（环境科学与工程专业论文）同步荧光法快速检测苯并a芘的研究.pdf

英文摘要 a b s t r a c t c o m p a r e d w i t hc o n v e n t i o n a lf l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y ，t h es y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r yh a sm a n yf e a t u r e s ，s u c ha ss i m p l i f y i n gt h es p e c t r u m ， p r o m o t i n gt h es e l e c t i v i t y ，r e d u c i n gt h el i g h ts c a t t e r i n gi n t e r f e r e n c e i ti sp a r t i c u l a r l y s u i t a b l ef o rt h ea n a l y s i so fm u l t i c o m p o n e n tm i x t u r e s f u r t h e r m o r e ，i ti sa ne f f e c t i v e a n a l y s i sm e t h o df o rd e t e c t i o nt r a c ep e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ( p o p s ) s u c ha st h e p a h s ，p c b si nt h ee n v i r o n m e n t i nt e r m so fb a pd e t e c t i o nw h i c hf e a t u r e s h i g hc a r c i n o g e n i c i t ya n dh i g h h a r m f u l n e s s ，i ti sg r e a ts i g n i f i c a n tt od e v e l o pa n dr e s e a r c ht h es i m p l ea n dr a p i dt e s t i n g m e t h o d sw i t hah i g hs e n s i t i v i t y i nt h i st h e s i s ，an e wa n dq u i c km e t h o dw a s p r o p o s e d f o r d e t e c t i n gt h e b a pq u a l i t a t i v e l ya n d q u a n t i t a t i v e l yu s i n gc o n s t a n t w a v e l e n g t h s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f16p a h si s s u e db y e p aa n dt h e i rm u t u a l l yi n t e r f e r e n t i a lc o n d i t i o n sh a db e e ni n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e ， o n l yb k fg e n e r a t e dt h ei n t e r f e r e n c ef o rt h eb a pf l u o r e s c e n c es p e c t r u m t h ec l e a r f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fb a pa n db k fw e r eo b t a i n e db yo p t i m i z i n gt h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o wt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o n so fn - h e x a n ea st h es o l v e n t ， e x c i t a t i o n e m i s s i o ns l “= 5 5 ，p m tv o l t a g ew a s6 0 0 v ，a aw a s13 7 n m ，t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fb a pa n db k ff e a t u r em o r es i m p l i c i t y ，s t r o n gf l u o r e s c e n c es i g n a l ，n a r r o w h a l f - p e a kw i d t h ，h i g hr e s o l u t i o no ft h es p e c t r u m ，a n dn oi n t e r f e r e n c ef r o mt h eo t h e r p e a k b e c a u s eo fo v e r l a po ff l u o r e s c e n c es p e c t r ao fb a pa n db k f ，o nt h eb a s i so f l a m b e r t b e e rl a w ，t h eq u a n t i t a t i v er e l a t i v ee q u a t i o nw a se s t a b l i s h e dr e g a r d i n gt h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fb a po rb k fw a s r e s p e c t i v e l yg o tb ys i m u l t a n e o u s l yo n e s t e ps c a n n i n g t h ep r e c i o u s n e s so ft h i sm e t h o d w a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ev a l u eo fr s do fb a pa n db k fa r e3 4 2 a n d3 4 8 ，r e s p e c t i v e l y ；t h e i rl o da r e0 8 2 0 6 n g m la n d0 1 2 5 6 n g m l ，r e s p e c t i v e l y ； t h e i rl i n e a r i t ya r er a n g e df r o m0 0 0 0 6t o0 2 5 0 p p ma n df r o m0 0 0 0 7t o0 0 4 0 p p m ， r e s p e c t i v e l y 英文摘要 i no r d e rt ov e r i f yt h ef e a s i b i l i t yo fm e t h o dp r o p o s e dh e r e ，i t se x p e r i m e n t a lr e s u l t s w e r ec o m p a r e dw i t hh p l c t h ea v e r a g ev a l u ea n dp r e c i o u s n e s so ft h e s et w om e t h o d s h a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c et h r o u g ht - t e s t ，a n dt h e s et w om e t h o d sc o u l dr e p l a c ee a c h o t h e ra n dt h i sm e t h o dw a sf e a s i b l e k e yw o r d s ：s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ；r a p i dd e t e c t i o n ；b a p ；b k f ； h ：p l c 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文“回生夔羞选：迭适捡趔茎差 鲴堇的婴窒：。除论文中已经注 明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确 方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开发表或 未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：蹇墨超 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库迸行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密母请在以上方框内打。 ) 论文作者虢趣导师躲锎蝌 日期：年月日 同步荧光法快速检测苯并 a 芘的研究 第1 章绪论 1 1 多环芳香烃 2 0 世纪中后期，随着煤炭、石油在工业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，其 产生的多环芳烃类物质已成为世界各国共同关注的有机污染物 ，它也是最早被发现和 研究的化学致癌物。由于其毒性、生物蓄积性和半挥发性并能在环境中持久存在，因而 被列入典型的持久性有机污染物( p o p s ) 中【2 4 1 。 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 是指两个以上的苯环连在一起 的化合物。两个以上的苯环连在一起有两种方式：一种是非稠环型的，苯环与苯环之间 各由一个碳原子相连，如联苯、联三苯等。另一个是稠环型的，两个碳原子为两个苯环 所共有，如萘、蒽等。p a h s 一般是指稠环型化合物。这类物质数量多，分布广，对人 类的潜在危害性大，其中多种p a h s 已被鉴定出具有致癌性。目前，已经被发现的致癌 性p a h s 及其衍生物已超过4 0 0 种，占已被发现致癌物总数1 3 以上【5 1 。 1 1 1p a h 。的理化性质 p a h s 大都是无色或淡黄色的结晶，个别具深色，熔点和沸点较高，所以蒸汽压很 小，疏水性强；化学性质稳定，具有荧光性，大多数很难降解。p a h s 的基本单位虽然 是苯环，但化学性质与苯并不完全相同，按其化学性质可分为下列几种：具有稠合多苯 结构的化合物，如三亚苯、二苯并【e ，i 】芘，四苯并 a ，c ，h ，j 芘等具有与苯相似的化学性质， 这是因为7 c 电子在这些p a h s 中的分布和苯类似。呈直线排列的p a h s ，如蒽、丁省、 戊省等。它们的化学性质要活泼的多，反应活性随着环的增多而增强，当环数达到7 个 的庚省，化学性质非常活泼，几乎得不到纯品。呈角状排列的p a h s ，如菲、苯并 a 葸 等，它们的反应活性总的来看比相应的呈直线型的同分异构体小。在发生加成反应时， 往往是在相当于菲的中间苯环的双键部位即菲的9 ，1 0 键( 简称中菲键) 上进行。 1 1 2p a h 。的来源 自然环境中p a j - i s 的含量极少，主要来自森林火灾和火山爆发，其次是某些植物微 生物的微量合成等自然源。而造成环境污染的是人为源，如石油、煤炭等化石燃料中所 第1 章绪论 含有的各种有机物质的不完全燃烧，如表1 1 所示。p a h s 在环境的分布较为广泛，无论 在空气、水体还是土壤中都能发现它们的踪迹【5 1 。在日常生活中，p a h s 可通过大气、 水、食品等途径进入人体，对人类健康造成危害。 表1 1p a h s 的人为来源 t a b 1 1a n t h r o p o g e n i cs o u r c e so fp a h s 介质类型来源 排烟 尾气 石油类 食品类 其他 各种燃烧炉( 窑、锅炉、焚烧炉等) 、 废弃物的户外焚埋( 塑料、橡胶等) 、火山喷发 汽油车、柴油车、液化丙烷汽车、飞机 汽油、煤油、柴油、重油、煤焦油、沥青、杂酚油 熏制品( 烤鱼、烧鸡) 、香烟 石棉、化学肥料 我国是发展中国家，生物质和煤炭等化石燃料是我国的主要能源，而生物质和煤炭 燃烧释放又分别占我国p a h s 释放总量的6 0 和2 0 。每公斤燃料燃烧所排出的苯并 a 芘( b a p ) 量分别约为：煤炭6 7 - 一1 3 7 m g ，木柴6 1 1 2 5 m g ，原油4 0 6 8 m g ，汽油1 2 5 0 4 m g 【6 】。因此，人类的生活环境如大气、土壤和水中都不同程度地含有b a p 等p a h s 。 1 1 3p a h 。的环境行为 p a h s 作为一种疏水性有机污染物，它在环境中的行为受控于一系列物理、化学及 生物过程的联合作用，然后分配到大气、水体、土壤和沉积物等环境介质中【7 1 ，由于其 本身性质稳定，对生物降解、化学分解等作用有较强的抵抗能力，因而难以分解，可以 在环境介质中存留数年时间【8 9 】。 p a h s 与土壤、沉积物、水体中固体悬浮物质等介质之间的吸附、解吸、生物转化 等行为强烈影响其本身在环境中的迁徙和最终归宿，同时制约着环境质量标准的确立和 p a h s 修复的彻底性【1 0 ，1 1 1 。 大气中p a h s 的传播往往与各种类型的气溶胶有关。天然气溶胶的来源包括被风刮 起的灰尘，火山尘埃以及陨石尘等，当然更具有研究意义的是由燃烧和工业排气产生的 同步荧光法快速检测苯并【a 】芘的研究 气溶胶。大气中p a h s 的分布主要通过风流作用，沉积物的降落，化学降解，使其从一 处迁徙到另一处。 p a i l s 的土壤吸附是一种在土壤与土壤中水的分配过程【1 2 】，通常认为是由于分配进 入土壤颗粒有机质中或土壤微孔隙分子中，因此土壤有机质影响p a i l s 的归宿：有机质 含量高的土壤对p a h s 的吸附量和吸附强度均较高，有机质的吸附限制了土壤中p a h s 的降解【13 1 。曹红英等【1 4 】研究天津地区菲的空间分异多介质归趋模型结果也证实，p a h s 在土壤中的分布主要受控于土壤有机质对降解的影响。而且，有机质的质量和p a h s 吸 附的点位对p a i l s 的光降解起决定性作用，吸附在土壤颗粒或有机质表面的可以被光解， 而吸附在深层的不能发生光解【”】。另外，有研究指出，p a h s 在土壤中的吸附行为以及 土壤和土壤水间的分配程度不仅与土壤性质( 例如有机碳含量) 有关，而且受p a h s 物 理性质( 辛醇水吸附系数、分子连接指数、分子长度、水溶解度等) 的影响。p a h s 的 土水分配系数( 吸附系数) 与其分子连接指数、辛醇水分配系数成正比，与p a h s 的 水溶解度成反比，而与其分子长度无明显相关性【l 酬。 p a h s 以三种状态进入水体：即被吸附在悬浮性颗粒上、微溶于水或呈乳化状态。 由于p a h s 水溶性低，辛醇水分配系数高，它极易分配到沉积物中，沉积物成了p a h s 的蓄积库，致使沉积物中p a h s 的浓度高出水中浓度几个数量级。在沉积物中p a h s 的 吸附比在土壤上的吸附强，主要是受含量高的有机质的影响，并且有机质的质量和数量 对于吸附p a h s 的作用比吸附多氯联苯( p c b s ) 更强【1 7 】。沉积物由于有较高含量的有机 质，因此具有复杂的孔隙结构，这些孔隙结构具有快速吸附的外表面和缓慢吸附的内表 面【1 8 】。污染物与沉积物颗粒中有机胶体形成了有机复合物，从而与沉积物颗粒结合更紧 密【1 9 】。海洋植物体内的p a h s 系内源性的，即自身合成的。海洋动物体内的p a h s 不是 其自身正常代谢产生的，而是从体外摄入并富集于体内的。海洋底质的p a h s 有4 种来 源，即流入海洋的污水，船舶的污染，火山爆发的碎片以及微生物的合成。我国对一些 河流、河i e i 、湖泊、海岸带、海湾和港1 2 等沉积物中p a h s 污染水平进行了调查【2 0 - 3 3 】： 不同类型水体中，一般以港口、海湾、河口地区沉积物中p a h s 含量较高，而在河流、 湖泊、海洋沉积物中相对较低，支流污染一般比干流严重。 第1 章绪论 1 1 4p a h 。的毒性和致癌性 p a h s 对人体的危害很早就被发现，科学家在1 9 1 5 年就发现，煤焦油对家兔有致癌 作用。由于p a h s 的水溶性极小，它们在土壤中的降解和生物可利用性受到严重限制， 易于分配到环境中疏水性有机物中，因此在生物体脂类中易于富集浓缩，有较高的生物 富集因子( b c f ) 。此外，p a h s 具有强烈的致突变作用( m u t a g e n e s i s ) 、致癌作用 ( c a r c i n o g e n e s i s ) 和致畸作用( t e r a t o g e n e s i s ) ，简称“三致”作用，对动植物的生长 都有明显的影响。它落在植物叶片上，使其变色、萎缩、卷曲，直至脱落，影响植物的 正常生长和结果；对小白鼠进行动物实验时，当p a h s 质量浓度为o o l m g l 时，小白鼠 条件反射活动有显著变化。因此，p a h s 进入环境后，通过环境蓄积、生物蓄积、生物 转化或化学反应等方式损害人类健康。 关于p a h s 的致癌机理研究很多。上世纪5 0 年代初，法国的p u l l m a n 提出k 区理 论，是致癌物分子轨道理论中最受重视的学说：把p a h s 分子分为k 区及l 区结构，分 子中双键特性最强的区域称为k 区，如菲的9 ，1 0 位置，苯并葸的5 , 6 位置，如图1 1 所 示，许多具有致癌性的p a h s 都具有有活性的k 区；电子相当容易通过的对位被定域的 区域( 即有低的对位能) ，称为l 区，如葸的9 ，1 0 位置，苯并葸的7 ，1 2 位置。这个区 的两个碳原子具有最高的自由价数，是属于非活性的。p a h s 必须具有一个活性高的k 区和一个活性低的l 区才具有致癌作用。p u l l m a n 指出的k 区是活性区，但是对p a h s 代谢产物的研究表明，往往代谢作用不发生在k 区，因此该理论具有一定的缺陷性。 6 7 k 区 l 区 2 l o 9 图1 1p a h s 的致癌理论k 区理论( a 、菲，p h a ：b 、苯并【a 】葸，b a a ) f i g 1 1k r e g i o nt h e o r yf o rc a r c i n o g e n i cm e c h a n i s mo fp a h s ( a 、p h e n a n t h r e n e ，p h a ：b 、b e n z a a n t h r a c e n e ，b a a ) 区 同步荧光法快速检测苯并【a 】芘的研究 美国j e r i n a 等人，通过研究b a p 、b a a 等的最终代谢产物二羟基环氧化物指出， 这些位于湾区角环上的环氧化物是p a h s 分子转化为生物活性中间物的重要一环，湾区 对p a h s 能诱发癌变是很重要的因素，提出了“湾区理论”。如图1 2 所示，“湾区 指图中1 位和1 2 位之间形成的区域( 不相连的两个环间) 。此理论也存在缺陷：不能 解释p a h s 中取代基的影响。我国学者戴乾园总结和发展了k 区理论和湾区理论，通过 计算证明了p a h s 分子显示致癌活性的条件是：分子中存在两个亲电活性区域，提出了 “p a h ；致癌性能的定量分子轨道模型双区理论”，是对致癌机理研究的重大突破。 7 6 3 4 图1 2p a h s 的致癌理论一湾区理论( 苯并 a 】葸，b a a ) f i g 1 2b a y r e g i o nt h e o r yf o rc a r c i n o g e n i cm e c h a n i s mo fp a h s ( b e n z a a n t h r a c e n e ，b a a ) 近几年来的研究也表明，p a h s 并不是直接致癌物质，只有它被动物体内酶系统代 谢，转化为多种代谢产物后，其中某些活性形式的代谢产物与d n a 或r n a 发生共价结 合，产生了不可修复的损害而导致癌症【3 4 】。此外，当p a h s 与- n 0 2 、o h 、- n h 2 等发生 作用时，会生成致癌性更强的p a h s 衍生物，对动物体进一步产生致畸、致突变等危害。 近年来，各国的肺癌发病率和死亡率都显著上升【3 5 1 ，事实表明p a h s 是导致肺癌发 病率上升的重要原因。有调查表明b a p 浓度每1 0 0 m 3 增加0 1 飕时，肺癌死亡率上升 5 t 3 6 】。许多山区居民经常就地拢火取暖，室内烟雾迷漫，终日不散，造成了较高的鼻 咽癌发生率。人们在煎炸食物等烹调过程中会产生大量的p a h s ，从而导致胃癌发病率 提高。例如，冰岛居民喜欢吃烟熏食品，其胃癌标化死亡率达1 2 5 5 1 0 万【3 7 】。所谓标化 死亡率是指在统计学中用来比较两个不同群体之间的死亡率的高低。其基本思想是寻 第1 章绪论 找一个统一的分布作为标准组，然后每个比较组均按该分布标准计算相应的率， 所得到的率是相对于标准组的，故称为标准化率。 目前对2 0 0 0 多种化合物作了致癌试验，发现有致癌作用的有5 0 0 余种，其中2 0 0 余种系芳烃类【3 8 】。因此在重致癌物质中p a h s 是重要的一类。早在1 9 7 9 年美国环保局 ( e p a ) 公布了1 2 9 种优先监控污染物，其中就有1 6 种p a h s ( 如表1 2 ) 。这1 6 种 p a h s 在我国大气中都有不同程度的检出【3 9 4 6 1 。 1 9 9 0 年我国提出的水中优先控制的6 8 种污染物中，p a h s 类化合物有7 种，被列入 “中国环境优先监控污染物黑名单”【4 7 】的分别是：苯并 a 葸、苊、苯并 b 荧蒽、苯并 k 荧蒽、苯并【a 】芘、茚并 1 ，2 ，3 ，c d 芘、二苯并 如h 】蒽，其中苯并 a 芘( b a p ) 的致癌特性 最强【4 8 1 ，因此它被当做环境受p a i l s 污染的指标，所以，针对p a h s 中b a p 的研究已成 为环保、生物、化学、医学等交叉领域的研究热点。 表1 2e p a1 6 种p a h s 结构式及性质【4 9 1 t a b 1 2s t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so f16k i n d so fp a h sb ye p a 同步荧光法快速检测苯并 a 芘的研究 续表1 2e p a1 6 种p a h s 结构式及性质【4 9 】 t a b 1 2s t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so f e p a s16p a h s 注：幸表示已被列入“中国环境优先监控污染物黑名单，【5 0 】。 7 第1 章绪论 1 2p a h 。的分析方法 用于p a h s 分析的方法有气相色谱、高效液相色谱、荧光分光光度法、超临界流体 色谱、薄层色谱、毛细管电泳法等【5 1 】。最早检测p a h s 的方法是荧光分析法，用于检测 煤焦油中的致癌组分，能测定低于纳克级的p a h s 。由于p a i l s 容易吸收太阳光中可见 ( 4 0 0 - - - 7 6 0 n m ) 和紫外( 2 9 0 - 4 0 0 n m ) 区域的光，对紫外辐射引起的光化学反应尤为 敏感，因此紫外吸收光谱法得以快速发展，并与其他技术联用，如液相色谱紫外检测 器联用( l c u v ) 、薄层液相色谱紫外检测器联用( t l c u v ) 等。现在，其他一些联 用技术也被广泛用于p a h s 的分析，如气相色谱质谱联用( g c m s ) 、液相色谱荧光 检测器联用( l c f l d ) 等。另外，一些新的分析技术也在不断地出现，如f e m a n d e 等 利用凝胶色谱( g p c ) 对p a h s 进行分离发现g p c 有高效的分离能力，能检出p a h s 的 衍生物和异构体；z e n o b i 等应用通过电喷雾沉积内标物的二级激光质谱法测定气溶胶颗 粒上的p a h s ，发现该法具有高灵敏度且基本无需进行样品预处理。 1 2 1 气相色谱法 气相色谱( g c ) 对于分离p a h s 是十分有效的，它被用于环境样品中p a h s 分析已 有3 0 多年历史，可以分离出包括p a h s 、烷基p a h s 等1 0 0 种化合物。由于在g c 技术 中，载气的选择很有限，所以固定相的发展和改进使g c 技术不断加以完善。2 0 世纪 7 0 年代中期，l e e 等【5 2 】发现路易斯酸浸出可使色谱柱钝化，大大地提高了柱效率，p a h s 的g c 分析取得了很大的进展。2 0 世纪8 0 年代中期，液晶固定相的出现，使分析p a h s 异构体成为可能。随着技术的发展，传统的固定相得到进一步的改进，g c 分析p a h s 的方法得以发展，其中出现的g c 毛细管柱气相色谱己被成功地用于解决许多复杂问题， 用其分析1 6 种p a h s 的某些化合物 5 3 , s 4 。此外，检测器多样化也是g c 技术的最大优点。 常用于p a h s 气相色谱分析的检测器有：火焰离子化检测器( f i d ) 、质谱检测器( m s ) 、 电子捕获检测器( e c d ) 等，其中g c m s 联用技术在p a h s 检测上应用十分广泛，g c m s 具有样品量小、检测限低、选择性高、操作方便快捷等优点，很好地弥补了g c 技术在 定性分析和定结构分析的不足。 另外，g c 与其他分析技术的联用为p a h s 的分析提供了更有效的手段。如c h i l d e r s 5 5 】 同步荧光法快速检测苯并 a 】芘f 物珊究 等用气相色谱一基体分离一红外光谱( g c m i i r ) 分析测定了空气颗粒物中的p a i l s ， 在测定不同生物活性的同分异构体方面有独到的优点；d c a m f 5 6 】等人将固相微萃取前处 理技术和g c m s 法相结合，分析了土壤中的p a h s 的含量，取得很好的分离效果，提 高了分辨率。虽然g c 在分析领域具有很多优点，但是受方法原理的限制，沸点太高的 物质或热稳定性差的物质都难于应用此方法进行分析，而且前处理十分繁琐。 1 2 2 高效液相色谱法 h p l c 法广泛用于p a i l s 分离和分析，已成为检测p a l - s 最重要、最有效的分析方 法。与g c 比较，h p l c 可用于分析g c 不能分析的高沸点p a h s ，具有更高灵敏度、更 好选择性、高分辨率、分析范围大、柱后馏分便于收集进行光谱鉴定等优点。 该方法的检测器常用紫外、荧光、化学发光、二极管阵列、m s 等。其中，应用最 多的是紫外检测器和荧光检测器。p a h s 具有共轭双键，可以用紫外检测器检测，通过 分析紫外光谱图进行p a h s 定性和定量。由于紫外吸收对温度、流动相组成和流速的变 化不敏感，因此紫外检测器也可用做梯度洗脱，常常用于p a h s 的检测。k e n n e t ho g a n l 5 7 j 等人用p e r k i n e l m e rh c o d s 反相c 1 8 色谱柱，r p h p l c 法分析了1 6 种p a i l s ，并用 乙腈和水作流动相进行等、梯度洗脱，结果获得了对1 6 种p a i l s 的完全分离，效果十分 理想；t a n g 等【5 8 1 用o d s 2 硅胶柱和乙腈。水( 9 0 ：l o ，v ) 作为流动相，流速为1 1 0 11 5 m l m i n ，在波长2 5 4 n m 条件下，h p l c 法能很好的分离测定除芘外的其他e p a 规定 的1 5 种p a h s ；m w i l h e l m 【5 9 】等采用阳离子交换l c f l d ，检测聚合物( 塑料等) 降解 过程中产生的2 2 种致畸、致癌含氮类p a h s ，得到了较为理想的加标回收率和检出限。 由于h p l c 法在分离复杂p a h s 混合物方面的优越性，e p a 已公布了一些相关的方法用 于分析饮用水( e p a 5 5 0 1 ) 、工业和城市废水( e p a 6 1 0 ) 、固体废弃物( e p a 9 3 1 0 ) 和大气( e p a 3 b 1 3 ) 中的p a h s 。但是，采用h p l c 法需要配制流动相而消耗大量的试 剂，而且前处理繁琐耗时。 第1 章绪论 1 2 3 荧光法 光源( 通常用汞灯、氙灯、激光器等) 照射到某些物质时，这些物质除了吸收某些 波长的光之外，还会发射出比原来吸收波长更长的光。激发光停止照射后，这种光线也 随之消失，这种光线被称为荧光【矧。 1 2 。3 1 发展 1 5 7 5 年，西班牙的内科医生和植物学家n m o n a r d e s 第一次记录了荧光现象；1 7 世纪，b o y l e 和n e w t o n 等科学家再次观察到荧光现象；直到1 8 5 2 年s t o k e s 在考察奎宁 和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现 象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而 导入了荧光是光发射的概念。s t o k e s 还对荧光强度与浓度之间的关系进行了研究，描述 了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他是第一个提出应用荧光作 为分析手段的人。1 8 6 7 年，g o p p e l s r o d e r 进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝 桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1 8 8 0 年，l i e b e m a n 提出了最早的关于荧光与化学 结构关系的经验法则。到1 9 世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、p a i l s 等6 0 0 种以上的荧光化合物。 2 0 世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1 9 0 5 年w o o d 发现了共振荧光； 1 9 1 4 年f r a n k 和h e r t z 利用电子冲击发光进行定量研究；1 9 2 2 年f r a n k 和c a d o 发现了 增感荧光；1 9 2 4 年w a w i l l o w 进行了荧光产率的绝对测定；1 9 2 6 年g a v i o l a 进行了荧光 寿命的直接测定等等。近十几年来，荧光分析法引入激光、电子学、光导纤维和纳米材 料等一些新技术，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分 辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定等新方法【6 1 1 。 1 2 3 2 基本原理 室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量( 电能、 热能、化学能或光能等) 后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变回到基态。若 返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象为“发光”。由于吸收光能而导致的发光称 为光致发光，荧光和磷光都是光致发光。 同步荧光法快速检测苯并 a 芘的研究 每个分子具有一系列严格分类的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含一 系列的振动能层和转动能层，如图1 3 所示。图中基态用s o 表示，第一电子激发单重态 和第二电子激发单重态分别用s 1 、s 2 表示，第一电子激发三重态和第二电子激发三重态 分别用t 1 、t 2 表示。 当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层跃迁到激发态s n 的较高振动能层 上去。但是，在液相或压力足够高的气相中分子间碰撞的概率很大，激发态分子可能将 过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从s n 的高振动能层失活到该电 子能级的最低振动能层上，这一过程称为振动弛豫。 当分子处于单重激发态的最低振动能层时，去活化过程的一种形式是以1 0 一1 0 s 左右的短时间内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。根据k a s h a 规则，荧光多 为s l s o 跃迁。 内部转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子能级的振 动能层间有重叠时，则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子激 发态。分子最初无论在哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫和内部转换到达最低激发 单( 或三) 重态的最低振动能层上。 体系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程，它涉及受激电子自旋 状态的改变。如s 1 一t 1 ，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的，但 如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时，则可能通过自旋轨道耦合等作用使s l 态转入t l 态的某一振动能层。 从单重态到三重态的分子体系间跨越跃迁发生，接着发生快速的振动弛豫而到达三 重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在1 0 4 - 1 0 s 左右时间内跃迁回基 态而发射磷光。由此，磷光的寿命比荧光要长得多。 荧光和磷光的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的 跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。 第1 章绪论 t 2 t l t r i p l e ts t a t e 三重态 s i n g l e ts t a t e 单重态 ( 成对电子) v i b r a t i o n a l r e l e x a t i o n 振动弛豫 o n v e r s l o n 内部转换 图1 3 荧光和磷光体系能级图 f i g 1 3e n e r g yl e v e ld i a g r a mo ff l u o r e s c e n c ea n dp h o s p h o r e s c e n c e 任何荧光化合物都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱，它们是荧光定性和定 量分析的基本参数和依据。激发光谱，选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发 光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即 得到荧光化合物的激发光谱；发射光谱即荧光光谱，如果将激发光波长固定在最大激发 波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，得到荧光发射光谱【6 2 】。 1 2 3 3 应用 有机化合物中脂肪族化合物能产生荧光的为数不多，芳香族及具有芳香结构的化合 物因存在共轭体系，在光激发下能发射荧光。对于天然具有荧光发射性质的化合物可以 用直接荧光法测定。还可以采用荧光衍生化方法，提高荧光分析的灵敏度和选择性。无 机化合物中除了铀盐等少数例外，一般不显荧光，但一些反磁性的金属离子与荧光试剂 形成配合物进行荧光分析的元素已有2 0 多种。所采用的荧光试剂，其分子中至少有2 个官能团与金属离子形成刚性的环状结构、具有大7 1 ；键的配合物。在液相色谱方面，可 同步荧光法快速检测苯并 a 】芘的研究 以采用荧光检测器，其灵敏度比通用的紫外检测器要高2 3 个数量级。此外，荧光标记 物在生物化学上有很大的应用价值。如在荧光免疫分析法中的荧光标记物，具有高荧光 强度，其发射的荧光与背景荧光有明显区别，与抗原或抗体的结合不破坏其免疫活性， 标记过程简单、快速等诸多优点【6 2 1 。 1 3 同步荧光法 同步荧光扫描技术由l l o y d 首先提出，它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时 扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长( 或发射波 长) 构成光谱图，称为同步荧光光谱。而在常规的发光分析中，则是固定发射或激发波 长，而扫描另一波长，如此获得的是两种基本类型的光谱，即激发光谱和发射光谱。 同步扫描荧光测定具有简化光谱、窄化谱带、减小光谱的重叠现象、减小散射光的 影响等很多优点。同步荧光光谱显然与激发光谱及发射光谱都有关系，它同时利用了物 质的吸收特性和发射特性，使选择性得到改善，目前，此技术已成为环境污染监测中 p a h s 的定性和定量分析的有效手段。 1 3 1 恒波长同步荧光分析法 在同步扫描过程中，使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔( a 2 = 屯。一 丸= 常数) ，这种方法称为恒波长同步荧光分析法( c o n s t a n t - w a v e l e n g t hs y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ，c w s f s ) 【6 3 1 。激发峰位和发射峰位的波长之间的差是一个表 示分子发光特性的物理常数，这个常数被称为斯托克斯位移( s t o k e ss h i f t ) 。它表示分 子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗。在同步扫描中，兄值的选择十分 重要，这直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度。五值与同步荧光光谱的 关系可以从理论上做预测，但五值的最终选择还是要在实际应用中通过实验确认。在 可能的条件下，选择等于斯托克斯位移的五值是有利的，这时会获得同步荧光信号最 强、半峰宽度最小的单峰同步荧光光谱。 恒波长同步荧光光谱法常用于多组分p a h s 的同时测定。p a h s 性质很相似，尽管 有强的荧光性，但各种化合物的激发和发射光谱往往相互重叠，用经典荧光法难以进行 混合物的直接分析，可用此法进行多组分p a h s 混合物的同时测定。l l o y d 和e v e t t 首 第1 章绪论 次将同步荧光分析法应用于法庭科学领域；h o m d u t ts h a r r l l a 【6 4 等采用此项技术，测定经 超声波萃取后的悬浮颗粒中p a h s 的含量，并分析了b a a 、p y r 、c h r y 、f l a n 、p h e n 和 b g h i p 的季节性分布变化；m s g a r c i af a l c 6 n t 6 5 l 等将发射和激发两者的波长差设定在 2 0 1 1 0 n m 之间，考察了溶剂和溶解氧对b a p 含量测定的影响；李静红等【删采用a 2 = 2 0 r i m 对混合物苯并蒽和9 ，1 0 二甲基蒽进行同步扫描，同步荧光峰互不干扰，克服了两 者激发和发射光谱相互重叠，用经典荧光光谱无法直接分析的缺点；蒋淑艳吲研究了 b a p 的同步荧光测定条件，用校正系数来消除同系物b k f 对b a p 的测定干扰；李耀群 等【6 8 】用同步荧光法同时测定2 ，2 ，二羟基联苯和4 羟基联苯；蔡其洪【6 9 】选择波长差 a 2 = 3 0 n m ，只需一次扫描，就可实现1 ，2 苯并蒽( 1 , 2 b a ) 、苯并 k 芴( b k f ) 和3 , 4 ，8 ，9 二苯并芘( d b p ) 三种p a i l s 的同时鉴别和定量分析，该方法用于自来水、海水和溪水 的分析，回收率分别为8 7 5 1 0 4 o ，8 9 0 1 0 2 o 和8 8 3 1 0 2 5 ，实验效果良好；张 勇等【7 0 , 7 1 1 用同步荧光法检测芘的微生物降解及鱼胆汁中的1 羟基芘。 恒波长同步荧光光谱法除应用于p a h s 的分析外，还常用于药物分析和蛋白质、氨 基酸测定。已见报道的有用同步荧光分析法分析维生素b 1 、b 2 和b 6 ，血清维生素e 及几种中草药中痕量锗，强力霉素和土霉素，并应用于粮食中维生素b 1 、奶粉中维生 素b 1 和b 2 的测定。 1 3 2 恒能量同步荧光分析法 恒能量同步荧光光谱法( c e s l s ) 由i n m a n 和w i n e f o r d n e r 于1 9 8 2 年提出。它在克 服拉曼光干扰、提高分析灵敏度方面均有显著效果，具有其他同步荧光法所没有的独特 优点。恒能量同步荧光法系在激发波长以和发射波长k 的同时扫描过程中保持两者一 恒定的能量差v 关系。该法以荧光体的量子振动跃迁的特征能量为依据来进行同步扫 描，若选择一固定能量差v 等于某一振动能量差，则在同步扫描中，当激发能量和发 射能量刚好匹配一特定吸收发射跃迁条件时，该跃迁处于最佳条件，由此产生的同步 光谱可达最大强度。恒能量同步荧光法的光谱优点可以以定量形式来表达并用来选择扫 描参数，从而为体系的参数优化提供了便利。 该方法已用于多种p a h s 的测定，绝对检测限低至7 x l o 1 3 9 ，线性动态范围达5 个 同步荧光法快速检钡4 苯并【a