（化学专业论文）酶促合成头孢羟氨苄以及酶的固定化研究.pdf

摘要 摘要 头孢羟氨苄具有广谱、高效和毒副作用小的特点，是重要的抗生素品种之 一。目前p 内酰胺抗生素的合成中主环与侧链连接步骤主要采用化学偶联合成 方法，反应条件苛刻，需要繁琐的基团保护与去保护步骤，消耗大量原料同时 产生许多污染物。酶促合成方法是p 内酰胺抗生素实现温和反应、减少反应步 骤、清洁生产的有效途径。 论文研究了以d 对羟基苯甘氨酸甲酯作为酰基供体酶促合成头孢羟氨苄的 方法。同时，筛选了一系列不同极性的有机溶剂，并考察了固定化青霉素g 酰 化酶i p a 7 5 0 的酶量、反应温度、反应时间和底物浓度与投料比等因素对酶促反 应的影响，成功地实现了二氯甲烷介质中酶促合成头孢羟氨苄的新途径。合成 产率和s h 比值分别达到了4 5 和0 4 5 。 论文研究比较了二氯甲烷与其它有机溶剂的混合体系对酶促合成头孢羟氨 苄的影响，结果发现在二氯甲烷水两相体系6 0 4 0 ( v v ) 中可以提高7 - a d c a 和 d 对羟基苯甘氨酸甲酯的转化率。在2 5o c ，p h6 0 ，酶量3 2 4i u ，1 0 0 m m o l l 7 - a d c a 和2 0 0m m o l ld h p g m 的底物浓度条件下反应2 4h ，反应的合成产率 为5 9 8 ，s h 比值达到了0 6 。 论文研究建立了青霉素g 酰化酶的固定化方法。详细研究了不同的固定化 载体，固定化时间，游离酶浓度对固定化酶活性的影响。同时比较了不同固定 化酶的热稳定性，酸碱耐受性，以及在二氯甲烷中的稳定性。研究发现，通过 活化的交联琼脂糖凝胶( s e p h a r o s ec l 6 b ) 固定化得到的固定化青霉素g 酰化 酶( f s e p h p g a ) 在热稳定性、酸碱耐受性还是二氯甲烷中的稳定性明显提高。 同时，f s e p h p g a 在上述各种特性上与商业化的固定化青霉素g 酰化酶 ( i p a 7 5 0 ) 都具有可比性。 本论文主要成果是建立了有机介质及有机溶剂水两相介质体系中酶促合成 头孢羟氨苄的方法，研究了有机介质对固定化青霉素g 酰化酶催化活性的影响； 建立了在活化s e p h a r o s ec l 6 b 载体上固定青霉素g 酰化酶的固定化方法。 关键词：头孢羟氨苄，酶促合成，有机介质，固定化，交联琼脂糖凝 摘要 a b s t r a c t b e c a u s eo fi t ss i m i l a r i t yi ns t r u c t u r e ，c e f a d r o x i lp o s s e s s e sm a n yo ft h es a m e c h a r a c t e r i s t i c sa sc e p h a l e x i na n dc e p h r a d i n e t h em o s ta p p a r e n ta d v a n t a g e so f c e f a d r o x i lo v e rt h er e f e r e n c ec o m p o u n d s ，h o w e v e r ，l i ei ni t s p h a r m a c o k i n e t i c p r o p e r t i e s a n dc e f a d r o x i lh a sb e e ns h o w nt oh a v eal o n g e rs e r u mh a l f - l i f ea f t e ro r a l d o s a g et oh u m a n s ，as l o w e ru r i n a r ye x c r e t i o nr a t e ，a n dag r e a t e ra r e at h a ne i t h e r c e p h a l e x i no rc e p h r a d i n e i na d d i t i o n ，i tw a sa l s on o t e dt h a tt h ea p p a r e n tv o l u m eo f d i s t r i b u t i o no fc e f a d r o x i li sg r e a t e rt h a nt h a to fc e p h a l e x i n b e c a u s eo fc e f a d r o x i l s b r o a dr a n g eo fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya n di t sf a v o r a b l ep h a r m a c o k i n e t i cp r o f i l ei nm a n ， s y n t h e s i st h i sa n t i b i o t i ci nag r e e nw a y a r ec u r r e n t l yu n d e rs t u d yb yu s t h i st h e s i sf o c u s e so nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fc e f a d r o x i li nf u l l yo r g a n i c m e d i u m w ea l s or e s e a r c h e dt h ea q u e o u sb u f f e r d i c h l o r o m e t h a n et w o p h a s es y s t e m a n di m m o b i l i z a t i o no f p e n i c i l l i ng a c y l a s eo nt h ef u n c t i o n a l i z e ds e p h a r o s ec l - 6 b t h ee f f i c i e n te n z y m a t i cs y n t h e s i so fc e f a d r o x i li nf u l l yo r g a n i cm e d i u mw a s s u c c e s s f u l l ya c h i e v e dw i t hd - p - h y d r o x y p h e n y l g l y c i n em e t h y le s t e r ( d - h p g m ) a st h e a c t i v a t e da c y ld o n o r as e r i e so fo r g a n i cs o l v e n t sw i t hd i f f e r e n tp o l a r i t yw e r e s c r e e n e d ，a m o n gw h i c hd i c h l o r o m e t h a n ew a st h eb e s t t h e i n f l u e n c ef a c t o r s i n c l u d i n gt h ee n z y m el o a d i n g ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ，i n i t i a ls u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o na n dm o l a rr a t i oo fs u b s t r a t e so nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fc e f a d r o x i l i np u r ed i c h l o r o m e t h a n ew e r es y s t e m a t i c a l l ye x a m i n e d a sar e s u l t , h i g hy i e l d ( 4 7 ) a n ds hr a t i o ( 0 4 5 ) w e r es u c c e s s f u l l ya c h i e v e dw i t h10 0m m o l l7 - a d c aa n d2 0 0 m m o l ld h p g mu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s m e d i ac o m p o s e dw i t hd i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sw e r es c r e e n e da n da q u e o u s b u f f e r d i c h l o r o m e t h a n et w o p h a s es y s t e m ( 4 0 6 0 ，v v ) w a sf o u n dt ob ea b l et o r e m a r k a b l yi m p r o v et h ee n z y m ea c t i v i t y t h ec o n v e r s i o no f7 - a d c aa n dd - h p g m w a sg r e a t l yi m p r o v e d a f t e r2 4hr e a c t i o n t h ec o n v e r s i o no f7 - a d c aw a s5 9 8 a n ds hr a t i oo f0 6w e r ea c h i e v e di nr e a c t i o nc a r r i e do u ta t2 5o c ，p h6 0 ，e n z y m e l o a d i n g3 2 4i u ，10 0m m o l l7 - a d c aa n d2 0 0m m o l ld h p g ms u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n 摘要 t h i st h e s i ss t u d i e dt h ei m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i nga c y l a s eo nt h e f u n c t i o n a l i z e d s e p h a r o s e c l - 6 b t h ei n f l u e n c eo ft h ed i f f e r e n t c a r r i e r s ， i m m o b i l i z a t i o nt i m e ，f r e ee n z y m ec o n c e n t r a t i o no nt h ei m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t y w a ss t u d i e d t h et h e r m a ls t a b i l i t y ，a c i da n da l k a l it o l e r a n c e ，a sw e l l 髂i n d i c h l o r o m e t h a n es t a b i l i t yo ft h ed i f f e r e n ti m m o b i l i z e de n z y m e sw e r ec o m p a r e d a sa r e s u l t ，p e n i c i l l i nga c y l a s ei m m o b i l i z e do nt h e t h ef u n c t i o n a l i z e ds e p h a r o s ec l 一6 b ( f s e p h - p g a ) s h o w ng r e a t t h e r m a l s t a b i l i t y ，a c i d a n da l k a l it o l e r a n c ea n d d i c h l o r o m e t h a n ec o m p a r i n gw i t hs e p h p g a a tt h es a m et i m e ，f s e p h p g ai nt h e a b o v e m e n t i o n e dv a r i o u sp r o p e r t i e sw i t hc o m m e r c i a li m m o b i l i z e dp e n i c i l l i ng a c y l a s e ( i p a - 7 5 0 ) a r ec o m p a r a b l e k e y w o r d s ：c e f a d r o x i l ，1 3 - l a c t a ma n t i b i o t i c s ，e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，o r g a n i cm e d i u m ， i m m o b i l i z a t i o n ，s e p h a r o s ec l - 6 b i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得滥鎏盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权监 盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 乒劾 签字日期：力，夕年乡月彦日 电话： 邮编： 翻日 缸渺。：)7 签 户 者 汐 储 力 文 期 沦 日 t c 一 学 签 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师 指导下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国 家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论 文或申请专利，均需以导师作为通讯联系人。未经导师的书面 许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署 名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本 人承担。 学位论文作者签名：也刁动 签字日期：沙户年乡月莎e t 致谢 致谢 本论文能够顺利完成，首先要特别感谢林贤福教授。最初是林 老师将我提携入本课题组的，并且一直以来以其独特的人格魅力影 响着我。林老师丰富的理论与实践经验、严谨的治学态度、忘我的 工作精神和平易近人的生活作风，是我学习和奋斗的榜样。在学业 上，林老师在我遇到困难之际给予指导，使我能够正确的把握学习 和研究的方向。在生活上，林老师也在我情绪低落的时候给予了深 切的关怀和帮助，让我能够重新拾起信心迎接挑战。在本论文结束 之际，谨向林老师表示衷心的感谢和崇高的敬意。 其次还要特别感谢我的导师吴起副研究员。从本论文的选题到 最后定稿，字里行间都凝聚着导师的诸多心血。吴老师学识渊博， 治学严谨，为人开明，工作忘我，不仅在学业上培养了我独立从事 科研工作的能力，也让我领悟到了许多做人做事的原则和态度，让 我受益匪浅。在此文结束之际，谨向我的导师表示衷心的感谢和崇 高的敬意。 感谢吕德水老师、陈志春老师在攻读硕士学位期间，对本论文 工作的指导、支持和帮助。 感谢课题组成员刘博凯、李霞、郑承臻、金鑫、郭辉、王君良、 张宜明、倪忠，宁静恒、钱学启、叶海朋、高遐、印翠、周星华、 李莉、陈香、刘志强、许凡、王婷婷、陈欢等同学给予的热情帮助 和有益探讨，感谢已经毕业的许建明、张清义、娄凤文、奚凤娜、 张馥、刘丽君、徐善浩、陈春秀、张明、陈万勤、潘绳彬、夏爱华 致谢 等，感谢你们给予的热情帮助和有益探讨。 感谢我的父母，此文能够完成，得益于他们一如既往的支持。 感谢所有曾经关心帮助过我的老师、同学和朋友! 杜莉莉 20 10 年1 月于浙江大学 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 1 3 一内酰胺类抗生素疗效好而毒性小，是目前治疗感染性疾病的重要药物。 该类药物包括青霉素类、头孢菌素类、青霉烯类、单环内酰胺类和1 3 - 内酰胺 酶抑制剂，它们的共同特点是都具有抗菌活性部分d 内酰胺环。其中，最重 要的两类是青霉素类和头孢菌素类抗生素。 1 3 内酰胺抗生素生产过程基本上分为三步【1 】：第一步，依靠发酵生产青霉 素g 、v 以及头孢菌素c ；第二步，裂解抗生素生产抗生素母核6 - a p a 和 7 - a c a ；第三步，从这些关键的中间体和新的d 氨基酸合成各种具有新的抗 菌活性和抗菌谱的半合成抗生素。目前工业上第二步生产技术已基本上由酶法 取代了传统的化学裂解工艺。第三步将中间体和d 氨基酸缩合成半合成青霉 素和头孢菌素的工艺，在国内外大多数为化学法【2 1 。但是化学方法需要经过保 护，活化，缩合和去保护步骤【1 1 ，反应过程复杂。同时，大量有机化学原料的 应用以及三废的产生都对环境造成了一定的污染。 1 9 6 9 年，m c o l e 3 】首次提出用酶法合成取代化学法合成的设想。但是， 由于当时条件和技术有限，该设想一直没有实现。直到2 0 世纪7 0 年代，固定 化青霉素酰化酶技术的成熟【4 1 ，实现了酶法水解青霉素g 生产6 - a p a ，从而取 代了传统的化学裂解法。在此基础上，青霉素g 酰化酶的固定化技术得到了 进一步的发展。在丙烯酸树脂类载体吼生物高聚物载体【6 】、硅材料【7 1 、磁性 材料【8 】以及膜介质【9 l 上固定化青霉素g 酰化酶的研究都取得了理想的结果，为 酶促合成1 3 - 内酰胺抗生素奠定了基础。 1 9 9 0 年以来，发达国家加强了对酶促合成1 3 - 内酰胺抗生素的研究。荷兰 d s m 公司和美国礼来公司已经成功实现了氨苄西林、阿莫西林以及头孢氨苄 的酶促合成。我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生 产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济的快速发展，人们对自身居住环 境要求的提高，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业正在加快“绿色化 学制药”的研究开发，特别是加快推进工业化生产的进程。这也是我们课题组 要解决的问题。 目前为止，对1 3 - 内酰胺类抗生素的酶促合成研究主要集中在水相中进行。 第一章绪论 m i y o u s h k o 课题组【l 4 】详细地研究了酰基供体、反应底物浓度以及p h 值对 酶促合成p 内酰胺类抗生素的影响。同时，许多课题组还系统地考察了反应 温度【1 5 ，1 6 1 、离子强度【1 7 。19 】等条件因素的影响，取得了一定的进展并获得了有 价值的研究结果。在此基础上，m g k i m 2 0 ，2 n 、a i l l a n e s l 2 2 - 2 6 】等课题组报道 了水相中添加有机物对酶促合成p 内酰胺类抗生素的影响。研究发现添加一 些有机物能够降低水活度，抑制酰基供体的水解，从而有助于提高反应的产率 和s h 比值；我们课题组【2 2 ，2 3 】实现了纯有机溶剂中氨苄西林与阿莫西林的酶促 合成，并取得了理想的产率和s h 比值。 头孢羟氨苄是b 内酰胺类抗生素重要的品种之一，l m v a nl a n g e n 1 6 】报 道了冰相体系对酶促合成头孢羟氨苄的影响，研究发现，在2 0o c 水相中头孢 羟氨苄的产率仅为2 2 。因为底物7 - a d c a 和d 对羟基苯甘氨酸在水中的溶 解度较低【1 ，2 9 1 ，因此探索研究在有机溶剂及其多相体系中酶促合成头孢羟氨 苄，将有助于提高反应的产率，促进该方法的实际应用。 本文选择了“酶促合成头孢羟氨苄以及酶的固定化的研究”作为课题的研 究内容，主要探索研究了有机介质及两相体系中酶促合成头孢羟氨苄的方法， 并研究研究了青霉素g 酰化酶的固定化过程。 2 浙江大学硕士学位论文 参考文献 l m a w e g m a n ，m h a j a n s s e n ，f v a nr a n t w i k ，r a s h e l d o n t o w a r d sb i o c a t a l y t i c s y n t h e s i so f b - l a c t a ma n t i b i o t i c s a d v s y n t h c a t a l 2 0 0 l ，3 4 3 ，5 5 9 5 7 6 2 w b w u ，x w a n g ，n w a n g ，q w u , x f l i n n e wp r o g r e s si ne n z y m a t i c s e m i s y n t h e s i so f b e t a - l a c t a ma n t i b i o t i c s c h i n e s ej o r g c h e m ，2 0 0 6 ，2 6 ( 3 ) ：2 9 2 2 9 8 3 m c o l e h y d r o l y s i so fp e n i c i l l i n sa n dr e l a t e dc o m p o u n d sb yt h ec e l l b o u n dp e n i c i l l i n a c y l a s eo fe s c h e r i c h i ac o l i b i o c h e m j 19 6 9 1 l5 ：7 3 3 - 7 3 9 4 t t i d w e l l ，h u g o ( u g o ) s c h i i f , s c h i f fb a s e s ，a n dac e n t u r yo fp - l a c t a ms y n t h e s i s a n g e w c h e m i n t e d ，2 0 0 8 ，4 7 ：1 0 1 6 - 1 0 2 0 5l m v a nl a n g e n ，m h a j a n s s e n ，n h p o o s t h o e k ，s r m p e r e i r a , v k s v e d a s ，f v a nr a n t w i j k ，r a s h e l d o n ，b i o t e c h n 0 1 b i o e n g 2 0 0 2 ，7 9 ，2 2 4 2 2 8 6 r f e m a n d e z l a f u e n t e ，c m r o s e l l l c a a n a n h a d e n 。l r o d e s ，j m g u i s a n ，e n z y m em i c r o b t e c h n 0 1 19 9 9 2 4 9 6 10 3 7yj l n ，gz l u ，y q w a n g ，y l g u o ，y g u o ，z gz h a n g ，ys w a n g , x h l i u f u n c t i o n a l i z a t i o no f c u b i cl a 3 dm e s o p o r o u ss i l i c af o ri m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i ng a c y l a s e a d v f u n c t m a t e r 2 0 0 7 ，17 ，216 0 216 6 8 j 。s h u a n g ，x t l i ，y h z h e n g ，y z h a n g ，r yz h a o ，x c g a o ，h s y a n ， i m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i nga c y l a s eo np o l y ( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ) 一c o 一( g l y c e r o l m o n o m e t h a c r y l a t e ) g r a f t e dm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，m a c r o m 0 1 b i o s c i 2 0 0 8 ，8 ， 5 0 8 - 51 5 9 c c h e n ，c w c h e n ，c w h u a n g ，yc l i u ，s i m u l t a n e o u sp u r i f i c a t i o na n d i m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i nga c y l a s eu s i n gb i f u n c t i o n a lm e m b r a n e j o u r n a lo f m e m b r a n es c i e n c e2 9 8 ( 2 0 0 7 ) 2 4 - 2 9 1o m i y o u s h k o ，l m v a nl a n g e n ，e d ev r o o m ，h m m o o d y , ev a nr a n t w i j k , r a s h e l d o n v k s v e d a s p e n i c i l l i na c y l a s e - c a t a l y z e ds y n t h e s i so fa m p i c i l l i ni n ”a q u e o u s s o l u t i o n - p r e c i p i t a t e ”s y s t e m s h i 曲s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n ds u p e r s a t u r a t i o ne f f e c t j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m 2 0 0 0 ，10 ( 5 ) ：5 0 9 515 1 lm i y o u s h k o vk s v e d a s k i n e t i c so fa m p i c i l l i ns y n t h e s i s c a t a l y z e db yp e n i c i l l i n a c y l a s e f r o me - c o l ii n h o m o g e n e o u s a n d h e t e r o g e n e o u ss y s t e m s q u a n t i t a t i v e c h a r a c t e r i z a t i o no fn u c l e o p h i l er e a c t i v i t ya n dm a t h e m a t i c a lm o d e l i n go ft h ep r o c e s s b i o c h e m i s t r y - m o s c o w , 2 0 0 0 ，6 5 ( 1 2 ) ：1 3 6 7 1 3 7 5 1 2m i y o u s h k o ，l m v a nl a n g e n ，e d ev r o o m ，ev a nr a n t w i j k ，& a s h e l d o n ，v k s v e d a s h i g l l l ye f f i c i e n ts y n t h e s i so fa r n p i c i l l i n i na l l ”a q u e o u ss o l u t i o n - p r e c i p i r a t e ” s y s t e m ：r e p e t i t i v ea d d i t i o no f s u b s t r a t e si nas e m i c o n t i n u o u sp r o c e s s b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ， 2 0 01 ，7 3 ( 5 ) ：4 2 6 - 4 3 0 13 m i y o u s h k o h m m o o d y , a l b u k h a n o v , w ：h j b o o s t e n v k s v e d a s p e n i c i l l i n a c y l a s e - c a t a l y z e ds y n t h e s i so fb e t a - l a c t a ma n t i b i o t i c si nh i 曲l yc o n d e n s e da q u e o u s s y s t e m s ：b e n e f i c i a li m p a c to fk i n e t i cs u b s t r a t es u p e r s a t u r a t i o n b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，2 0 0 4 ， 8 5 ( 3 ) ：3 2 3 3 2 9 1 4 m i y o u s h k o ，l m v a nl a n g e n ，e d ev r o o m ，f v a nr a n t w i j k ，& a s h e l d o n , v k s v e d a s p e n i c i l l i na c y l a s e - c a t a l y z e da m p i c i l l i ns y n t h e s i su s i n gap hg r a d i e n t ：al l e w a p p r o a c ht oo p t i m i z a t i o n b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，2 0 0 2 ，7 8 ( 5 ) ：5 8 9 5 9 3 3 第一章绪论 15 a s c h w a r t z , d s t e i n k e ，m r k u l a , c w a n d r e y b i o t e c h n 0 1 a p p l b i o c h e m ，19 9 0 ，12 ： 1 8 8 1 9 5 16l m v a i ll a n g e n ，e d ev r o o m ，f v a i lr a n t w i j k ，r a s h e l d o n e n z y m a t i cs y n t h e s i so f b - l a c t a ma n t i b i o t i c su s i n gp e n i c i l l i n - ga c y l a s ei nf r o z e nm e d i a f e b sl e t t ，19 9 9 ，4 5 6 ： 8 9 9 2 1 7 j m f r e r e ，j m g h u y s e n ，h r p e r k i n s ，m n i e t o b i o c h e m j ，1 9 7 3 ，1 3 5 ：4 8 3 - 4 9 2 1 8vk a s c h e ，b g a l u n s k y b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n ，1 9 8 2 ，8 0 ：1 2 1 5 - 1 2 2 2 1 9 a s c h w a r t z , d s t e i n k e ，m r k u l a , c w a n d r e y b i o t e c h n 0 1 a p p l b i o c h e m ，1 9 9 0 ，1 2 ： 1 8 8 - 1 9 5 2 0m g k i m s b l e e e f f e c to fo r g a n i cs o l v e n t so np e n i c i l l i na c y l a s e - c a t a l y z e dr e a c t i o n s ： i n t e r a c t i o no fo r g a n i cs o l v e n t sw i t he n z y m e s j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m ，19 9 6 ，l ：181 19 0 21 m g k i m ，s b l e e ，p e n i c i l l i na c y l a s e - c a t a l y z e ds y n t h e s i so f - l a c t a ma n t i b i o t i c si n w a t e r - m e t h a n o lm i x t u r e s ：e f f e c to fc o s o l v e n tc o n t e n ta n dc h e m i c a ln a t u r eo fs u b s t r a t eo n r e a c t i o nr a t e sa n dy i e l d s j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m ，19 9 6 ，1 ：2 01 211 2 2 a i l l a n e s ，a f a j a r d o ，k i n e t i c a l l yc o n t r o l l e ds y n t h e s i so fa m p i c i l l i nw i t hi m m o b i l i z e d p e n i c i l l i na c y l a s ei nt h ep r e s e n c eo fo r g a n i cc o s o l v e n t s j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m 2 0 0 1 11 ( 4 - 6 1 ：5 8 7 5 9 5 2 3c a g u i r r e ，p o p a z o ，v e n e g a sm ，r i v e r o s i l l a n e sa l o wt e m p e r a t u r ee f f e c to n p r o d u c t i o no fa m p i c i l l i na n de e p h a l e x i ni ne t h y l e n eg l y c o lm e d i u mw i t hi m m o b i l i z e d p e n i c i l l i na c y l a s e p r o c e s sb i o c h e m 2 0 0 6 ，4l ( 9 ) ：19 2 4 - 19 31 2 4 a i l l a n e s ，z a i d ac a b r e r a , l o r e n aw i l s o n ，c a r o l i n aa g u i r r e ，s y n t h e s i so fc e p h a l e x i ni n e t h y l e n eg l y c o lw i t hg l y o x y l a g a r o s ei m m o b i l i s e dp e n i c i l l i na c y l a s e ：t e m p e r a t u r ea n dp h o p t i m i z a t i o n ，p r o c e s sb i o c h e m i s t r y3 9 ( 2 0 0 3 ) 1 ll - 1 17 ； 2 5a 1 l l a n e s ，c a l t a m i r a n o ，m f u e n t e s ，f z a m o r a n o ，c a g u i r r e ，s y n t h e s i so fc e p h a l e x i n i no r g a n i cm e d i u ma th i g l ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n sa n dl o wg a l z y m et os u b s t r a t er a t i o ， j o u r n a lo f m o l e c u l a rc a t a l y s i sb ：e n z y m a t i c3 5 ( 2 0 0 5 ) 4 5 5 1 2 6 a i l l a n e s ，l w i l s o n ，c a l t a m i r a n o ，z c a b r e r a ，l a l v a r e z ，c a g u i r r e ，p r o d u c t i o no f c e p h a l e x i ni no r g a n i cm e d i u ma th i g hs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n sw i t hc l e ao fp e n i c i l l i n a c y l a s ea n dp g a - 4 5 0 ，e n z y m ea n dm i c r o b i a lt e c h n o l o g y4 0 ( 2 0 0 7 ) 1 9 5 - 2 0 3 2 7s b p a n ，q w u , c x c h e n ，x f l i n ，e f f i c i e n te n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m p i c i l l i ni n f u l l yo r g a n i cm e d i u m j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m 5 4 ( 2 0 0 8 ) 13 2 8 c x c h e n , q w u ，b kl i u ，d s l v ，x f l i n a n h y d r o u st e r t p e n t a n o l 嬲n o v e lm e d i a f o re f f i c i e n te n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m o x i c i l l i n e n z y m ea n dm i c r o b i a lt e c h n o l o g y , 2 0 0 8 ， 4 2 ：6 0 1 6 0 7 2 9b a 1 1 e c e r o o s e d ev r o o m ；p e n i c i l l i na c y l a s ei nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f p - l a c t a ma n t i b i o t i c s ；o r g a n i cp r o c e s sr e s e a r c h & d e v e l o p m e n t19 9 8 ，2 ，12 8 - 13 3 4 浙江大学硕士学位论文 第二章酰化酶的固定化及其酶促合成p 内酰胺研究 2 1 引言 广谱1 3 内酰胺抗生素中最主要是青霉素和头孢菌素两大类，它们的分子 结构中都含有p 内酰胺环，即氨基在内酰胺环中的1 3 位碳原子上( 图2 1 ) 。 它们都具备很好的选择性和杀菌作用，是临床上应用最为广泛的药物之一。将 左端的r c = o 基团换成h 即分别为青霉素的母核6 氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 和头孢菌素的母核7 氨基3 脱乙酰氧基头孢烷酸( 7 - a d c a ) ，通过不同的侧 链与母核酰化缩合改变左端的r 基就可以得到各种半合成青霉素和头孢菌素。 由于半合成青霉素和头孢菌素具有更好的耐酸碱性能和抗细菌耐药性能力，引 起了越来越多的关注。随着青霉素g 酰化酶在水解青霉素制备6 - a p a 以及酶 促半合成p 内酰胺类抗生素中的广泛应用，对固定化青霉素g 酰化酶方法的 研究也受到人们极大的重视。 a h l b r 丫搏抟r 丫 c o o h 图2 1a ，青霉素；b ，头孢菌素 f i g 2 1 a ，s l r u c t u r eo fp e n i c i l l i n ；b ，s 仉l c t u r eo fp e n i c i l l i nc e p h a i o s p