（材料学专业论文）双荧光载药脂质体与细胞相互作用的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 由于本身众多的优良性质，脂质体被广泛应用于药物载体领域，对其作为药 物载体的性能的研究以及其与细胞相互作用的研究也随之成为热门的科研领域。 本论文利用荧光药物代替荧光染料对不同类型的脂质体载药体系与细胞之间的相 互作用进行系统的研究。首先制备磷脂上连接f i t c 及内部包埋荧光药物的具有 双荧光性质的负电荷型、正电荷型及p e g 修饰型的脂质体，然后再将这些脂质体 与细胞共培育不同时间后利用激光共聚焦显微成像技术对细胞进行成像，通过考 察细胞内两种荧光的分布和强度来研究脂质体类型的不同对脂质体载药体系与细 胞相互作用的影响。具体开展了以下三个方面的工作： ( 1 ) 双荧光载药脂质体的制备及表征 以二棕榈酰磷脂酰乙醇胺( d p p e ) 、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺一异硫氰酸荧光素 ( d p p e f i t c ) 、胆固醇以及荧光药物阿霉素、原卟啉为原料，采用薄膜分散法制 备了负电荷型阿霉素及原卟啉脂质体，另外在负电荷型脂质体原料的基础上添加 十八胺或聚乙二醇一二棕榈酰磷脂酰乙醇胺( p e g d p p e ) 分别制备成正电荷型及 p e g 修饰型阿霉素及原卟啉双荧光脂质体。对制备的各种类型的双荧光载药脂质 体的表面电势、大小和形貌进行了表征，得到符合下一步实验需要的各种类型 的脂质体。 ( 2 ) 双荧光阿霉素脂质体与细胞相互作用的研究 利用激光共聚焦观测和分析双荧光阿霉素脂质体与子宫颈癌h e l a 细胞共培 育不同的时间后连接在磷脂上的f i t c 荧光及包埋在脂质体内的药物阿霉素的荧 光的分布区域来研究阿霉素脂质体载药体系与细胞的相互作用。首先对阿霉素脂 质体与h e l a 细胞的共培育条件进行了优化，然后考察了不同类型的阿霉素脂质体 与h e l a 细胞的相互作用。结果发现：无血清的共培育条件下更适宜开展三种类型 的阿霉素脂质体与h e l a 细胞的相互作用研究；在无血清的共培育条件下，三种类 型的阿霉素脂质体中p e g 修饰型最能促进阿霉素进入细胞和聚集至其目标位置一 细胞核。 ( 3 ) 双荧光原卟啉脂质体与细胞相互作用的研究 在与上一部分工作相同的条件下，采用同样的方法对不同类型原卟啉双荧光 脂质体与细胞的相互作用进行了考察和分析。得到的结论如下：三种类型的原卟 啉脂质体中正电荷型和p e g 修饰型比负电荷型的能更有效地促进原卟啉进入细胞 和聚集至其目标位置一细胞膜及细胞质区域。但是，与阿霉素脂质体相比，原卟啉 脂质体对原卟啉进入细胞及目标位置的促进作用要弱于相应类型的阿霉素脂质体 n 双荧光载药脂质体的细胞内在化过程的研究 对阿霉素进入细胞及目标位置的促进作用。 关键词：脂质体；阿霉素；原卟啉；激光共聚焦；细胞 i l l 硕士学位论文 a b s t r a c t l i p o s o m e sh a v ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o n s i nd r u gd e l i v e r yb e c a u s eo ft h e i rv a r i o u s a d v a n t a g e o u sp r o p e r t i e s c o n s e q u e n t l y , t h e r eh a sb e e ni n c r e a s i n ga t t e n t i o no nt h er e s e a r c ho f l i p o s o m e - c e l li n t e r a c t i o na n di t sp e r f o r m a n c ea sad r u gc a r r i e r t h ew o r ko ft h i st h e s i si s i n v e s t i g a t i o no fi n t e r a c t i o nb e t w e e nc e l l sa n dv a r i o u st y p e so fd r u g - l o a d e dl i p o s o m e s f i r s t ， t h r e et y p e so fd u a l f l u o r e s c e n tl i p o s o m e s ，i n c l u d i n ga n i o n i cl i p o s o m e s ，c a t i o n i cl i p o s o m e s a n dp e g l i p o s o m e sw e r ep r e p a r e d a l ll i p o s o m e sw e r el a b e l e dw i t hf i t c o nt h es u f a c ea n d f l u o r e s c e n td r u g sw e r ee n c a p s u l a t e dw i t h i nl i p o s o m e s t h e n ，c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h l i p o s o m e sa td i f f e r e n tt i m e l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p yw a su s e dt os t u d yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h el i p o s o m e sa n dc e l l s t h ew o r ko ft h i st h e s i si sa sf o l l o w s ： ( 1 ) p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fd u a l f l u o r e s c e n td r u g - l o a d e dl i p o s o m e s a n i o n i cd o x o r u b i c i na n dp r o t o p o r p h y r i nl i p o s o m e su s e di nt h et h e s i sw e r ep r e p a r e db y f i l md i s p e r s i o nm e t h o du s i n gu n l a b e l e dd i p a l m i t o y lp h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( d p p e ) ，f i t c l a b e l e dd p p e ，c h o l e s t e r o l ，a n dt h ef l u o r e s c e n td r u gd o x o r u b i c i n ，p r o t o p o r p h y r i n c a t i o n i c l i p o s o m e sa n dp e gl i p o s o m e sw e r es y n t h e s i z e db ya d d i n go c t a d e c y l a m i n eo rp o l y e t h y l e n e g l y c o l - d i p a l m i t o y lp h o s p h a t i d r l e t h a n o l a m i n e ( p e g d p p e ) b a s e do na n i o n i cl i p o s o m e s z e t a - p o t e n t i a l s ，s h a p ea n ds i z eo ft h ea sp r e p a r e dl i p o s o m e sw e r ec h a r a c t e r i z e d a p p r o p r i a t e l i p o s o m e sn e e d e di nt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t sw e r eo b t a i n e d ( 2 ) i n v e s t i g a t i o no f d u a l f l u o r e s c e n c ed o x o r u b i c i nl i p o s o m e - c e l li n t e r a c t i o n l a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gi m a g ew a sc h a r a c t e r i s t i co fh e l ac e l l si n c u b a t e dw i t hf i t c l a b e l e dd o x - l i p o s o m e s t h e d i f f e r e n tf l u o r e s c e n c ed i s t r i b u t i o nr e s u l t so ff i t ca n df i t c l a b e l e dd o x l i p o s o m e sw e r ei n v e s t i g a t e dt os t u d yt h em e c h a n i s m si n v o l v e di nl i p o s o m e - c e l l i n t e r a c t i o n f i r s t ，t h ec e l li n c u b a t i o nc o n d i t i o nw a do p t i m i z e da n di tw a sf o u n dt h a tt h e f l u o r e s c e n c ed i s t r i b u t i o ni nh e l ac e l l sc o u l db eo b s e r v e dm o r ec l e a r l yi nt h ea b s e n c eo fs e r u m a m o n g t h r e et y p e so fd u a l - f l u o r e s c e n c ed o x o r u b i c i nl i p o s o m e ，p e gl i p o s o m ew a ss h o w nt o h a v et h eh i g h e s te f f i c i e n c yi nd e l i v e r i n gd o x o r u b i c i nt oi t et a r g e ts i t e n u c l e o l u s ( 3 ) d u a l f l u o r e s c e n c ep r o t o p o r p h y r i nl i p o s o m e - c e l li n t e r a c t i o n t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h r e et y p e so fd u a l f l u o r e s c e n c ep r o t o p o r p h y r i nl i p o s o m e sa n d h e l ac e l l sw e r es t u d i e du n d e rt h es a m ec o n d i t i o n sa sd o x o r u b i c i nl i p o s o m e su s i n gt h es a m e m e t h o d s i nt h i sc a s e ，c a t i o n i ca n dp e gl i p o s o m e sw e r em o r ee f f i c i e n t l yi nd e l i v e r i n g p r o t o p o r p h y r i nt o i t s t a r g e ta r e a - c e l lm e m b r a n ea n dc y t o p l a s mt h a na n i o n i cl i p o s o m e s c o m p a r e dw i t ha b o v ed o x o r u b i c i nl i p o s o m e s ，t h ec o r r e s p o n d i n gt y p e so fp r o t o p o r p h y r i n i v 双荧光载药脂质体的细胞内在化过程的研究 l i p o s o m e sw e r el e s se f f i c i e n ti nd e l i v e r i n gd r u g st oi t st a r g e ts i t s k e yw o r d s ：l i p o s o m e ；d o x o m b i c i n ；p r o t o p o r p h y r i n ；c o n f o c a l ；c e l l v 硕士学位论文 v i 硕i ：学位论文 第1 章绪论 纳米技术是2 0 世纪9 0 年代迅速发展起来的高新技术，被认为是2 1 世纪科技 发展的四大支柱领域之一，它贯穿了从以原子、分子为主体的微观、微观与宏观 的过渡区( 纳米世界) 以及人类活动的宏观世界，现已成为各国投入最多，发展 最快的科学研究和技术开发领域之一【l 。5 】。同时，人们也开始逐步将纳米技术与生 物技术相结合，应用到药物传递系统的改进，使药物的应用能够越来越满足临床 的需要【6 j 。纳米药物载体是该技术应用到药物传递系统最主要和成功的范例之一 j 。相对于传统传递系统，运用了纳米药物载体的药物传递系统拥有众多的优势， 如更好的药物的控制释放；纳米尺寸效应( 被动靶向、e p r 效应等) ；更容易进 行功能化修饰以提高药物传递系统性能等。这些优势使纳米药物载体成为药物研 究特别是肿瘤药物研究的最为热门的领域。 在研究过程中人们发现，载体材料是影响药物传递系统性能的关键要素【8 ，9 】， 根据载体材料来源及结构的不同可将其大致分为人工合成的高分子聚合物、天然 的高分子聚合物与脂质体三大类。人工合成的高分子聚合物有脂肪族聚酯、聚氨 基酸和聚膦腈高聚物等，它们不仅具有良好的生物相容性，而且可以生物降解； 在缓释过程中能有效地控制药物按零级动力学释放，但也存在一些缺点，如冲击 强度、渗透性和亲水性都有待加强；合成周期较长，有机溶剂残留较严重：载体 材料易发生水解和聚集；水解产物对人体可能会产生一定的毒副作用 1 0 - 1 3 】等。天 然的高分子聚合物有淀粉、蛋白质、几丁质等【1 4 17 1 ，由于不需合成，减少了有机 溶剂的残留，但目前在应用中仍然存在一些问题，如药物包封率及载药量低；药 物稳定性不够；药物按非零级动力学释放；缓释系统可能引起机体的抗药性等。 脂质体是由磷脂双层膜构成的中空小球【l 引，由于其组成和结构的特点使它成为一 类应用广泛的优良的纳米药物载体，下面我们将重点介绍它的研究进展。 1 1 脂质体简介 1 9 6 5 年，b a n g h a m 1 9 1 发现，当磷脂分散在水中时形成多层囊泡，而且每一层 均为磷脂双分子层，各层之间被水隔开，这种由磷脂双分子层构成，内部为水相 的闭合囊泡被称为脂质体( l i p o s o m e ) 。磷脂之所以能形成脂质体，是由于它本 身所具有的亲水的“头部”和疏水的“尾部”这种特殊的两亲性结构。1 9 7 4 年 r a h m a n 2 0 j 等开始将脂质体作为药物载体加以研究，揭开了药物载体研究新的一 页。脂质体作为药物载体具备许多优势：原料来源广；制备简便；对机体无毒副 作用；无免疫原性；易实现靶向性；既能包埋亲水性物质又能包埋疏水性物质； 双荧光载药脂质体细胞相互作用的研究 使药物具有药理活性的专一性，选择性地杀伤癌细胞或抑制癌细胞的繁殖；增加 药物对淋巴系统的指向性和靶细胞的滞留性，使药物在靶组织中维持较高的浓度， 以提高抗癌药物制剂的生物利用度；使药物对癌细胞有较好的亲和力，与癌组织 接触时，能较长时间的粘附于癌细胞周围，使药物充分向癌细胞内渗透，以提高 抗癌药物疗效。下面我们将分别介绍脂质体的分类、制备以及功能化修饰。 1 1 1 脂质体的分类 脂质体有多种分类方法，通常根据粒径大小、电荷性质、脂膜结构性能等来 对它进行分类。 制备方法、原料等条件的不同会对脂质体粒径造成比较大的影响，而粒径的 大小对脂质体无论是性质还是应用的影响都很大，所以根据粒径大小分类是一类 常见的分类方法。按照这种方法脂质体可以分为多层脂质体( m l v s ) 、大单层 脂质体( l u v s ) 和小单层脂质体( s u v s ) 。多层脂质体是双层脂质膜与水溶液 交替形成葱皮样结构的囊泡，一般来说它含有5 层或更多层的脂质双层膜，粒径 分布在4 0 0 5 0 0 0 n m ，它最主要的缺点是包封容量相对低。大单层脂质体和小单 层脂质体都只含有一层脂质双层膜，区别在于大单层脂质体一般分布在 8 0 - 2 0 0 n m ，而小单层脂质体粒径小于5 0 n m 。单层脂质体与多层脂质体的结构示 意图见图1 1 。 图1 1 单层脂质体与多层脂质体的结构示意刚引1 ( 左为单层脂质体，右为多层脂质体，其中小球代表磷脂的亲水头部：与小球相连的条形代表 磷脂的疏水尾部) 按表面电荷性质脂质体可分为中性脂质体、负电荷脂质体和j 下电荷脂质体。 脂质体所带电荷主要是由制备脂质体的原料以及修饰物所带电荷决定的。用于制 备脂质体的磷脂中，不带电荷的有磷脂酰胆碱( p c ) 、磷脂酰乙醇胺( p e ) 等，带负 硕l 二学位论文 电荷的有磷脂酰甘油( p g ) 、磷脂酰肌醇( p i ) 、磷脂酰丝氨酸( p s ) 、磷脂酸 ( p a ) 等，带正电荷的则包括硬脂酰胺( s a ) 、胆固醇的衍生物d c c h o l 、双十 二烷基二甲基溴化铵( d d a b ) 等。由于脂质体所带电荷不同不仅会对它与细胞 的相互作用产生影响，而且使脂质体适宜包埋的药物的性质也不同，因此脂质体 表面电荷的不同会直接影响它的应用，如用于药物载体的脂质体多为带负电荷或 不带电的，而正电荷脂质体多用于基因载体，这是因为正电荷脂质体可以通过电 荷间的吸引与负电荷的d n a 或r n a 紧密结合。早在1 9 8 7 年f e i g n e r 2 2 1 等就首先 利用正电荷脂质体将d n a 传输到细胞内，目前这种方法得到了很好的继承和发 扬，正电荷的脂质体成为一种重要的基因载体之一，而负电荷及中性脂质体则广 泛用于其它抗肿瘤药物的载体。 由于某些磷脂或其它物质的特殊性质，将它们制成或掺入后会使脂质体脂膜 结构产生一些特殊的性能，按照脂质体所具有的不同脂膜结构性能我们可以将它 们分为普通脂质体、长循环脂质体和智能脂质体。普通脂质体没有掺入具有特殊 性质的磷脂或其它物质，所以只具有脂质体的一般性质。在脂质体表面修饰聚乙 二醇( p e g ) 使其在血液里的循环时问增长从而得到长循环脂质体。智能脂质体是 指经掺入不同的具有特殊性质的磷脂或其它物质后使脂质体对药物的释放能随外 界p h 值、热、磁等条件的变化而变化，从而实现对药物的定时、定点、定量释 放的一类脂质体。 1 1 2 载药脂质体的制备方法 制备载药脂质体的方法有很多，主要有以下几种：薄膜分散法、超声分散法、 复乳法、逆向蒸发法、p h 梯度法、注入法、乳化分散法、熔融法、表面活性剂处 理法、离心法、冷冻干燥法、超临界法、硫酸铵梯度法、钙融合法等。下面主要 介绍几种常用的方法。 1 1 2 1 薄膜分散法 此法最初由b a n g h a m t l 9 】等报道，是最原始但又是迄今为止最基本和应用最广 泛的脂质体的制备方法。将磷脂和胆固醇等类脂及脂溶性药物溶解于有机溶剂， 然后将此溶液置于一大的圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形 成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液，充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落， 即可得到脂质体。这种方法对脂溶性药物可获得较高的包封率，但是脂质体粒径 在0 2 5p m 之间，可通过超声波仪处理或者通过挤压使脂质体通过固定粒径 的聚碳酸酯膜，在一定程度上降低脂质体的粒径。 1 1 2 2 超声分散法 将磷脂、胆固醇和待包封药物起溶解于有机溶剂中，混合均匀后旋转蒸发 3 一 双荧光载药脂质体与细胞相互作用的研究 去除有机溶剂，将剩下的溶液再经超声波处理，分离即得脂质体。超声分散法可 分为水浴超声波法和探针超声波法，是制各小脂质体的常用方法，但是超声波易 引起药物的降解。 1 1 2 3 复乳法 此法第一步将磷脂溶于有机溶剂，加入待包封药物的溶液，乳化得到油包水 ( w o ) 初乳，第二步将初乳加入到1 0 倍体积的水中混合，乳化得到复配对w o w 乳液，然后在一定温度下去除有机溶剂即可得到脂质体。k i m 2 3 】用乳化 法制得脂质体的包封率比较高，但是粒径较大。t o m o k o 2 4 1 等通过研究发现，第二 步乳化过程和有机溶剂的去除过程的温度对脂质体的粒径有比较大的影响，较低 的温度有利于减小脂质体的粒径，通过控制温度可以制得粒径为4 0 0n m ，包封 率达到9 0 的脂质体。 1 1 2 4 反相蒸发法 最初由s z o k a 2 5 】提出，一般的制法是将磷脂等膜材料溶于有机溶剂中，短时 超声振荡直至形成稳定的w o 乳液，然后减压蒸发除掉有机溶剂，达到胶态后， 滴加缓冲液，旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落，然后在减压下继续蒸发，制得水性 混悬液，除去未包入的药物，即得大单层脂质体。此法可包裹较大的水相容积， 一般适用于包封水溶性药物、大分子生物活性物质等。 1 1 3 脂质体的功能化修饰 对脂质体进行功能化修饰是提高脂质体性能的重要途径，而随着对脂质体研 究的深入，脂质体的功能化修饰变得更加多样化，并且逐渐形成了对同一脂质体 进行多种功能化修饰的趋势，使脂质体各方面性能进一步提高。以下我们主要介 绍几种常见的功能化修饰的脂质体。 1 1 3 1 长循环脂质体 传统脂质体会迅速被单核吞噬细胞吞噬，导致其在血液内循环时间短，从而 不能达到充分的吸收效果。因此，为改善脂质体的稳定性，研究者通过在脂质体 表面修饰含有聚乙二醇( p e g ) 的类脂衍生物，制备得到长循环脂质体。p e g 在脂 质体表面具有高度修饰的作用，能形成空问位阻层，阻止血浆蛋白吸附于脂质体 表面，并增强脂质体在固体瘤中聚集的e p r 效应【2 6 瑚】。这种立体位阻能够保护脂 质体不被识别、摄取，使脂质体不易被清除，从而延长了在血液内循环时间，因 此被称为长循环脂质体。如以p e g d s p e ( 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺) 修饰的阿霉素 脂质体，2 4 h 后在血液中滞留达3 5 以上，在肝、脾组织中摄取不足1 0 ，而传 统脂质体在血液中仅滞留1 0 ，被单核吞噬细胞捕获5 0 以上【2 9 1 。 4 硕一 j 学位论文 1 1 3 2 磁性脂质体 磁性脂质体是将适当的磁性材料及辅料包埋进脂质体内而形成的具有磁靶向 性的一类脂质体。磁性材料在磁性脂质体中起导向和定位作用。当其进入体内后， 利用体外磁场的效应可引导脂质体在体内定向移动和定位集中，使药物靶向到病 患组织和区域，从而减少对正常组织的损害，达到更佳的治疗效果。b a b i n c o v a 等【3 0 】将f e 3 0 4 包裹到磷脂双层中，在外加磁场条件下，磁性脂质体靶向到特定组织 中，以微波辐射1 5 m i n 后，所包封的药物6 一羧基一荧光素完全释放出来。 1 1 3 3p h 敏感脂质体 p h 敏感脂质体是一种具有细胞内靶向和控制药物( 如基因、核酸、蛋白质) 释 放的功能性脂质体。其原理是在酸性条件下，即在核内体形成后几分钟内，脂质 体进入溶酶体之前，脂质体周围环境的p h 从7 4 减至5 3 6 3 左右，此时的低p h 环境可导致脂肪酯羧基的质子化而引起六角晶相的形成，这是膜融合的主要机制， 从而促使脂质体膜与核内体溶酶体膜的融合，将包封的物质导人胞浆【3 0 1 。另外， 由于肿瘤附近的p h 值比周围正常组织低，利用p h 敏感脂质体载药可靶向释放药物 到这些部位，达到主动靶向病变组织的效果。这类脂质体应用较广泛，! t h t e n u 3 2 】 等应用p h 敏感脂质体作为干扰素的载体可以激发巨噬细胞的宿主防卫反应，而非 p h 敏感脂质体却无此作用。 1 1 3 4 靶向修饰脂质体 靶向修饰是近年来对脂质体进行功能化修饰中最热门的领域，它是通过在脂 质体上修饰能特异性识别某些病变组织或细胞的靶向性物质使脂质体能靶向这些 组织或细胞的方法，这些靶向性物质包括抗体、核酸识体( a p t a m e r ) 、多肽、叶 酸等生物性分子。本实验室将鼠抗人c k l 9 单克隆抗体修饰到连有f i t c 荧光染料 的荧光脂质体后制备成免疫荧光脂质体，分别与m g c 细胞和c o s 7 细胞共培育 3 0 m i n 后在激光共聚焦下观测，发现细胞膜表面有该抗体的抗原的m g c 细胞内能 看到很强的荧光信号，而表面没有该抗体的抗原的c o s 7 细胞则看不到任何荧光， 说明该脂质体对特定的细胞具有很好的特异性识别功能1 3 3 。北京大学的熊晓兵f 3 4 】 等制备了一种表面修饰了r g d 肽链的脂质体阿霉素载药纳米颗粒，并考察了这一 载药体系对b 1 6 与a 3 7 5 f l q 瘤细胞( 这两种细胞表面有能被r g d 所识别的整合素) 的体外靶向活性，结果表明，这两种细胞对r g d d o x 1 i p o s o m e 载药体系中阿霉素 的吸收量l 匕d o x 1 i p o s o m e 载药体系中的药物吸收量高3 4 倍。最近对细胞内的器官 ( 如细胞核、线粒体) 的靶向也逐渐成为该领域新的发展方向 3 5 , 3 6 】。 另外近年来也涌现了些新颖的功能化修饰，如t r i s t a n 3 7 】等将单链d n a 修 饰在脂质体表面然后利用d n a 聚合酶使它们相互之间部分聚合，从而起到稳定 双荧光载药脂质体j 细胞相互作用的研究 脂质体的作用，该脂质体被细胞摄入后才能被d n a 解旋酶破坏从而减少被细胞 摄入前的降解。在众多学者的不断努力下，对脂质体的研究也日益深入，脂质体 也由最开始的简单脂质体向着功能更加多样化，性能更加稳定，应用范围更加广 泛的方向发展，随着众多类型的脂质体载药体系成功的应用到临床，脂质体载药 体系也已成为临床药物治疗的一种重要手段。 1 2 在细胞及亚细胞层面脂质体载药体系与细胞相互作用的研究 进展 脂质体自2 0 世纪7 0 年代开始作为药物载体应用以来，因其众多的优势而备 受关注。经过四十多年的研究，脂质体在药物传输方面的应用取得了巨大的进展， 脂质体的在该领域的应用范围也大为增加，同时也出现了许多新问题，这就需要 我们更全面的了解各种脂质体的性能，因此也吸引了越来越多的科研工作者加入 了对脂质体载药体系与细胞相互作用的研究领域中来，下面将从脂质体与细胞的 相互作用的几种方式、脂质体载药体系与细胞相互作用的影响因素和脂质体载药 体系与细胞相互作用研究进展这几方面来介绍这个领域的研究进展。 1 2 1 脂质体与细胞的相互作用的几种方式 脂质体可以通过多种方式与细胞作用，最终使脂质体膜组分成为这些细胞的 一部分，脂质体内所包埋的药物则释放到细胞内或者释放到细胞附近形成高药物 浓度区域。至今为止，已有众多科研工作者对不同脂质体与细胞作用的方式进行 了研究3 8 4 0 1 ，而这些方式主要包括接触释放、吸附、内吞吞噬、融合和脂质交换， 下面分别对几种方式进行介绍。 1 2 1 1 接触释放 脂质体与细胞接触后引起脂质体通透性增加，脂质体的内容物在细胞周围释 放，从而在细胞膜外形成高浓度。一般情况下，脂质体原料中掺入胆固醇可以减 少这种释放，但在含有3 0 以上浓度的胆固醇的脂质体与细胞接触时，这种释放 却变得更强烈。 1 2 1 2 吸附 在适当的条件下，脂质体能通过静电作用和疏水作用非特异的吸附到细胞表 面，或通过脂质体的特异性配体与细胞表面结合而特异性吸附到细胞表面。吸附 在细胞表面的脂质体仅在蛋白质溶解酶作用下才能与细胞脱离。吸附使细胞周围 药物浓度增高，药物可慢慢地渗透到细胞内，多数脂质体进入细胞中经历了吸附 这个过程。 硕 ：学位论文 1 2 1 3 内吞吞噬 具有吞噬能力的细胞摄取脂质体进入其吞噬体内，质膜内陷形成亚细胞空 泡，由于膜结合质子泵的作用，使空泡内p h 值达到5 5 5 ，这些吞噬体与溶酶体 融合形成次级溶酶体，环境p h 值约为4 5 并发生细胞消化，溶酶体溶解脂质体， 磷脂被水解成脂肪酸并重新循环掺入到细胞质膜内，包埋在脂质体内的内容物如 果能抵抗溶酶体的作用则可释放到胞浆。由于代谢抑制剂和细胞松弛素b 能抑制 内吞作用，一些研究者【4 i 】通过加入这些物质后观测其是否会影响脂质体进入细胞 的速度来验证其进入细胞的机理是否为内吞。 1 2 1 4 融合 融合是指脂质体的膜插入细胞膜的脂质层中，从而将亲水性的内容物释放到 细胞内。在脂质体的原料中掺入融合剂如溶血卵磷脂、p s 、去污剂或表面活性物 质后容易发生融合，但这些材料对细胞均有一定的毒性。其它的方法如应用p e 、 油酸或正电荷脂质也增加发生融合的可能性。 1 2 1 5 脂质交换 脂质体与细胞膜进行交换而不释放脂质体包埋的水溶性内容物进入细胞的 方式被称为脂质交换。由于某些磷脂如p c 、p e 在膜蛋白酶处理后，这种脂质交 换过程减慢，所以推测这种交换可能是通过细胞表面特异性交换蛋白介导的。 这几种脂质体与细胞的相互作用的方式的图解参看图1 2 。 图1 2 脂质体与细胞相互作用图解【3 6 1 1 2 2 脂质体载药体系与细胞相互作用的影响因素 对脂质体作为药物载体的性能研究表明，制备脂质体所用的磷脂种类的不同 双荧光载药脂质体与细胞相互作用的研究 或磷脂结构细小的差异、脂质体所带电荷、脂质体的大小、脂质体修饰等与脂质 体本身有关的因素都可能对脂质体与细胞的相互作用产生影响。另外，脂质体与 细胞共培育的条件也会对它们之间的作用效果产生显著的影响，有的甚至会改变 脂质体进入细胞的机理。同一种脂质体与不同类型的细胞之间的相互作用也可能 由于细胞类型的不同而不同。下面我们从这几个方面具体的加以介绍。 1 2 2 1 脂质体载药体系的组成对它与细胞相互作用的影响 随着脂质体载药体系在药物载体领域应用的日益增多，研究者们一方面追求 脂质体载药体系功能多样化，一方面也希望得到针对某些具体情况的更专一的脂 质体载药体系，这两种趋势都使得脂质体载药体系日趋多样化。而这种多样化也 使得脂质体载药体系与细胞的相互作用表现出多样性，如脂质体与细胞相互作用 时进入细胞的速度不同，有的甚至会改变进入细胞的机理及方式，而如果将靶向 性物质修饰在脂质体上后，这类脂质体与其靶细胞的作用效果将变得尤为显著。 下面我们分别从制备脂质体所用磷腊、脂质体所带电荷、脂质体的大小以及脂质 体的修饰这几个方面来讨论脂质体载药体系的组成对它与细胞相互作用的影响。 ( 1 ) 制备脂质体所用磷脂的不同对它与细胞相互作用的影响 磷脂本身是细胞内各种膜的重要组成成分，作为制各脂质体的主要原料，磷 脂的种类、纯度、不同种类磷脂的混合比例等都会对制备的脂质体性能造成很大 的影响。磷脂由一个头部和两个尾部组成，其大致结构见图1 3 。磷脂的头部由 磷酸和水溶性分子如胆碱、丝氨酸酯化形成，可溶于水，所以也称亲水性头部； 向下延伸的两条平行尾部是由脂肪酸链组成，每条链有1 0 2 4 个碳原子和o 一6 个 双键，不溶于水，所以也称疏水性尾部。由于它的这种特殊结构，所以磷脂被称 为双亲媒性分子或兼性分子。 内钍y a c y l c h 曩融 ，冉_ 叫岬_ 州砷叫蛐、 g i y r o l ，_ s 两o c h o ；i ； p h 蝴a i ，。k - 、 9 八v v 蚺黪墨一a 。她 o |：；i： a l c o h o l 八v 八k 墨一o - c ， ! 型堕 、 h y d r o p h o b k ：t a i l |110 l芦 嶙一o - - p l - - o - - c 心一c h l 一譬一c 鸭 0 e h ；3 h y d r o p h i l i ch e a d 图1 3 磷脂的化学结构【3 9 】 硕士学位论文 磷脂的种类繁多，如经常用到的既能天然提取又能合成的中性磷脂磷脂酰胆 碱( p c ) 和磷脂酰乙醇胺( p e ) ，p c 具有价格便宜和化学性质稳定的特性，天 然来源的p c 是一种混合物，而p e 则具有一个不可置换的氨基基团，在中性p h 的条件下能发生质子化，能在交联剂的作用下与其它给电子基团交联形成共价键， 所以p e 常用来作为修饰用磷脂。另外还有其它的如磷脂酸( p a ) 、磷脂酰丝氨 酸( p s ) 、磷脂酰肌醇( p i ) 等负电荷磷脂及硬脂酰胺( s a ) 、胆固醇衍生物等 正电荷磷脂。制备脂质体所用磷脂种类的不同一般都会对脂质体载药体系与 细胞作用产生影响，这点在较早之前就已得到验证，早在19 7 3 年 p a p a h a d j o p o u l o sd 【4 2 】等就发现单纯以p s 或者以p s ：p c 为1 ：9 的比例为原 料制备的脂质体在与3 t 3 ，l 9 2 9a n db h k 2 1 这几种细胞共培育时能导致细胞 与细胞间膜融合现象的发生，而用单纯以p c 为原料制备的脂质体在同样的 条件下则不能导致任何的膜融合现象的发生。p i r e sp t 4 0 】等研究也表明不同原 料制备的正电荷型脂质体与t h p 1 细胞的融合效果有很明显的差别，纯 d o t a p 具有最高的融合效果，掺入p e 后会降低这种效果，而掺入p c 或 p e g 修饰的p e 后则会更大程度上抑制这种效果，具体结果见图1 4 。 80 70 6 o 5 0 4 0 3o 20 10 o 厶 卜 ， 、- 一 盆 翻 蠢： 、 o v q 幽 厶 塑 。 盘 。 厶 瓮： 算二 po 口 。一 厶“ 、i 篮- - 厶 o 盘一 一 o ， i i t1 4 各种正电荷型脂质体与t h p 1 细胞的融合【4 3 】 ( 膜融合效率是在3 7 c 与细胞共培育3 0 m i n 的条件下对连接在p e 上的罗丹明染料在细胞膜里的荧光强 度来检测的，单位是5 t 0 0 1 ，脂质体的浓度与细胞的密度分别为2 0 m m 年1 ：1 1 3 1 0 c e l l s m l 。每种脂 质体的z e t a 电位都标注于每种脂质体的柱状图上) 进一步的研究表明，即使用同一类磷脂制备的脂质体也可能因为磷脂化学结 双荧光载药脂质体0 细胞相瓦作用的研究 构细微的差别而导致与细胞作用效果的不同。t a n a k a 删等研究了两种以相同种类 但化学结构不同的磷脂( 分别为p c 、p e 、p g ) 和胆固醇为原料制备的脂质体， 一种的原料为硬脂酰胆碱( p c 的一种) 、硬脂酰乙醇胺( p e 的一种) 、硬脂酰甘 油( p g 的一种) 和胆固醇( 硬脂酰脂质体) ，另一种原料为油酰胆碱( p c 的一种) 、 油酰乙醇胺( p e 的一种) 、油酰甘油( p g 的一种) 和胆固醇( 油酰脂质体) ，结 果发现，在连接同样的o v a 抗原后与巨噬细胞培育，油酰脂质体的抗原表达效果 要比硬脂酰脂质体强约l o 倍。 磷脂的纯度同样可能对脂质体载药体系与细胞相互作用产生影响。m a n c o n i m 【4 5 j 等将p c 含量不同的s l ( 含8 0 p c ) 、商业用p 9 0 ( 含9 0 p c ) 及人工合成 的高纯度d p p c ( 含9 9 p c ) 分别混合染料罗丹明标记的p e ，再包埋染料c f 制 各成双荧光脂质体，将它们与h e l a 细胞在无血清培基的条件下共培育后移至荧光 显微镜下成像，发现p 9 0 制备的脂质体在细胞内有良好的缓释染料c f 的效果， s l 制备的脂质体既容易被细胞吞噬也容易被细胞吐出，致使释放c f 效果不佳， 而d p p c 制备的脂质体由于在细胞内较难被降解破坏，释放效果较差。 ( 2 ) 脂质体所带电荷对它与细胞相互作用的影响 由于细胞膜本身带有负电荷，细胞内的很多物质也都带有电荷，所以脂质体 所带电荷必然会对它与细胞的相互作用产生影响。正电荷脂质体由于其电荷原因， 一般都能比负电荷脂质体及不带电脂质体更快的聚集并粘附到细胞膜表面，但这 并不意味着所有正电荷脂质体都能比其它类型脂质体更快的进入细胞。m a n c o n i m 【4 5 】等的研究表明，以p c 为主要原料制备的带不同电荷的脂质体中，正电荷脂 质体能更快的聚集到h e l a 细胞膜周围，但负电荷脂质体却更容易进入h e l a 细胞 内，作者推测可能是由于负电荷的电性引发了某些细胞内吞作用的机制。 ( 3 ) 脂质体的大小对它与细胞相互作用的影响 颗粒的大小一般都会对颗粒的生物效应产生影响，w e m 【4 6 】等将2 1 0 0n m 的一 系列大小的金和银纳米颗粒连接上抗体后再与细胞作用，结果发现，蛋白质的表 达显著依赖于颗粒的大小，并且4 0 n m 和5 0 n m 的颗粒蛋白质表达效果最佳。作 为一种纳米颗粒，脂质体也存在这种尺寸差异带来的与细胞相互作用效果的不同， 如s i m s e s t 47 】等就曾报道过不同尺寸的正电荷脂质体被细胞吞噬的方式不同：大于 2 0 0 n m 的正电荷脂质体通过c a v e o l i n ( 一种膜结构的标记性蛋白) 介导的方式的 方式被细胞吞噬，而小一些的脂质体则是通过网格蛋白( c l a t h r i n ) 介导的方式被 细胞吞噬的。 ( 4 ) 脂质体的功能化修饰对它与细胞相互作用的影响 脂质体经过不同的修饰后会使它具有一些特殊的功能，常见的功能化修饰脂 质体有长循环脂质体、p h 敏感脂质体、温度敏感脂质体及靶向修饰脂质体等，在 本论文1 1 3 中已经做过详细的介绍。 硕i ：学位论文 这些对于普通脂质体的功能化修饰通常会在很大程度上改变脂质体与细胞的 相互作用的效率和过程。如在脂质体上修饰的靶向性物质能主动识别特定细胞上 的而靶标，从而大大提高该脂质体与这种细胞的相互作用效率，l e e 4 8 】等应用叶酸 标记脂质体作为基因转移载体，与未修饰叶酸的该种脂质体相比，脂质体与细胞 膜表面有大量叶酸受体表达的肿瘤细胞的相互作用效率大为提高，最终表现为转 染效率显著提高。 1 2 2 2 细胞的类型对脂质体与细胞相互作用的影响 由于不同细胞的细胞膜表面往往带有一些其特有的蛋白质、糖类等物质，因 此，不同的细胞即使是与相同的脂质体相互作用，其作用效果也会不同。大量的 研究结果表明，同种脂质体与某些细胞的作用效果很明显，而与其它细胞的作用 却非常弱。如y o s h i t o 4 9 】等将聚阳离子脂质体包埋光敏剂b p d m a 后分别与人体 内皮细胞e c v 3 0 4 和人体脐血管内皮细胞h u v e c s 共培育后发现，h u v e c s 细胞 内b p d m a 荧光表达要远高于e c v 3 0 4 细胞，而且6 0m i n 后e c v 3 0 4 细胞中 b p d m a 主要分布在细胞核区而h u v e c s 细胞则分布在细胞质及细胞核区。 1 2 2 3 脂质体与细胞共培育的环境对它们相互作用的影响 在体外实验中，脂质体与细胞的共培育环境经常在很大程度上影响脂质体与 细胞的相互作用，有的条件的变更甚至有可能改变脂质体进入细胞的方式及机理。 体外实验主要考察的两个环境因素是共培育培养基的成份和培育的温度。下面我 们将分别讨论这两个方面。 ( 1 ) 共培育培养基的成份对脂质体与细胞相互作用的影响 全血、血浆、血清都会对脂质体本身的稳定性及与细胞相互作用产生影响， 原因可能有以下两点：1 全血、血浆、血清中的高密度载脂蛋白( h d l ) 与脂质体 相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低，双分子层堆积特性改变，脂质成分 被转移到载脂蛋白上，使脂质体膜的通透性增加，脂质体结构不稳定、分解最终 破裂失活。血清白蛋白、仅和p 珠蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白同样也可 引起脂质体膜的不稳定【5 州；2 脂质体与一些能促进巨噬细胞吞噬的被称为“调理 素”的血浆蛋白结合而容易被清除【5 l 】。m o h s e n 等【5 2 1 人将等量的d l p e 、d o p s 及胆 固醇掺入标记物r h p e ( 染料罗丹明标记的p e ) 制备成荧光脂质体，将它与m e w o 细胞分别在无血清的d m e m 培基；加入3 0 d , 牛血清( f c s ) 的d m e m 培基以及 纯f c s 罩共培育l h 后，再对它们进入细胞的情况用激光共聚焦进行成像，结果发 现在无血清的d m e m 培基中脂质体进入m e w o 细胞最快，其次是加入3 0 f c s 的 d m e m 培基，而以纯f c s 作为培基的脂质体进入细胞速度最慢( 结果如图1 5 ) 。 双荧光载药脂质体与细胞相互作用的研究 d 3 0 0 2 5 0 蚤2 0 0 蚺 c 名t 5 0 博 差1 0 0 0 3 0 f c s