（环境科学与工程专业论文）硝基苯降解菌pseudomonas+xn—1细胞质粒的提取和特性研究.pdf

摘要 但是未能取得满意的结果， 粒上没有合适的酶切位点； 原因可能有两个：一， 二，质粒的纯度不够， 所选择的酶不合适，在质 影响了酶切反应的结果。 关键词：p s e u d o m o n a sx n 一1 ；硝基苯降解；降解性质粒 塑至苎堕壁堕垒! ! ! 竺! ! 竺! ! 二! 塑塑堕整塑堡墼塑鲎丝里塞 一一 a b s t r a c t t h en i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i v ep l a s m i di np s e u d o m o n a sx n - 1i sd i s c u s s e di nt h i s p a p e r ，b a s e do n t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fn i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb ys t r a i np s e u d o m o n a s x n l ，w h i c ha t t e m p t st od os o m ep r e p a r e dw o r kf o rt h er e s e a r c hi nm o l e c u l e l e v e lo f n i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb yt h i ss t r a i n t h ea n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo ft h i ss t r a i ni sd e t e c t e d ，b e c a u s ei t g e n e r a l l y r e l a t e st ot h e p l a s m i d t h e r e s u l ts h o w st h a tt h i ss t r a i nh a sn o ta n t i b i o t i c r e s is t a n c et oc h l o r a m p h e n i e o la n dt e t r a c y c l i n e ，b u ta m p i c i l l i n t h e p l a s m i de x t r a c t i o nf r o mw i l ds t r a i n sn e e d s a na p p r o p r i a t em e t h o d f i r s t l y s i sb ya l k a l iw a su s e dt oe x t r a c tp l a s m i df r o ms t r a i np s e u d o m o n a sx n - 1 b u t t h e e x p e c t e d r e s u l th a dn o tb e e n g o t ，a n d al o to fc r a c k e d p l a s m i d d n a f r a g m e n t sw e r eg o to n l y t h e nt h es t r a i nc e l li sd e t e c t e dt od e t e r m i n ew e a t h e rt h e r ei sa n yp l a s m i di n t h ec e l l t h ed e t e c t i o nr e s u l ta n a l y s e db yg e l o s eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w st h a t t h ec e l lh a r b o r sap l a s m i d ，a n dt h i sp l a s m i di sr e l a t i v e l yl a r g e s os o m em e t h o d ss u i t a b l et o l a r g ep l a s m i de x t r a c t i o n ，i n c l u d i n gl y s i sb y s d sa n dam e t h o df r o mal i t e r a t u r e ，w e r eu s e dt ot r yt oe x t r a c tt h el a r g ep l a s m i d f r o mt h es t r a i nc e l l t h el y s i sr e a c t i o n si nt h e s et w om e t h o d sa r eg e n t l e ，s ot h e l a r g ep l a s m i d c a n n o tb ei n ju r e di nt h el y s i sp r o c e s s ，o p p o s i t et ol y s i sb ya l k a l i i t w o u l db e h e l p f u l t o k e e p t h e i n t e g r a l i t y o ft h e l a r g ep l a s m i dd u r i n g t h e e x t r a c t i o n t h ee x t r a c t i o nr e s u l t ss h o wt h a tt h ec l e a ra n di n t e g r a lp l a s m i dd n a b a n d sw e r eg o tu s i n gt h e s et w om e t h o d s a n dt h e g e l o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i n d i c a t e st h a tt h i sl a r g ep l a s m i di sa b o u t2 2 k b t od e t e r m i n et h e p l a s m i df u n c t i o n ，t h ee x p e r i m e n t i sd o n et o c u r et h e p l a s m i df r o mt h ec e l l ，w h i c hw i l l c a u s es o m ec h a n g eo nt h es t r a i np h y s i o l o g y t h er e s u l ts h o wt h a ta f t e rc u r i n gt h ep l a s m i d ，t h es t r a i nc e l lc a n n o tg r o wo nt h e s e l e c t i v em e d i u mc o n t a i n i n gn i t r o b e n z e n e t h i sr e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ep l a s m i d r e l a t e st on i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o n a tt h es a m et i m e ，s o m er e s u l t si n d i c a t et h a t t h i s p l a s m i d h a s n o t h i n g t od ow i t ht h ea n t i b i o t i c r e s i s t a n c e ，b e c a u s et h e a n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo ft h es t r a i nr e m a i n sa f t e rt h ep l a s m i d c u r i n g af e wm u t a n t sw e r ef o u n do nt h ep l a t ec o n t a i n i n gn i t r o b e n z e n es e l e c t i v e m e d i u m t h e i rc o l o n ya p p e a r a n c e sh a v es o m ed i f f e r e n c ef r o mt h ew i l ds t r a i n s o m ee v i d e n c e ss h o wt h a tt h e i rg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so nt h es e l e c t i v em e d i u m a r er e l a t e dt ot h ep l a s m i d sh a r b o r e di nt h e i rc e l l s am u t a n tp r o b a b l yh a r b o r i n g m o r ep l a s m i d sc a ng r o wb e t t e ro nn i t r o b e n z e n es e l e c t i v em e d i u mt h a no t h e r s t r a i n s t h ep l a s m i dh a r b o r e di nt h i sm u t a n ti sa l s oaf e wk bs m a l l e rt h a no t h e r s s oap r o b a b i l i t yi ss u p p o s e dt h a tac e r t a i np l a s m i dd n a f r a g m e n td e l e t i o nm a d e t h en u m b e ro fp l a s m i dc o p yc h a n g e ，w h i c ha f f e c t e dt h em u t a n tg r o w t ho nt h e s e l e c t i v em e d i u m t os e tu pt h ep h y s i c a lm a po ft h i sp l a s m i d ，s o m er e s t r i c t i o ne n z y m e sa r e u s e dt oc u tt h ep l a s m i di n t os e v e r a lp l a s m i dd n a f r a g m e n t s b u tt h er e s u l t so f r e s t r i c t i o ne n z y m er e a c t i o na r en o ts a t i s f i e d t h e r em a yb et w or e a s o n sw h i c h l e a dt ot h e s er e s u l t s ：o n ei st h a tt h er e s t r i c t i o ne n z y m e sa r en o ts u i t a b l ef o rt h i s p l a s m i d ，t h a ti s t os a yt h e r ea r en oa p p r o p r i a t ec u ts i t e so nt h ep l a s m i df o rt h e s e r e s t r i c t i o ne n z y m e s ；a n dt h eo t h e ri st h a tt h ep u r i f i c a t i o no ft h ep l a s m i di sn o t e n o u g hf o r r e s t r i c t i o n e n z y m er e a c t i o n ，a n ds o m ei m p u r i t y a f f e c t st h el a s t r e s u l t s k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sx n 一1 ：r l i tr o b e n z e n ed e gr a d a t i o n ：d e g r a d a t iv e p la s m i d 硝基苯降解菌p s e u d o m o n a sx n l 细胞质粒的提取和特蓬! ! 窒 前言 前言 随着现代化工工业，特别是医药、农药、染料、炸药等行业的发展，大 量的硝基苯污染物被排放到环境中，由于硝基苯的毒害性和难生物降解性， 造成了硝基苯在环境中长期存在、积累，已经严重威胁到了人和其他生物的 健康，造成了硝基苯环境污染问题。人们在处理硝基苯废水的实践中，研究 了许多物理和化学的方法，虽然也取得了一些成果，但是依然存在着处理成 本高、容易造成二次污染等问题，难以在工程实践中得到满意的应用。传统 的生物处理法虽然不存在这些缺点，但是由于硝基苯难以生物降解，而且对 生物体有毒性，所以传统的生物法的处理效率一般都不高。 为了解决这些问题，人们开始对硝基苯的生物降解性展开研究，寻找可 以耐受硝基苯的毒性，对硝基苯具有高效降解性的微生物资源，希望能将其 应用到生物法的处理中，提高处理效率。基于这个目的，人们展开了大量的 关于微生物降解硝基苯的效率、特性、条件、途径、机理的研究，并且取得 了丰富的研究成果，对硝基苯的微生物降解性已经有了比较全面和深入的认 识，为高效生物法处理硝基苯废水打下了基础。 随着生物技术和基因工程技术的发展，人们已经可以开始从分子水平上 来理解微生物降解有机污染物豹过程，在这方面的研究工作也在不断的开展 和深入，无论是广度还是深度都发展很快，取得了很大的进展。可以预见， 人们在分子水平上对微生物降解污染物的深刻理解和认识，将会大大的提高 人们利用这些微生物资源解决环境污染问题的能力和水平，为环境污染问题 的解决展现了光明的前景。 对于硝基苯生物降解的遗传学研究也开展了一些工作，取得了一些很有 价值的成果，但还需要更为深入、更为全面的研究来完善我们的认识。相信 对微生物降解硝基苯遗传学机制的把握，一定会帮助我们更好的利用生物法 来解决硝基苯污染的环境问题。 硝基苯降解菌p s e u d o m o n a sx n 一1 细胞质粒的提取和特性研究 1 文献综述 1 1 硝基苯及硝基芳香族化合物 硝基芳香族化合物如硝基苯、硝基酚、硝基甲苯、硝基苯甲酸盐及多硝 基芳烃等，是工业上一类重要的硝化合物，广泛应用于生产农药、染料、炸 药、医药、多聚体及其他化工产品，随着这些产品的制造和使用，硝基芳香 烃也多途径的进入环境中，污染环境。一方面，这类化合物毒性很大，有致 癌、致畸、致突变等作用，对人类健康造成威胁；另一方面，苯环结构的对 称性和稳定性使其不易发生反应，硝基的存在使苯环的电子云密度降低，生 物降解性更差。因此，硝基芳香族化合物可以在环境中长期残留和积累，而 难以通过微生物降解的自然净化作用去除，对人类和其他生物体造成巨大的、 潜在的、长期的威胁。如何减轻和消除这类化合物对环境的污染，日益引起 人们的关注，多年来，研究者已经尝试着采用各种物理、化学、生物的方法 来解决硝基芳香族化合物的污染问题。 1 2 物化法处理硝基苯废水的研究 由于硝基苯毒性较大，而且结构稳定，因此生物可降解性较差，用一般 传统的生物法处理往往难以获得满意的效果，因此，用物理化学法处理硝基 苯废水的研究一直受到人们的重视，也取得了一些令人满意的结果。 1 2 1 萃取法 萃取法是利用一种难溶的有机溶剂，将硝基苯从水溶液中提取出来，同 时，有机溶剂和硝基苯都可以回收利用。 苯是常用的萃取剂。林忠祥等采用苯作萃取剂，使水中的硝基苯浓度 降到3 p p m 以下。毛连山等 2 1 用苯萃取低浓度硝基苯废水，也得到了满意的 结果。但是，由于苯在水中也有一定的溶解度，所以处理过的废水含有一定 量的苯，排放后会造成二次污染。也有用脂类或者石脑油作萃取剂，效果也 比较理想，但是由于沸点较高，所以溶剂回收困难。因此，沙耀武等t 3 1 尝试 l 文献综述 用四氯化碳作萃取剂，对硝基苯的去除率也可以达到9 6 ，由于四氯化碳在 水中的溶解度很小，萃取效率也很高，所以是一种比较理想的萃取剂。 萃取法工艺简单，去除效率高，而且可以回收利用硝基苯，不失为一种 可取的处理方法。但是，该方法也存在着萃取剂容易造成二次污染的问题， 同时，由于硝基苯在水相和有机相的分配系数是定值，所以尽管回收效率较 高，硝基苯废水的残留浓度有时也难以达到要求，特别是对浓度较高的废水。 因此该方法的关键在于寻找一种成本低，在水中的溶解度小，对水的分配系 数大的有机溶剂来做萃取剂，同时为了消除有机溶剂的二次污染，往往需要 在萃取工艺后辅助其他的工艺来去除有机溶剂，比如气提工艺，但是这样一 来，就会增加处理的成本。 1 2 2 吸附法 吸附法是利用树脂等对有机物的吸附作用将有机废物从废水中脱除，进 一步还可以利用某种脱附剂，将有机废物丛树脂上洗脱，加以回收利用。这 种方法也被应用于硝基苯废水的处理。 张全兴等【4 】采用树脂吸附法处理硝基苯废水，利用国产的c h a 1 1 l 树脂， 在适宜的条件下，可使硝基苯的去除率达到9 9 以上，采用异丙醇作脱附剂， 脱附率 9 7 ，表明该树脂具有良好的吸附和脱附性能。毛连山等的研究结果 表明，h - 1 0 3 树脂的对硝基苯吸附性能要好于c h a 1 1 1 树脂，而且酸性条件 下的吸附性能要好于碱性条件，甲醇的脱附效果要好与其他的脱附剂。 膨润土也可以用于对硝基苯的吸附，其主要成分是蒙脱石，但是其对硝 基苯的吸附效率比较低。顾曼华等【5 】用氯化十六烷基吡啶( c p c ) 和溴化十 六烷基三甲铵( c t m a b ) 改性膨润土，经过这些阳离子表面活性剂改性的膨 润土，对硝基苯的吸附效率提高了4 5 倍，而且大大降低了废水的c o d 值。 有机膨润土吸附有机物的机理主要有两种：一种是离子吸附交换，另一种是 表面活性剂的非极性脂肪链萃取水中的有机污染物。对于硝基苯，主要是通 过季铵盐非极性脂肪链端的萃取作用而被有机膨润土吸附。这种方法的一个 硝基苯降解菌p s e u d o m o d s sx n i 细胞质粒的提取和特牲研究 缺点是，尽管经过改性的有机膨润土的吸附效率大大提高但是总的吸附效 率仍然不高，仅仅有5 0 左右。 1 2 3 其他方法 化学氧化法是国内处理硝基苯废水的一种常用方法，比较常用的氧化剂 有次氯酸钠，氯气，过氧化氢，臭氧等。化学氧化法对硝基苯的去除率很高， 一般都可以达到9 5 以上，甚至9 9 ，使硝基苯废水达到排放标准。当然， 氧化剂的用量是决定处理效果的关键因素，为了保证较好的处理效果，往往 需要比较大的氧化剂用量，这就使得处理的成本较高，同时也会因为残存的 氧化剂的排放，比如臭氧、氯气，造成二次污染。另外，化学氧化法的动力 消耗也比较大。 超临晃水氧化技术是经年来迅速发展起来的一种处理有机废水的高耨技 术，其原理是在超临界水中将有机污染物氧化为h 2 0 和c 0 2 。水在超临界状 态下物理化学性质会发生显著的变化，能与有机物和氧气以任意比例互溶， 因此成为一种理想的反应介质。基于超临界水的这种特殊性质，人们发现， 如果在将有机废水加温加压至超临界状态，有机物和氧气都充分的溶解于超 临界水中，在均相中进行反应，反应不受相问传递及氧浓度的限制，同时高 的反应温度和压力也是反应速度大大加快，可以在短时间内对有机物达到很 高的去除效率。赵朝成等【6 l 将这项技术应用于硝基苯废水的处理中，在保证 反应时间和氧气浓度的前提下，可以基本完全去除硝基苯。但是，如果处理 的硝基苯废水的浓度较低，则该方法因为处理成本较高而不经济，只有在处 理高浓度有机废水，而且充分的回收利用产品和能源之后，才能在经济角度 接受该方法。此外，该方法存在的另一个主要问题是，由于氧浓度较高，而 且反应过程中会有有机酸物质产生，因此反应对反应器的腐蚀情况很严重， 因此大大限制了这种方法的应用。反应只能在高温高压下进行也是该方法的 一个缺陷。 非平衡等离子体技术也是在环境领域中日益受到重视的一项高新技术。 4 1 文献综述 电子束技术、电水锤技术、气液混合体脉冲电晕技术，都展现了良好的应用 前景。郭香会等1 7 进行了脉冲放电等离子体处理硝基苯废水的实验研究，该 技术是基于：( 1 ) ，超窄脉冲电晕放电产生的非平衡等离子体是一种无需辐射 屏蔽的高能电子源，用于污水处理是因为此类高能电子具有形成自由基的能 量：( 2 ) ，由于超窄脉冲电晕上升时间短，其能量基本不会消耗在对产生自由 基无用的离子加速迁移上，而是作用在自由电予上，获得充足能量的自由电 子将促使环境物质的激发裂解或电解，达到产生自由基的目的；( 3 ) ，不仅利 用放电所产生的高能电子，同时还利用放电形成的紫外线，以及气体放电所 产生的臭氧，这三者的综合作用增强了处理效果。研究表明，在酸性和碱性 条件下，处理效果较好。但相对于处理成本来说，处理的效率还不是很高。 李劲等 8 利用电流体直流放电降解水中的硝基苯，在电压4 0 v 时，经过两次 放电，可使总降解率达到8 0 ，而且苯环己被破坏，生成丙酮等小分子物质。 m i g u e l 9 1 等利用紫外线对水相中的硝基苯进行光降解，其原理是利用紫 外线的照射能量，使水溶液中产生羟基自由基，然后羟基自由基氧化降解硝 基苯。紫外线单独作用于硝基苯水溶液时，产生羟基自由基的效率很低，因 此处理效果不理想，因此，需要额外的因素促进羟基自由基的生成效率。研 究者在研究中采用了两种方法来解决这个问题，一是加入h 2 0 2 ，在紫外线的 照射下，h 2 0 2 很容易分解成羟基自由基；二是在水溶液中加入f e ( i i i ) ，f e ( i i i ) 的存在可以使紫外线将水分解为羟基自由基和氢离子，同时f e ( i i i ) 还原为f e ( i i ) 。通过这两种方式，就可以大大提高紫外线光降解硝基苯的 效率。 1 3 生物法降解硝基苯 物理化学法处理硝基苯废水虽然有处理效率高，处理工艺相对简单的特 点，但是物化法存在着一些目前尚难以克服的缺陷，比如处理成本较高，存 在二次污染，反应条件比较苛刻等，因此给实际的工程应用带来了许多困难。 生物法处理废水是一种应用最广泛的方法，经过很长时间的发展，目前 硝基苯降解菌p s e u d o m o n a sx n l 细胞质粒的提取和特性研究 也是应用最成熟的方法，它处理成本低，运行管理简单，没有二次污染，适 用于各种成分复杂的废水，处理效果显著，若能用生物法取代物化法处理硝 基苯废水，将能够大大提高排放硝基苯废水的处理率。但是，由于硝基苯的 生物难降解性，传统的活性污泥法等生物处理法对硝基苯难以取得良好的处 理效果，这也是制约生物法应用的主要因素。随着人们对难降解有机物生物 降解性研究的深入，微生物降解硝基苯的研究日益受到人们的关注，并且取 得了丰富的研究成果 o a l l ，主要表现在：一，从受硝基苯污染的环境中筛选 分离到对硝基苯具有高效降解性的微生物，从而为微生物降解硝基苯的研究 奠定了基础；二，深刻认识了微生物对硝基苯的降解机理和代谢途径，揭示 了微生物矿化硝基苯的反应过程，以及在反应过程中起重要作用的酶，三， 在分子生物学水平上研究了控制降解硝基苯性状的遗传机制，对编码硝基苯 降解酶的基因进行了定位和功能的研究。这些研究的一个重要应用就是要将 硝基苯高效降解菌应用于硝基苯废水的处理中，从而解决传统生物法处理存 在的问题。 1 3 1 降解硝基苯的微生物资源 近年来，随着微生物降解硝基苯研究的广泛开展，人们已经得到了越来 越多的能够降解硝基苯的细菌菌株，这些菌株分布于多个菌属，如表1 1 所 示，而且，对于这些菌株降解硝基苯的生长条件、降解条件等宏观特性的认 识也比较详尽。这些研究一方面为硝基苯降鳃菌在实际硝基苯废水处理中的 应用提供了必要和可靠的参数，另一方面，也为硝基苯降解菌进一步的深入 研究打下了基础。 表1 1 降解硝基苯的微生物菌株 t a b l e 1 1t h es t r a i n st od e g r a d en i t r o b e n z e n e 降解底物菌属 参考文献 硝基苯假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 1 2 ，1 3 ，1 4 从毛单胞菌属( c o m a m o n a s s p ) 15 1 l 文献综述 吉氏拟杆菌( b a c t e r i o d e sd i s t a s o n i s )【1 6 】 屎拟杆菌( b a c t e r i o d e sm e r d a e ) 1 6 】 1 3 2 微生物降解代谢硝基苯的途径和机理 降解途径是微生物降解代谢硝基苯研究的一个重要方面，它向人们揭示 了硝基苯在微生物作用下的降解过程和归宿，降解的中间产物和能否最终矿 化都是人们关注的问题。已有众多的研究者采用不同的微生物研究其对硝基 苯的降解途径，结果表明，不同菌株存在着不同的降解途径，其主要差异在 于硝基的变化和苯环的变化。 厌氧好氧 双加氧酶 开环降解 o h 图1 ，1 硝基苯厌氧降解过程 f i g 1 1t h ep r o c e s so fn i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o ni na n a e r o b i cc o n d i t i o n s 在厌氧条件下，微生物降解硝基苯主要是通过还原途径，将硝基还原为氨基，然 后进入好氧降解过程，在双加氧酶的作用下，转化为邻苯二酚或氨基邻苯二酚，然后 苯环开环降解，如图1 1 所示。 在好氧条件下，微生物降解硝基苯存在着两种途径：氧化途径和还原途 径。微生物究竟采用那种途径降解硝基苯取决于它来自的环境。一般来讲， 从活性污泥中筛选出来的菌株，由于其生长的环境是氧过量的，所以采用氧 化途径降解硝基苯，如果菌株是从土壤、地下水等缺氧环境中筛选出来的， 7 洲 洲 一 洲 一顶 气慨由 硝基苯降解亩p s e u d o 日o n a sx n i 细胞质粒的提取和特性研究 则通常会采用还原途径降解硝基苯。当然，这种还原途径还不同于厌氧状态 下的还原途径，而仅仅是初始步骤的还原。 好氧条件下，氧化途径主要有两种方式：一，硝基苯在微生物双加氧酶 的作用下加氧生成硝基二酚，或者一步去除硝基，生成邻苯二酚，继而苯环 断裂，而进行的降解过程；二，硝基苯在微生物单加氧酶的作 单加氧酶单加氧酶 图1 2 单加氧酶对硝基苯的氧化过程 o h 0 h f i g 1 2t h eo x i d a t i v ep r o c e s so f n i t r o b e n z e n eb ym o n o o x y g e n a s e 双加氧酶 o 双加氧酶 0 2 0 h h o h o h 图1 3 双氧化酶对硝基苯的氧化过程 h f i g 1 3t h eo x i d a t i v ep r o c e s so f n i t r o b e n z e n eb yd i o x y g e n a s e 用下经过两个氧化过程，生成硝基邻苯二酚。在这个过程中，硝基苯的第一 步被氧化是反应的关键步骤，这其中，硝基苯加氧酶起了决定性作用，如果 因为某种原因使硝基苯加氧酶失去活性，就会使得降解进程无法进行。氧化 慨卤 r 1 文献综述 途径的一般过程如图1 2 、1 3 所示。 s h i r l e yf n i s h i n o 和j i mc s p a i n 5 】研究了菌株c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 对 硝基苯的氧化降解过程，这株菌能够以硝基苯为唯一碳源和氮源，将硝基苯 完全降解，而且在这个过程中，脱除的硝基转化为亚硝酸盐，可以作为氮源 被细菌利用。该株菌氧化降解硝基苯的具体过程如图1 4 所示： 【卤半r 1 2 ， h o h o 一 一 h 2 0 n a d + + h c o o h 图1 4c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 对硝基苯的氧化降解过程 f i g 1 4t h eo x i d a t i v ep a t h w a yo f n i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb yc o m a m o n a s s p j s 7 6 5 对降解过程的中间产物以及催化反应的酶的研究确定了降解反应的过 程，其中硝基苯1 ，2 - 双加氧酶将硝基苯转化为一种不稳定的过渡中间产物， 这种中间产物会自发的分解为邻苯二酚和脱硝基，然后邻苯二酚在邻苯二酚 - 2 ，3 - 双加氧酶的作用下经间位开环的途径降解，因此，这两种酶是硝基苯 氧化代谢途径过程中的关键的酶。硝基苯1 ，2 - 双加氧酶由四部分组成，分 龟 硝基苯降解蘸p s e u d o m o n a sx n 一1 细胞质粒的提取和特性研究 别是还原酶( n b z ) 、铁氧化还原蛋白( n b z ) 、氧化酶( n b z - a ) 和氧化酶 ( n b z b ) ，编码的基因分别是n b z a a 、n b z a b 、n b z a c 和n b z a d 。它还可以 氧化许多其它的底物，并且和其它的硝基芳香族化合物氧化酶有很高的同源 性【1 7 】。邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶的活性很高，对核苷酸序列的分析表明，三 个开放阅读框架编码了大小分别为3 3 6 、1 3 0 、3 5 0 k d a 的三种蛋白质，对这 三种蛋白质的氨基酸序列进行同源性分析，发现o r f l 编码了一种l y s r 型的 转录调节子，o f r 2 编码了一种x y l t 型的铁氧化还原蛋白，而o f r 3 则编码 了邻苯二酚一2 ，3 双加氧酶，而且这种酶和芳香族化合物降解过程中的邻苯 二酚2 ，3 双加氧酶，以及降解苯胺和甲基苯胺的菌株p s e u d o m o n a sp u t i d a u c c 2 细胞中的3 - 甲基邻苯二酚- 2 ，3 双加氧酶的氨基酸序列非常接近。这 又一次说明了芳香族化合物在生物降解过程中的相似性i ts 。 微生物对硝基苯的还原降解也是一种主要的硝基苯降解途径，关于在好 氧条件下，微生物采用还原途径降解硝基苯的原因，有两种说法。s h i r l e yf n i s h i n o 15 1 研究了15 5 株硝基苯降解菌，发现绝大多数菌株都采用还原途径降 解，其认为造成这个结果的原因是菌株对环境的适应性，因为菌株来源的环 境都是氧气比较缺乏的环境。而c l a u d i a v o r b e c k 1 9 】贝0 认为硝基苯类化合物的 还原降解是因为其自身的高度缺电子性造成的。 硝基芳香族化合物还原降解途径主要是苯环上硝基被还原的变化，硝基 经亚硝基还原成羟氨基，然后水解脱氨基，生成二羟基芳香族化合物；或者 直接还原成氨基。硝基芳香族化合物在硝基被还原成氨基，生成芳香胺后， 会有不同的变化过程，比如，由苯胺加氧酶作用脱氨基，生成二羟基化台物， 开环降解，或者芳香胺直接开环，然后释放氨基，如图1 5 所示。硝基苯的 还原降解似乎有着些许的差异，即硝基还原到羟氨基后，无法继续被还原到 氨基。 s h i r l e yf n i s h i n o 和j i mc s p a i n 2 0 j 等详尽的研究了菌株p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 对硝基苯的还原降解代谢途径，鉴定了硝基苯降解的 中间产物，分离鉴定了硝基苯降解过程中起关键作用的降解酶，使我们对硝 基苯还原代谢的机理机制有了清晰的认识。而且，他们还发现了一个以前未 见报道的步骤，硝基被还原酶转化为羟氨基后，并不是被还原酶进一步还原 为氨基，而是在异构酶的作用下，羟氨基转化为氨基和羟基，生成邻羟基苯 胺，而后开环降解，如图1 6 所示。p a r k h s 等在对菌株p s e u d o m o n a s p u t i d a h s l 2 降解硝基苯的研究中，也发现了相同的降解途径，说明这个降解途径不 是特殊的，具有一定的普遍性。 r r n 0 r r + 直接开环 环 图1 5 硝基芳香族化合物还原降解的一般途径 f i g 1 5t h eg e n e r a lr e d u c t i v ep a t h w a yo fn i t r o a r o m a t i c sd e g r a d a t i o n 菌株p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 对硝基苯的降解过程是一个典 型的部分还原降解过程，对这个过程的研究代表了硝基苯的还原降解代谢。 在这个过程中，有许多典型的和特殊的降解酶，它们都很有代表性。其中， 比较受关注的主要是硝基还原酶、羟氨基苯异构酶、2 氨基酚1 ，6 - 双氧化酶、 2 一氨基粘康酸半缩醛脱氢酶以及2 一氨基粘康酸脱胺酶，这些酶都是在降解过 程中发挥关键作用的酶。 硝基苯降解菌p s e u d o m o n a sx n 一1 细胞质粒的提取和特性研究 硝基还原酶 1 7 可 n a d p hn a d h 异构酶 r 1 【 l ， 1 【 o h 硝基还原酶 厂可一 n a d p hn a d h 双加氧酶 h + c h 3 c o c o o h 图1 6p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 对硝基苯部分还原降解的途径 f i g 1 6t h ep a r t i a lr e d u c t i v ep a t h w a yo f n i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb y p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 硝基还原酶是催化硝基苯起始还原反应的酶，因为这是硝基苯降解起始 步骤，所以这个酶的作用是很关键的。硝基还原酶是由底物硝基苯诱导的， 卫r 哆 对氧不敏感，大小约为3 0 。k d a 。这种酶是黄素蛋白，每摩尔蛋白含有两摩尔 黄素。实验表明，以硝基苯为还原底物，检测不到亚硝基苯作为中间产物的 存在，而亚硝基苯却可以作为硝基还原酶的还原底物，而且，硝基还原酶对 亚硝基苯的还原活性还要高于硝基苯，这说明，降解过程的确形成了亚硝基 苯，但是其立即就被还原成了羟氨基苯，因此检测不到其存在。羟氨基苯是 以硝基苯为底物，硝基还原酶还原得到的唯一产物，但是羟氨基苯却不能作 为底物被进一步还原，这个结果与硝基苯降解过程是一致的 2 1 1 。 羟氨基苯异构为羟氨基酚是菌株p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 降 解硝基苯过程的一个特殊步骤，催化这个反应的羟氨基苯异构酶也显得比较 引人注目。构建p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 的基因文库，得到两个 开放的阅读框架：h a b a 和h a b b ( 分别为2 5 k b ) ，分别编码了一种羟氨基苯 异构酶：h a b a 和h a b b ，这两种同功酶的氨基酸序列有4 4 是一致的。从大 肠杆菌克隆子中提取的这两种酶的活性，与从生长在硝基苯上的 p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 中提取的这两种酶的活性是相似的。但 是，从大肠杆菌中提取的h a b b 酶具有较高的热稳定性，而h a b a 酶的热稳 定性较差，从菌株j s 4 5 中提取的异构酶的热稳定性则介于两者之间。虽然 h a b a 和h a b b 都可以转入大肠杆菌，并且在大肠杆菌中表达异构酶的活性， 但是反转录酶p c r 分析表明，只有h a b a 可以在p s e u d o m o ”盯s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 转录表达，因此，破坏了h a b b 基因的突变株依然可 以降解硝基苯，但是破坏了h a b a 基因的突变株就丧失了降解硝基苯的能力。 所以，真正在降解过程中起作用的异构酶是h a b a 2 2 23 1 。 2 一氨基酚l ，6 一双氧化酶催化硝基苯降解过程中的开环过程，这种酶在芳 香族化合物的降解过程中是常见的，也是必需的，比如如前所述的菌株 c o m a m o n a s s p j s 7 6 5 细胞内的邻苯二酚2 ，3 双加氧酶以及菌株 p s e u d o m o n a s p u t i d au c c 2 细胞中的3 - 甲基邻苯二酚2 ，3 双加氧酶都与这种 酶在功能和结构上有相似之处。但是，值得注意的一点是邻苯二酚会使2 氨 基酚1 ，6 一双氧化酶的催化活性减弱，因此在这个还原降解过程中，没有出 硝基苯降解菌p s e u d o m o n a sx n l 细胞质粒的提取和特性研究 现邻苯二酚这个芳香族化合物降解过程中最为常见的中间产物f 2 引。 2 氨基粘康酸半缩醛脱氢酶的大小约为1 6 0 k d a ，活性的最适p h 值为7 3 ， 这个酶还可以氧化其他的乙醛类似物，比如苯甲醛。通过与氨基酸序列的匹 配，推断出编码这种酶的基因序列【2 5 1 。 2 - 氨基粘康酸脱胺酶的大小约为1 0 0 k d a ，活性的最适p h 值为6 6 ，经过 脱氨基作用后，可以为微生物生长提供氮源【2 6 i 。 至此，应该说菌株p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i d e n e sj s 4 5 还原降解硝基苯的过程和 其中的各种关键降解酶的特性和功能有了比较清楚的了解。但是，由于编码降解酶的 基因位于染色体上，所以对确定控制降解过程的基因片段造成了困难，只能通过一些 间接的方法来寻找目的基因，比如构建基因文库，或者从酶的氨基酸序列反推编码基 因的核瞢酸序列，以及从已知的基因片段出发，通过设计引物，应用p c r 法寻找基 因片段，这些方法都存在着自身的局限性，而且工作量很大。同时，也难以确定这些 基因片段在染色体上的相对位冕，更难以确定它们之间的内在关系，以及调控基因表 达的机制，这就为深入研究硝基苯生物降解的分子生物学机制设置了障碍，因此在这 方面的研究成果还不多，内容也不够深入。 1 4 硝基苯降解的遗传学机制 1 4 1 微生物降解有机污染物的遗传学研究 随着分子生物学和基因工程技术的发展，人们对微生物降解有机污染物 的研究也提高到了一个新的高度，不再仅仅局限于降解条件、降解效率、降 解产物等等外在的、宏观的问题，而是深入到菌体细胞的内部，探求控制有 机物降解性状的基因及其调控机制。这个问题的研究不仅有利于更加深刻揭 示微生物降解有机污染物现象和本质的联系，而且可以帮助我们应用基因工 程技术，通过对微生物降解基因的改造，创造出适用范围更广，降解效率更 高的新的菌种，来处理一般难以生物降解有机污染物。 当微生物在环境中遇到新的有机物的时候，它们可以通过两种途径来获 得降解这种新有机物的编码基因：一，通过结合和转移的方式从其它的微生 l4 物那里得到所需的代谢基因，这种获得方式的结果是，在一个环境中，降解 同一种有机污染物的基因具有极高的同源性，即使是在不同的环境中得到的 菌株，其降解同一种有机物的基因同源性也很高，这种基因在微生物种群内 传播的现象很普遍，因此，一个基因的研究对相关的其它基因的研究具有很 高的参考价值；二，通过突变过程来调整现有的基因，以获得新的降解基因。 控制有机物降解的基因不仅仅是位于微生物的染色体上，现代微生物学研究 表明，许多有毒的有机化合物，特别是复杂的芳烃类有机物的生物降解，往 往有降解性质粒的参与。 质粒是种环状的d n a 分子，个别时候也可能是线性的( 线性质粒往往 都很大) ，大小一般在2 2 k b 一2 0 0 k b 之间，比染色体要小的多，而且是可以独 立复制的遗传单位。微生物细胞内的质粒种类很多，比如，对抗生素具有抗 性的微生物细胞内往往含有抗药性质粒，控制微生物的抗药性性状。降解性 质粒在有机污染物生物降解过程中起重要作用，它们编码了一些降解过程中 的关键酶类，在微生物降解有机污染物的遗传学研究中，降解性质粒是重要 的一部分。此外，在基因工程技术操作中，质粒是一种非常重要的载体。一 般来说，质粒之有无对宿主细胞的生死存亡和生长繁殖基本没有影响，但在 特定的环境下，由于质粒能给宿主带来具有选择优势的基因，因而具有极其 重要的意义。质粒能够转移，获得质粒的细胞可以同时获得质粒具有的性状。 质粒的一些比较独特的性质，决定了它在微生物生理过程中的一些独特的功 能。比如前面提到的某种功能的基因在微生物种群内的传播，质粒由于能够 通过转移和接合在微生物细胞间移动，所以在基因传播过程中扮演了很重要 的角色。 降解性质粒的研究工作开展于六、七十年代，到现在为止，人们已经发 现了许多与微生物降解有机污染物有关的质粒，并且对其中的许多质粒进行 了分离和鉴定，对质粒的性质、结构和功能进行了研究。这些质粒通常都比 较大，一般都在几十个k b 以上，很多都是上百k b 。一般来说，由于降解性 质粒在微