（环境科学专业论文）人工合成寡核苷酸的液相色谱质谱研究.pdf

人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 子离子谱图主要受碰撞能和电荷态的影响。碰撞能越大，碎片离子越多，碎 片离子m z 分布越窄；在得到相似碎片离子谱图时，高电荷态较低电荷态需 较少的碰撞。 3 应用h p l c m s m s 不仅能快速鉴定s n p 分型类别，而且可通过测序快速确 定位于片段前端或后端的s n p 位点。 4 应用h p l c m s m s 可快速定量甲基化率，并且可通过测序确定甲基化位点。 t - r i c h 片段中碱基c 被m 5 c 替换时，只使片段在h p l c 中的保留时间增加， 而不改变片段在m s m s 中的破碎规律。不同电荷态下片段在m s m s 中的破 碎规律不同，低电荷态下有利于快速确定甲基化位点。 5 自制高分辨t o f m s 调试结果显示其具有优越的性能，已成功测试了脱氧三 磷酸鸟苷( d g t p ) 。 关键词：高效液相色谱一串级质谱联用仪，s n p 分型，d n a 甲基化，飞行时间 质谱仪 i i 摘要 a b s t r a c t s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) g e n o t y i n ga n dd e o x y 曲o n u c l e i ca c i d ( d n a ) m e t h y l a t i o na r es i g n i f i c a n ti nm o l e c u l a rb i o l o g y , b u tt h e i rt r a d i t i o na n a l y s e m e t h o d sh a v es o m el i m i t a t i o n s ，a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( l c - m s ) a r ef a v o u r a b l ef o ra n a l y z i n gt h e m f e wr e p o r t sh a v ef o c u s e do ns t u d y i n g s n pg e n o t y p i n ga n dd n am e t h y l a t i o nb yl c m sa n dl c m s m s i nt h i st h e s i s ， s y n t h e t i co l i g o d e o x y n u c l e o t i d e sa c i d ( o d n s ) a n dm e t h y l a t e do l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s s h o u l d b ea n a l y z e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c m s m s ) ，a n dt h em e t h o d so fo d n ss e q u e n c i n ga n dl o c a t i n g m e t h y l a t e ds i t e sb ym a s ss p e c t r o m e t r ys h o u l db eb u i l tp r i m a r i l y t h es t u d i e sa r e e x p l o r i n ga n dh a r d ，a n dt h e s ec a l lb et h eb a s eo fa n a l y z i n gd n a a d d u c t sb ym a s s s p e c t r o m e t r y t h ef o l l o w i n g sa r et h em a i nc o n t e n t ： 1 u t i l i z e r e v e r s e d - p h a s ei o n - p a i rh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p i p h p l c ) t os e p a r a t eo d n s ，a n dd i s c u s st h er e t e n t i o nb e h a v i o ro fo d n s i n r p i p - h p l cf r o ml e n g t h ，n u c l e o t i d ec o m p o s i t i o n s ，v a r i e t yo f3 - e n dn u c l e o t i d e ， s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fo d n s ，a n dt h ed i f f e r e n tm o b i l ep h a s es y s t e m 2 u t i l i z eh p l c m s m st oq u i c k l ya c q u i r et h em o l e c u l a rw e i g h to fo d n s ，a n dt o e n s u r et h es e q u e n c ea ts u i t a b l ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h e ns u m m a r i z e st h e r u l eo fo d n sb ym sa n dm s m s 3 u t i l i z eh p l c - m s m st oa n a l y z et w og r o u p so fo d n sw h i c hc a nb es e e na s s n p g e n o t y p i n g s 4 u t i l i z eh p l c m s m st oa n a l y z em e t h y l a t e do d n s 5 m o r e o v e r , w eh a v ed e b u g g e db u i l t i n h o u s et i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ( t o f m s ) ，a n dt r yt oa n a l y z eo d n sb yi t f r o mt h ef i v er e s e a r c h e sa b o v e ，t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sc a nb ed r a w n ： 1 i nt h er p i p - h p l c ，t h es h o r t e ra n dt h el o w e r ( g + c ) o fo d n sa r e ，t h ee a r l i e r t h e ye l u t ef r o mt h ec h r o m a t o g r a mc o l u m n ；a t2 5 0 c t h eo d n s 谢t hd i f f e r e n t 3 - e n dn u c l e o t i d ee l u t ei nt h eo r d e ro fg c t a ；i nt e a am o b i l ep h a s es y s t e m ， o d n s 、析t hs e c o n d a r ys t r u c t u r ee l u t ee a r l i e rt h a nt h o s ew i t h o u tt h es t r u c t u r e ；t h e e l u t i o no r d e ro fo d n si nt e a am o b i l ep h a s es y s t e mi ss a m et ot h a ti nt e a a m o b i l ep h a s es y s t e m ，a n di ti sm a i n l ye f f e c t e db y ( g + c ) a n dt h el e n g t ho f i i i 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 o d n s ；b u ti nt e a h f i pm o b i l ep h a s es y s t e m ，t h ee l u t i o no r d e ro fo d n si s s t r o n g l ye f f e c t e db yl e n g t h ，c o m p a r e dw i t h ( g + c ) o fo d n s ；m o r e o v e r ，u s i n g g r a d i e n te l u t i o nt h eh i g h e rg r a d i e n to fo r g a n i cp h a s ec a na c c e l e r a t et h ee l u t i o no f o d n s ，b u ti tc a l la l s or e d u c et h es e p a r a t i o nr e s o l u t i o n 2 i nh p l c m s m s ，t h ei n t e n s i t yo ft o t a li o nc h r o m a t o g r a p h y ( t i c ) o fo d n s p a r a e n ti o n sa r em a i n l ye f f e c t e db yt h en u c l e o t i d ec o m p o s i t i o n s ，t h ed i f f e r e n t m o b i l ep h a s es y s t e ma n dt h ep a r a m e t e r so fi n s t r u m e n t ( s u c h 懿c u r , i s ) ；t h e d i s t r i b u t i o no fc h a r g es t a t e si sm a i n l ye f f e c t e db yt h ed e c l u s t e r i n gp o t e n t i a l ，t h e d i f f e r e n tm o b i l ep h a s es y s t e m ，t h el e n g t ho fo d n sa n dt h es a m p l ee j e c t i o nm o d e ； t h em s m ss p e c t r u mo fo d n sa l em a i n l ye f f e c t e db yt h ec o l l i s i o ne n e r g y ( c e ) a n dt h ec h a r g es t a t e s ；c o m m o n l yu n d e rh i g h e rc e ，m o r ef r a g m e n t a t i o no c c u r , a n d t h er n zo ft h e me x t e n d sn a r r o w l y t oa c h i e v eas i m i l a re x t e n to ff r a g m e n t a t i o n , l o w e rc ei sr e q u i r e da th i g h e rc h a r g es t a t e s 3 i nh p l c m s m s ，t h et y p e so fs n p g e n o t y p i n gc a nb ei d e n t i f i e db yd e t e c t i n gt h e m o l e c u l a rw e i g h to fo d n s ，a n dt h es n ps i t e sw h i c hl o c a t en e a rt h e5 a n d3 - e n d o ft h eo d n sc a nb ee n s u r e dq u i c k l yb ys e q u e n c i n g 4 i nh p l c - m s m s t h em e t h y l a t e dr a t i oo fm e t h y l a t e dv s u n m e t h y l a t e do d n sc a n b eq u a n t i f i e d ，a n dt h em e t h y l a t e ds i t e sc a nb ee n s u r e dq u i c k l yb ys e q u e n c i n g w h e nc y t o s i n ei ss u b s t i t u t e db y5 m e t h y l c y t o s i n ei nt - r i c ho d n s t h er e t e n t i o n t i m eo fo d n sw i l li n c r e a s ei nh p l c ，b u tt h ef r a g m e n t a t i o np a t t e r n so fo d n s d o n tc h a n g ei nm s m s t h ef r a g m e n t a t i o np a t t e r n so fo d n sa td i f f e r e n tc h a r g e s t a t e sa r en o ts a m e ，a n dt h em s m ss p e c t r u mo fo d n sa tl o w e rc h a r g es t a t e sa r e s u i tf o re n s u r i n gt h em e t h y l a t e ds i t e sq u i c k l y 5 t h er e s u l to fd e b u g g i n gb u i l t i n h o u s et o f m ss h o w si th a s p r e d o m i n a n t p e r f o r m a n c e ， a n d 2 - d e o x y g u a n o s i n e 5 一t r i p h o s p h a t e( d g t p ) i s a n a l y z e d s u c c e s s f u l l yb yi t k e yw o r d ：h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c m s m s ) ， s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ( s n p )g e n o t y i n g ， d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) m e t h y l a t i o n ，t i m e o ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ( t o f m s ) i v 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 索引 缩写全称 r p i p h p l c t e a a t e a b t e a h f i p m s m s m s c a d c u r i s d p t i c c e w o t - b t o f m s r f 、树m d g t p 鸟嘌呤 腺嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶 寡脱氧核苷酸 脱氧核糖核酸 单核苷酸多态性 反相离子对高效液相色谱 三乙胺一冰醋酸缓冲盐 三乙胺一碳酸缓冲盐 三乙胺一六氟异丙醇缓冲盐 单级质谱 串级质谱 碰撞活化解析 布帘气 喷雾电压 去簇离子电压 总离子流色谱强度 碰撞能 3 - - - * 5 延伸的特征离子 5 _ 3 延伸的特征离子 飞行时间质谱 半峰高处的分辨率 脱氧三磷酸鸟苷 g a t c 洲 叭 姗 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 声明 本人郑重声明：所呈交的( 博士) 学位论文( 人工合成寡核苷酸的液相色谱 质谱研究) ，是本人在导师( 傅家谟院士、盛国英和周振研究员) 的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经引用的内容外，本文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担。 9 3 一躲侧碧 2 0 0 5 1 1 1 2 第一章前言 1 1 色谱法及其特点 第一章前言 第一节色谱法简介 色谱法( c h r o m a t o g r a p h y ) 是一种物理或物理化学分离分析方法，它利用不 同物质在两相中具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，这些物质在两相间 进行多次反复分配而实现分离的。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪。 色谱法的分离过程实质上是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分 子尺寸等基础上的分离过程。不同组分在相对运动、相互不溶的两相中迁移，其 中相对静止的一相称为固定相( s t a t i o n a r yp h a s e ) ，而另一个相对运动的相称为流 动相( m o b i l ep h a s e ) ，由于各组分的吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力 或分子大小等性质的微小差别，在两相间经过连续多次的质量交换后得到分离。 不同组分性质上的微小差别是色谱分离的根本，即必要条件；而性质上微小差别 的组分之所以能得到分离是因为它们在两相之间进行了上千次甚至上百万次的 质量交换，这是色谱分离的充分条件。 色谱的分类有很多种，通常按流动相的状态可分为气相色谱( g a s c h r o m a t o g r a p h y , g c ) ，液相色谱( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , l c ) 或超临界流体色谱 ( s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y , s f c ) - - 种。 色谱法作为一种分析方法，其最大特点在于分离能力超强，它的分离效能远 远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。此外，色谱法还有以下几个优 点1 ： 1 应用范围广它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、 无机物、低分子或高分子化合物，还是有生物活性的生物大分子均可 以进行分离和测定。 2 分析速度快各组分在两相的交换速度很快，通常仅千分之几秒，因 此一个复杂样品的分析仅需几分钟到几十分钟。 3 样品用量少用极少的样品就可以完成一次分离和测定。 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 4 灵敏度高它采用近代光学或电子学的各种手段做检测器，一般可直 接检测含量为百万分之几或更低的成分。 5 分离和鉴定一次完成通过与多种形式的质谱仪联用。 6 易于自动化分离与分析自动完成，可在工业流程中使用。 1 2 色谱法的发展 色谱法的应用最早要追溯到古罗马时代，古罗马人将一滴包含有混合色素的 溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现， 这种简单的方法可用来分析染料和色素。大约在1 0 0 年前，德国的化学家r u n g e 又对此方法作了重要改进，使其具有更好的重现性与定量能力，这种技术后来发 展成了今天的纸色谱技术。 但是，首先认识到这种层析现象在分离分析方面重大价值的是俄国植物学家 t s w e e t 。1 9 0 6 年，俄国植物学家t s w e e t 在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作 吸附剂，他把干燥的碳酸钙粉末装在竖立的玻璃柱中，然后把植物叶子的石油醚 萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再 用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是，在管内的碳酸钙上形成3 种颜色的6 个色带，当时t s w e e t 把这种色带叫做“色谱”。在这一方法中管内填充物碳酸钙 称为固定相，冲洗剂石油醚称为流动相。随着色谱法的不断发展，色谱不仅用于 有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。色谱的“色”字虽己失去原有意 义，但色谱名词仍沿用至今。 色谱法发展的简明过程如下2 ： 1 9 0 3 年，t s w e e t 在华沙自然科学学会生物学会会议上提出了应用吸附原理 分离植物色素的新方法。1 9 0 6 年他将这个方法命名为色谱法。 1 9 31 年，k u h n 与l e d e r e r 使用色谱法证实了蛋黄内的叶绿素系植物叶黄素 与玉米黄质的混合物，使人们认识到色谱技术在分离科学中的重要性。 1 9 3 7 年，纸色谱开始被应用。 1 9 3 8 年，i z m a i l o v 和s h r a i b e r 第一次使用薄层色谱法( t h i n 1 a y e r c h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 。 1 9 3 8 年，t a y o r 和u r a y 用离子交换分离锂和钾的同位素。2 0 世纪4 0 年代后， 2 第一章前言 合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱得到了广泛应用。 1 9 4 1 年，m a r t i n 和s y n g e 创立了分配色谱。他们采用水分饱和的硅胶为固 定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸。 1 9 4 4 年，m a r t i n 等发展了纸色谱。 1 9 5 2 年，m a r t i n 和j a m e s 发展了气一液分配色谱，提出了从理论到实践较 完整的气一液色谱方法，从而获得了1 9 5 2 年的诺贝尔奖。 1 9 5 6 年，v a nd e e m t e r 等发表了关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色 谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y , g c ) 。 1 9 5 7 年，h o l m e s 和m o r e l l 首次在实验室实现了色谱仪与质谱仪的联用。 1 9 5 8 年，g o l a y 提出了分离效率极高的毛细管柱气相色谱法。 1 9 6 2 年，k l e s p e r 等人提出了超临界流体色谱。 1 9 6 3 年，g i d d i n g s 的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。 1 9 6 6 年，i t o 等提出了逆流色谱。 2 0 世纪6 0 年代末，把高压泵和化学键合相用于液相色谱，出现了高效液相 色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 。 2 0 世纪8 0 年代初，超临界流体色谱兴起，出现了高速逆流色谱。 2 0 世纪8 0 年代以后，毛细管柱应用于超临界流体色谱技术中。 2 0 世纪8 0 年代末，毛细管电泳得到发展。 2 0 世纪9 0 年代，毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 得 到广泛应用。同时集h p l c 和c z e 优点的毛细管电色谱在2 0 世纪9 0 年代后期 受到关注3 。 2 1 质谱法及其特点 第二节质谱法简介 质谱法( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 是通过对样品离子的质量和强度的测定来进行成 分和结构分析的一种分析方法。质谱分析中待测样品首先要离子化，然后利用离 子在电场或磁场中的运动性质，把离子按质荷比( m z ) 分开，最后各离子按质 3 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 荷比大小依次抵达检测器，信号经过放大、记录得到质谱图。通过分析质谱图， 可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的 信息。能实现质谱分析的仪器叫质谱仪。 质谱仪通常由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、真空系统以及数据 系统等部分组成。其中质量分析器能将气态离子按质荷比的大小分开，是质谱仪 最关键的部件。 质量分析器的种类很多，目前商品仪器中常用的有单聚焦质量分析器、双聚 焦质量分析器、四级杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱以及离子回旋 共振质量分析器等。相应地，质谱仪按质量分析器的不同主要可分为单聚焦质谱、 双聚焦质谱、四级杆质谱( q u a d r u p o l em a s ss p e c t r o m e t r y , q - m s ) 、飞行时间质谱 ( t i m e o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y , t o f m s ) 、离子阱质谱( i o nt r a pm a s s s p e c t r o m e t r y , i t m s ) 以及富里叶变换离子回旋共振质谱( f o u r i e rt r a n s f o r mi o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s ss p e c t r o m e t r y , f t - i c rm s ) 等。 质谱法作为一种现代分析手段，具有以下特点4 ： 1 高灵敏度，可测1 0 m o l 以下物质的量； 2 快速，数分钟内即可完成测试； 3 高精度，能同时提供样品的精确分子质量和结构信息； 4 既可用于定性分析，也可用于定量分析： 5 能有效地与各种色谱联用，如g c m s ，h p l c m s ，t l c m s 及c z e m s 等，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构分析。 2 2 质谱法的发展 质谱法的发展与两种技术的发展有着密切的联系，即离子源技术和联用技 术。质谱法发展的简明过程如下： 1 8 8 6 年，g o l d s t e i n 发明阳极射线管可作为离子源。 1 8 9 8 年，w e i n 用抛物线质谱仪对阳极射线进行了研究，实现了在电场和磁 场中偏转正离子束。 1 9 0 5 年，t h o m s o n 发现2 0 n e 与2 2 n e 分离现象。 1 9 1 2 年，t h o m s o n 使用磁偏仪，证明氖有相对质量2 0 d a 和2 2 d a 两种同位 4 第一章前言 素存在。 1 9 1 8 年，美国芝加哥大学的d e m s t e r 成功研制了1 8 0 0 扇形磁场方向聚焦型 质谱计。 1 9 1 9 年，a s t o n f l l j 成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里 程碑。 1 9 3 4 1 9 3 6 年，发明双聚焦质谱仪，期间各种形式的仪器不断被研制出来。 1 9 4 2 年，美国c e c 公司第一台商品仪器单聚焦质谱仪问世。 19 4 8 年，c a m e r o n 和d f e g g e r s 研制出世界上第一台t o f m s 。 1 9 5 8 年，英国联合电子工业( a e i ) 研制出火花源双聚焦质谱仪。 1 9 6 1 年，德国a l t a l m a t 推出了商品化四级滤质器。 1 9 6 5 年，瑞典l k b 推出了气质联用仪( g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y , g c m s ) 。 1 9 7 0 年，出现了f t i c rm s 。 2 0 世纪7 0 年代末和8 0 年代初，短脉冲辉光放电离子源和电感耦合离子源开始 应用于质谱仪。 2 0 世纪8 0 年代末，f e n n 和田中耕一分别发明电喷雾( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n , e s l 5 ) 和基体辅助激光解析电离离源( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n , m a l d l 6 ) ，实现了生物大分子软电离，使质谱仪发展到生物质谱时代。 3 1 研究背景 第三节选题依据 2 0 世纪初色谱、质谱技术的出现，推动了分析化学的快速发展。在经过近 百年的发展后，色谱、质谱已经成为现代分析手段中必不可少的组成部分。目前， 不同类型的色谱仪、质谱仪已广泛地应用于各个领域的科研和日常分析中，例如 矿物学、地质学、海洋学、化学、生物学和医药学等方面。 2 0 世纪5 0 年代美国生物学家w a t s o n 发现了脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ，d n a ) 双螺旋结构，并以此来解释基因的多种特征，从而揭示出了“生命的 5 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 秘密”。这一科学发现为现代分子生物学的发展奠定了基础，带动了生命科学的 快速发展，堪称二十世纪最伟大的发现。 2 0 世纪7 0 年代后，生命科学更是以惊人的速度在发展，对快速了解生物大 分子质量与结构的需求越来越高。质谱技术在生物大分子的测定中，以其快速、 准确、灵敏等优点受到生物学家的特别关注。但是如何完整地电离生物大分子 直是质谱学家关注的焦点问题。在此后的近2 0 年内，科学家们找到了许多技术 来电离生物大分子，如快原子轰击、大气压下放电、热喷雾器等，但是都不十分 成功。直到2 0 世纪8 0 年代末，m a l d i 和e s i 的出现才实现了生物大分子软电 离，它们与质谱的结合使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命 性的变革。e s i m s 和m a l d i m s 具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在 p m o l ( 1 0 d 2 ) 甚至f m o l ( 1 0 j 5 ) 的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的 生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到 迅速的发展。质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注入了新的活力， 形成了独特的生物质谱技术。生物质谱具有快速、准确、高灵敏度以及高通量等 特点，是分析和检测高极性、难挥发和热不稳定的生物大分子最主要的手段之一。 目前，生物质谱正通过与色谱技术联用在蛋白质和多肽分子量测定、序列测 定7 ，多糖结构测定，微生物鉴定，药物代谢，寡核苷酸8 和核酸的分析等方面 得以广泛应用。然而，生物质谱在核酸方面的应用远远落后于蛋白质和肽的分析 9 ，这主要是因为核酸分子带有磷酸基，极性和电负性大，容易与1 0 、n a - 等碱 金属离子结合形成加合物，导致离子速度与能量分散引起核酸分子离子峰变宽， 不易准确确定其质量数；在m a l d i 电离过程中，核酸分子所含的碱基会强烈吸 收紫外光，使其在离子化过程中易于破碎；此外，已有经典的生物化学方法用于 测定核酸分子的表征和序列，如电泳1 0 。 随着近代物理学、电子学、计算机、真空技术和机械加工技术的快速发展， 生物质谱无论在性能上，还是在功能上都取得了显著进步，已逐渐在核酸领域得 到广泛应用，主要体现在单核苷酸多态性分型分析、短串连重复序列分析、基因 缺陷而导致的疾病诊断、寡核苷酸片段序列分析1 1 以及与寡核苷酸形成的非共价 复合物分析等方面。 6 第一章前言 3 2 立题依据 3 2 1 串级质谱分析寡核苷酸的优势 随着分子生物学和生物技术的迅猛发展以及核酸在生命科学研究中的重要 位置，有关核酸的分子生物学已成为当前生命化学中最具活力的研究方向之一。 其中，人工合成寡核苷酸作为引物、探针已广泛应用于各种分子生物学技术。近 年来人工合成和化学修饰寡核苷酸作为反义治疗剂在病毒感染和一些癌症的治 疗方面显示出良好的前景。 寡核苷酸作为药物其结构特征必须进行确证。传统的寡核苷酸分析方法如聚 丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p a g e ) 1 2 、毛细管凝胶电泳 ( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e t i c ，c g e ) 1 3 、高效液相色谱( h p l c ) 、高效薄层色谱( 1 1 i 曲 p e r f o r m a n c et h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , h p t l c ) 1 4 1 5 等，只能对其浓度和纯度进行 分析，而对其碱基组成、修饰基团以及序列等结构特性的检测却无能为力。目前， 寡核苷酸测序主要采用s a n g e r 双脱氧链终止法晦1 7 和m a x a m - g i l b e r t 化学降解法 1 8 - 1 9 ，这两种方法不仅成本高、效率和可靠性低，而且均要用到放射性元素标记， 显然不是寡核苷酸特别是化学修饰寡核苷酸的有效测序方法。因此，建立和发展 一种更有效，灵敏，快速和精确的寡核苷酸结构和序列分析方法一直是生物化学 家们研究的前沿之一。 串级质谱技术具有快速、灵敏、准确和有效等特点，它不仅能直接或间接测 定寡核苷酸的碎片离子，而且在化学修饰寡核苷酸及核酸片段的序列分析上也显 示了良好的应用前景，正逐渐成为寡核苷酸分析的重要工具。 3 2 2 串级质谱分析单核苷酸多态性分型的优势 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 是指在基因组d n a 某个位置处存在有单个碱基的差异，它在解释多基因病遗传途径、药物基因组学、 法医学和进化遗传学等方面有着非常重要的作用，是当前功能基因组研究的热点 问题。目前，对s n p 的研究主要包括以下几个方面：1 ) s n p 作图( s n pm a p p i n g ) ， 即在基因组序列上找到单核苷酸多态性位点；2 ) s n p 分型( s n pg e n o t y p i n g ) ， 即在大量的样本中测定每一个s n p 的等位频率2 0 ；3 ) 通过对s n p 作图和s n p 7 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 分型研究得到的数据进行连锁不平衡分析或关联分析，以找出其中所隐含的生物 信息。 目前，已有超过6 0 0 万的s n p 得以发现，在探明某些感兴趣s n p 位点处等 位基因频率时，往往需要对多种样本的成千上万个样本进行分析，工作量非常巨 大。研究s n p 分型最经典的方法是d n a 测序法，但是由于基于凝胶电泳的测序 法费时、费力、同时还产生大量冗余的信息，很不适合大规模s n p 分型技术的 要求。此外，还有一些其它的s n p 分型检测方法，如荧光检测法、荧光极化法 等，但它们需要对人工合成寡核苷酸进行荧光标记，操作繁琐，也不适合高通量 分析。 与上述方法相比，质谱法不仅具有准确、快速、耗费少等特点，而且不需要 对人工合成寡核苷酸进行荧光标记，是s n p 分型检测最好的一种方法。此外， 应用串级质谱不仅可以快速鉴定s n p 分型，还能通过结构分析确定s n p 位点。 3 2 3 串级质谱分析d n a 甲基化的优势 d n a 甲基化和癌变紧密相关，许多研究发现肿瘤细胞d n a 甲基化酶活性 过高，转化细胞常常表现出总d n a 甲基化酶活性增高，正常甲基化位点甲基丢 失，和高甲基化区域的出现2 1 。2 2 。近年来，d n a 甲基化在致瘤过程中的作用正日 益引起人们的关注，检测d n a 的异常甲基化有助于深入理解肿瘤形成机理2 3 以， 并且可以为肿瘤的早期诊断、病理分型、疗效评估及复发监测等提供十分重要的 信息。因此为了更好地了解d n a 甲基化在正常和发病机体中的影响，有必要建 立一种灵敏度高、特异性强，而且能够定量分析的d n a 甲基化以及确定甲基化 位点的分析方法。 现有的甲基化检测方法主要有甲基化敏感的限制性内切酶法( m s r e s ) s o u t h e r nb l o t 2 5 、甲基化特异性p c r 法( m s p ) 2 6 结合亚硫酸氢盐限制酶分析法 ( c o b r a ) 2 7 甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法( m s s n u p e ) 2 8 - 2 9m e t h y l i g h t 法3 0 以及变性高效液相色谱法( d h p l c ) 3 1 等。这些方法有的灵敏度不高，有的 操作步骤繁琐、费时、费力，还有的需要用到昂贵的荧光双标记寡核苷酸探针， 它们多数只能检测是否发生了甲基化，不能确定甲基化的具体位点或只能确定特 定位点的甲基化。 8 第一章前言 串级质谱在d n a 甲基化分析中具有灵敏度高、特异性强的特点，它与液相 色谱联用不仅能够快速定量d n a 甲基化率而且能确定甲基化位点，是d n a 甲 基化分析的理想工具。 总的来看，虽然s n p 分型和d n a 甲基化在分子生物学中具有重要的研究意 义，但它们传统的分析方法存在较大的缺陷，而液质联用技术在s n p 分型和 d n a 甲基化分析中显示出良好的应用前景。目前，应用液质联用仪，特别是串 级质谱研究s n p 分型和d n a 甲基化鲜有报道，正处于起步阶段。因此，本文将 用新的分析技术高效液相色谱一串级质谱联用仪( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y , h p l c - m s m s ) 对人工合成寡核苷酸 和甲基化修饰寡核苷酸样品进行研究，以建立高效的s n p 分型和d n a 甲基化分 析方法。 3 3 主要研究内容 1 通过应用反相离子对高效液相色谱( r e v e r s e d - p h a s ei o n - p a i rh i 曲p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , r p i p h p l c ) 对人工合成寡核苷酸混合片段的分离， 从片段长度、碱基组成、末位碱基差异、片段内二级结构以及不同流动相等 方面探讨它们对寡核苷酸片段在r p i p h p l c 中保留行为的影响。 2 通过应用h p l c m s m s 快速确定人工合成寡核苷酸的分子量，并在选择合适 条件下进行串级质谱分析得到其序列信息，总结人工合成寡核苷酸单级质谱 和串级质谱分析的普遍规律。 3 通过应用h p l c m s m s 对两组s n p 分型寡核苷酸进行分析，建立快速鉴定 s n p 分型的方法； 4 通过应用h p l c m s m s 对甲基化寡核苷酸进行分析，建立快速定量甲基化率 及确定甲基化位点的方法。 5 对自制高分辨飞行时间质谱仪( t o f m s ) 进行调试，并应用t o f m s 分析人 工合成寡核苷酸。 9 人工合成寡核苷酸的液相色谱一质谱研究 第二章r p i p h p l c 分离寡核苷酸 人工合成寡核苷酸作为引物、探针已广泛应用于各种分子生物学技术，如聚 合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 、基因测序3 2 - 3 4 基因型3 5 - 3 8 , 基因 药物、基因毒理、基因诊断以及基因治疗3 9 等方面。人工合成寡核苷酸多采用亚 磷酰胺三酯法在d n a 全自动合成仪上合成，合成的产物纯度往往有限。当它们 用于某些特殊分析( 如基因型化验) 时，需要具有较高的纯度，这就要对其进行 纯化。此外，质谱通常只能同时分析一种或有限几种人工寡核苷酸片段，这就要 求先对人工合成寡核苷酸混合样品进行分离。 目前，最常用的人工合成寡核苷酸分离纯化技术有聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( p a g e ) 和高效液相色谱( h p l c ) ，这两种方法纯化得到的产物纯度均大于9 5 。其中p a g e 对长链d n a 片段纯化特别有效，但是该法费时、费力，且产量 较低；h p l c 是在经典的液相柱色谱的基础上通过改进填料的粒度及柱压而发 展起来的，它在理论上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵、 高效固定相和高灵敏度的检测器，大大提高了分析能力，加快了分析速度，并实 现了操作自动化，是国外公司常用的人工合成寡核苷酸分离纯化方法。 通常，离子交换高效液相色谱( i r - h p l c ) 在分离碱基、核苷和核苷酸等核 酸物质时，分析时间长、操作麻烦，且分离效率低，分离后的产物还需要脱盐后 才能用于生物分析；反相高效液相色谱( r p h p l c ) 分离核苷酸和碱基时，保留 较小，难以同时分析核酸降解产物中的碱基、核苷和核苷