（环境科学专业论文）基于新型有机—无机杂化材料的安培型生物传感器研究.pdf

a b s t r a c t b i o s e n s o r sa r en e wa n a l y t i e a lt o o l sw i t ht h em e r i t so fs e l e c t i v i t y , f a s tr e s p o n d i n g ， l o wo p e r a t i o ne x p e n s ee ta l ，a n dt h e yh a v eb e e na p p l i e di n t oe n v i r o n m e n tm o n i t o r i n g ， c l i n i c a ld i a g n o s i s ，f o o dq u a l i t yc o n t r o la n dm i l i t a r ym e d i c i n e s o l g e ld e r i v e dh y b r i d m a t e r i a lh a v eb e c o m eo n eo ft h em o s ta p p r o p r i a t e de n z y m e si m m o b i l i z e dm a t r i x i n t h i st h e s i s ，an e ws o l - g e ld e r i v e dm a t e r i a lh a sb e e nc o m p o s e da n ds e v e r a lg l u c o s e o x i d a s eb i o s e n s o r sa n dan i t r a t er e d u c t a s e b i o s e n s o rh a v eb e e nf a b r i c a t e d t h e e l e c t r o c h e m i s t r yc h a r a c t e r so ft h eb i o s e n s o r sh a v eb e e ns t u d i e d ，a n dl o t so fw o r kh a s b e e nd o n et oe n h a n c et h ep e r f o r m a n c eo ft h eg l u c o s eb i o s e n s o r s t h ed e t a i l e dw o r ko f t h i st h e s i sh a sb e e ns e to u ta sf o l l o w s ： an e wg r a f tp o l y m e rw a sc o m p o s e db ye s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nb e t w e e np o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) a n dm e r c a p t o e t h y l a r n i n e ，b a s e do nt h i sg r a f tp o l y m e ra n ds o l - g e l ，a n e wo r g a n i c i n o r g a n i ch y b r i dm a t e r i a lh a db e e no b t a i n e d t h ec h a r a c t e r so ft h en e w g r a f tp o l y m e ra n dh y b r i dm a t e r i a lh a v eb e e ns t u d i e d ，a n dt h ep a r a m e t e r so fh y b r i d m a t e r i a lp r e p a r a t i o nh a v ea l s ob e e no p t i m i z e d 。 b a s e do nt h i sh y b r i dm a t e r i a l ，g l u c o s eo x i d a s ew a se m b e d d e da n di m m o b i l i z e d o ns u r f a c eo fg o l de l e c t r o d et of a b r i c a t ean e wt y p eo fg l u c o s eb i o s e n s o r t h e e n z y m e se m b e d d e di nt h eh y b r i dm a t e r i a ls h o w e dh i g ha c t i v i t yd u et ot h eg r e a td e a l o fh y d r o x i d er a d i c a la n dh y d r o g e nb o n d so ft h eh y b r i dm a t e r i a l ，t h eg r e a td e a l m e r c a p t og r o u po ft h eg r a f tp o l y m e rc a nh e l pt h eh y b r i dm a t e r i a lm e m b r a n et ob e a d s o r b e do n t og o l ds u r f a c et i g h t l y , s ot h eb i o s e n s o r sb a s e do nt h i sh y b r i dm a t e r i a l h a v ee x c e l l e n ts t a b i l i t y , a tt h es a m et i m e ，t h eb i o s e n s o rh a sm a n ym e r i t ss u c ha sf a s t r e s p o n s e ，g r e a tr e s p o n s ec u r r e n ta n dl o wd e t e c tl i m i t b a s e do nt h i sh y b r i dm a t e r i a la n dp l a t i n u me l e c t r o d e ，an e wt y p eo fg l u c o s e b i o s e n s o rh a db e e nf a b r i c a t e d ，t h i sb i o s e n s o rc a nw o r ka tal o wp o t e n t i a l ( o 0 5 v ) s o i t sa n t i d i s t u r b a n c ep e r f o r m a n c ew a se x c e l l e n t w eh a v ea l s of a b r i c a t e dab i o s e n s o rw i t ht h e h y b r i d m a t e r i a la n d e l e c 仃o d e p o s i t e dp m s s i a nb l u e ，t h i sb i o s e n s o rc a nw o r ku n d e r o 0 5 vb yr e d u c t i o no f t h eh 2 0 2p r o d u c e db ye n z y m e sr e a c t i o n ，t h el o ww o r k i n gp o t e n t i a lc a l lh e l pt o e n h a n c et h eb i o s e n s o r si n t e r f e r e n c ei m m u n i t y , s ot h eb i o s e n s o r sh a v eg o o dp r a c t i c a l v a l u e a f t e r21d a y si n t e r v a lu s e ，t h er e s p o n s ec u r r e n td r o p p e dt o9 2 o fi t si n i t i a l v a l u e t h er e s p o n s et i m eo ft h eb i o s e n s o rw a sa b o u t4 s t oe n h a n c et h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r s ，s i l v e rn a n o p a r t i c l e sa n dc a r b o n n a n o t u b e sw e r ea d d e di n t ot h eh y b r i dm a t e r i a l t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es i l v e r n a n o p a r t i c l e st a i le x t e n dt h ei i n e a r i t yr a n g eb y4t i m e sa n dt h ec a r b o nn a n o t u b e sc a n r e d u c et h eo p e r a t i n gp o t e n t i a lf r o mo 6 5 vt o0 1 8 v ( v ss c e ) t h er e s p o n s et i m eo f t h et w ob i o s e n s o rw e r ea b o u t3 4 sa n d3 s n i t r a t ei sa v e r yi m p o r t a n tc o n t a m i n a t i o no fw a t e r , s ot h ed e t e c t i o no fn i t r a t eb y af a s ta n da c c u r a t em e t h o di so fg r e a tv a l u e i nt h i st h e s i s ，t h ef i r s ta m p e r o m e t r i c n i t r a t er e d u c t a s e sb i o s e n s o rb a s e do ns o l g e ld e r i v e dh y b r i dm a t e r i a lw a sf a b r i c a t e d t h en i t r a t eb i o s e n s o rs h o w e dg o o ds t a b i l i t yb y8 5 7 r e s p o n s ec u r r e n tr e t a i n e da f t e r 2l d a y s t oo u rk n o w l e d g e t h i si st h ef i r s ta m p e r o m e t r i cn i t r a t er e d u c t a s eb i o s e n s o r b a s e do ns o l - g e lm a t e r i a l s ， k e yw o r d s ：m e r c a p t o p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) ，s o l g e l ，o r g a n i c i n o r g a n i c h y b r i dm a t e r i a l ，b i o s e n s o gg l u c o s eo x i d a s e ，n i t r a t er e d u c t a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 阀博 签字日期：亿一6 年4 月伽目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫注盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名 闶俘 签字r 期：“年，2 月似日 导师签名 勃牡 年z 月z 口日 第一章文献综述 1 1 生物传感器概述 第一章文献综述 1 1 1 生物传感器的定义及分类 生物传感器是以生物活性物质如酶、抗体、核酸、细胞器等为敏感元件的传 感器。其工作原理是：通过各种物理型或化学型信号转换器捕捉目标物与敏感元 件间的反应，然后将这一反应的程度用电信号表达出来，从而得出被测物的浓度。 抗体 酶 d n a 细胞 组织 光 电化学 质量 其它 图卜1 生物传感器的传感原理 f i g u r e1 - 1h e c h a n i s mo fb i o s e n s o r s 生物传感器是一门多学科交叉的新兴学科，融合了生物、化学、物理、医学、 材料学和电子技术等多种学科，具有选择性高、分析速度快、灵敏度高、成本低、 能在复杂的体系中进行在线监测甚至活体分析等特点。生物传感器的高度自动 化、微型化和集成化，减少了对使用者操作技术的要求，适合野外现场分析。生 第一章文献综述 物传感器在环境监测、临床医学、食品分析、军事医学等领域有着重要应用价值， 因此引起世界各国的极大关注。近些年来，生物传感器的研究取得了很大的进展， 已经成功制备出了一系列在生物医学、环境监测、生化分析等方面具有实用价值 的生物传感器，并涌现了许多新的制备技术和材料。 生物传感器是由生物分子识别元件和信号转换器所组成，它将被测物的浓度 与可测量的物理化学信号关联起来，当被测物与分子识别元件特异性结合以后， 所产生的复合物( 如光、热等) 通过信号换能器变为可输出的电信号、光信号等， 从而达到分析检测的目的( 图i - 1 ) 。 根据侧重点不同，生物传感器的分类有三种。根据生物分子识别元件上的敏 感物质可以分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、基因传感器和免疫传感 器等；根据传感器输出信号的产生方式，可分为生物亲和型、代谢型和催化型生 物传感器；根据生物传感器上的信号转换过程，又可以分为光学型、质量型、热 量型和电化学型生物传感器。与光学、质量和热生物传感器相比，电化学生物传 感器发展的最快，而且最具有实用价值。电化学生物传感器又分为电流型( 安培 型) 、电位型和电导型。电流型酶电极是研究最广泛和深入的生物传感器之一 电流型酶电极所应用的酶可以是氧化还原酶，过氧化物酶，脱氢酶或一些非氧化 还原酶。其工作原理是：电极表面进行酶反应时，酶反应所需或产生的电子通过 媒介体转移到电极上，被检测装置放大得到响应电流，根据响应电流的大小确定 底物的浓度；或者通过检测酶反应的产物在电极表面发生氧化还原反应时在电极 生的响应电流来自j 接测定底物的浓度。 1 1 2 酶电极中的电子转移 根据酶电极中电子的传递方式不同，安培型酶电极已经经历了三代l l - 3 。以 葡萄糖氧化酶为例，电极上的反应如公式( 1 1 ) ，( 1 2 ) 所示： p d q 一g l u c o s e + e “g l u c o s e a c i d + e r e _ j e 。 其中和分别是葡萄糖氧化酶的氧化态和还原态， 如下三种形式实现： 。 1 1 2 1 第一代酶电极 0 - 1 ) ( 1 - 2 ) 公式中第二步可以通过 最早将酶与电极相结合的研究出现在1 9 6 2 年，c l a r k 和l y r o n s 提出将葡萄 糖氧化酶涂在氧电极的表面，葡萄糖被氧化时需要消耗氧，根据电极附近氧的浓 度来关联葡萄糖的浓度。第一只报道的酶电极是在用聚丙烯酰胺将葡萄糖氧化酶 第一章文献综述 固定在氧电极的表面，通过检测酶反应所产生的过氧化氢在电极上的氧化而制成 【4 】。这种酶电极属于第一代酶电极，即依靠溶液中的溶解氧来进行化学反应。由 于这种电极受溶液中的溶解氧浓度的影响很大，因此精度不高。此酶电极的电极 反应如公式( 卜3 ) 。( 卜4 ) 所示。 e + 0 2 je “+ h p t d 2j2 - + + d 2 + 2 矿( 电极表面反应) ( i - 3 ) ( 1 - 4 ) 1 1 2 2 第二代酶电极 在第二代酶电极中，一些人工的电子媒介体取代了氧，反应过程的电子通过 这些媒介体在电极表面和酶的活性位点之间进行传递。这样电极反应可以在一个 相对较低的电位下进行【3 5 】，有效的降低了电活性物质的干扰，还可以将媒介体 同酶一起固定在电极表面制成免试剂的酶电极。第二代酶电极是研究的最多的一 种酶电极。此酶电极的电极反应如公式( 卜5 ) ，( 卜6 ) 所示。 e + m “e 。+ m 埘 肘d 寸虬+ n e - ( 电极表面反应) ( 卜5 ) ( 1 - 6 ) 其中m o 。和m 捌分别为媒介体的氧化态和还原态，这些媒介体比天然的媒介体 ( 氧) 更能很好的传递电子。一般来说，优良的电子媒介体应有如下一些特征【6 】： a 可与酶的氧化还原辅基快速反应，提高响应电流密度； b 能吸附或滞留在电极表面； c 呈现可逆的电极反应动力学； d 具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关； e 氧化还原形式能稳定存在； f 对氧惰性或非反应活性； g 具有生物兼容性，无毒性。 1 1 2 3 第三代酶电极 第三代酶电极的特征是电子直接传递。在电极表面，酶反应所产生的电子直 接转移到电极上，如公式( 1 - 6 ) 所示。 m jj 】l k + n e 一 ( 卜6 ) 已经有一些基于直接电子传递的酶电极的文章发表【弘9 1 ，但是这种基于电子 - 3 第一章文献综述 直接传递的第三代酶电极的定义并没有得到普遍的认可，这是因为酶分子的体积 很大，氧化还原位点不太可能和电极表面近距离的接触，也就不会产生电予的快 速转移。经过修饰的酶可能会使这一问题得到改善而产生电子的直接传递， w i l l n e 1 0 1 1 1 研究小组在这方面的研究较为深入。当前第一代和第二代酶电极仍然 是研究最为广泛的酶电极。 1 1 3 改善酶电极性能的方法 1 1 3 1 选择高效的电子媒介体 一 电子媒介体( 又称电子转移媒介体，媒介体等) 是指能将酶反应过程中产生的 电子从酶活性位点转移到电极表面，从而在电极上产生响应电流变化的分子导电 体。目前使用的电子媒介体按分子结构特点和分子量大小可分为有机小分子媒介 体、高分子媒介体和纳米级单质媒介体等。 1 1 3 1 1 小分子媒介体 小分子媒介体主要包括二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四硫 富瓦烯( t t f ) 和导电有机盐等。其中二茂铁及其衍生物具有独特的物理化学性质， 氧化还原电位较低，是应用比较广泛的一种物质1 1 2 1 6 1 。小分子有机染料分子由于 带有大量电荷，也是一种优良的电子媒介体，常用的有机染料分子有亚甲基绿【1 1 1 、 麦尔多拉蓝【1 8 】、亚甲基蓝【1 9 1 、靛酚【2 0 j 和甲基紫精( 甲基紫罗碱) 2 1 , 2 2 垮。以有 机染料分子为电子媒介体的传感器具有的共同特征为：选择性高、灵敏度高、稳 定性好和电流响应快、传感器制备简便。四硫富瓦烯( r r f ) 富含电子，氧化还 原可逆性很好，是一种很好的媒介体。以t t f 为媒介体的酶电极具有许多优异的 性能，如灵敏度高、响应速度快、稳定性好以及对固定化酶无毒等【2 3 】。铁氰化钾 2 4 , 2 5 1 和亚铁氰化钾也是一种优良的电子媒介体，这两种铁盐一般是加入到溶液 中，取代氧而成为电子受体。电子媒介体不一定是单独使用，也可以是将几种媒 介体物质结合起来使用，如将二茂铁和其他电子媒介体( 如吩嗪的衍生物等) 复合 u 6 1 ，这类传感器的突出特点是线性范围比较宽。 小分子媒介体的使用一般有两种方法，第一种方法是直接加入到溶液中， 这种方法的优点是电子的传递效果较好，缺点是造成媒介体的大量浪费同时造成 溶液的污染；第二种方法是将媒介体和酶一起固定在电极表面，制备成无试剂的 酶电极，酶电极使用方便。但由于这些媒介体的分子体积较小，容易从酶膜中扩 散出来进入底物溶液中，使所制备的生物传感器的稳定性较差。 第一章文献综述 1 1 3 1 2 高分子媒介体 高分子媒介体通常是由小分子媒介体与高分子链所带的活性基团进行反应 固载生成的，由于高分子链间的相互缠结或交联从根本上消除了媒介体的扩散流 失问题，从而保证了酶电极的稳定性高分子媒介体主要包括如下四种类型： a ) 变价过渡金属离子鳌合型高分子媒介体 常用的螯合型高分子媒介体化合物有3 种，即含铁型、含锇型和含钌型。为 了加快酶活性中心与电极表面之间的电子传输速度，通常是将低分子导电体通过 化学键键合到具有充分柔性的聚硅烷为主链的高分子载体上。含铁型主要是将二 茂铁及其衍生物通过化学键连接到硅氧烷的主链上，用作酶传感器的电予媒介体 【2 7 】。含锇型和含钉型高分子一般是合成高分予与锇或钉的配位物，充当媒介体 【2 8 0 9 1 。 b ) 氧化还原聚合物型高分子媒介体 将葱、醌类物质键合到高分子链上形成的氧化还原聚合物是高分子媒介体的 又一表现形式。i n a g a k i 3 0 1 等人采用化学方法将醌或葸醌键合到硅氧烷高分子主链 上，并把此媒介体用于修饰酶电极，有效地防止了电极上媒介体向溶液中的流失 和电活性物质的干扰，通过对电极的循环伏安曲线分析得知，键合到硅氧烷主链 上的醌和葱醌保持了自由醌基的电活性，使制备的电极具有良好的响应特性。 c ) 单体聚合型高分子媒介体 文献报道的比较多的单体聚合型高分子媒介体主要是含乙烯基的电活性单 体聚合物，如聚乙烯基二茂铁、聚乙烯基吡啶、聚乙烯咪唑和络离子的聚合物【3 1 】 等，这类媒介体带有非常丰富的正电荷，可以同多种带负电荷的酶分子形成缔合 物，保证了酶分子与媒介体顺利接触。而由染料分子经电化学聚合法制得的染料 聚合物用作电子媒介体则是最新的研究动向。电聚合法制备的氧化还原型聚合物 还有电聚合麦尔多拉蓝1 3 2 1 ，聚紫精r 3 3 1 及聚天青兰p 4 1 等。 d ) 包络型高分子媒介体 包络型高分子媒介体是指将小分子的媒介体通过主客体化学反应，包埋在高 分子聚合物的空穴中。刘盛辉【3 5 垮人利用具有空穴结构的伊环糊精聚合物。通过 主客体化学反应将二茂铁包络在它的空穴中，同时将葡萄糖氧化酶交联在肛环糊 精聚合物上，制成了对葡萄糖有灵敏响应的酶电极。 1 1 313 纳米级单质粒子 对于纳米粒子的大量研究表明，当颗粒变小时，尤其是小于1 0 h m 时，颗粒 第一章文献综述 已不是一个惰性体，而是一个电子供体或者电子受体，或者说变成了一个电化学 活性物质。但是，在大多数情况下，金和银是电子受体，只有由几个分子或原子 组成的粒子才是电子给体。当然，是否给体还取决于环境的氧化还原电位。在电 位变负的同时，纳米颗粒的巨大比表面使这种效应十分突出。可以说，所有的氧 化、还原反应都可以受到具有这种性质的纳米颗粒的影响。由于纳米粒子具有这 种特点，近年来已经有学者将纳米颗粒引入到生物传感器领域中，并取得了很好 的效果【3 6 】。纳米颗粒在生物传感器中所起到的作用是多方面的【3 7 1 。首先是表面 效应，是指纳米粒子表面原子与总原子数之比随着粒径小而急剧增大后所引起的 性质上的变化。其次还有吸附定向效应、改变构型效应和量子尺寸颗粒效应，如 上所述，当纳米粒子足够小时，已经成为一个电化学活性物质，具有电子媒介体 的功能，直接参与了酶分子的氧化还原过程。相对于常规的媒介体而言，纳米粒 子具有不易流失、生物相容性好等特点。纳米粒子修饰的生物传感器是近年来的 一个研究热点 3 8 - 4 0 】。 自从1 9 9 1 年日本豇j i m a 教授在高分辨率透射电镜下发现碳纳米管以来f 4 ”， 由于其特殊的结构和独特的物理、化学、电学特性以及潜在的应用前景而倍受关 注。近年来，随着对碳纳米管性质研究的深入，越来越多的研究者将其作为一种新 型的电极材料应用到传感器领域，并取得了理想的效果。 碳纳米管的尺寸处在原子、分子为代表的微观物体和宏观物体交界的过渡区 域，既非典型的微观系统也非典型的宏观系统，因而具有表面效应、体积效应、量 子效应和宏观量子隧道效应四大效应【4 2 1 。 碳纳米管在生物传感器中的应用也是多方面的。首先，它可以降低氧化还原 的过电位。m u s a m e h 等人【4 3 悃碳纳米管修饰玻碳电极。明显地降低t n a d h 的 氧化过电位，显示了显著的电催化活性。也有关于碳纳米管修饰电极降低尿酸、 抗坏血酸和过氧化氢氧化过电位的报道。碳纳米管修饰电极对过氧化氢的还原表 现出优异的电催化效果，基于以上特性，有研究者将葡萄糖氧化酶固定在碳纳米 管修饰电极上制成了新型的葡萄糖氧化酶电极f 删，此酶电极具有较低的工作电 位。 其次，用碳纳米管可以实现酶与电极表面之间的直接电子传递。y u a n d i z h a o 等【4 5 】和蔡称心等d 6 1 研究了辣根过氧化物酶在碳纳米管修饰电极上的直接 电化学行为，葡萄糖氧化酶在碳纳米管上的直接电子传递也多有报道【4 7 - 5 0 。 1 1 3 2 消除干扰 生物传感器的一个最大的优点就是选择性好，但也会受到一些干扰。这些干 扰物质包括电活性物质和非电活性物质。电活性物质指氧、抗坏血酸、尿酸、乙 第一章文献综述 酰氨基酚等具有氧化还原能力的物质，它们有可能参与电极反应。非电活性物质 是指一些生物大分子，尽管它们不参与反应，但易沉积在电极表面而严重影响电 极的响应。消除这些干扰的方法主要有如下几种： 第一种方法是通过引入合适的电子媒介体。由于电子媒介体的氧化还原电位 较低，生物传感器可以在较低的电位下进行工作。这时电活性物质在电极表面的 氧化还原能力大幅度降低，达到了抗干扰的效果。 第二种方法是引入过氧化氢的催化剂。电流型氧化酶电极通常是通过检测酶 反应的产物过氧化氢来达到检测底物的目的。这样就可以通过引入一些催化剂来 催化过氧化氢进行还原反应，通过检测过氧化氢的还原电流，两可得知底物浓度 的大小。这些催化剂中研究较多的一种物质是普鲁士蓝( p b ) ，这是因为普鲁士 蓝膜具有优良的电化学可逆性、极高的稳定性及电催化性能。普鲁士蓝对过氧化 氢的催化能力非常强，被称为“人工过氧化物酶” 5 h 。p b 膜修饰电极用于制备 酶电极已有大量文献报道 5 2 - 5 6 】。普鲁士蓝得到广泛应用的另一个原因是普鲁士蓝 修饰电极的制备方法简单，可以得到稳定的电沉积层。另外，钉，铑，铂，铜， 铱等材料也对过氧化氢具有催化还原作用，将这些物质添加到酶层中，或者这些 材质的电极上制备葡萄糖酶电极，也可以在较低的电位下进行工作【5 7 1 ，从而减弱 了电活性物质的干扰。 第三种方法是在酶膜上方加上一层抗干扰膜。利用高分子阻挡膜修饰电极可 以有效地消除电活性物质和非电活性物质的干扰，其作用机理是：依靠电性排斥 或体积排斥作用，将电活性物质阻止在聚合物膜之外，防止电活性物质在电极上 发生反应而干扰对底物的准确测定，从而能够有效地提高传感器的测定精度。目 前比较常用的电性排斥膜有两种，一种是e a s t m a n a q 膜 5 8 , 5 9 1 ，另一种是n a t i o n 膜【1 u 3 舯】。用于制备e 勰t n l a l l ，a q 膜的材料是一种新型的聚合物( 磺酸酯) 阳离子 交换树脂，将其涂敷于电极表面上，形成的膜除了具有比较强的附着力外，还具 有预富集、离子交换及防污性能。n a t i o n 是一种全氟化的磺酸酯聚合物电解质， n a t i o n 膜由氟碳骨架和许多顶端为磺酸基的侧链构成，由于磺酸基的静电作用， 使许多电活性阳离子都能固定在n a t i o n 膜中。因为n a t i o n 膜具有不溶于水、容 易制备、化学稳定性好，离子交换容量大、附着力强、不影响酶活性、膜中氧化 还原性物质的分配系数高、能够抵抗阴离子和许多生物分子的干扰等诸多优点， 所以近几年的研究发展很快。 另外一种阻挡膜材料是不容行金属氧化物，其工作原理是：在电极上形成一 层强氧化物膜，干扰物接近电极时先遇到氧化物膜而被氧化除去。在金属氧化物 中p b 0 2 的阻挡效果最佳【6 1 】。 第一章文献综述 1 1 3 3 优化酶的固定化方法 酶电极中，酶作为识别元件，其在电极表面的固定化效果至关重要。酶电极 的性能优劣很大程度上取决于酶的固定化效果。好的固定化方法必须满足以下三 个条件： a 1 保持酶的高活性； b 1 保持酶的稳定性； c ) 使酶电极响应迅速，灵敏性强。 固定化酶的方法有很多种，包括物理法和化学法。一般来说，主要有四大类 固定化方法：物理吸附法、交联法、共价结合法和包埋法。 1 1 3 3 1 物理吸附法 许多物质，如氧化铝、石墨、黏土和硅胶等，具有很大的比表面积，可以用 来吸附酶。这时酶与电极之间的连接依靠的是范德华力、酶分子极性键、氢键、 疏水键以及静电等作用。这种方法最大的优点是操作简单，固定过程无需其它试 剂。相对于化学法而言，这种方法可以较好的保持酶的活性。但吸附作用很弱， 酶很容易流失，而且这种酶电极对p h 、温度和离子强度等参数极为敏感。有文 献报道将葡萄糖氧化酶结合到葡聚糖衍生物上，然后吸附于多孔碳电极上构建成 酶电极，由于葡聚糖衍生物增强了酶的稳定性及多孔碳的强吸附性，使酶电极具 有较好的稳定性和重现性【6 2 1 。 1 1 3 3 2 物理包埋法 物理包埋法是将酶包埋在晶格中或多孔结构中。对于小分子底物而言，这是 一种非常好的方法，因为小分子可以通过晶格或多孔结构的孔进入到材料的内部 进行酶反应。包埋材料包括一些水溶胶如明胶【6 3 1 、环糊精【硎、聚氯乙烯【6 5 】、聚 丙烯腈【6 6 】、聚乙烯亚胺【柏1 及其他许多聚合物以及胶体，也包括一些无机的溶 胶一凝胶，如s i 0 2 【6 8 】、a 1 2 0 3 【6 9 7 0 】和t i 0 2 7 1 垮。无机溶胶一凝胶具有许多水凝胶 不具备的优点，它们的多孔凝胶网络结构尤其适合固定生物大分子，孔内的亲水 环境可增加酶的稳定性。但溶胶一凝胶也有一些缺点，其中最大的缺点是其易脆 裂，难以得到理想的形状。解决脆裂的一种方法是加入一些有机物形成有机一无 机杂化材料d 7 2 3 。酶也可以直接加入到碳糊中，制备成掺杂酶的碳糊电极【7 2 , 7 3 1 。 电聚合物质如聚苯胺”固定酶也属于包埋方法，且这种方法可以将酶固定在微电 极上。电聚合制备酶电极的过程是：将酶溶解在聚合单体的溶液中，使单体在电 极表面发生电化学氧化，形成导电或者不导电的聚合物，同时酶被包埋在聚合物 中。关于电聚合制备酶电极的技术已经有了详尽的综述【7 5 硎。图1 2 为包埋法的 第一章文献综述 示意图，酶分子被包埋在网络内，微小物质能扩散至孔内与酶结合。 图卜2 物理包埋法示意图 f i g u r e1 2e n z y m e se m b e d d e di nv e s i c u l a rs t r u c t u r e 1 1 3 3 3 交联法 通过双功能试剂交联酶也是一种常用的固定化方法，最常用的双功能试剂是 戊二醛【7 剐，它和酶的赖氨酸残基发生反应从而将酶与酶相互连接起来，这样酶就 不易脱落。化学交联对酶的活性有很大的损坏，必须小心的进行。交联法一般和 其它固定化方法配合使用1 7 9 , 8 0 。 1 1 3 3 4 共价结合法 共价结合是通过酶上的某些基团与电极之间形成共价键实现酶的固定。这些 基团一般都不是活性中心所必须的。通过单体或其衍生物共聚合，或者通过与预 聚物直接反应，可以将功能基团( 如n h 2 ，s h ，c o o h 等) 加到聚合物上， 再将这些聚合物以薄层的形式沉积到整个电极上，酶通过氨基酸残基和这些聚合 物的功能基进行共价结合【8 l j 。在利用天然材料如甲壳素【蜘、丝素蛋白【8 3 1 等固定 化酶时，所用的方法就是通过酶的氨基酸残基与这些材料上的酰基共价结合的。 共价键结合的优点是酶结合牢固，不易在电极使用过程中流失，固定化酶的稳定 性与其它固定化方法相比是最好的。但是这个反应是一个比较激烈的化学反应， 如果共价键反应发生在生物分子的活性部位，或反应条件苛刻，都会严重降低酶 的活性。 不同的固定化方法各有利弊，可以根据生物活性物质的性质选择适合的固定 化方法。在以上几种固定化方法中，包埋法由于具有载酶量大，制备简单等特点， 应用最为广泛。包埋法中的溶胶一凝胶固定化方法是最近十几年来发展的新方 法，由于其一系列的优点，在生物传感器的研究中应用日益广泛。 第一章文献综述 1 2 有机一无机杂化材料在生物传感器中的应用 自从1 9 9 0 年b r a u ns 等【醯】证明酶在溶胶一凝胶中具有生物活性以来，已有 多种生物活性物质通过溶胶一凝胶方法进行了包埋固定【洲，这种技术也越来越多 的应用到生物传感器领域【8 5 1 。溶胶一凝胶( s 0 1 g e l ) 法是将金属醇盐等原料配置 成均质溶液，在饱和条件下经水解、缩聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，再经 蒸发干燥转变为凝胶，是在低温下制备纳米粉末或多孔玻璃的一种技术【8 6 删。溶 胶一凝胶作为一种新型的无机多孔材料，具有许多高分子材料无法比拟的优点， 如物理刚性、化学惰性、溶剂中可以忽略的溶胀性以及对光、化学、热和生物降 解的高温定性【8 8 舯】等。溶胶一凝胶制备条件温和，适用范围广泛，包埋于其中的 生物活性物质可以保持较高的活性和特异性，小分子物质则可以通过溶胶一凝胶 的孔道与生物物质接触。另外，溶胶一凝胶的孔径具有一定的可调性【9 ”，进一步 提高了生物化学的选择性，所以在生物传感器中广受关注。 1 2 1 溶胶一凝胶法的原理及特性 1 2 1 1 溶胶一凝胶法的基本过程 1 2 1 1 1 水解反应 溶胶液一般是通过金属醇盐为前驱体，通过水解作用而成。正硅酸甲酯和正 硅酸乙酯是最常用的两种前驱体，原因是这两种物质的水解和浓缩过程很容易控 制【8 9 熙l 。以硅的醇盐为例，当用正硅酸甲酯( t m o s ) 作前驱体时，发生如下水 解反应( 公式1 7 ，1 ，7 ，1 - 9 ) 。 ( 1 - 7 ) q iq i i 伽伽 j ii h o s _ o h + h o s i _ o h + h 0 s i o s 卜o h + 2 0 l l o ho h o h0 h i ( 1 8 ) 明 阻i洚l叫 一 生 护 甜 p汁i叽 一 第一章文献综述 0 h i h 0 一s i o r o h 伽0 h i i + h o - s 壬_ 一o h 。- h 0 s i 0 s i o h + r o h iii o h 0 ho h ( 1 9 ) 第一步是前驱体的水解，烷氧基( - - o r ，r 可以是一c h 3 ，一c h 2 c h 3 等) 和水进行水解反应形成硅烷醇。乙醇释放到溶液中，这一过程一般用酸进行催化， 相比用碱催化而言，酸催化更能得到均一透明的网络结构 8 6 , 9 3 1 。 1 2 1 1 2 凝胶化和老化 水解和缩聚中 形成溶胶粒子 向溶胶中加入酶 凝胶网络开始形成 酶分子被固 定于凝胶中 图1 - 3 溶胶一凝胶法固定酶的示意图 f i g u r el 一3e n z y m em o l e c u l e se m b e d d e di ns o l g e l 水解的同时伴随着硅烷醇之间及硅烷醇和烷氧基团之间的聚合，形成硅氧 烷，溶胶慢慢失去了流动性，形成了凝胶。这时凝胶中含有两种不同的相，一个 是无定型的二氧化硅粒子( 直径5 - 1 0 m n ) 固相，一个是连通的液相。根据合成 条件的不同，凝胶化的时问可以从几秒到几天。凝胶化以后，溶胶一凝胶材料保 持一个动态的结构，同时剩余的羟基和烷氧基也在互相接近进行反应。凝胶化以 后，凝胶可以在合适的干燥条件下变成千凝胶，其体积也会交为开始的1 0 1 5 ， 孔径在o 1 纳米以内。因为湿凝胶中包裹着大量溶剂和水，当它们从小孔中蒸发 时，伴随着较大的体积收缩，凝胶很容易开裂【吲。这是由于液体的表面张力所引 起的毛细管力造成的，毛细管孔径大小不等，因而造成的应力差导致了凝胶的开 裂。实验表明，除了凝胶本身的尺寸因素( 膜越厚越容易开裂) 外，干燥速率也 n y 第一章文献综述 是一个重要因素，干燥越快膜越易开裂。为了减慢凝胶的干燥速度，可以在溶胶 中加入控制干燥的化学添加剂( d r y i n gc o n t r o lc h e m i c a la d d i t i v ( d c c a ) ) ， 如t r i t o n - - x 和甲酰胺等【9 5 舯】。由于干燥控制剂的挥发性差，可以把不同孔径中 醇的不均匀蒸发大大降低，从而减小了毛细管应力。但一些生物分子对于这些添 加剂极为敏感，限制了这一方法的应用。加入长链的有机分子形成互穿网络是控 制凝胶的开裂一个很好的方法 2 3 , 9 7 。 高温热处理可以消除干凝胶中的大量气孔，从而可以得到致密的陶瓷体或纳 米粒子。但大多数传感器中含有的生物活性物质不能耐受高温，故在传感器应用 中干凝胶即为最终产物。 如果在开始的溶胶中加入酶等生物大分子，凝胶网络就会在生物大分子的周 围形成，最终生物大分子被包埋在干凝胶中( 图1 3 ) 。随着时间的延长，最终形 成一种三维的网络结构。 1 2 1 2 过程参数的影响 最后形成的干凝胶的性质受很多因素影响，其中比较重要的影响因素有p h 、 h 2 0 与s i 的摩尔比、溶剂的种类和用量等。 a 1 溶液的p h 对同一种醇盐，酸催化和碱催化产生的水解产物的结构和形态不尽相同。在 包埋生物大分子时，一般都采用酸进行催化，这时的水解由h 3 0 + 的亲核机理引 起9 引，水解速度快，但反应速率随分子上硅氧基团数量的减少而减慢。 高的p h 值条件下得到的微粒结构较紧密，体积较大，呈现较大的孔径和比 表面积。相反在低的p h 值条件下，得到的微粒结构紧密，比表面积较小。当用 于固定化酶时，酸的初始浓度一般在2 5 1 1 5 m m 之间【9 9 】。 b ) 水的摩尔比 这是最重要的一个参数，直接与水解缩聚物的结构、溶胶的粘度和胶凝的时 间有密切关系畔】。为使溶胶澄清透明、稳定放鼍和具有良好的性能，一般采取 h 2 0 s i l i c a t e 比率r 至4 ，这样可以防止干燥过程较长而产生较大的收缩张力m 0 。 c 1 溶剂的种类和用量 溶剂的种类和用量对水解的速率和粒径及胶凝时间有影响，实际中一般采用 醇为溶剂。w a n g 等 1 0 1 1 发现，当醇含量为5 2 5 ( v v ) 时，醇数量的改变 对葡萄糖氧化酶活性影响较小。醇溶剂不是必需的，根据前驱物的性质，也可以 在不加醇的条件下，得到高质量的溶胶m 】。 第一章文献综述 1 2 1 3 溶胶一凝胶法的优点和缺点 l 213 1 溶胶一凝胶的优点 目前用s 0 1 g c l 法固定生物分子已成为化学修饰电极的一大热点【1 7 0 3 ，1 0 1 1 0 3 1 0 4 1 。因为此方法固定生物分子时方法简单，被固定生物分子的种类和数量可 任意调节，并且具有以下性质。 a ) 保持了被固定试剂的液相性质 由于包埋过程中不需要化学试剂的衍生，因此被固定生物分子保持了其活性 和特异性。自从1 9 9 0 年b r a u n s 等吲证明酶在溶胶一凝胶中具有生物活性以来， 大量的蛋白质、酶和抗原抗体都得到了应用。 b ) 扩散行为 一般认为一些小分子、离子可以自由进出s o l - g e l 的孔径而导致玻璃基质内 外浓度相等，然而最近通过对z n c y t 的半衰期的测定，发现k 3 f e ( c n ) 6 、0 2 和醌 等抑制剂在基质内部时，其反应速率常数与在溶液中不同。即使达到平衡时， f e ( c n ) 6 在基质内部的浓度要比外部溶液低，且与离子强度，p h 等有关。这是 由于带负电荷的s i 0 2 表面对其存在离子排斥作用，阻碍了其扩散行为。 c ) 泄漏问题 被包埋物可以在溶胶一凝胶的孔径内自由旋转，这就有可能扩散到固液界面 而导致泄漏。这与被包埋物与基质的亲和力大小以及被包埋物的分子大小有关 【瑚l 。溶胶一凝胶的比表面积、平均孔径、孔径大小分布在一定程度上可以通过 改变制备条件来控制。在制作优良的溶胶一凝胶中，酶和大分子蛋白质均无泄漏， 这是因为s o l g e l 孑l 的瓶颈结构限制了大分子的自由运动。 d ) 稳定性 在长期稳定性问题上，由于被包埋物被孔的瓶颈结构所限制，故s 0 1 g e l 传 感器的稳定性可与共价键法相比拟。王炳权等【2 3 1 用s 0 1 g e l 有机一无机掺杂材料 制备的葡萄糖氧化酶电极在4 c 存储时，5 个月内未发现响应有明显下降。谭学 才等【9 7 1 制备了壳聚糖掺杂的溶胶- n n n 酶电极，每隔两天迸行一次葡萄糖的测 定，6 0 天后电极的响应电流是开始的9 7 。溶胶一凝胶中的生物分子的热稳定 也大大超过了有机分子所能承受的温度范围。溶胶一凝胶也不会光降解，如果是 s i 0 2 基质，则基质不会产生光诱导反应。 第一章文献综述 1 2 1 3 2 溶胶一凝胶的缺点