（材料学专业论文）壳聚糖接枝氨基酸材料的制备与性能的研究.pdf

上晦壬：l t 土学博士学位论文 垂 壳聚糖接枝氨基酸材料的制各与性能的研究 摘要 壳聚糖是天然多糖类高分子甲壳素的脱乙酰产物，具有良好的生物相容性、可 降解性和生物活性，有利于其作为骨修复材料，并应用于骨组织工程，作为种子细 胞或活性生长因子的生物载体材料。随着壳聚糖衍生改性的研究发展，壳聚糖类复 合材料在骨填充修复材料、骨组织工程和软骨组织工程等方面显现了广阔应用前景。 本论文仿照骨和甲壳的天然构成与矿化机制，进行新型仿生复合材料微结构的构筑 与设计，开展了壳聚糖接枝谷氨酸及天冬氨酸材料、磷酸钙盐壳聚糖一聚氨基酸仿生 复合支架的研究，为壳聚糖组织工程材料研究提供了新思路。 研究工作分为四个阶段，主要研究内容和研究成果如下： 一、半脱乙酰度壳聚糖原料的锘4 备研究。 采用醋酸水溶液体系，由9 1 脱乙酰度壳聚糖与乙酸酐反应，制得5 2 脱乙酰 度壳聚糖产物。研究发现，乙酸酐与壳聚糖原料用量比、醋酸浓度等反应条件影响 着乙酰化反应程度，可用于控制制备不同脱乙酰度壳聚糖产物。限、c p m a s _ 1 3 c n m r 表征了半脱乙酰度壳聚糖结构。采用x r d 与热分析研究了壳聚糖粉末样品的晶型结 构和聚集态特性。结果表明，与高脱乙酰度壳聚糖原料相比，半脱乙酰度壳聚糖产 物的晶体结构发生改变，结晶度降低，并表现出较强的水结合能力和较低的热稳定 性，对此通过分子间氢键差异的分析进行了解释。 采用i r 、x r d 、溶胀实验和力学测试比较研究了不同脱乙酰度壳聚糖膜的结构、 结晶性能、溶胀溶解性能和力学性能。结果表明，壳聚糖膜的溶胀率随着脱乙酰度 的减少而增加，尤其是半脱乙酰度壳聚糖膜呈水速溶性。壳聚糖膜的拉伸强度和断 裂伸长率与脱乙酰度有关，而半脱乙酰度壳聚糖膜的断裂伸长率明显改善。x r d 测 试表明，半脱乙酰度壳聚糖膜结晶度高，分析认为其具有层状结晶结构，从而引起 各性能的改变。 二、引入谷氨酸的壳聚糖材料仿生矿化性能的探索实验 分别制备了戊二醛交联壳聚糖膜、戊二醛交联谷氨酸壳聚糖膜材料，进行仿生 矿化研究。i r 、e s c a 测试表明，利用戊二醛交联将谷氨酸引入壳聚糖膜结构。采用 s e m 、e d a x 、x r d ，i c p 研究了磷酸钙盐在膜材料表面沉积生长的情况。研究发现， 在模拟体液( 1 5 x s b f ) 浸泡初期，先形成c a p 比为1 3 缸1 3 7 细小颗粒状磷酸钙盐沉 积，随后在底层上成核生长c a p 比为1 4 6 1 4 9 片状堆积磷酸钙盐沉积，且在浸泡 上喀士逗上学博士学位论文姜 过程中，两层沉积的密度逐渐增加。s e m 测试表明，戊二醛交联程度影响壳聚糖膜 上沉积磷酸钙盐的形貌与数量。壳聚糖与戊二醛摩尔比为2 5 ：1 的膜仿生矿化性能较 2 0 ：i 和1 5 ：1 强。与戊二醛交联壳聚糖膜相比，壳聚糖氨酸膜材料表面沉积磷酸钙盐 的密集程度增加，表明谷氨酸的引入对促进壳聚糖材料体外矿化的作用较明显。 三、壳聚糖接枝氨基酸系列制备技术的研究 分别在水的均相条件、乙酸乙酯溶剂的异相条件下，以壳聚糖的氨基引发n 羧 酸酐( n c a ) 开环聚合，制备了接枝l 谷氨酸甲酯壳聚糖产物。均相接枝反应中，以 5 2 脱乙酰度壳聚糖为原料，在中性条件下反应转化率可达4 1 0 。异相接枝反应中， 增加n c a 的用量和适当延长反应时间，可提高谷氨酸甲酯按技侧链聚合度。采用瓜、 c p f m a s j 3 c n m r 对均相接枝物、异相接枝物的结构进行表征。结果表明，谷氨酸甲 酯侧链通过酰胺键与壳聚糖结合，形成梳状接枝产物。x r d 谱图中，在2 0 = 8 3 0 处 出现衍射峰，是接入谷氨酸甲酯侧链引起的。d s c 、t c d d t g 测试发现，均相接枝物、 异相接枝物高温一侧吸放热峰的数量与位置，较原料有明显改变，并互有不同，反 映了各壳聚糖接枝产物由于结构和接枝量的差异，具有不同的热稳定性。接枝物在 i m o l 1 4 氢氧化钠水溶液中水解反应，使壳聚糖上谷氨酸甲酯接枝侧链碱解生成谷氨 酸。新接枝方法可用于壳聚糖材料的表面改性，赋予材料特殊性质以满足不同要求。 以磷酸为催化剂，热缩聚合成摩尔比分别为1 0 ：0 、8 ：2 、5 ：5 的天冬氨酸谷氨酸 共聚物，在d m f 体系中，与壳聚糖进行异相接枝反应。合成摩尔比为2 ：8 的天冬氨 酸一谷氨酸共聚物可溶于水，与壳聚糖进行均相接枝反应。瓜、c p m a s - 1 3 c n m r 测 试表明，壳聚糖氨基使共聚物中酰亚胺环开环反应，制得的接枝产物结构明确。x r d 谱图中，在2 0 = 1 5 1 处出现新衍射峰，是由共聚物接枝链引起。d s c 热分析结果可 见，对比接枝摩尔比分别为1 0 ：0 、8 ：2 、5 ：5 共聚物的壳聚糖产物，其热稳定性，随着 接枝链中羧基比例的增加而增强，且比壳聚稽原料略有提高。接枝物在2 m o l l o 氢氧 化钠水溶液中进行水解反应，使未反应的酰亚胺环水解开环。新的合成方法为壳聚 糖材料的进一步开发利用提供了可能。 四、壳聚糖系列支架材料的制各与性能研究 采用冷冻干燥法制备天冬氨酸一谷氨酸共聚物交联壳聚糖支架材料，分别进行了 i r ，x r d ，s e m ，孔隙率测定、力学性能测定，考察了组分和交联改性对其结构形 貌的影响。研究发现，壳聚糖支架材料交联后，孔隙率较原多孔支架略有减小，但 仍保持较高孔隙率，范围为8 5 9 5 。交联后支架材料孔隙大小可控制在直径为 4 0 2 0 0 1 x r n ，支架材料多孔结构及孔隙间相互通透性未明显改变。交联后壳聚糖支架 材料压缩性能改善。体外细胞培养研究表明，成骨细胞在支架中粘附性和生长状态 良好。从四氮唑盐( m 兀) 测试结果看，壳聚糖支架的细胞粘附增殖量高于交联支架 材料其中，5 w t - 8 ：2 交联支架细胞培养结果略好于其它交联支架材料。壳聚糖及 上瘁文盈土学博士学位论文要 其交联支架材料经明胶处理后，成骨细胞粘附增殖量增加。含丁二酰亚胺结构的天 冬氨酸谷氨酸共聚物作交联剂，为更有利地利用壳聚糖材料作为组织工程支架提供 了新方法。 分别制备了壳聚糖聚氨基酸支架材料、磷酸钙盐壳聚糖聚氨基酸仿生复合支 架，进行i r 、x r d 、s e m 、孔隙率测定、力学性能测定，研究了材料结构与表面形 貌、孔隙率、孔形态等性能。研究发现，壳聚糖系列多孔支架均形成超过9 0 的高 孔隙率。扫描电镜照片观察到多孔支架内孔径分布较宽，孔相连性好，壳聚糖聚氨 基酸支架孔径尺寸为5 0 2 5 0 1 a m ，磷酸钙盐壳聚糖聚氨基酸仿生复合支架孔径尺寸 为1 0 0 3 0 0 9 m ，且仿生复合支架中磷酸钙盐呈亚微米级密实颗粒状结合。测试表明， 支架样品的压缩强度均在1 0 1 c k p a 数量级。体外细胞培养研究表明，成骨细胞在支 架材料表面粘附和增殖生长状态良好，呈组织化趋向。m t t 测试表明，壳聚糖一聚氨 基酸支架、磷酸钙盐壳聚糖聚氨基酸复合支架的细胞培养结果较好，部分样品优于 羟基磷灰石壳聚糖复合支架样品c h i t h a p 8 0 2 0 。系列支架经明胶处理后细胞粘附 增殖量明显增加，表明由明胶引入细胞结合域有促进作用，并与复合的磷酸钙盐呈 现协同效应。磷酸钙盐，壳聚糖聚氨基酸仿生复合支架有望成为培养成骨细胞的组织 工程材料。 关键词：壳聚糖；聚氨基酸；骨组织工程；支架材料；生物矿化；接枝改性 本课题得到上海市自然科学基金资助( 0 4 z r l 4 0 8 7 ) u i s t u d yo np r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f a m i n o a c i d g r a f l e dc h i t o s a nm a t e ：r i a l s a b s t r a c t c h i t o s a ni st h ep a r t i a l l yd e a c e t y l a t e dd e r i v a t i v eo fc h i t i n ，w h i c hi st h en a t u r a l p o l y s a c c h a r i d e a sp r o m i s i n gb i o c o m p a t i b l e ，b i o d e g r a d a b l e a n db i o a c t i v em a t e r i a l s ， c h i t o s a na n di t sc o m p l e x e sh a v eb e e ns t u d i e df o ra p p l i c a t i o n si nb o n er e p a i ra n db o n e t i s s u ee n g i n e e r i n gs c a f f o l d s ，s u p p o r t i n gt h eg r o w t ho fs e e dc e l l so ra c t i v eg r o w i n gf a c t o r s w i t hd e v e l o p m e n to fm o d i f i c a t i o nm e t h o d sf o rc h i t o s a nd e r i v a t i v e s ，c h i t o s a nb a s e d c o m p o s i t em a t e r i a l sh a v eb r i l l i a n tp r o s p e c t sf o ra p p l i c a t i o ni ns u c hf i e l d sa sb o n er e p a i r a n db o n ea n dc a r t i l a g et i s s u ee n g i n e e r i n g i nt h i sp a p e r , s p e c i a lm i c r o s t r u c t u r eo f n e wt y p e o fb i o m i r n e t i cc o m p o s i t e sw e r ed e s i g na n dc o n s u a l c t e da c c o r d i n gt ot h en a t u r a ls u - d c t u r e s a n db i o m i n e r a l i z a t i o nm e c h a n i s m so f b o n ea n dc h i t i n s e r i e so fc h i t o s a n - a m i n oa c i d s c a f f o l d sa n dc a l c i u mp h o s p h a t e c h i t o s a n - a m i n oa c i ds c a f f o l d sw e r ep r e p a r e da n ds t u d i e d t oi m i t a t e n a t u r a lb o n ea n dc h i t i n , w h i c hp r o v i d en e wi d e a sf o r 也er e s e a r c hf i e l do f c h i t o s a nt i s s u ee n g i n e e r i n gm a t e r i a l s t h er e s e a r c hw o r ki sd i v i d e di n t of o u rp e r i o d s m a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r e d e s c r i b e di nt h ef o l l o w i n g ： f i r s t ，s t u d yo np r e p a r a t i o no f h a l f n - a c e t y l a t e dc h i t o s a n c h i t o s a nw i t h9 1 d e g r e eo fd e a c e t y l m i o n d a ) r e a c t e dw i t ha c e t i ca n h y d r i d ei nt h e s y s t e mo fa q u e o u sa c e t i ca c i dt of o r m5 2 d d ao fc h i t o s a n ，a sw a t e rs o l u b l eh a l f n - a c e t y l a p e dc h i t o s a n t h er e a c t i o nc o n d i t i o n si n c l u d i n gm o l a rr a t i oo f a c e t i ca n h y d r i d et o g l u c o s a m i n eu n i t so fr e a c t a n tc h i t o s a na n dt h ee o n e e n t r a t i o f lo fa c e t i ca c i di n f l u e n c e dt h e n a c e t y l a t e dr e a c t i o no fc h i t o s a n , w h i c hm a yb ec o n t r o l l e dt op r e p a r ec h i t o s a np r o d u c t s w i t hd i f f e r e n td d a t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fh a l fn a c e t y l a t e dc h i t o s a ns a m p l e sw a s e x a m i n e db yi r , c p m a s 1 3 c n m mn ec r y s t a l l i n ea n dp o l y m o r p h i cn a t u r eo fp o w d e r c h i t o s a n sw e r es t u d i e db yx r da n dt h e r m a la n a l y s i s c o m p a r e dw i t l lc h i t o s a nr a w m a t e r i a lo fh i g hd d a ，t h ec r y s t a l l i n es t r u c t u r eo fh a l fn a c e t y l a t e dc h i t o s a nc h a n g e sa n d i th a sh i g h e rw a t e rc o n n e c t i o na n dl o w e rc r y s t a l l i n i t ya n dh e a ts t a b i l i t y , w h i c hi se x p l a i n e d b yd i s c u s s i n gd i f f e r e n c e so fi n t c r m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d i n g 。 t h es t r u c t u r e ，c r y s t a l l i n e ，m e c h a n i c a la n ds w e l l i n gp r o p e r t i e so fc h i t o s a nf i l m sw i t h v a r i o u sd d aw e r es t u d i e da n dc o m p a r e db yi r 、x r d ，d y n a m i cm e c h a n i c a la n a l y z e ra n d i v s w e l l i n gt e s t ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o wt h es w e l l i n gi n d e xo fc h i t o s a nf i l m sr e d u c e w i mt h ed d ao fc h i t o s a n , e s p e c i a l l yf o rh a l fn a c e t y l a t e dc h i t o s a nf i l ms h o w i n gi n s t a n t w a t e rs o l u b i l i t y t h et e n s i l es t r e n g t ha n de l o n g a t i o na tb r e a k i n go fc h i t o s a nf i l m sh a v e r e l a t i o n s h i pw i t hd d a , a n dh a l f n - a c c t y l a t e dc h i t o s a nf i l ms h o w si m p r o v e de l o n g a t i o na t b r e a k i n g x r dr e s u l t ss h o wt h a th a l fn - a c e t y l a t e dc h i t o s a nf i l mh a sh i g h e rc r y s t a l l i n i t y w i t ha l a y e r e dc r y s t a l l i n es t r u c t u r e ，w h i c hc a u s e dc h a n g e so f o t h e rp r o p e r t i e s s e c o n d , s t u d yo nb i o m i n e r a l i z a t i o np r o p e r t yi nv i t r oo fc h i t o s a nm a t e r i a l sc o n n e c t e d w i t hg l u t a m i ca c i d g l u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k e dc h i t o s a na n dc h i t o s a n g l u t a m i ca c i df i l m sw e r ep r e p a r e d a n db i o m i n e r a l i z a t i o np r o p e r t i e si nv i t r ow e r es t u d i e db yt h eb i o m i m e t i ca p p r o a c h i ra n d e s c ac o n f i r m e dt h a tc h i t o s a na n dg l u t a m i ca c i dw e r es u c c e s s f u l l yc r o s s l i n k e db y g l u t a r a l d e h y d e m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n so ft h ed e p o s i t e dc a l c i u mp h o s p h a t e c o a t i n g s 、 眦s t u d i e du s i n gs e m , e d a x , x r da n di c p i n i t i a l l y , t h et r e a t m e n ti n s i m u l a t e db o d yf l u i d ( 1 5 x s b f ) r e s u l t e di nt h ef o r m a t i o no fs i n g l el a y e ro fc a l c i u m p h o s p h a t ep a r t i c l e sw i t hc a p = i 3 6 一1 3 7o v c l t h ef i l ms u r f a c e a si m m e r s i o nt i m ei ns b f i n c r e a s e d ，f l r r t h e rn u c l e a t i o na n dg r o w t hp r o d u c e da s i m u l a t e dc a l c i u mp h o s p h a t ec o a t i n g w i t hc a p = i 4 6 - 1 4 9 t h ed e n s i t yo fb o t hl a y e r so fc a l c i u mp h o s p h a t e si n c r e a s e dd u r i n g t h ei m m e r s i o nt i m e s e mr e s u l t ss h o wt h eg l u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k i n gd e g r e ei n f l u e n c e t h em o r p h o l o g ya n dm a 鲥缸d eo ft h ec a l c i u mp h o s p h a t ec o a t i n g s ，a n dt h ee r o s s l i n k e d c h i t o s a n f i l m s w i t h 2 5 ：1m o l a rr a t i o o f c h i t o s a n t og l u t a r a l d e h y d es h o w b e t t e r b i o m i m e t i c m i n e r a l i z a t i o np r o p e r t yt h a n2 0 ：1a n d1 5 ：1c h i t o s a nf i l m s c o m p a r e dw i t hg l u t a r a l d e h y d e e r o s s l i n k e dc h i t o s a nf i l m s ，c h i t o s a n g l u m m i ea c i df i l m sg e tm o r ec a l c i u mp h o s p h a t e d e p o s i t i o n st h a nc h i t o s a nf i l m s w h i c hm e a n sg l u t a m i ca c i dc o n t r i b u t et oi m p r o v e b i o m i n e r a l i z a t i o np r o p e r t yi nv i t r of o rc h i t o s a nm a t e r i a l s t h i r d ，s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o nm e t h o d sf o rc h i t o s a ng r a f t e dw i t ha m i n oa c i d u n d e rh o m o g e n e o u sc o n d i t i o n so f w a t e ra n dh e t e r o g e n e o u sc o n d i t i o n so f e t h y la c e t a t e , c h i t o s a nw e r eg r a f t e db ym e t h y ll - g l u t a m a t eu s i n ga m i n og r o u pi nc h i t o s a nm o l e c u l et o i n d u c eo p e nc y c l er e a c t i o n o fg l u t u m i ca c i dn - c a r b o x y l a m i d e ( n c a ) i nh o m o g e n e o u s g r a f t i n gr e a c t i o n , h a l fn - a c e t y l a t e dc h i t o s a ni ss o l u b l ei nw a t e ra n dt h ec o n v e r s i o ni s 4 1 0 i nn e u t r a lp h i nh e t e r o g e n e o u sg r a f t i n gr e a c t i o n , t h ed p so fs i d ec h a l l l sg r a f t e d o n t oc h i t o s a ni n c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n go fn c aa n dc o n t r o l l e dl o n g e rr e a c t i o nt i m e m o l e c u l a rs t r u c t u r e so fd i f f e r e n tg r a f t e dp o l y m e r sw e r ee x a m i n e db ym e a n so fi l lc p m a s - ”c n m r 田1 er e s u l t ss h o ws i d ec h a i n so fm e t h y ll - g l u t a m a t ea r ec o n n e c t e dw i t h c h i t o s a nt h r o u g ha m i d eb o n dt of o r mb o m b - g r a f t e dp r o d u c t s i nx r ds p e c t r u m , t h e v g r a f t e ds i d ec h a i i 毽g a u s en e wd i f f r a c t i o np e a ka p p e a ra t2 0 = 8 3 0 a m o n gd s ca n d t g d t gc u r v e s ，t h e r ea r ed i f f e r e n te n d o t h e r m a la n de x o t h e r m a lp e a k sa p p e a r i n gi n d i f f e r e n tp o s i t i o na t h i 【g ht e m p e r a t u r ef o rh o m o g e n e o u sa n dh e t e r o g e n e o u sg r a f t i n g p r o d u c t s t h a tm e a n sh o m o g e n e o u sa n dh e t e r o g e n e o u sg r a f t i n gp r o d u c t sh a v ed i f f e r e n t h e a ts t a b i l i t i e sf o rt h ed i f f e r e n c eo fs t r u c t u r ea n dg r a f t i n gd e g r e e f o rb a s i ch y d r o l y s i so f g r a f t e dc h i t o s a n , t h em e t h y ll g j u t a m a t es i d ec h a i n sm a yb eh y d r o l y z e dt og l u t a m i ca c i d i nl m o l 1 1s o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o mt h en g wg r a f t i n gp r o c e d u r ec a nb ea p p l i e di n s u r f a c em o d i f i c a t i o no fc h i m s a nm a t e i i a l st op r o v i d es u i t a b l ep r o p e r t i e st of u l f i l lv a r i o u s r e q u e s t s c o p o l y p e p t i d ec o n s i s t i n go fa s p a r t i ca c i da n dg l u t a m i ca c i dw i t hm o l er a t i oo f1 0 ：0 、 8 ：2 、5 ：5w e r ep r e p a r e db yh e a tc o n d e n s a t i o np o l y m e r i z a t i o nu s i n gp h o s p h o r i ca c i da s c a t a l y s t t h e yw e r eh e t e r o g e n e o u s l yg r a f t e do n t oc h i t o s a ni nd m fs y s t e m c o p o l y p e p t i d e w i t hm o l er a t i oo f2 ：8w a ss o l u b l ei nw a t e ra n dh o m o g e n e o u s l yg r a f t e do n t oc h i t o s a n i r , c p m a s 1 3 c n m rm e a s u r e m e n ts h o wa m i n og r o u p so fc h i t o s a ni n d u c eo p e nc y c l e r e a c t i o no fa m i d ec y c l i n gi nc o p o l y p e p t i d ea n dt h eo b t a i n e dc h i t o s a ng r a f t e dp r o d u c t s h a v ec l e a ra n dd e f i n i t es t r u c t u r e i nx p , ds p e 蜘u n l t h eg r a 盎e dc o p o l y p e p f i d es i d ec h a i l l s c a u s en e wd i f f r a c t i o np e a ka p p e a ra t2 0 = 1 5 1 。c o m p a r e dd s cc u r v e so fc h i t o s a n p r o d u c t sg r a f t e db y1 0 ：0 、8 ：2 、5 ：5o f c o p o l y p e p t i d e ，h e a ts t a b i l i t yo f g r a f t i n gp r o d u c t si s f o u n dt oi n c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n gp r o p o r t i o no fc a r b o x y lg r o u p si ng r a f t i n gc h a i n sa n d a l la r eb e a e rt h a nc h i t o s a nr a wm a t e r i a l f o rb a s i ch y d r o l y s i so fg r a r e dc h i t o s a n , t h e c o p o l y p e p t i d es i d e c h a i n sm a yb eh y d r o l y z e dt oo p e nr e m a i n i n ga m i d ec y c l i n gi n 2 m o l l s o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o n t h en e w s y n t h e s i s m e t h o dp r o m o t e sf u r t h e r d e v e l o p m e n to f c h i t o s a nb i o m a t e r i a l s f o u r t h ，s t u d yo np r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f c h i t o s a ns c a f f o l d s t h ec h i t o s a ns c a f f o l d sc r o s s l i n k e db ya s p a r t i ca c i d g l u m m i ca c i dc o p o l y p e p t i d ew e r e p r e p a r e db yf r e e z ed r y i n g t h ei n f l u e n c eo fc o n s t i t u e n t sa n dc r o s s l i n k i n gm o d i f i c a t i o no n m a t e r i a ls t r u c t u r ea n dm o r p h o g r a p hw e r ec h a r a c t e r i z e db yi r 、x r d 、s e m 、p o r o s i t ya n d m e c h a n i c a lp r o p e r t y t h ec r o s s l i n k e dc h i t o s a ns c a f f o l d sh a v el e s sp o r o s i t yt h a nc h i t o s a n s c a f f o l d s ，b u tk e e ph i g ha ts c o p eo f8 5 9 5 t h e yh a v ec o n t r o l l e dp o r ed i a m e t e ro f 4 0 - 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