（环境科学专业论文）亚麻脱胶微生物的筛选、鉴定及其多样性研究.pdf

进行了亚麻脱胶的应用研究，测定了脱胶液中的相关酶活性，结果发现，加菌 脱胶之后脱胶液中的果胶酶和木聚糖酶活性显著增高，纤维素酶活性较低。符 合亚麻脱胶用菌的要求。测定了脱胶液中其他相关参数，还原糖，总含氮量、 p h 值和脱胶率等。测定结果发现，加菌之后还原糖变化不太显著，总含氮量明 显增高，脱胶率提高，p h 略显碱性。 3 对4 株高效脱胶菌产酶活性的影响因素温度、p h 值、碳源、氮源和金 属离子做了相关性的研究。在3 5 左右，脱胶菌产果胶酶活性最高；在底物偏 酸性的环境下，果胶酶活性相对较高；对于碳源的影响，在加入麸皮和豆粉的 培养基中，果胶菌产果胶酶活性相对较高；在氮源加入硫酸铵时，果胶菌产酶 活性相对较高；不同金属离子对4 株脱胶菌的产酶活性影响各不相同。 4 从亚麻发酵液提取不同时间段发酵液中的细菌总d n a ，应用p c r d g g e 技术，分析了亚麻发酵液中的微生物多样性的的动态变化，结果发现亚麻发酵 前期( 2 4 h 左右) ，发酵液中的微生物多样性较高，之后至亚麻发酵结束，细菌 微生物多样性变化不大，多样性相对较稳定。对于四种不同处理的亚麻发酵， 结果发现不同处理亚麻发酵液中微生物多样性有很大不同，通气的亚麻发酵液 中细菌微生物多样性相对较高，加入尿素之后微生物多样性明显减少，加入细 菌g j 一8 6 6 之后微生物多样性中出现明显优势菌群。 关键词：亚麻，生物脱胶，脱胶菌，果胶酶，微生物多样性 s t u d yo ns r y e e n i n gb a c t e r i ao ff l a xd e g u m m i n g 、 i d e n t i f y i n ga n dk n o w l n ga b o u tmi c r o b i o l o g y d i v er s l t y a b s t r a c t f l a xi sav e r yi m p o r t a n tt e x t i l er a wm a t e r i a la n di sp o p u l a rw i t hp e o p l e t h e r e a r et h r e em a i n l ym e t h o d so ff l a xd e g u m m i n g ，p h y s i c a l ，c h e m i c a la n db i o l o g i c a l a t p r e s e n tb i o l o g i c a l f l a xd e g u m m i n gi st h em a i nu s i n ga n di n v e s t i g a t i v em e t h o d b i o l o g i c a lf l a xd e g u m m i n gi n c l u d e sa d d i n gb a c t e r i u ma n da d d i n ge n z y m e i nt h i s t h e s i si th a si n v e s t i g a t e dc o r r e l a t i o np a r a m e t e ra n df a c t o r so ff l a xd e g u m m i n gi nl a b c o n d i t i o n s a n a l y s e t h ef l a x d e g u m m i n g f a c t o r sw i t h d e t e r m i n i n ge n z y m e a c t i v i t y t h e yh a v ef i l t e r e ds o m eb a c t e r i ao fe f f ic i e n tf l a xd e g u m m i n ga n dm a d et h e i d e n t i f i c a t i o n t h e yh a v ei n v e s t i g a t i v e dt h ei n f l u e n c ef a c t o r so fd e g u m m i n gb a c t e r i a 、s p e c t i n a s ea c t i v i t y t h e ya l s oi n v e s t i g a t i v e dt h em i c r o o r g a n i s md i v e r s i t ya td i f f e r e n t c o n d i t i o n so ff l a xd e g u m m i n gu s i n gd g g em e t h o d t h em a i nr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1 a tt h ep r o c e s so ff l a xd e g u m m i n g ，t h ea m o u n to fa l i v eb a c t e r i u mg o e su pa t t h ep r o p h a s ea n df a l l sa tt h ea n a p h a s e p e c t i n a s e ，c e l l u l o s ea n dx y l a n a s ea r ev e r y i m p o r t a n ta n dh a v ee f f e c t so nf l a xd e g u m m i n g ，t h ec o n t e n to fp e c t i n s ei sh i g h e rt h a n t w oo t h e r s t h eq u a n t i t yo fn i t r o g e na n dr e d u c i n gs u g a ra r er a p i d l yi n c r e a s i n ga tt h e p r o p h a s eo ff l a xd e g u m m i n g i nt h ef a l xd e g u m m i n gp r o c e s sm i c r o o r g a n i s mu t i l i z e c a r b o n t h ec o n t e n to f r e d u c i n gs u g a rd e c r e a s ea n dt h ec o n t e n to fn i t r o g e ni n c r e a s e a m o n g t h e f l u c t u a t i o n p h h a sas h a r pd e l i n ei nt h e p r o p h a s e a n db e c o m e s s t a b i l i z a t i o ni nt h ea n a p h a s e c o dh a sas h a r pi n c r e a s ei nt h ep r o p h a s ea n dh a sa s l o w n e s si n c r e a s ei nt h ea n a p h a s e a m o n gt h ei n f l u e n c e f a c t o r ，w oc h o o s et e m p e r a t u r e ，r a t i oo ff l a xs t e mt o w a t e r , p ha n dd e g u m m i n ga d d i t i v et oi n v e s t i g a t e t h eo p t i m u me r t e m a lr e t t i n g c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：w a t e rt e m p e r a t u r e3 5 。c ，r a t i oo ff l a xs t e mt ow a t e1 ：2 0 a n dp h6o r8 t h ea c t i v i t yo fp e c t i n s ei sh i g h e r a d d i n gu r e ai n t or e t t n gw a t e rh a s h i g h e ra c t i v i t yo fp e c t i n s et h a na d d i n g o t h e r sa n da d d i n gn o n e t h ea c t i v i t yo f x y l a n a s ei sh i g h e rw i t ha d d i n ga m m o n i u m n i t r a t et h e no t h e r s 2 t h e r ea r ea b u n d a n tm i c r o o r g a n i s mi nt h es o i l v v h e nf l a xw e r er e t t i n g ，w e a d d e dd i f f e n tt y p eo fs o i li n t ot h er e t t i n gw a t e ra n dm o r et h e n5 0b a c t e r i aw e r e s c r e e n e df r o mt h e m f o u rb a c t e r i aw i t hh i g h e rf l a xr e t t i n ge f f e c tw e r ec h o s ef r o m t h e m i no r d e rt oi d e n t i f yt h e i rc a t e g o r yw ed e t e r m i n e dt h e i rg e n es e q u e n c e t h e y w e r ep r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da n dg j - 8 7 - 1 ，g j 一8 7 2 ，g j - 8 7 3w e r en a m e da sb a c i l l u s g j 8 6 6w e r en a m e da sp a e n i b a c i l l u sm a s s i l i e n s i s w ea d d e dt h e s ef o u rb a c t e r i ai n t o f l a xs t e mr e s p e c t i v e l ya n da d d e dw a t e rt or e t ，t h e nd e t e r m i n e di n t e r r e l a t e de n z y m e t h er e s u l tw e r et h a tw h e nw ea d d e db a c t e r i aw ef o n dt h ea c t i v i t yo fp e c t i n s ea n d x y l a n a s eo b s e r v a b l yi n c r e a s e da n da c t i v i t yo fc e l l u l o s ew a sl o wi nr e t t i n gw a t e r t h e yc o n f o r m e dt ot h er e q u i r eo fd e g u m m i n gb a c t e r i a w ea ls od e t e r m i n e do t h e r s i n t e r r e l a t e dp a r a m e t e rr e d u c i n gs u g a r , n i t r o g e n ，p ha n dr a t i oo ff l a xs t e md e g u m m i n g t h er e s u l tw e r ea sf o l l o w s ：w h e nw ea d d e db a c t e r i ai n t or e t t i n gw a t e rt h er e d u c i n g s u g a rh a sn or e m a r k a b l ec h a n g e ，t h ec o n t e n to fn i t r o g e nh a sas h a r pi n c r e a s e ，t h e r a t i oo fd e g u m m e df l a xs t e mi n c r e a s e da n dp hs h o w e da l k a l e s c e n c e 3 w ei n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c i n gf a c t o r st ot h ea c t i v i t yo fp e c t i n s ea b o u tt h e f o u rb a c t e r i at e m p e r a t u r e ，p h ，c a r b o n ，n i t r o g e na n dm e t a li o n t h ep e c t i n s e sa c t i v i t y o fb a c t e r i aw a sh i g h e ra t3 5 。ct h a no t h e r s ；t h ep e c t i n s e 、sa c t i v i t yo fb a c t e r i aw a s i v c o m p a r a t i v e l yh i g h e rw h e nt h es u b s t r a tw a sa ta c i dc o n d i t i o n ；t oc a r b o no r i g i n ，t h e a c t i v i t yo fp e c t i n s ew a sh i g h e rw h e nw ea d d e db r a na n dp u l s ef l o u rt h a no t h e r s ； a d d i n ga m m o n i as u l f a t e ，t h ea c t i v i t yo fp e c t i n s ew a sh i g h e rt h a na d d i n go t h e r s ； d i f f e r e n tm e t a li o nh a sd i f f e r e n te f f e c tt ot h ea c t i v i t yo fp e c t i n s ea b o u tt h ef o u r b a c t e r i a 4 w ee x t r a c t e dd n ao fb a c t e r i af r o mt h er e t t i n gw a t e ra td i f f e r e n tt i m ea n du s e p c r - d g g em e t h o dt oi n v e s t i g a t e dd y n a m i cc h a n g eo fm i c r o o r g a n i s md i v e r s i t yi n t h er e t t i n gw a t e r t h er e s u l tw a st h a tm i c r o o r g a n i s md i v e r s i t yo ft h er e t t i n gw a t e rw a s h i g h e ra tp r o p h a s et h a na to t h e rt i m e ( a ta b o u t2 4h o u r s ) ，t h e nt h em i c r o o r g a n i s m d i v e r s i t yw a ss t e a d yu n t i lf l a xr e t t i n gf i n i s h e d w h e nw eu s e df o u rm e t h o d st od e a l w i t ht h ef l a xd e g u m m i n g ，t h er e s u l s to fm i c r o o r g a n i s md i v e r s i t ya b o u tt h er e t t e d w a t e rw e r ev e r yd i f f e r e n t m i c r o o r g a n i s md i v e r s i t yi sh i g h e r t h a no t h e r sw h e n w e a d d e do x y g e nt ot h er e t t i n gw a t e r w h e nw ea d d e du r e ai n t ot h er e t t i n gw a t e rt h e m i c r o o r g a n i s md i v e r s i t yd e c r e a s e d t h e r ew e r ed o m i n a n tp o p u l a t i o nw h e n w ea d d e d g j 一8 6 6t ot h er e t t i n gw a t e r k e y w o r d s ：f l a x ，b i o l o g i c a ld e g u m m i n g ，d e g u m m i n gb a c t e r i a ，p e c t i n a s e ， m i c r o o r g a n i s md i v e r s i t y v 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得内蒙古大学及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的通知对 本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名= 韵习兰 一一 日 艚老师繇堡薹： 指导老师签名： 全一! 一二一 日 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位 论文的全部内容或部分内容保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允 许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。 为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使 用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于 发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：纽蒸车 日 指导老师躲莹生 指导老师签名： 一二一一 日 麻脱胶微生物的筛选、鉴定及其多样性研究 第一章亚麻脱胶微生物研究进展 1 1 亚麻生产概况 亚麻别名胡麻，属亚麻科，亚麻属，为一年生草本植物。亚麻纤维来源于亚麻这种植物。 亚麻纤维是世界上最古老的纺织纤维，亚麻的原产地至今说法不一，有主张原产地在黑海或 里海的，也有主张在波斯湾沿岸及中国。古埃及人早在8 0 0 0 年前就使用了亚麻，是亚麻发展 的起点。我国在4 7 0 0 年前使用了亚麻。新石器时代，埃及人就将亚麻引进了地中海沿岸的国 家，到罗马帝国兴盛时期，亚麻在欧洲各地更加普遍，中世纪以来，亚麻又从瑞士传到法国、 英国、比利时等国家。到十世纪初，亚麻纤维即开始作为商品在市场上流通。 亚麻的种植区域较广，除主产于北纬4 5 0 到北纬5 5 0 之间的东欧诸国和我国的东北地区外， 在我国的湖南、浙江和云南等长江流域及其以南地区( 南方) 均可利用冬闲地种植，我国常 年种植面积为4 9 万公顷，高峰时达2 0 万公顷，其生产规模已超过俄罗斯，居世界首位，年 创汇近8 - - 9 亿美元，亚麻产业已成为我国出口创汇的重要产业之一。特别是随着世界服装 纤维天然化、多样化潮流的兴起，纺织品的“绿色革命 ，亚麻纤维织物倍受人们的偏爱。 亚麻纤维制成的织物用途很广泛，可以用作服装面料、装饰织物、桌布、床上用品和汽 车用品等产业用品。亚麻作为主要的高级麻纺原料，素有“纤维皇后 的美称，具有“既挺 括又柔韧，既有光滑外表又爽快的内质，视之有明亮光泽而不闪烁耀眼，触之有翩翩之感而 不觉轻浮，给人以峰韧纯洁，柔和自然，明亮美观，端庄大方的特殊感觉”的特殊风格f 2 l 。 1 2 亚麻脱胶原理及过程 亚麻纤维存在于亚麻原茎的韧皮部，亚麻的单纤维长度为1 0 - - - 2 6m m ，单纤维两端靠果 胶质轴向搭接形成纤维束，纤维束之间，韧皮与木质部之间均靠胶质相联。为了制取亚麻中的 可纺纤维，必须破坏纤维束与周围组织的连结程度，使得韧皮与木质部易于分离，同时又较少 破坏连接单纤维之间的胶质，这个工艺过程称为亚麻原茎脱胶。通过这个工艺过程可去除亚 麻纤维的果胶、半纤维素和木质素等非纤维素物质( 通称为胶质) 。这种工艺俗称沤麻，即 内蒙古人学硕一i ：论文 将纤维素同其他物质分离。沤麻的方法主要有两种：露水沤麻和水池沤麻。露水沤麻方法就 是将亚麻散铺在地面上，通过露水、雨水、阳光以及一些细菌的作用，将亚麻外面的表皮腐 蚀和溶解；水池沤麻的方法是将砸麻浸泡在水中，经过6 2 0 天，通过细菌的作用使麻表皮 溶解，但这个过程与露水沤麻比起来成本较高| 2 i 。 亚麻脱胶是一个复杂生物发酵过程，大致分为三个阶段p i ：物理阶段、前生物阶段和主 生物阶段。 物理阶段：注水之后，亚麻茎被浸湿，继而膨胀，麻茎体积增大，麻茎中的可溶性有机 质及矿物质从麻茎内部逐步扩散到水中，使沤麻水颜色加深，该阶段基本上没有微生物生长。 该阶段的持续时间从加入温水( 3 0 3 2 ) 开始，一般为6 8 小时。 前生物阶段：紧接着物理阶段，持续1 8 2 4 h ，沤麻水中的可溶性有机质被微生物分解，产 生酸类，氢气及二氧化碳，使沤麻水酸度下降。 主生物阶段：从f j i 生物阶段结束至沤麻结束，麻茎中的果胶类物质被微生物分泌的酶部 分分解。首先是原果胶酶作用于不溶性果胶使之变成可溶性果胶，然后受到果胶脂酶的水解， 生成果胶酸等物质，果胶酸进一步被多半乳糖醛酸酶水解生成半乳糖醛酸等物质。果胶类物 质被部分分解的结果是纤维束被释放，使韧皮部和木质部易于分离，从而达到脱胶的目的。 1 3 亚麻天然微生物脱胶研究进展 利用天然存在的微生物进行麻类脱胶，古已有之，我国诗经陈凤里就有“东门之 池，可以沤麻”的记载。目前，亚麻天然微生物脱胶方法主要有水沤法和雨露法两种，水沤 法又分为温水沤麻法和天然水沤法。亚麻温水沤麻法是在天然水沤法的基础通过人工控制水 温，使麻茎在适宜的温水中沤制，利用温水中存在的天然微生物对亚麻进行脱胶，它是我国 北方亚麻脱胶最主要的方法。亚麻天然水沤麻法是将收割后的亚麻浸渍在池塘、湖泊或水沟 中，利用麻茎及水源中天然微生物的发酵作用分解麻茎内的胶质，致使韧皮部与木质部分离。 因国内外亚麻主产区分布于高纬度地区，亚麻收获后气温和水温迅速下降，天然水沤法脱胶 的研究和应用极少。这是传统的沤麻方法，但传统的沤麻方法存在着诸多问题，如菌株混杂， 难以进行有效的控制，导致脱胶时间长、综合长麻率低、质量不稳定( 束纤维强力低) 和环 境污染重等诸多问题，严重制约着哑麻产业的大力发展。 2 亚麻脱胶微生物的筛选、鉴定及】e 多样性研究 1 4 亚麻脱胶方法研究 目前，对亚麻脱胶及相关研究逐渐增多，传统的温水浸渍脱胶利用麻茎和水源中存在的 微生物通过自然发酵作用，产生果胶酶等酶类，使果胶类物质部分分解。但存在脱胶时间长， 麻纤维可纺性较差等缺点，因此研究者在温水浸渍的基础上加入其他物质，力图改进其缺点。 目前关于生物脱胶方法的研究主要包括化学助剂脱胶、加菌脱胶、加酶脱胶三个方面。其中 化学法脱胶较早，后来主要是对加菌脱胶的研究较多，酶法脱胶是年代发展起来的新的脱胶 技术。 1 4 1 化学脱胶 在沤麻过程中，向沤麻水中加入一定量的化学试剂，提供微生物生长所需的氮源、碳源 等营养物质，帮助亚麻脱胶尽快完成，称为化学助剂法脱胶【4 】。由于其纤维质量及可纺性较 差和水污染问题，少有采用。 早期，前苏联学者进行过化学脱胶的研究，并得出通过添加亚麻原茎重量的硫酸铵或碳酸 铵，可以使亚麻脱胶时间缩短2 4 6 3 3 。a n d e r sp e t e r 先生研究了加入e d t a 、三聚磷酸钠、 氢氧化钠等化学试剂添加量与亚麻脱胶效果的关系1 5 1 。 我国对亚麻化学法脱胶的研究也有，但不多。有研究者向亚麻脱胶水中加入硝酸铵、碳 酸铵、尿素等化学助剂对脱胶效果的影响，通过对脱胶时间$ 1 p h 值和果胶酶活性的变化，得 出了适宜脱胶的化学助剂的种类，添加量和添加时间，并对沤麻水p h 值、氨基氮、细菌数量 等的变化规律进行了研究，发现化学试剂的加入在缩短脱胶时间的同时，也可以提高纤维质 量【刚。此外，也有向沤麻水中加入表面活性剂的研究，在化学脱胶的基础上加入不同类型表 面活性剂，尤其是高分子表面活性剂，改进了传统的亚麻化学脱胶工艺，可以明显提高麻质 量，缩短脱胶时间1 7 堪j 。 1 4 2 加菌脱胶 加菌脱胶是把脱胶细菌进行扩大培养，加入到脱胶液中，在适宜条件下使细菌大量繁殖， 分泌出酶液来分解胶质，将果胶和半纤维素等大分子溶进沤麻水中，从而达到脱胶的目的。 此方法是我国目自仃研究最多的脱胶方法。 内蒙古人学颂l ：论文 1 4 2 1 加菌脱胶的原理 自然界中的生物可以根据它们生长所需要的营养物质的性质不同将它们分成两类基本的 营养类型：一类是在生长时需要以复杂的有机物质作为营养物质，这类生物通常称为异养型生 物；一类是在生长时能以简单的无机物作为营养物质，这类生物通常称为自养型生物。目前 工业发酵中包括亚麻脱胶工艺使用的菌种一般都是异养型生物。对于脱胶菌来说，要维持生长 繁殖所必须进行的新陈代谢，就必须从周围的生长环境，即脱胶液罩获得这些物质。脱胶液 中，大部分营养物质是聚戊糖、聚己糖和杂聚多糖，这些都是不能被菌种直接利用的营养源。 处于这种环境中，微生物会自动通过新陈代谢来分泌一定的胞外酶系，将上述营养物质水解 成可以利用的单糖后再吸收。 脱胶液中的物质传递过程如下：可溶性物质溶入脱胶液中一脱胶菌利用脱胶液中物质生 长繁殖一脱胶菌在新陈代谢中分泌果胶酶和半纤维素酶等酶，这些酶对果胶质和半纤维素类 物质进行水解一脱胶菌吸收利用水解后形成的单糖。单糖分子被吸收到生物体内就会进入糖 酵解过程。糖酵解途径简称e m p 途径或e m 途径。e m p 途径包括几个独立而又连续的反应，分别 由特定的种酶催化，大致以下分为三个阶段：第一阶段为葡萄糖分子活化阶段，是需能过程， 共消耗2 分子a t p ，将葡萄糖分子磷酸化后转化成高度活化的l ，6 一二磷酸果糖形式；第二阶段 为六碳糖降解为三碳糖阶段，1 ，6 一二磷酸果糖裂解为两个可以相互转换的三碳糖；第三阶段 为氧化产能阶段，3 一磷酸甘油醛经过一系列脱氢、异构、脱水和能量转换等反应，最后生成 丙酮酸。糖酵解所得的最终物质丙酮酸无论在有氧还是无氧条件下，都要继续转变在有氧条 件下，丙酮酸将继续分解为二氧化碳和水，进一步释放它的化学能；在无氧条件下，将进一 步转化成乙醇、乙酸、丙酸、乳酸、丙酮、丁酮、甘油等一】。 1 4 2 2 加菌脱胶研究进展 加菌脱胶的实质就是利用加入的优势脱胶菌株的繁殖和发酵作用产生果胶酶类，使果胶 类物质部分分解。因此，能产生果胶酶，分解果胶的菌种的分离、筛选和鉴定研究非常重要。 国外对黑曲霉真菌脱胶研究较多，真菌脱胶存在许多缺点，真菌生长速度慢，脱胶周期 长，一般需一周以上，酸性生长条件，且真菌会产生纤维素酶，纤维强力容易受到损害，残 胶率较高m 。 m a c h a m m a d h 禾l b e t r a b e t 分别对多粘芽抱杆菌和假单胞菌的浸解活性进行了研究，丌始关 注对生物脱胶技术生产应用1 2 1 。 4 亚麻脱胶微生物的筛选、苍定及j e 多样性砂f 究 国内研究比较多的是中性偏碱性的细荫脱胶，包括脱胶菌种的选育。脱胶新技术等研究 在亚麻沤制过程中加入一些特别培育的果胶分解菌种，使亚麻茎的沤制间缩短。这方面的研 究在中国农业科学院湖南农业大学和齐齐哈尔大学研究较多。刘晓兰等在现行温水浸渍亚麻 脱胶过程中，通过对过程中产果胶酶的微生物数量和果胶酶活力变化规律的研究，分离筛选 出了一株产果胶酶活力较高的兼性厌氧菌株，并研究了该菌株的种子培养条件，与常规温水 浸渍法相比，脱胶周期可缩短，且麻纤维质量有所改善3 1 。 田英华等利用优选的亚麻脱胶菌株，对亚麻脱胶条件进行了测试，通过紫外线处理黑曲 霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) h y 4 孢子，获得了一株高产酶突变株，其酶活力可达比出发菌株提高了 两倍。中国农业科学院麻类研究所通过广泛采集菌样、初筛、复筛和诱变育种等手段，获得 了株编号为y m 6 8 亚麻快速脱胶菌株该菌株在实验室条件下1 6 h 内可完成亚麻脱胶与传统脱 工艺相比，其脱胶周期缩短以上7 0 以上、纤维强力和长度约分别提高5 0 和3 3 、c o d 降 低左右1 7 。并对发酵液中各指标进行定期测定，分析了果胶、半纤维素、木质素等化学成 分在脱胶过程中的变化情况【1 4 。7 1 。为解决较粗放条件下在大规模生产管理问题，他们还进行了 该技术的规模化生产应用研究，获得了工厂化生产研究最佳技术参数和工艺流程【l 引。黄小龙 等研究了南方亚麻天然水沤法脱胶过程中微生物种类与数量、脱胶酶等各参数的动态变化规 律，外界因子，麻茎特性等影响因子与亚麻脱胶的相互关系，并从亚麻茎上筛选得到了一株 产果胶酶和木聚糖酶活性较高的脱胶菌株a 6 ，初步鉴定为环状芽抱杆菌，进行了亚麻酶法脱 胶的初步研究引。葛著萍、凌宏志等也从不同发酵时期的沤麻液中，分离得到两株果胶酶产生 菌m h z p 一0 l 和m h z p 0 2 ，经初步鉴定也为芽孢杆菌属，并进行了培养条件实l2 0 j 。除此之外， 许多学者通过研究发现，真菌担子菌纲中的木腐真菌具有较强的降解木素的能力，其中白腐 真菌降解能力最强 2 1 - 2 2 。有实验证明白腐真菌经载体固定化培养获得的木质素过氧化物酶酶 活是悬浮培养的7 1 倍，但载体投加量对其产酶影响很大【2 引。 1 4 3 酶法脱胶及研究进展 随着生物技术的发展，亚麻脱胶研究己经深人到分子水平，即酶法脱胶。生物酶是一种 无毒、对环境友好的生物催化剂，其化学本质为蛋白质【2 引。酶的生产和应用广泛，可以用在 食品、制药、纸浆和造纸、水处理、纺织等工业中，在国内外己具有8 0 多年历史。进入2 0 世 纪8 0 年代，生物工程作为一门新兴高新术在我国得到了迅速发展，酶的制造和应用领域逐渐 扩大，酶在纺织工业中的应用也同臻成熟，关于酶法亚麻脱胶的研究也越来越多。酶法脱胶 就是将脱胶菌种培养到菌生长的衰老期后进行过滤或离心等处理，再用得到的粗酶液浸渍亚 内蒙古人学硕i ：论文 麻原茎，或者将粗酶液提纯、浓缩为液剂，也可将该浓缩液干燥成为粉剂，使用时将液剂稀 释或将粉剂溶于水，把亚麻原茎浸渍在酶稀释液中进行酶解脱胶| 2 川。 酶法脱胶的主要特点有：( 1 ) 高选择性，它的选择性超过了任何人造催化剂，例如果胶 酶它只能将果胶迅速转化成果胶酶与果胶的复合物，而对其他反应没有任何活性。( 2 ) 高效 率，它比人造催化剂的效率高出1 0 9 至1 0 1 5 倍：( 3 ) 反应条件温和，一般在常温、常压下进行。 ( 4 ) 反应历程复杂，受底物浓度、p h 、温度等影响较大 2 6 j 。 酶法亚麻脱胶技术具有酶作用条件温和，不需要高温加压，因而设备投资少，易于工业 化生产；不需要强酸强碱条件；工业生产污染轻，废水易处理，无空气污染等优点。因此逐 渐受到人们的重视【i1 。 为进一步提高亚麻脱胶效率，从根本上消除亚麻脱胶带来的环境污染，长期以来人们一 直努力寻找现行亚麻脱胶的替代方法，2 0 世纪8 0 年代，国外对亚麻的酶法脱胶进行了广泛的 研究。1 9 8 7 年由n o v o n o r d i s k 公司和比利时的g h e a t 大学合作开发了一种用于亚麻脱胶的混合 酶制剂脚y m p f ”j 。它是由a s p e r g i l l u s 廊p d 力i 础s 或彳a c u t e a t u s 的菌株产生的液体混合酶制剂。 在随后的几年罩，u l t r a z y m ，e p m 及v i s c o z y m el 等一批亚麻脱胶酶制剂相继研制成功，并申 请了专利保护。v a ns u m e r e 和s h a r m a 测定了f l a x z y m e 的组成主要品为果胶酶、木聚糖酶、 纤维素酶、甘露聚糖酶等1 2 8 i 。f l a x z y m e 矛i 其他一些脱胶效果良好的微生物酶制剂都有较高的 果胶酶活力。以3 1 的浓度，浴比1 ：l o 使用f l a x z y m e 进行亚麻酶法脱胶试验，所得纤维与温 水脱胶所得品质最佳的纤维在细度、强力、色泽和蜡质含量等方面相当。美国f o u l k j a 等对 亚麻酶法脱胶的条件进行了研究，结果表明亚麻原料经加压处理后，有利于脱胶酶的吸收， 加快脱胶的速度1 2 9 j 。酶法脱胶存在的问题主要是，虽然效果好但目前成本较高，无法应用于 工业生产，所以近年来关于减少酶的用量的研究较多1 3 0 。1 1 ，主要是在加入酶进行沤麻的同时 也加入一些鳌合剂，如e d t a ( 乙二胺四乙酸二钠) 、草酸等，缩短沤麻时间，减少酶用量，同 时提高纤维质量。得出e d t a ，草酸等可以减少酶用量，原因可能是去除了胞间层果胶链中 的c a 。并进一步研究了酶法脱胶对亚麻结构和组成的影响。目前，美国农业部正在形成基于 果胶酶和鳌合处理的完整的亚麻加工过程的概念。也有报道用弱酸酸对麻茎预浸润后，再用 酶进行沤麻的，这种方法可以去除果胶链中的钙离子和纤维表皮皮质，减少酶的用量1 3 2 。引。 此外，研究者在酶法脱胶过程中加入助，唧肠砂加以鲫p 和尺乃f z d ，z “c d ，p u s i l l u s ，取得了较好的脱 胶效果1 3 4 - 3 5 1 。成品酶制剂脱胶的研究较少，关于如何减少酶的用量的研究未见报道。一般认 为果胶酶在脱胶中起主导作用，半纤维素酶和少量的纤维素酶也发挥着一定的作用。但近来 的研究表明，半纤维素和纤维素在脱胶中不一定不是必须的。g u n n a rh e n r i k s s o n 和d a n n 6 亚麻脱胶微生物的筛选、签定及j e 多样性训f 究 e a k i n 3 6 - 3 7 1 将在北美和西欧地区从雨露麻中分离筛选出的几株真菌分别进行固体发酵，所得 粗酶液用于亚麻脱胶。试验结果表明，r h i z o m u c o r p u s i l l u s 在以麻茎和果胶为唯一碳源的培 养基上生长良好，固体发酵所产生酶液对亚麻脱胶最有效。脱胶后的亚麻纤维柔软，品质优 良。向r h i z o m u c o r p u s i l l u s 沤麻液中加入螫合剂草酸能够促进脱胶效率。以商品酶l j 齐l j f l a x z y m e 和蛋白质浓度约为f l a x z y m e l 1 0 的r h i z o m u c o r p u s i l l u s 的粗酶液分别进行亚麻脱胶，两者的脱 胶效果相同。s d s p a g e 分析酶制剂的蛋白组分，发现此酶制剂含有丰富的内切多聚半乳糖 醛酸酶，不含果胶甲基水解酶、果胶裂解酶、木聚糖酶，但含有极其微量的纤维素酶。因此 推测内切多聚半乳糖醛酸可能是沤麻的关键酶。 我国酶法脱胶技术方面也有研究，主要在细菌所产粗酶液脱胶方而成品酶制剂脱胶的研 究较少，关于如何减少酶的用量的研究未见报道【3 引。 我国对亚麻脱胶的研究尚处于初级阶段，还没有专用于亚麻脱胶的酶制剂。近年来对亚 麻脱胶的工作主要集中在脱胶菌的选育和接菌脱胶工艺的研究上，还不能成为严格意义上的 酶法脱胶。但这些工作为研究酶法脱胶及脱胶酶制剂的生产奠定了基础。我国的科研工作者 王奉喜等曾经引进前苏联的酶制剂和n o v o n o r d i s k 公司的n o v o f l a x z y m e 酶制剂产品进行亚麻 的酶法脱胶研究。结果表明，加酶量为亚麻原茎重量的0 5 ，水温为3 8 c ，浸渍过程中不换 水，脱胶周期为5 0 7 0 h ：在脱胶液中加入1 l 非离子表面活性剂，保持4 5 恒温，可是脱胶 缩短3 0 h 左右，且酶液可以重复利用6 8 次，从而节省成本，而打麻的质量和出麻率均比温水 亚麻脱胶有明显的效果，脱胶液经处理后废水达到了城市废水排放标准，减少了污水处理的 成本i - 3 9 。 1 4 4 三种脱胶方法的比较 ( 1 ) 加菌脱胶与酶法脱胶相比，有一个显著的不同，加菌脱胶直接将培养好的细菌接种在 麻茎上，让细菌在沤麻水中繁殖，分解胶质，而酶法脱胶直接利用获得的生物酶来催化水解 胶质。从工艺上讲，酶法脱胶操作比细菌脱胶灵活，可以添加多种辅助酶制剂，并且细菌培 养与脱胶过程分开，质量容易控制。 ( 2 ) 从脱胶时间缩短来看，资料显示，这三种方法因不同程度提高沤麻液中的果胶酶活力， 加速果胶酶对果胶的分解，与传统的天然温水浸渍方法相比，加酶、加菌、加化学助剂分别 缩短沤麻时间6 0 ，3 0 ，4 0 以上。 ( 3 ) 从脱胶后的纤维质量上看，加酶脱胶效果最好，其次是加菌脱胶，化学助剂法较差。 ( 4 ) 从生产成本来看，酶法沤麻成本高，主要是果胶酶价格高，工厂难以承受。加菌沤麻 7 内蒙古人学硕i ：论文 方法中，除了增加一套培菌设备以外，生产中基本不增加过程成本，化学助剂成本比前两者 低。 ( 5 ) 从技术复杂程度方面来看，酶法和化学助剂法较简单、易操作，加菌沤麻需对生产人 员进行专门的培训。 酶法脱胶与加菌脱胶是相互关联不可分割的，加菌脱胶实际就是利用脱胶菌脱胶过程中 所产生的脱胶酶来分解亚麻纤维束之间的果胶，从而达到亚麻脱胶的目的。酶法脱胶是利用 脱胶菌所产生的脱胶酶经粗提或者纯化后进行脱胶。 1 5 1 环境微生物多样性 1 5 环境微生物多样性和研究方法 微生物是地球上最早出现的生命形式，其生物多样性在维持生物圈和为人类提供广泛而 大量的未开发资源方面都起着主要的作用。微生物的多样性包括所有微生物的生命形式、生 态系统和生态过程以及有关微生物在遗传、分类和生态系统水平上的知识概念。 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物：细菌、放线菌、原生动物、真菌、藻类 和病毒，是生物多样性的重要组成部分。微生物物种繁多，是地球上仅次于昆虫的第二大类 群的生物。微生物物种的多样性是微生物多样性的最基本的内容，但微生物物种多样性的研 究要落后于其它的大生物类群。微生物多样性与其它生物类群相比有许多独特之处：( 1 ) 生 活环境的多样性，微生物可在高温、高盐、高碱、高压和低温、低p h 等极端环境中生长，具 有特殊的生理功能和适应能力；( 2 ) 生长繁殖速度的多样性：微生物生长和繁殖的速度差异 极大，细菌的生长繁殖速度极快而某些地衣型真菌生长极慢；( 3 ) 营养和代谢类型的多样性： 微生物的能量和物质的获取和利用方式多种多样，如有光能自养型、化能自养型、异养型和 无机营养型等各种微生物；( 4 ) 生活方式的多样性：微生物可自由生活在环境中，也可与其 它生物成各种各样的生活方式和不同的关系，如互生、共生、寄生和拈抗等。 1 5 2 传统微生物多样性研究方法 最早检测微生物的多样性是通过显微镜进行的，列文虎克利用显微镜观察菌体的形态使 人们对微生物的研究成为可能：科赫建立了微生物纯培养技术，人们除了可以对研究对象进 行形态观察外，还能够对其生长所需的营养要求、环境条件和生长特性进行深入的研究，这 弧麻脱胶微生物的筛选、鉴定及j 多样性研究 一技术也成为研究微生物种群多样性的一个经典方法。但随着研究的不断进行，这一技术暴 露出了其最大的局限性即平板计数异常( p l a t ec o u n t a n o m a l y ) ，只有少数的微生物能在实验室获 得培养成功，许多微生物是难培养的，甚至是不能培养成功的，可培养微生物只是很少的一 部分。 1 5 3 微生物的现代分子生物学研究方法 随着重组d n a 技术的出现和广泛应用，微生物种群小规模研究成为可能。它克服了传统 培养方法的局限，可以从基因水平准确定位微生物的分类地位和种群关系。 近十年来，分子生物学的发展使得我们可以摆脱依赖培养的传统方法的束缚，开辟了一 条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路、新途径。 p a c e 等( 1 9 8 6 ) 首次将5 sr r n a 基因用于环境样品中总微生物的测定，随之很快被用于微 生物多样性研究领域。由于5 sr r n a 基因相对较小( 约2 0 个核苷酸) ，携带信息相对较少，因 而揭示微生物群落多样性的能力有限。1 6 sr r n a ( 约1 5 k b ) 种类少，含量大( 约占细菌r n a 含量的8 0 ) ，分子大小适中，存在于所有生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结 构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称( 焦振泉，1 9 9 8 ) 。细菌的1 6 sr r n a 的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，设计引物将1 6 sr r n