p h o r e s c e n c e ( r t p ) s i g n a l sw e r eo b s e r v e di nt h e t e m a r ys y s t e mo fd b n ，p - c y c l o d e x t r i na n dc y c l o h e x a n e t h em a x i m 啪e x c i t a t i o na n d e m i s s i o nw a v e l e n 豇h sw e r ea t3 4 7a n d5 7 2n m ，r e s p e c t i v e l y t h ec o n c e n t r a t i o no f p c d ，c y c l o h e x a n ew e r ei n v e s t i g e t e d ag o o dl i n e a r i t yb e t w e e nt h er t pi n t e n s i t ya n d t h ec o n c e n t r a t i o no fd b nf r o m2 10 5t o9 l0 5 m o l lw a so b t a i n e dw i t ham i n i m u m d e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f6 7 lo 。7m o l l t h ei 汀po fd b nw a ss e n s i t i v et o p h l o 4 0 t h em e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e m l i n a t i o no fd b n i nw a t e rs 锄p l e sa n d t h er e c o v e r yw a s9 8 9 10 2 3 w i t har e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nl e s st h a n1 4 t h en u o r e s c e n c ea n dp h o s p h o r e s c e n c ep r o p e r t i e so fd b nw e r eo b v i o u s l yd i f f e r e n t o w i n g t ot h em e c h a n i s m so ft h e mw e r ed i 虢r e n t ( 3 ) p h e n y l b o r o n i ca c i dd e r i v a t i v e sa r ek n o w nt of o mr e v e r s i b l ec o m p l e x e sw i t h p o l y o lc o m p o u n d s t h er e a c t i o np r o d u c to f2 - f ；d m a l d e h y d e y l - p h e n y b o r o n i ca c i da n d 2 - 锄i n o n u o r e n ew a sn o tt h ec o m p o u n dw h i c hd e s i g n e da c c o r d i n gt oe x p e r i m e m t h e 硕士学位论文 c o u r s eo ft h i sr e s u l tm i g h tb et h er e a c t i o ns o l v e n tw a sn o ts a t i s f a c t o r y - k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ep r o b e ；n 印h t h a l i m i d e ；r o o mt e m p e r a t u r ep h o s p h o r e s c e n c e ； m e t a li o n s ；p h e n y l b o r o n i ca c i dd e r i v a t i v e s i i i 几种荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 插图索引 图1 1p e t 荧光开关一般原理图1 4 图1 2p e t 机制的前线轨道理论示意图1 4 图1 3i c t 荧光分子探针在金属离子与其电子受体结合作用后荧光光谱移动方向16 图2 1p e r k i n e l m e rl s 5 5 荧光磷光分光光度计2 5 图2 2p m a n 的合成路线2 6 图2 3p m a n 的质谱2 7 图2 4p m a n 的荧光激发和发射光谱2 8 图2 5p h 对p m a n 荧光强度的影响2 9 图2 6 不同金属离子对p m a n 荧光强度的影响3 0 图2 7 不同f e 3 + 浓度对荧光强度的影响3 1 图2 8 荧光强度与f e ”浓度关系的线性回归线3 2 图3 1d b n 的合成路线3 6 图3 2d b n 的质谱3 7 图3 3d b n 的磷光激发和发射光谱3 8 图3 4 静置时间对r t p 强度的影响3 9 图3 5 通氮时间对r t p 强度的影响4 0 图3 6p c d 浓度对r t p 强度的影响4 1 图3 7 不同有机溶剂对r t p 强度的影响4 2 图3 8 环己烷浓度对r t p 强度的影响4 3 图3 9p h 对r t p 强度的影响4 4 图3 1 0 磷光增强机理4 4 图3 1 1r t p 强度与d b n 浓度关系的线性回归线4 5 图3 1 2d b n 的荧光激发和发射光谱4 7 图3 1 3p h 对d b n 荧光强度的影响4 8 图3 1 4 不同金属离子对d b n 荧光强度的影响4 9 图4 1 硼酸衍生物与糖结合前后荧光的变化5 3 图4 2 二硼酸衍生物对二糖响应的荧光传感器5 4 图4 3 当多羟基化合物存在时，苯硼酸在水溶液中的平衡状态5 5 图4 4a 2 的合成路线5 5 图4 5b 2 的合成路线5 6 图4 6b 2 的质谱5 7 v i 硕士学位论文 附表索引 表1 1 取代基对苯荧光的影响3 表1 2 卤素取代的“重原子效应 4 表1 3 不同取代基对芳烃荧光的影响5 表1 4p h 值对荧光素荧光强度的影响6 表2 1 回收率实验3 2 表3 1 水样中d b n 含量的测定4 6 表3 2d b n 的真值表4 6 表3 3d b n 在不同溶剂中的光谱数据5 0 v i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 幺彤牝日期：聊年月玎日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 饬杉小 日期：瑚年严月拥 导师签名：牛彩商日期：2 口。8 年牛月绣日 硕士学位论文 1 1 概述 第1 章绪论 近年来，超分子化学的应用研究已经越来越引起人们广泛的关注和浓厚的兴 趣。超分子化学是利用不同结构的独立单元借分子间的非共价键弱相互作用力连 接起来的复杂有序且具有特定功能的分子集合体的化学l l ，2 j ，现在已经迅速发展成 为覆盖化学、物理、生物以及材料等基础学科的极富挑战性的新领域之一1 3 巧j 。 超分子的结合都是建立在分子识别基础之上的。分子识别就是主体或受体对 客体或底物的选择性结合产生某种特定功能的过程，互补性和预组织是决定分子 识别过程的两个关键因素，底物与受体的互补性包括空间结构及空间电学特性的 互补性。空间结构互补性包括“锁碉关系”和“诱导契合”，电学特性互补包括 氢键形成，静电作用，兀7 【s t a c k i n g 作用，阳离子一兀作用，疏水相互作用等【引。 荧光分子探针是超分子科学中最引人入胜的领域之一【7 ，s j 。它是一种利用探针 化合物的光物理和光化学特征【9 】，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程 和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。用作探针的试剂必须具备以 下条件：( 1 ) 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性结合，且结合得比较牢固； ( 2 ) 探针的荧光必须对环境条件灵敏；( 3 ) 结合的探针不影响被研究的大分子的结构 和特性。其基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围。当探针浓度 极稀时如体系中仅有1 0 母摩尔浓度的含量存在时，就可检测出探针的荧光，这对 某些要求尽量减少外来分子影响的研究体系特别重要。由于探针分子除可用发射 荧光的化合物外也可用发射磷光的化合物，而己知荧光发射的时间为l o 以o 1 0 击s ， 磷光为1 0 一1 0 1 s ，两种不同发光所跨越的时间间隔范围达1 0 个数量级以上，这就 使得荧光探针技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些 体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测【l 州引。 荧光化合物之所以能用来研究一系列不同体系在不同条件下发生的物理或 化学过程以及不同特殊体系的结构及其物化特征，主要是与作为探针的化合物所 具有的光物理特性有关，如已知荧光化合物在不同极性介质中有着不同的光谱特 征，即不同的峰值波长、不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此利用测定荧光 峰值波长位移及量子产率就有可能探知荧光分子所处环境介质的极性及其它有关 性质。又如荧光分子可因体系中引入另一种分子而发生荧光淬灭，光化学家通过 对荧光淬灭机理的研究得知荧光淬灭是因为发生了分子间的能量转移的原因。 具有荧光的分子作为探针化合物涉及很广泛的研究领域，当然在不同的领域 中所依据光物理、化学原理不尽相同。除了溶剂变色效应，还有例如荧光淬灭、 荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 荧光增强、光诱导能量转移、光诱导电子转移、激发态缔合物的生成、激发态缔 合物的解离等光物理化学性质的变化都可以在相关问题的研究中得到应用。由于 在信息的传递过程中，荧光分子受不同的环境刺激如异构体互变、离子配位、氧 化还原、光电控制的电子能量转移、质子化、弱键的形成与断裂等发生荧光变化， 可以实现荧光的开一关动作，更适合于生物微观结构的识别和标记，因而今年来荧 光分子探针在生命科学【15 1 、环境科学【16 1 、材料科学17 1 、信息科学等【1 8 。1 9 1 领域得到 了广泛的应用。 通常评价荧光分子探针的性能主要考虑其灵敏度、选择性、实时性和原位检 测性能等四方面的因素。其中，影响灵敏性的因素有许多：首先，探针分子与被 检测物的结合强度是识别灵敏性的前提：其次，识别信息的荧光信号转换效率同 样影响识别灵敏性，荧光增强的探针一般会比荧光猝灭的探针灵敏性高；另外， 荧光团的发射波长、量子产率、斯托克斯位移、背景荧光干扰等影响探针的检测 灵敏性；灵敏性还与仪器性能有关。而选择性则取决于探针与被检测物特异性的 结合；有时某些被结合的客体性质有关，专一选择性是最好的。实时性主要包括 识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测客体的变 化速度相匹配，则可称之为实时响应探针；原位检测性能主要取决于探针分子与 被检测体系的相溶性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系发出识别信号； 从目前的识别情况看，水溶性比非水溶性探针好；在一定限度内，荧光探针检测 的空间分辨率取决于仪器【2 。 1 2 荧光的影响因素【2 1 】 1 2 1 分子结构与荧光的关系 大量实验事实证明，有机试剂分子的荧光特性如荧光量子产率，紫外吸收光 谱，荧光发射光谱等首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构， 而外界因素，如温度，压力，浓度，介质，酸度等对荧光特性的影响是次要的。 对于试剂分子结构跟荧光特性的关系的规律，人们做了大量的研究，认为试剂的 荧光性能与其共扼体系的大小，共轭大兀键的共平面性及刚性程度，分子母体上 取代基的种类及取代基所在位置和分子的几何结构等因素有关，下面分别给予讨 论。 1 2 1 1 分子共扼体系大小对荧光的影响 有机荧光剂分子都含有发射荧光的基团称为荧光团。荧光团必须含有共轭大 7 c 键，共轭的7 【键达到一定程度才会发射出荧光，如( 一c h = c h 一) n ( n 2 ) 、苯、萘、 对苯二醌，苯并杂环等基团。当这些基团是分子的共扼体系的一部分时，则该化 合物可能产生荧光。芳香类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振动 2 硕士学位论文 能的转换更难，因而荧光强度更大。而对于具有强荧光的有机化合物和荧光试剂， 仅有大的共轭体系还是不够的，分子的共轭体系必须具备共平面性并且还要有一 定程度的刚性。例如芴与联苯，芴相当于由一个一c h 2 一把联苯的两个苯环固定 在一个平面上，不扭曲或转动，其共平面性比联苯大，而且刚性强，荧光量子产 率接近l 。 1 2 1 2 取代基对荧光的影响【2 2 - 2 4 】 取代基的性质( 尤其是发色基团) 对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影 响。芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光产率常随取代基而变，取代基对荧光体 的激发光谱、发射光谱和荧光效率的影响规律和机理，是人们甚为关注的领域， 可惜人们对激发态分子的性质了解甚少，其影响规律多出自实验总结和猜测，尚 不能真正从机理上揭开其影响的秘密。 1 、取代基种类的影响 ( 1 ) 给电子取代基，加强荧光 属于这类取代基的有：。n h 2 ，- n h r ，n r 2 ，一o h ，一o r ，一c n 等，含 这类取代基的荧光有机分子，其激发态的产生常由环外的羟基或氨基上的n 电子激 发转移到环上而产生的。由于它们的n 电子的电子云几乎与芳环上的7 c 轨道平行， 因而实际上它们共享了共轭7 【电子结构，同时扩大了其共轭双键体系。因此，这 类化合物的吸收光谱与发射光谱的波长，都比未被取代的芳族化合物的波长长， 荧光效率也提高了许多( 见表1 1 ) 。这类荧光体的跃迁特性不同于一般的n 一冗l 跃 迁，而接近于7 c 一兀l 跃迁，为区别于一般的n ，兀l 态，通常称它为7 c l 一7 【+ l 跃迁。 表1 1 取代基对苯荧光的影响( 乙醇溶液) t a b l e1 1t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ts u b s t i t u e n to nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f b e n z e n e ( 2 ) 得电子取代基，减弱荧光 吸电子取代基有：c = 0 ，- n 0 2 ，一c o o h ，c o r ，卤素除氟外，它们对荧 光强度的影响与推电子基相反，即减弱荧光。这类取代基也都含有n 电子，然而其 n 电子的电子云并不与芳环上的7 【电子云共平面，不像给电子基团那样与芳环共享 共轭7 【键和扩大其共轭兀键。这类化合物的n 一兀+ l 跃迁属于禁戒跃迁，摩尔吸光系 3 荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 数很小( 约为1 0 2 ) ，最低单线激发态s l 为n ，冗l 型，s l t l 的系间跨越强烈，因 而荧光强度都很弱，而磷光强度相应增强。 2 、取代基在分子上的位置及取代基的数量对荧光的影响 只有一个推电子取代基，处于空间位阻最小或无位阻的位置时，可使荧光增 强，对于不同的发光母体，同类取代基所处位置不同所表达的荧光强弱变化规律 也不相同，文献1 2 5 j 介绍了一系列对称l ，4 一二( 2 苯基1 ，3 ，4 一嗯二唑5 ) 苯衍生物的荧 光性能及其与取代基的关系，可以看出取代基位置对化合物的荧光量子产率影响 是m p o 。另外对荧光的影响还要看取代基的种类，小体积取代基所贡献的共扼 效应小，只是体现出电荷的影响，若一个大的取代基如苯或乙炔基苯，其共轭效 应大，取代后扩大了试剂的共扼体系，使荧光增强效应大于其吸电子使荧光减弱 的效应，结果是取代后的荧光强度不是减弱而是大大增强。 3 、取代基重原子效应对荧光的影响 荧光体取代上重原子之后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取 代，一般指的是卤素( c l 、b r 和i ) 取代，芳烃取代上重原子后荧光强度一般随卤素 原子量增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。这种效应被解释为：由于重 原子的存在，使得荧光体中的电子自旋一轨道偶合作用加强、s l t l 的系间跨越 显著增大，结果导致荧光强度减弱、磷光强度增加。表1 2 说明了这种效应。 表1 2 卤素取代的“重原子效应” t a b l e1 2h e a v ya t o me f f e c to ft h eh a l o g e ns u b s t i t u t e d 4 、饱和烷烃的取代对荧光的影响 此类取代基对荧光体的荧光强度影响不大，可是，由于可动的饱和烃基的引 入，增加了荧光体的振动和转动自由度，因而削弱了荧光激发光谱和发射光谱振 动结构的分辨率，同时激发峰和发射峰略为红移。表1 3 所列的不同取代基对芳烃 荧光影响的一般规律。在推测含有n 电子取代基的影响时，应留意溶剂极性和酸度 的影响。 4 硕士学位论文 表1 3 不同取代基对芳烃荧光的影响 t a b l e1 3t h ee f f e c t so fd i f f e 陀n ts u b s t i t u e mo nt h en u o r e s c e n c ei n t e n s i t ) ，o fa r o m a t i c s 1 2 1 3 环中杂原子对荧光的影响 芳香环中杂原子的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧光，主要看杂 原子化合物的结构。简单的杂环化合物如吡咯、噻吩及呋喃荧光量子产率很小， 几乎为零，它们与苯相并后形成吲哚、硫茚及苯并呋喃的荧光大大增强，呋喃的2 、 5 位置被苯基取代构成2 ，5 二苯基呋喃，其荧光量子产率接近1 ；所以一些含杂原 子的荧光团，如香豆素衍生物、喹啉、吲哚等作为衍生试剂，用于荧光检测某些 化学及生物活性物质。有关杂原子有机化合物的结构及荧光量子产率见文献f 2 6 。 1 2 1 4 分子离子化对荧光的影响 苯胺和苯酚的质子化和离解对它们的荧光性能的影响情况：在p h = 7 1 2 时， 苯胺发出蓝色的荧光，而在p h 1 3 时无荧光。1 萘酚和4 羟基联苯都没有荧光，而它们的一o h 离 解出h 后的阴离子形式有荧光。随着介质酸度的变化，荧光素的荧光强度也变化， 在碱性条件下荧光强度达到最大，此时荧光素以阴离子形式存在，如表1 4 。除上 述影响荧光的因素外，分子的立体结构也有影响，像反式的l ，2 二苯乙烯具有较 强的荧光，顺式则无荧光，所以在研究合成或选用新的荧光试剂时还要考虑立体 结构的影响。 荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 1 2 2 环境因素对荧光的影响 溶液中的环境因素对分子荧光可能产生强烈的影响，了解和利用这一重要因 素，可以提高荧光分析的灵敏度和选择性。以下讨论一些比较重要的环境因素的 影响。 1 2 2 1 溶剂对荧光的影响 同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的 差别。光的吸收和再发射之间存在着一定的能量损失，即发生斯托克斯( s t o k e s ) 位移现象。这种现象是几种动态过程所造成的结果。这些过程包括振动松弛、激 发态荧光体偶极矩的改变所引起的周围溶剂分子中电子的重排、溶剂分子围绕激 发态偶极的重新定向和荧光体与溶剂分子间的特殊作用等。光的吸收过程极其迅 速，约1 0 以5 s ，这一瞬间，核间来不及发生有效的移动，但对于电子的重排却是足 够的。通常芳族化合物的电子激发态所具有偶极矩( “。) 比其基态的偶极矩( ) 来 得大，结果荧光体吸光后产生瞬间偶极，从而使其周围的溶剂分子受到微扰。因 此，激发之后荧光体周围的溶剂笼将重新组成。这个过程称为溶剂松弛，费时约 1 0 1 1 s 。该过程的速率与溶剂的物理化学性质有关。 许多荧光体，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们的荧光光 谱易受溶剂的影响。溶剂的影响可以分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应，前 者指溶剂的折射率和介电常数的影响，后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化 学作用，如氢键的生成和配合作用。一般的溶剂效应是普遍存在的，而特殊的溶 剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊的溶剂效应所引起荧光光谱的移 动值，往往大于一般的溶剂效应所引起的。 许多共轭芳族化合物，激发时发生了7 【7 【跃迁，其荧光光谱受溶剂极性的影 响较大，由于这些分子受激发时，其电子激发态比基态具有更大的极性，随着溶 剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，结果，荧光光谱随溶剂 的极性增大而向长波方向移动【3 0 1 。 特殊的溶剂效应，往往可以通过检查在各种溶剂中的发射光谱来加以鉴别， 如在环己烷中加入小量的、不足以改变母体溶剂性质的乙醇之后，却会使2 苯胺 基萘的荧光光谱发生重要的移动。例如，加入的乙醇量小于3 时，使荧光峰从 3 7 2 i u i l 移到4 0 0 i l i l l ，而乙醇含量从3 增大到1 0 0 时，才使荧光峰移到4 3 0 i u i l 。加 6 硕士学位论文 入微量乙醇时，原先的光谱强度下降了，同时出现了新的红移的光谱，这种新的 光谱组分的出现，是特殊的溶剂效应的反映。 如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，则 荧光峰的波长和强度都会发生很大的改变。例如，在萘胺的乙醇溶液中加入h c l ， 将导致荧光光谱很大的改变。随溶液中h c i 浓度的增加，溶液的荧光光谱越接近 于萘的荧光光谱。这是由于随溶液中h c i 浓度的增大，n h 2 基逐渐被n h 3 c l 基所代替，而一n h 3 c l 基对于禁环的特征频率的影响远远小于- n h 2 基的影响，因 此溶液的荧光光谱逐渐趋近于萘的荧光光谱。 至于荧光强度随溶剂的变化，情况更为复杂，规律发生并不那么明显，有些 作者认为，荧光强度一般随着溶剂极性的增大而增强，但却也有些相反的实验结 果。e l l i o t t 等【3 l 】曾对某些醇类及甲酰胺类溶剂与硼一安息香配合物的荧光强度的关 系进行过试验，认为溶剂对于荧光强度的影响主要决定于溶剂的分子结构，而不 在于溶剂的极性。 1 2 2 2 温度对荧光的影响 温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的降低，荧光物 质溶液的荧光量子产率和荧光强度增大。当溶液中没有猝灭剂存在时，荧光量子 产率的数值与辐射过程和非辐射过程的相对速率有关。辐射过程的速率被认为不 随温度变化而变化，因此荧光量子产率的变化反映了非辐射过程速率的改变。随 着溶液温度的降低，介质的粘度增大，从而使荧光分子与溶剂分子的碰撞猝灭机 会减小。溶液温度上升而使荧光强度下降的一个主要原因是分子的内部能量转化 作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交于或相切于一点。 溶液的荧光强度和温度的关系曲线可用下列方程式表示： ( f o f ) f = k e 。刖k 1 式中e 是激发分子转移至基态曲线时所必须得到的额外热能，亦即激发热。实验 上求得的e 值通常为4 7 k c a l m o l ，约为由分子的红外光谱所求得的振动能量的两 倍。 1 2 2 3p h 值对荧光的影晌 假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的p h 值改变将对荧光强度产生很大 的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳族化合物的荧光光谱，对于溶剂的p h 氢 键能力是非常敏感的。 当分子由基态被激发到较高的电子激发态时，其偶极距也将发生变化。由于 激发态与基态两者的电荷分布情况不同，因而它们的化学性质也会有所差别，溶 液的p h 改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性质。例如，假定分子处于 7 荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 激发态时其酸性或碱性基团的电子密度比处于基态时来得低，那么，该分子在被 激发后其酸性将增强，或其碱性减弱。假如激发时发生电荷转移到酸性基团或碱 性基团，那么，激发态分子与基态分子相比将是更弱的酸或更强的碱。 1 2 2 4 荧光物质的稳定性对荧光的影响 在激发光的直接照射下，有些荧光物质不稳定，当连续地用激发光照射时， 因荧光物质的光分解或聚合，会使荧光强度减弱。对于这些荧光强度不太稳定的 成分应尽快测定，不要经常开启光闸，使光分解现象尽量减少。生成荧光物质的 反应速度和荧光物质的稳定性及其化学结构有关，不同结构之间的差别较大。在 定量测定之前，必须认真考察荧光物质的稳定性。 1 2 2 5 共存物质对荧光的影响 在定量分析中，共存物质的干扰主要有以下几个方面：共存物的荧光猝灭作 用，共存物质产生背景荧光，共存物质与荧光物质发生反应、共存物质吸收激发 光或荧光使荧光强度减弱等。遇到这些情况必须采取相应的措施，消除其干扰。 共存物质的存在，会影响荧光分析的定量测定，实际工作中应认真分析其影响原 因，不可轻易放过。有时往往因此发现新类型的荧光反应。 1 3 荧光团与识别基团 1 3 1 荧光团 荧光基团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达 为荧光信号。目前，尽管关于荧光化分子探针的研究工作比较多，但荧光分子探 针中所用的荧光团仍局限于相当有限的几类，主要为荧光素类衍生物、多环芳烃 类化合物及其他可以发荧光的有机化合物和金属配合物等。寻找灵敏度高、选择 性好、对光稳定、量子产率高、可用于设计合成荧光分子探针的新型荧光团，对 于荧光分子探针的研制是非常有重要要的。目前设计荧光分子探针常用的荧光团 多为芳香族的化合物。 以葸、芘【3 2 】为主要代表的稠环芳烃类一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光 探针领域里它们作为结构最简单的荧光团，经常用于基础理论的研究。荧光探针 领域的权威l f a b b r i z z i 【3 3 ，3 4 】曾就葸做信息系统的荧光探针发表综述。特别重要的 是，蒽、芘能产生激基缔合物荧光这一特征是其它种类荧光团不具备的。到目前 为止，基于激基缔合物原理设计的探针，绝大多数都是以葸和芘作为荧光团的， 但是这类荧光团一般不能人工合成，而且往往具有致癌性，吸收波在紫外区，大 大限制了其作为生物荧光分子探针的应用。 以荧光素和罗丹明为代表的砧吨类荧光化合物【3 5 ，3 6 1 是非常著名的荧光染料， 8 硕士学位论文 经常被用于各类荧光分子探针的合成。其特点是荧光量子效率高，因此在生物医 学用荧光探针领域应用非常广泛。但是，它们的缺点也很明显，其s t o c k s 位移小， 对环境因素如p h 值、温度等很敏感，特别是p h 值，它们不适合在中性和酸性条 件下使用；而且当它们与生物大分子结合后，荧光猝灭非常严重，达6 0 9 0 。尽 管如此由于目前还没有合适的替代品，它们在生物医学上的应用仍然是应用最广 泛的荧光团。 查尔酮和香豆素是典型分子内共轭的电荷转移化合物，是另一类发光物种， 无论它们是处于基态或激发态，它们的分子都表现为极化结构，一端偏正，而另 一端偏负。这类化合物的分子内存在“推电子 和“拉电子”两个部分。它们在 基态时就具有极化结构，而在光照激发后则更进一步强化了这种极化特征。当荧 光分子探针在接受外来物种后，则将因所接受物种与发光的荧光团间位置的不同， 而引起发光化合物荧光发射行为的变化。这是由于外来物种的引入导致发光化合 物分子内电荷的重新分布，以及化合物在不同位置接受外来物种时所引起的i c t 能级的变化。所有这些都将十分灵敏的在其发光强度和能量上反映出来。因此， 分子内共轭的电荷转移化合物被广泛用作荧光分子探针的荧光基团。由于分子内 共轭的电荷转移化合物两端存在着不同的极性基团，因此当将它们用作为荧光团 时，必须考虑如何与其相联结以完成其作为敏感荧光基团目的问题。 菁类荧光染料【3 7 】是近年来倍受青睐的生物大分子标记用荧光染料，特点是波 长可调范围特别大，可以进入近红外区，能有效避开体系的背景荧光，提高探针 的灵敏性。吡咯甲川类荧光团【3 8 ，3 9 】的特点是荧光量子产率高，随取代基变化其荧 光波长可调范围大，不易受环境p h 的影响。1 ，8 萘酰亚胺也是一类重要的荧光化 合物【4 0 4 1 1 。l ，8 一萘酰亚胺是由l ，8 萘酸酐和伯胺缩合后生成的。l ，8 萘酸酐本身是 一个荧光发射团，但荧光微弱，如果萘环上有给电子基团，就形成了荧光团。但 若是吸电子基团，则不显示荧光。这类荧光团的分子结构有共同的特点：具有 较大的共轭体系；分子结构中一端具有强的给电子基团，另一端具有强的吸 电子基团，因此，其分子结构中存在着一大的“吸一供电子共轭体系”。处于这样 体系中的电子很易受到光的照射而发生跃迁，从而产生荧光，特别是4 位有强烈供 电子基( 如氮基) 的衍生物都能够发射很强的荧光，其光化学与光物理特点是光 稳定性好、荧光发射波长适中且s t o c k s 位移大。目前国内外有关l ，8 一萘酞亚胺类化 合物的研究主要集中在亚胺的变化和萘环的修饰上。其它常用的荧光团还有吖啶 【4 2 1 ，丹磺酞胺【4 3 1 ，n b d 【4 4 1 ，香豆素类【4 5 】等【4 6 】。 1 3 2 识别基团 受体设计是超分子化学的最重要环节，识别是荧光分子探针的基本目的，识 别基团是为实现对目标物种的识别而合成的探针机构单元。它决定分子探针与被 9 荧光分子探针的设计、合成及其性能研究 识别客体的结合灵敏性( 强度) 和选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识 别客体具有选择性和灵敏性的前提。所以，选择具有较高的灵敏度和选择性，良 好的稳定性和可逆性，与分析对象发生选择性相互作用的同时伴随明显的光学性 质变化的的受体，是设计好的荧光分子探针的关键。荧光分子探针中常用的识别 基团有冠醚、开链聚醚、多乙烯多胺、多羟甲基胺、环糊精、环芳烃、多肽等。 1 3 2 1 环糊精【4 。卜5 1 】 环糊精是由淀粉经酶促水解而生成的一类低聚吡喃糖环状分子，自然界存在 的环糊精是最早被研究的受体之一，它们和有机分子的结合性能被详细地研究过。 其结构是由葡萄糖通过1 ，4 糖苷键相连而形成的一类筒状化合物，一级醇羟基位 于窄口端，二级醇羟基位于宽口端，内腔疏水而外部亲水，疏水性的空腔使得环 糊精在水溶液中成为一种疏水性有机分子的良好受体，而在羟基上的衍生可以调 节其对客体分子的选择性。环糊精是一种性能优异的分子受体，能够包结各种中 性无机、有机或者生物分子，其中一些是成功的酶模型体系，被广泛地应用于科 学技术的多个领域。 环糊精的分子结构独特，而且易于衍生，所以可以被用来设计目的不同的具 有特殊结构和高度选择性的主体分子。环糊精的研究在荧光分析、药物控制释放、 手性识别、模拟酶、分子开关以及超分子构筑等方面都发挥着巨大的作用。围绕 环糊精的研究诸如设计合成新型环糊精衍生物、构造新奇的和智能化的超分子器 件等正向着更深和更广的方向发展。 1 3 2 2 冠醚【5 2 】 冠醚分子由于具有对介质的两亲性和选择性与金属离子的配位性能，是客一 主识别中最主要的受体。冠醚通过配位作用与各种金属离子形成具有一定稳定性 的配合物；或者通过氢键与客体分子生成配合物，如伯胺的盐、有机中性分子等。 将其和荧光团连接成的超分子体系是研究最多的一类阳离子荧光分子探针。冠醚 化学在这十多年来得到了长足的发展，并已经取得很多令人注目的成就，它不仅 是配位化学、分析化学、有机化学和生物无机化学的重要研究内容，而且与生命 科学、信息科学、材料科学等都有着密切的联系。 一般的氧杂冠醚含氧数大部分为5 1 0 个，可与l i + 、n a + 、n h + 4 、k + 、r b + 、 c s + 、a 矿、a u + 、c a 2 + 、s p 、b a 2 + 、c d 2 + 、h 矿、h g ”、p b 2 + 等形成络合物。冠 醚荧光分子探针的合成，大多是利用苯并冠醚的苯环的反应活性、苯环上取代基 的反应活性，或脂肪族冠醚侧链上功能基的活性，借助经典的有机化学反应将荧 光团引入【5 弘”j 。 氮杂冠醚按环中氮原子的数量可分为单氮杂冠醚、双氮杂冠醚、多氮杂冠醚 l o 硕士学位论文 和全氮杂冠醚( 大环多胺) 。氮杂冠醚由于空腔及杂原子的不同，表现出对不同的 金属离子显著的选择性。不仅因为它的配位选择性，同时氮杂冠醚与荧光团连接 方便，并且识别信息容易通过p e t ，i c t 等方式影响荧光信号。所以这类冠醚在 荧光分子探针中应用最为广泛【5 6 5 引。 人们在考察冠醚的络合性质时，注意到冠醚体系中的氧原子为硬碱，对碱金 属和碱土金属离子有显著的络合作用，同时发现在环系中的部分氧原子被硫原子 所代替，因为硫原子为软碱，因此对重金属或过渡金属离子有特异的络合能力， 形成稳定的络合物，从而引起了人们极大的关注【5 9 ，6 0 1 。 1 3 2 3 杯芳烃 杯 n 】芳烃是由苯酚单元通过亚甲基经酚的2 ，6 位链接而成的一类具有独特空 穴结构的环状低聚物。这类化合物的最大特点是具有由苯环单元组成的、富兀电 子的、大小可调的三维空腔和环形排列的氧原子，既可络合离子又可包结中性分 子。更为重要的是，杯芳烃的上下沿易于选择性修饰，可以以其为“结构平台 合成大量的具有“预组织结构”的主体分子。因此杯芳烃被看作超分子化学中继 环糊精、冠醚之后的更具发展潜力的第三代主体分子【6 。 杯芳烃由于兼具冠醚与环糊精之长，既能配位识别离子型客体，又能包结中 性分子，可用作分子中的识别单元。杯芳烃作为新型的环状受体，其分子识别能 力具有很多独特之处变、具有多重结合能力和易于修饰等，因此在分子器件、分 子探针，如空腔柔韧分子传感器、放射医学、特别是仿酶催化等多方面都具有很 大的应用前景。 1 3 2 4 环状多胺盐类及胍类阴离子受体 识别阴离子的荧光探针在生物学领域中有重大的意义，但是相对于阳离子荧 光探针来讲，其研究的历史较短，近年来才开始受到关注。阴离子识别的受体部 分一般都含有阳离子，或缺电子位点，通过静电作用与阴离子结合；而且由于多 数阴离子容易形成氢键，受体中往往引入氢键的给体基团以提高结合强度和选择 性。 1 3 2