（环境科学与工程专业论文）基于PCRDGGE方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析.pdf

硕士学位论文 厨垃圾堆肥高温期真菌、放线菌d g g e 图谱相似性q 值不高，堆体中真菌、放线 菌群落经历了明显的演变过程，群落结构和优势种群具有时序动态性。 关键词：餐厨垃圾；高温堆肥；p c r d g g e ；嗜热微生物；微生物种群结构；系 统发育分析 i a b s t r a c t c o m p o s t i n gi st h en a t u r a lp r o c e s so ft h es t r e n g t h e n i n go fm i c r o b i a ld e g r a d a t i o n a n dr e l i e so nt h ew i d e l yd i s t r i b u t e dn a t u r eo ft h eb a c t e r i a ，f u n g i ，a c t i n o m y c e t e s m i c r o o f g a n i s m sa r ek e yo r g a n i s m si n t h ec o m p o s t i n gs y s t e m s s o ，s t u d y i n gt h e m i c r o b i a lc o m m u n i t i e si nc o m p o s t i n gs y s t e m si so fg r e a ti m p o r r t a n c ef o rt e c h n i q u e i m p r o v e m e n ta n de m c i e n c ye n h a n c e m e n t h o w e v e r ，t h et r a d i t i o n a lt e c l l l l i q u e so f c u l t u r ea n ds e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e sf o re n v i r o 衄e n t a lm i c r o b i o l o g yr e s e a r c h e sc o u l d n o ts a t i s f yn o w a d a ye n v i r o n m e n t a lm i c r o b i o l o g yr e s e a r c h e sw h i c hr e q u i r e 觚a l y s i sa n d i d e n t i f i c a t i o nm o r ed i r e c t l ya n dm o r ee x a c t l y u s i n gm o l e c u l a rt b e c l m o l o g i e s p c r d g g e ，r e s e a r c h e r sc a ns t u d ym i c r o b e sw i t h o u ts e p a r a t i o na n dc u l t u r e a n dm o r e ， r e s e a r c h e r se v e nc a ne x p e c td i r e c ta n de x a c tr e s u l t so fc o n f o r m a t i o no rf u n c t i o no f m i c r o b i a lc o m n l u n i t i e s p c r d g g ea n a l y s i sw a su s e dt os t u d yt h ed y n a m i cs u c c e s s i o no fb a c t e r i a l c o m m u n i t i e sd u r i n gc o m p o s t i n go fk i t c h e nw a s t e c o m p o s t sw e r es 锄p l e dd u r i n g d i f f e r e n tc o m p o s t i n gp e r i o d s ，a n dp h y s i c a lc h e m i c a lp a m m e t e r sw e r em e a s u r e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef i n a lp hw a s7 5a n dt h ec nw a s2 0 0 4 ，t h ep i l ew a s i n s u l a t e d a n dt e m p e r a t u r e sa b o v e5o w e r em a i n t a i n e df o r7 d a y s w h i c hw a sh i g he n o u g ht o k i l lp a 也o g e n s a r e re x t r a c t i o na n dp u r i n c a t i o no ft h eg e n o m i cd n a f r o mt h es a m p l e c o m p o s t ，t h e16 sr r n ag e n e s ( v 3r e g i o n ) w e r e 锄p l i f l e db yu s i n gt h eb a c t e r i a lp r i m e r p a i rg c 3 4 1f 9 0 7 r t h e n ，t h ea m p l i f i e dl6 sr d n af r a g m e n t sw e r es e p a r a t e db y d g g e d i f f e r e md g g eb a n d sa p p e a r e dd u r i n gd i f f e r e n tc o m p o s t i n gp e r i o d s t h eo v a l u e so fp a i r w i s es i m i l a r i t yc o e m c i e n tw e r ea n a l y z e df o rs a m p l e sf r o mc o m p o s t i n g d a y s ( o ，4 ，1o ，1 4 ，18 ) t h e 西v a l u eo fm i c r o - e c 0 1 0 9 i c a ls t r u c t u r ew a st h eh i g h e s t i n t h e4 t hd a y s ，t e m p e r a t u r ea p p e a r st op l a y e dak e yr o l ei nd e t e r m i n i n gt h ec o m p o s i t i o n o fb a c t e r i ap r e s e n ta i tt h er e s p e c t i v es t a g e so ft h ec o m p o s t i n gp r o c e s s u s i n g p c r d g g et e c h n i q u ea n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ， t h et h e r m o p h i l i c b a c t e r i a lc o m m u n i t i e ss t r u c t u r ei nh i g h t e m p e r a t u r ec o m p o s t i n go fk i t c h e nw a s t ew a s s t u d i e d t h ec o m p o s t i n gh i g h t e m p e r a t u r es t a g e ( 5o ) t i m ec o n t i n u e d7d a y s ，i nt h i s p e r i o d ，s a m p l i n gs t a c kb o d ya n dc o l l e c t i n g m i c r o b i a lt o t a ld n ao ft h eo b l j e c t ，1 6 s r d n af r a g m e n t sw e r e 锄p l i f i e du s i n gu n i v e r s a lb a c t e r i ap r i m e r s ( g c 一3 4 1f 9 0 7 r ) t h ed g g ea n a l y s i sw a sc a r r i e do u to n 锄p l i 丘c a t i o no fl6 sr d n a t h ed g g et w i g 硕士学位论文 b e l ts i m i l a r i t yc sv a l u e 孤a l y s i sa n dc u tg l u es u r v e yo r d e r ，u s i n go r d e ra r r a n g ed a t at o c a r r yo u ts a m es o u r c ep r o p e r t ya n a l y s i s ，a n ds y s t e mp h y l o g e n e t i ct r c ew a s e s t a b l i s h e d t h ea n a l y s i sr e s u l t so fd g g ea n ds i m i l a r i t yc 0v a l u es h o w e dt h a tt h ec o m p o s t i n gh i g h t e m p e r a t u r es t a g eh a dm o r er i c hb a c t e r i ad i v e r s i t ya n de x i s t e d0 b v i o u ss u p e r i o r c o m m u n i t ys t r u c t u r ec h a n g e ，t h ea n a l y s i sr e s u l t so fc u ts u r v e yo r d e r 孤dp h y l o g e n e t i c s h o w e dt h a tl a 穆ep a r to fh i g ht e m p e r a t u r es t a g es u p e r i o rc o m m u n i t yo r d e ra r r a n g e 曰口c f ，“sa n dc ，o s f ，f 破“朋p o s s e s s e dn e a r e rb l o o dr e l a t i o n t h es u c c e s s i o np r o f i l eo ft h e m o p h i l i cf - u n g ia n da c t i n o m y c e t e sc o m m u n i t i e s d u r i n gt h eh i g ht e m p e r a t u r es t a g e so fk i t c h e nc o m p o s t i n gw e r es t u d i e db yp c r d g g e m i c r o b i a lt d t a ld n aw a se x t r a c t e df r o mh i 曲t e m p e r a t u r es t a g e s s a m p l e s ， a n dt h e a i m i n gp r o d u c t sw e r es u c c e s s f u l l ya m p l i f i e df r o mt h et o t a ld n ab yf u n g a lp r i m e r p a i r s ( g c n s 7 n s 8 ) a n da c t i n o m y c e t e sp r i m e rp a i r s ( f 2 4 3 g c - r 5l3 ) ，a n dt h e nw e r e u s e df o rd g g ea n dc 奢v a l u ea n a l y s i s t h er e s u l ts h o w e dt h a tb o t ho ft h et h e r m o p h i l i c f u n g ia n da c t i n d m y c e t e so fh i g ht e m p e r a t u r es t a g e sc h a n g e ds i m i l a r l y t h e m o p h i l i c f u n g ii nh i g ht e m p e r a t u r es t a g e so fc o m p o s t i n gc a nb ed i v i d e di n t ot h r e ep h a s e s t h e k i t c h e nc o m p o s t i n g h i g ht e m p e r a t u r es t a g e e x i s t e do b v i o u ss u p e r i o r f u n g i a n d a c t i n o m y c e t e sc o m m u n i t i e ss t r u c t u r ec h a n g e k e yw o r d s ： l 【i t c h e nw a s t e ； h i g ht e m p e r a t u r ec o m p o s t i n g ； p c r d g g e ； t h e r m o p h i i i cm i c r o o r g a n i s m s ； m i c r o b i a lc o m m u i 每； p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s v 硕士学位论文 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 矗。啕串 日期：烨每月 j 占- 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密d 。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 参1 匈私 日期：je 哆年争月) 占日 导师签名：伽哆茂膂日期：硼踔 弘月站日 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 餐厨垃圾特征及其危害 1 1 1 餐厨垃圾的特征 餐厨垃圾主要是指在食物加工和饮食消费过程中产生的易腐烂、易生物降解 的废弃物。一般在食品加工过程中产生的食物残余称为厨余，饮食消费后的食物 残渣称为泔脚。从化学成分上看主要是淀粉、纤维素、蛋白质、脂类和无机盐等。 餐厨垃圾的来源比较集中，主要是城镇菜场垃圾、餐馆饮食业垃圾、家庭厨房垃 圾及各种市场的瓜果皮等城镇垃圾。 ( 1 ) 餐厨垃圾具有较低的发热值 发热值又称发热量，是指1k g 的垃圾完全燃烧后所释放出的热量，人们常用 发热值来衡量或表示垃圾作为燃料的价值和能力。由于餐厨垃圾的水分含量很高， 所以其单位质量的低位热值在2 1 0 0 3 1 0 0k j k g 左右，( 当垃圾的平均低位热值高 于3 3 4 9k j k g 时焚烧过程不用添加任何助燃剂，高于4 1 8 0k j k g 时可进行余热利 用如发电) 故需加入燃油或煤等助燃，使成本增加，同时要注意控制温度，防止灰 尘、二恶英等有害物质产生【l 】。 ( 2 ) 营养元素高，可实施资源化 餐厨垃圾中营养元素含量高，干物料中粗脂肪约为2 9 ，是大豆的1 5 倍；粗 蛋白约占2 0 ，是玉米的2 倍，有实验表明粗脂肪消化率为8 8 2 6 ，粗蛋白消化 率为8 9 6 3 ，其消化率与常规饲料相近，是生产绿色饲料最理想的原料。但是由 于我国垃圾不是分类处理，各种垃圾都混合在一起，导致大量营养元素的浪费。 1 1 2 餐厨垃圾的危害 餐厨垃圾中含有大量易腐物质，而我国垃圾收集容器和运输车辆对其并不适 宜，从而带来在垃圾收集和运输过程中的二次污染。同时，餐厨垃圾因其含水量 大，又是垃圾填埋场的渗滤液的主要来源。由于餐厨垃圾易腐烂，产生臭气污染 大气的同时还使苍蝇蟑螂等害虫横行，传播疾病。加之人们环保意识比较薄弱， 在一些城郊结合区，可以看见餐厨垃圾被随意倒入阴沟、路边，严重影响了市容 环境卫生。再者，我国有把餐厨垃圾作为牲畜饲料的习惯，一些垃圾的细菌、重 金属会通过牲畜的内脏危害人体的健康，更有甚者，有一些不法之徒为了牟求暴 利，降低成本，甚至用“泔水油”提炼色拉油来加工食品，毒害百姓。 基于p c r d l g i g e 方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析 1 2 堆肥 根据餐厨垃圾的以上特征：有机物含量高、含水率高、热值低、易造成疾病 感染，因此高温好氧堆肥化处理是解决餐厨垃圾问题的一个重要途径。 1 2 1 堆肥原理 堆肥化是依靠自然界广泛分布的细菌、真菌、放线菌等微生物，在一定的人 工条件下，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学 过程，其实质是一种发酵过程【2 】，是自然界微生物降解过程的强化，在环境工程中 它被广泛用来处理城市生活垃圾。在堆肥过程中，生活垃圾中的溶解性有机物质 透过徽生物的细胞壁和细胞膜而为微生物所吸收，固体和胶体的有机物质先附着 在微生物体外，由生物所分泌的胞外酶分解为溶解性物质，再渗入细胞。微生物 通过自身的生命活动：氧化、还原、合成等过程，把一部分被吸收的有机物氧化 成简单的无机物，并放出生物生长活动所需要的能量。把另一部分有机物转化为 生物体所必需的营养物质，合成新的细胞物质，于是微生物生长繁殖，产生更多 的生物体。根据处理过程中起作用的微生物对氧气要求的不同，有机废物处理可 分为好氧堆肥法( 高温堆肥法) 和厌氧堆肥法两种。前者是在通气的条件下借好氧微 生物使有机物得到降解，由于好氧堆肥温度一般在4 0 6 0 ，极限温度可达7 0 9 0 ，故亦称为高温堆肥。后者是利用微生物的发酵造肥。由于好氧堆肥相对于 厌氧堆肥有高效性，因此是城市生活垃圾的堆肥化处理过程中采用较多的一种方 式。一般情况下，利用堆肥温度变化来作为( 好氧) 堆肥过程( 阶段) 的评价指标。一 个完整的堆肥过程一般可分为三个阶段。 ( 1 ) 中温阶段 这是指堆肥化过程的初期，堆层基本呈1 5 4 5 的中温，嗜温微生物较为活 跃并利用堆肥中可溶性有机物进行旺盛的生命活动。这些嗜温微生物包括真菌、 细菌和放线菌，主要以糖类和淀粉类为基质。真菌菌丝体能够延伸到堆肥原料的 所有部分，并会出现中温真菌的实体。 ( 2 ) 高温阶段 当堆肥温度升至4 5 以上时即进入高温阶段，在这一阶段，嗜温微生物受到 抑制甚至死亡，取而代之的是嗜热徽生物。堆肥中残留的和新形成的可溶性有机 物质继续被氧化分解，堆肥中复杂的有机物如半纤维素一纤维素和蛋白质也开始 被强烈分解。在高温阶段中，各种嗜热徽生物的最适宜温度也是不相同的，在温 度上升的过程中，嗜热微生物的类群和种群是相互接替的。通常在5 0 左右最活 跃的是嗜热真菌和放线茵：当温度上升到6 0 时，真菌则几乎完全停止活动，仅为 2 硕士学位论文 嗜热性放线菌和细菌的活动；温度升到7 0 以上时，对大多数嗜热性微生物己不 再适应，从而大批进入死亡和休眠状态。现代化堆肥生产的最佳温度一般为5 5 ， 这是因为大多数微生物在4 5 8 0 范围内最活跃，最易分解有机物，其中的病原 微生物大多数可被杀死。 ( 3 ) 降温阶段 在内源呼吸后期，剩下部分为较难分解的有机物和新形成的腐殖质。此时微 生物的活性下降，发热量减少，温度下降，嗜温微生物又占优势，对残余较难分 解的有机物作进一步分解，腐殖质不断增多且稳定化，堆肥进入腐熟阶段，需氧 量大大减少，含水率也降低。 1 2 2 堆肥影响因素 判断堆肥过程进行是否顺利，主要依据堆肥物料中有机物的变化和堆肥工艺 控制参数( 如含水率、温度、通气量) 的变化。因此宏观上通过堆肥的过程控制，可 保证堆肥过程顺利进行。目前控制方法的基本原理为调解堆肥过程中各种参与生 化反应的物质之间的浓度配比，使之更有利于微生物的生长和有机质的代谢过程。 好氧堆肥的降解过程中，除了微生物之外主要的反应因子有堆肥有机物本身、堆 肥介质空隙间的水、间隙中的氧和反应温度等。而堆肥有机物的影响又来自其有 机质的种类和比例、无机盐的性质和酸碱度等。人为控制供氧量、垃圾含水率、 碳氮比( c n ) ，碳磷比( c p ) 以及p h 值等是优化堆肥过程的工程手段。 ( 1 ) 供氧量 氧气是好氧堆肥过程中好氧徽生物生长和降解反应高效进行所必需的物质。 在实际堆肥过程中，由于氧气供应是通过堆肥物料之间的缝隙渗入来实现的，因 此供氧的好坏就取决于物料之间的空隙率，即取决于物料的尺寸、结构强度以及 含水量。其中，物料尺寸和结构强度对空隙率的影响是相互矛盾的。尺寸越小， 物料之间的缝隙就越多，但物料的结构强度也会减小，在受压下，物料易发生倾 塌或压缩，从而导致实际隙缝的减小。因此，为保证充分供氧，就必须选择合适 的物料尺寸。进行人工的翻堆和强制通风也是加强堆肥介质空隙中的空气和外界 空气对流和氧交换的重要方式，同时可以控制堆肥的温度。另外，添加多孔填料 和膨胀剂也是提高堆肥垃圾的蓬松程度和空隙率，直接增大堆肥介质中的氧含量 和加强空气对流的一种有效方法。 ( 2 ) 含水量 堆肥中水分的主要作用其一是溶解有机物，参与微生物的新陈代谢；其二是 蒸发带走热量，起到调解堆肥温度的作用。维持适当的水分标准是均衡堆肥化过 3 基于p c r d l g g e 方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析 程各种对抗力量的方法，水分标准至少应保证生化反应能以合适的速度稳定的进 行，但不能太高，否则会引起空隙减少，氧气的交换率降低而使生物活度下降。 在实际堆肥过程中，含水量最大值取决于物料的成分和空隙容积。堆肥过程中， 物料的最低含水量取决于微生物活性。如物料中含水量太低，堆肥中微生物的活 性就会受到抑制。含水率为4 5 5 0 时，生物活性就开始下降，堆肥温度也随 之下降，温度的下降又导致生物活性加速下降。根据国外研究结果，在进行有机 物与污泥混合堆肥时，仍能保证堆肥过程顺利进行的最低含水量为4 0 。因此， 堆肥正常进行的堆肥含水率下限为4 0 5 0 。当含水率降到2 0 以下时，生物 活性就停止。当原生垃圾含水量不能保证堆肥过程顺利进行时，就应该采取相应 的水分调整和补救措施。对于低于堆肥所需的正常含水率的堆肥原料，一般直接 添加水分或者添加含水量高的调理剂，这种方法操作起来较为容易。而为了克服 供料底物中的高湿度问题，许多方法也都是有效的。第一，可回流堆过肥的干物 料，以调节起始混合物的水分含量；第二，可把干的调理剂如锯末或碾碎的垃圾、 秸秆等加入高湿度的原料中( 如污泥和鸡粪) ，用或不用回流堆肥产物；第三，可把 膨胀剂如木屑和秸秆等加进高湿度的原料中，以维持堆垛结构的完整性和多孔性； 第四，可通过机械设备来提供经常的搅动。第五，在堆肥化之前可使高水分含量 的原料进行风干或加热烘干以减少其含量。 ( 3 ) 温度 对堆肥系统而言，温度是影响微生物活动和堆肥工艺过程的重要因素。堆肥 中微生物分解有机物两释放出热量，这些热量使堆肥温度上升。在很多情况下， 堆肥温度的控制除与堆肥物料成分、含水率、微生物活性、通风量等因素有关外， 还与发酵装置的类型有关。好氧堆肥中，温度的过程控制一般是通过控制供氧量 来实现的，但对于静态条垛式堆肥而言，堆垛内不同部位温度的分布有较大的差 异，因此通常需要采用翻堆达到均衡温度和有机物分解速率的目的。 ( 4 ) 碳氮比( c n ) 堆肥物料碳氮比的变化在堆肥中有特殊意义。众所周知，在微生物的新陈代 谢和细胞物质的合成中需要大量的营养元素和微量元素，如碳、磷、钾、氮、钻、 锰、镁、铜和钙等。其中，以碳、氮、磷、钾四种元素最为重要。碳在微生物的 新陈代谢过程中约有2 3 变成二氧化碳而被消耗掉，1 3 用于细胞质合成，碳被称 为是细菌的能源。氮主要用于细胞原生质的合成。在堆肥过程中，有机物碳氮比 对分解速度有重要影响。如果碳氮比高，容易导致成品堆肥的碳氮比过高，这种 堆肥施入土壤后，将夺取土镶中的氮素，使土壤陷入“氮饥饿”状态，会影响作物 的生长。有些城市生活垃圾中的碳氮比在2 0 ：1 左右，但其有机质含量较低，不及 4 硕士学位论文 2 0 ，氮的含量也较少，因此需要同时添加碳素和氮素，一般调整的方法是加人粪 尿，牲畜粪以及城市污泥等。 1 2 3 堆肥评价指标 腐熟度，就是堆肥腐熟的程度即堆肥中有机质经过矿化、腐殖化过程最后达 到稳定的程度。堆肥的腐熟程度影响堆肥产品的使用，所有未经处理的有机废物、 未腐熟的堆肥都会提高土壤中微生物的活性，在一段时间内造成潜在的氧缺乏和 间接毒性，亦会产生臭味【3 1 。堆肥的腐熟度是堆肥厂的设计、运行及堆肥过程控制 的重要依据【4 1 ，关系到堆肥厂的建造成本及运行效率。关于腐熟度的参数及指标研 究，已有大量工作报道，提出了一些评价方法。李艳等将其划分为表观分析法、 化学分析法、波谱分析法和植物生长分析法等4 大类【5 】。腐熟度的指标与堆肥时间 有非常重要的相关性。所以对降温期和稳定期时间的控制是堆肥能否腐熟的关键。 堆肥原材料的c n 比、性质及结构也会影响堆肥的腐熟度。 1 2 4 堆肥微生物及优势种群 好氧堆肥是将要堆肥的有机物料与填充料按一定的比例混合，在合适的水分、 通气条件下，使微生物繁殖并降解有机质，从而产生高温，杀死其中的病原菌及 杂草种子，使有机物达到稳定化。好氧堆肥堆体温度高，一般在5 0 6 5 ，故亦 称为高温堆肥。由于高温堆肥可以最大限度地杀灭病原菌，同时，对有机质的降 解速度快，目前，大多都采用高温好氧堆肥。在好氧堆肥过程中，微生物将有机 物转化成为c 0 2 、生物量( b i o m a s s ) 、热量和腐殖质。堆肥中使用的有机物原料、 填充剂和调节剂绝大部分来自植物，它们的主要成分是碳水化合物( 即纤维素) 、 蛋白质、脂和木质素。微生物通过新陈代谢活动分解有机底物来维持自身的生命 活动，同时达到分解复杂的有机化合物为可被生物利用的小分子物质的目的。微 生物吸收利用有机物的能力取决于它们产生的可以分解底物的酶的活性，堆肥底 物越复杂，所需要的酶系统就越多而且越综合。不同的微生物分泌的酶种类不同， 一般地，好氧堆肥中有机底物的降解是细菌、放线菌和真菌等多种微生物共同作 用的结果，因此有必要研究它们在堆肥过程中所起的作用。 1 2 4 1 细菌 在好氧堆肥系统中，存在着大量的细菌。细菌凭借大的比表面积，可以快速 将可溶性底物吸收到细胞中。所以在堆肥过程中，细菌在数量上通常要比体积更 大的微生物( 如真菌) 多得多。在不同的堆肥环境中分离的细菌在分类学上具有 多样性，其中包括假单胞菌属( 筇p 掰面肼d 以口s ) 、克雷伯氏菌属( 射p 6 s f p ，肠) 以及 5 基于p c r d g g e 方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析 芽孢杆菌属( 6 口c f z z j ) 的细菌。一些细菌，例如芽孢杆菌，能够生成很厚的孢子 壁以抵抗高温、辐射和化学腐蚀。因此芽孢杆菌属( 6 口c f ， s ) 的一些种，例如枯 草芽孢杆菌( 丑s 掰硒f 括) ，地衣芽孢杆菌( 丑z f c 加以珈，掰话) 和环状芽孢杆菌 ( 曰c f ，c 甜肠，z j ) 成为了堆肥高温阶段中的代表性细菌，或是优势菌。嗜温细菌是堆 肥系统中最主要的微生物，随着堆体温度达到最大值，其种群数量达到最低；在 降温阶段，嗜温细菌的数量又有所回升。b e f f at 【6 】等人曾经在堆肥过程中的高温 期筛选出嗜热菌属，这些细菌能够在6 5 以上，甚至高达8 2 的堆体温度下生长。 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌在堆肥过程中也表现出不同的生长情况。 在以秸秆为底物的堆肥系统中，利用磷脂肪酸作为指示剂的结果表明，革兰氏阳 性细菌的数量随堆温的升高而增加、随其降低而减少；革兰氏阴性细菌和真菌的 数量则在最初堆温达到5 0 左右时达到最大值，在之后的高温阶段则不断减少【7 】。 1 2 4 2 放线菌 放线菌是具有多细胞茵丝的细菌，因此它更像是真菌。放线菌可以分解一些 纤维素，并溶解木质素。同时，它们比真菌能够忍受更高的温度和p h 值。所以， 尽管放线菌降解纤维素和木质素的能力并没有真菌强，但是它们在堆肥过程中的 高温期却是分解木质纤维素的优势菌群。在条件恶劣的情况下，放线菌则以孢子 的形式存活。研究表明，诺卡氏菌( ，l o c 口翮口) 、链霉菌( j 姚p ，o 删c p j ) 、高温放 线菌( t 加，聊。口c f 砌d ，砂c p s ) 和单孢子菌( 聊f c ，d 坍d 刀d 印d ，口) 等都是在堆肥中占优势 的嗜热性放线菌，它们不仅出现在堆肥过程中的高温阶段，同样也在降温阶段和 熟化阶段出现【b 】。 1 2 4 3 真菌 真菌，尤其是白腐真菌可以利用堆肥底物中所有的木质纤维素，由此，真菌 的存在对于堆肥物的腐熟和稳定具有重要的意义。嗜温性真菌地霉菌 ( d f ，f 如甜聊印) 和嗜热性真菌烟曲霉( 口印p 曙f ，甜s m 和f 甜s ) 是堆肥生料中的优 势种群，其他一些真菌，如担子菌( 6 口s f 破d ，妙c d r 砌口) 、子囊菌( 伽c o ，缈c d ，f 刀口) 、 橙色嗜热子囊茵( 砌p ，m d 口s c “s 口甜，口”r 蛔c 甜j ) 也具有较强的分解木质纤维素的能力。 但随着温度的升高，真菌的菌落数开始减少，在6 4 时，所有的嗜热性真菌几乎 全部消失。当温度下降到6 0 以下时，嗜温性真菌和嗜热性真菌又都会重新出现 在堆肥中。研究显示【9 1 ，温度是影响真菌生长的最重要因素之一，绝大部分的真菌 是嗜温性菌，可以在5 3 7 的环境中生存，其最适温度为2 5 3 0 。但是，在堆 肥过程中，由于高温时间持续较短，在增强真菌降解能力的同时却不足以将其致 死，因此高温意味着小群落的嗜热性真菌成为生物降解的重要因素。 6 硕士学位论文 1 3 微生物多样性研究 所谓生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指“生物之间的多样化和变异性及物种生境的 生态复杂性【1 0 】，h a w k s w o r t h 将生物多样性简述为“t h ee x t e n to f b i o l o g i c a lv a r i a t i o n o ne a i r t h 【1 1j ”。因此，生物多样性可以理解为生物物种的多样化及其变异变化的程 度，是物种多样性、遗传( 基因) 多样性和生态多样性三个层次的综合表述。微生物 包括了从原核到真核的不同类型的生物：细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻 类和病毒，是生物多样性的重要组成部分。通过其代谢多样性和遗传适应性，微 生物在许多小生境包括其它生命类型不适宜的极端环境中得以生存并发挥作用。 2 j 微生物作为生态系统中极重要的一员，对动植物的生长，生态系统中的能流和 物质循环【1 3 1 及环境污染物的降解和解毒【1 4 1 等方面起着重要作用。只是由于微生物 一般个体小，看不见，因而不像动植物那样引人注目，一旦濒危较快受到社会重 视。但这不应该成为忽视微生物多样性及其研究的理由。而且生物多样性的研究 决不仅局限于对己知濒危生物的保护。实际上，微生物的消失可以影响许多植物 的生长，甚至导致它们死亡，有直接引起生态系统中能流和物质循环的失调。目 前我国微生物多样性及其保护的调查研究仍较薄弱，尚未形成完整的研究体系和 规划。本节试图简介回顾微生物多样性及其特征，对微生物多样性的研究方法作 一介绍，为这方面的研究提供一些新的思路。 1 3 1 微生物物种的多样性 微生物物种的多样性是微生物多样性最基本的内容。根据有关资料统计，微 生物的种类仅次于昆虫，是生命世界的第二大类群，而已知物种的比例却很小， 细菌，真菌及病毒的已知种占估计种的比例分别为5 、1 0 和4 ，微生物多样 性的研究要落后于其他大生物类群【1 1 1 。由于微生物的某些特殊性及其分类区系的 研究起步较晚，迄今尚未对我国微生物物种消失或濒危状况开展调查研究。微生 物物种及其资源的信息系统正处建立的初步阶段。就全球而言，虽然微生物的种 类知之甚少，但微生物在生命起源与生物进化中的重要地位，在生态系统中的巨 大功能，以及在生产实践和人类进步中的杰出作用，已为世人所公认。对微生物 多样性的进一步研究，显然在科学和实践上都产生深远影响，并大大丰富，挖掘 和保护微生物资源为人类服务。虽然我国微生物多样性研究由于多方面的原因而 存在较大差距，但同时表明我国微生物多样性研究有着巨大潜力和广阔前景。 1 3 2 微生物多样性的某些特征 作为一类特殊的生物类群，微生物的特点决定了其多样性的某些特征是其它 7 基于p c r d l g g e 方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析 任何生物类群无法比拟的。 ( 1 ) 生活环境的多样性 这种多样性可以概括为“无孔不入”、“无处不有”，特别在高寒极地、高山冻原、 悬崖峭壁以及各类土壤中，微生物扮演了生物因子中的主角。而在高温、高盐、 高碱、高压和低温、低p h 等极端环境中，也有微生物的存在。它们的特殊生理功 能与适应能力必然由特殊基因所操纵，有重要的理论研究价值和巨大的开发潜力。 因而尽快查明我国各气候带和极端环境下的微生物区系组成、群落类型、分布特 征有着重要的意义。 ( 2 ) 生长繁殖速度的多样性 有的细菌生长速度很快，在l 小时内可以繁殖3 代，而有的地衣型真菌的生 长速度则非常慢，1 年内其地衣体只增长几毫米。地衣生长虽然缓慢，但对大气污 染极为敏感，成为大气质量的重要指示生物之一，这就是为什么城市中或工业区 或其它受污染环境中很少见到地衣( 特别是大型地衣) 的基本原因。因此，开展有关 地区地衣区系、群落生态调查对环境保护有一定的积极意义。 ( 3 ) 营养和代谢类型的多样性 不同的微生物类群有不同的营养方式和代谢类型。有的可利用光能，有的只 利用化学能；有的以无机物为碳源；有的以有机物为碳源；有的只能在有氧条件 下生活，有的则只能在无氧条件下生存，有的在有氧和无氧条件下均能生息繁衍。 因而有光能自养菌，化能自养菌，光能异氧菌和化能异氧菌之分，以及有好氧菌， 厌氧菌与兼性菌之别。这就为研究微生物在不同环境中的生态功能以及为开发利 用微生物资源提供了更多的机会和途径。 ( 4 ) 生活方式的多样性 微生物可以自由生活于环境之中，但不少微生物在长期进化过程中与其它生 物形成了各种生活方式和不同的关系，如互生、共生、寄生、拮抗等。豆科植物“根 瘤”中的根瘤菌、某些非豆科植物“根瘤”中的放线菌以及某些植物“叶瘤”中的细菌 的固氮作用在生态系统氮素循环和生产实践上的巨大作用已为人们熟知。而土壤 真菌与植物根形成的共生体一“菌根”则是植物共生中一种更为普遍的自然想象。 在关注坏境恶化引起动、植物物种消失或濒危的宏观现象的时候，切不可忽视植 物的伙伴一菌根真菌的命运。菌根在自然植被，人工造林等方面有着重要意义， 是生物多样性及其保护研究中一个不可缺少的内容。 ( 5 ) 基因多样性 一个物种就是一个独特的基因库。因此微生物物种多样性必然伴随着微生物 基因的多样性。比如有的真菌，1 个种的基因可达1 万个。因此，人们把每一个物 8 硕士学位论文 种及其基因都看成一种资源，并建立种子库，基因库等。如果只研究现在已知有 用的物种，是十分短视的。现在知道的有用物种在此之前也被认为是无用的，甚 至还不知道其名称。只有广泛研究生物物种，才有可能发现新的物种和更多的有 用物种及其基因。我国气候多样，地形复杂，为研究物种与遗传多样性提供了很 好的客观条件，而许多微生物又是研究分子遗传学的极好材料和对象，如果不加 快微生物多样性的研究，势必许许多多微生物及其基因在我们认识或知道它们之 前就已消失、灭绝。 1 3 3 微生物多样性研究方法 由于堆肥样是将堆肥物质与土壤样混合堆置而成的，所以堆肥样中微生物种 群多样性的研究可以借鉴土壤中微生物多样性的研究【l5 1 。微生物多样性的实验研 究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上包括以下几类： ( 1 ) 微生物平板培养方法 微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。这种方法主要使用不同营养成 分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落 形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。平板稀释法是进行土壤微生物分 离培养的常用方法，一般分为稀释一接种一培养一计数等几个步骤，该方法简便 易行，一直以来，被广泛应用。然而，这种方法也存在不少缺陷，主要表现在固 体培养基的选择和实验室培养条件等方面的限制上。首先，由于微生物对培养基 具有选择性，因此，有限的几种培养基不可能将土壤中所有的微生物培养出来。 利用平板培养法测定的土壤微生物类群数量只能占到土壤中实际存在的微生物总 数的l 1 0 。另一方面，这种平板培养方法通常只能得到微生物类群的数量信息， 若要得到种类信息，则必须进一步地分离、纯化和鉴定。因此，微生物培养方法 存在许多不足，在土壤微生物群落多样性研究中，需要结合分子生物学技术来更 详细的了解土壤微生物状况。但也不能忽视这种传统微生物培养方法的作用，因 为许多微生物资源的开发与利用还是要依赖传统的平板培养技术。 ( 2 ) b i o l o g 微平板方法 b i o l o g 微平板法是测定土壤微生物对9 5 种不同c 源的利用能力及其代谢差 异，进而用以表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的一种方法。但是， 对于微生物的分类鉴定，仅靠b i o l o g 系统的方法是远远不够的，需结合其他方法 如微生物生理生化和表型分析等进行。b l o l o g 微平板法描述的只是土壤中快速生 长型或富营养微生物类群的活性，而不能反映土壤中生长缓慢的微生物信息，包 括b l o l o g 方法在内的微生物培养方法测定的土壤微生物种类数量不到1 6 s r r n a 方 9 基于p c r - d o g e 方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析 法测定的微生物数量的1 ，因而大大低估了土壤中微生物的实际情况，故许多学 者建议在使用b i o l o g 微平板法时，需要结合其他方法，以获得更全面的结果。 ( 3 ) p l f a 谱图分析 近些年来，磷脂脂肪酸分析方法逐渐被应用于土壤微生物多样性的研究中来， 并作为土壤微生物种群变化的监测指标。目前，p l f a 谱图分析已成为土壤微生物 多样性的较为常用研究方法之一。p l f a 分析方法不需要对土壤微生物进行培养， 可以直接提取原位土壤微生物群落的脂肪酸。但p l f a 分析结果的准确性与微生 物体内的磷脂脂肪酸是否提取完全、稳定以及实验过程是否造成污染等有很大关 系。在该方法中，细菌和真菌可根据其磷脂脂肪酸的组成来鉴别，但不同属甚至 不同科的微生物p l f a 有可能重叠，而且该方法只能鉴定到微生物属，不能鉴定 到种，同时，该方法强烈地依赖于标记脂肪酸，标记脂肪酸变化可导致错误的群 落变化估计。另外，该方法一个明显的缺陷是实验条件要求高，耗时长，成本高， 因而在实际研究工作中常受到一定的限制。 ( 4 ) 生物标记物法 目前用生物标志物来定量描述土壤微生物群落结构是较为常用的方法之一。 土壤微生物学家利用生物标记物方法并结合微生物鉴定系统( m i c r o b i a l i d ) 来对 微生物群落进行分析。生物标记物法的优点是既不需要把微生物的细胞从环境样 品中分离，又能克服由于对微生物培养而导致不同微生物种群可能发生的选择性 生长所造成的麻烦。但应用脂肪酸分析方法时首先应尽可能地提取脂肪酸，否则 可能失去一些重要的信息。同时在选择提取方法时必须注意避免非目标生物的脂 肪酸的释放，避免偏重于那些普遍存在的脂肪酸。为了更加准确的鉴定微生物的 种类，进行主成分分析( p c a ) 是非常必要的。另外值得注意的是因为不同属甚 至不同科的微生物的脂肪酸可能重叠，所以以磷脂类组成来鉴定区分关系较远的 微生物有一定的困难，所以在将来还需寻求更加可靠的分析方法。 ( 5 ) 分子生物学技术 分子生物学是以从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以 核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研 究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前 沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人 类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主 要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利 用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗 传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的 l o 硕士学位论文 蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核 苷酸或氨基