（外科学专业论文）抑癌基因runx3在神经母细胞瘤中对癌基因mycn的调控作用研究.pdf

-_-_1_-_-_-_-_-_-_1j_111 删ffj|fi|ffiiffffff|fflfiff|ff|fif删 y 19 0 0 8 8 芝 1 4 基因m y c n 的调控 7 ； 1 8 2 0 讨论3 1 结论3 3 参考文献3 3 综述i n x 3 基因在肿瘤中的研究进展3 8 致谢：4 7 个人简历4 8 摘要 癌基因m y c n 的调控作 目的： 神经母细胞瘤来源于原始神经嵴，是一种较常见的婴儿和儿童颅外实 体肿瘤，占小儿肿瘤病死率的1 5 。m y c 基因家族( c m y c ，m y c na n d m y c l ) 属于癌基因中的核蛋白类调控基因，其基因产物m y c 蛋白在许多 肿瘤中存在着异常表达。m y c 基因家族及其产物在细胞增殖、永生化、 去分化及转化和诱导凋亡等多方面起到调节作用，在多种肿瘤形成过程中 处于重要地位。癌基因m y c n 异常扩增是判断神经母细胞瘤预后的重要 指标之一，m y c n 扩增和肿瘤的恶性分期、进展速度、耐药性等有高度 相关性，因此m y c n 基因被认为是神经母细胞瘤药物及基因治疗的重要 靶点。 r i 烈x 3 是转录因子黜i n t 家族成员之一。该基因家族在哺乳动物生长 过程中扮演重要角色，近来的研究表明，r i 帜3 在多种肿瘤，包括胃癌、 肺癌、肝癌、乳腺癌、胆管癌等的发生、发展过程中都表现出了抑癌基因 功能。我们之前的临床样本分析显示r i 烈x 3 高表达与神经母细胞瘤患者 的良好预后密切相关，表现出了肿瘤抑制基因的活性。本实验目的旨在从 生化和分子生物角度验证r i 玳d ( 3 基因在神经母细胞瘤中的抑癌功能，对 此，我们采用多种实验方法，测定了r i 肘x 3 对m y c n 的负向调节作用， 并分析了此调节作用的分子生物学机制。 方法： 本研究选用m y c n 扩增的人类神经母细胞瘤细胞系s k - n b e 、n l f 和m y c n 未扩增的人类神经母细胞瘤细胞系s y 5 y 、s k n a s 以及人胚 胎肾上皮细胞 玎三k 2 9 3 ，通过克隆形成实验分析r i 小3 过表达对不同神 经母细胞瘤的增殖抑制作用；使用r t - p c r 和w - e s t e mb l o t 方法研究在 r i 小3 转染细胞系中，m y c n 转录水平和蛋白质水平的变化；通过泛 素化实验，研究神经母细胞瘤细胞系中，r i 脓3 基因对于m y c n 蛋白 降解途径的影响；最后又运用免疫沉降和g s t p u ud o 、n 的方法，分析细 中文摘要 胞内和细胞外m y c n 和r i 肘x 3 蛋白质水平的相互作用。 结果： 1 克隆形成实验结果：在三种神经母细胞瘤细胞系中转染不同量的 p c d n a 3 一r in x 3 表达质粒( o 岭，o 5 嵋，1 腭，2 鹏) ，4 8h 后用g 4 1 8 ( 8 0 0 耀- m 1 ) 筛选，2 周后用姬姆萨染液对细胞进行染色。结果显示在 m y c n 扩增和未扩增的神经母细胞瘤细胞中，r i 烈x 3 基因均有抑制肿瘤 细胞扩增作用。 2 转染外源性p c d n a 3 r i 肘x 3 表达质粒抑制m y c n 的蛋白表达水平， 但是对其m r n a 表达水平没有影响。 2 1 在m y c n 扩增的神经母细胞瘤细胞系s k n b e 和n l f 中转染外 源性p c d n a 3 r i 腻x 3 表达质粒，转染后4 8h 收集细胞分别进行w e s t e m 和p c r 实验检测c n 蛋白和删5 矾a 的表达，结果显示内源性m y c n 蛋白随着p c d n a 3 一r i 脓3 表达质粒转染量( o “g ，2 嵋，4 峙) 的增加而降低。 但是m y c n 的删5 a 表达水平没有受p c d n a 3 r in x 3 的影响。 2 2 在m y c n 扩增的神经母细胞瘤细胞系s k - n b e 转染外源性 p c d n a 3 r i 腻x 3 表达质粒，在转染后不同的时间段( oh ，1 2h ，1 8h ，2 4h ，3 0 h ) 收集细胞进行，用w e s t e m - b 1 0 t 实验检测m y c n 蛋白的表达。结果显 示在蛋白水平m y c n 表达量随r i n x 3 表达量增高而降低。 2 3 在m y c n 扩增的神经母细胞瘤细胞s k - n b e 中转染 p c d n a 3 r i 烈x 3 表达质粒，2 4h 后r i 烈x 3 转染组与未转染组均用蛋白 合成抑制剂c y c l o h e x i m i d e ( c h x5 0 嵋m 1 ) 处理，并在处理后不同的时间段 收集细胞( oh ，o 5h ，lh ，1 5h ，2h ) ，用w e s t e m - b l o t 实验检测m y c n 蛋白 的表达。在r 【玳x 3 未转染组m y c n 蛋白半衰期为2 7m i n ，在r i 胍3 转 染组m y c n 蛋白的半衰期为1 8m i n 。由此提示r i 烈x 3 可以促进m y c n 的蛋白质降解。 2 4 在m y c n 扩增的神经母细胞瘤细胞s k n b e 中转染 p c d n a 3 r i 烈x 3 表达质粒，免疫荧光实验结果显示，外源性r i 肘x 3 ( 红 色) 抑制m y c n ( 绿色) 蛋白在细胞核( 蓝色) 的定位。 3 在s k - n b e 和n f l 细胞转染外源性p c d l 姒3 r i 烈x 3 表达质粒，并使 用蛋白酶体抑制剂m g l 3 2 ( 1 0 蚓m 1 ) 处理细胞，同时设立未处理组作对 中文摘要 照。m g l 3 2 处理4h 后收集细胞，用w e s t 啪- b 1 0 t 实验检测m y n 蛋白 的表达。结果显示在m g l 3 2 未使用组，r i 肘x 3 抑制m y ( 烈的蛋白表达， 在m g l 3 2 使用组r i 小3 对m y c n 蛋白表达没有抑制作用。 4r i 烈x 3 和m y c n 的蛋白相互作用 4 1 外源性免疫共沉降结果显示，外源性的r i 刷x 3 蛋白与m y c n 蛋 白在h e k 2 9 3 细胞中存在蛋白相互作用。 4 2 内源性免疫共沉降结果显示，内源性的r 切怄3 蛋白与m y c n 蛋 白在s l b e 细胞存在蛋白相互作用。 4 3 细胞外g s t - p u l ld o w n 结果分析说明r u n t 结构域是r i 肘x 3 与 m y c n 结合的主要区域。 4 4 免疫荧光染色实验表明外源性r i j n x 3 和m y c n 蛋白在h e k 2 9 3 细胞定位于细胞核内，并存在蛋白相互作用。 5 在s k n b e 细胞中共转染p c d n a 3 r u n x 3 表达质粒和h i s u b i q u i t i n 质粒，并使用n i tb e a d s 进行沉降，泛素化实验结果显示i 辽附x 3 可以促 进m y c n 蛋白的多泛素化过程。 结论： 1 在m y c n 扩增和未扩增的神经母细胞瘤细胞中，r i 肘x 3 均有抑制肿瘤 细胞增殖作用。 2r i x 3 抑制m y c n 的蛋白表达水平，但是对其m r n a 表达水平没有 影响。 3r i 肘x 3 对m y c n 蛋白水平降解作用依赖于蛋白酶体功能。 4r 切怄3 和m y c n 存在蛋白相互作用。 5r u n x 3 可以促进m y c n 蛋白的多泛素化降解过程。 综上所述，抑癌基因r i x 3 在神经母细胞瘤中的抑癌机制可解释如 下：即促进m y c n 癌蛋白的泛素化降解从而抑制其癌基因功能，并且此 降解作用可能与r i 州x 3 与m y c n 在蛋白水平的相互结合有关。 关键词：m y c n ；i n x ；神经母细胞瘤；w b s t 锄；免疫荧光染色； 免疫沉降；l m p c r ， o b j e c t i v e ： 英文摘要 r u n x 3d e s t a b i i i z em y c ni nn e u r o b i a s t o m a a b s t r a c t n e u r o b l a s t o m ai sm em o s tc o m m o nm a l i g n a n te x t r a c r a n i a ls 0 1 i dt u m o r o fc h i l d h o o d t h i sn e u r o n a lc a n c e ra c c o u 】n sf o rl5 o fc a n c e rd e a m si n c h i i d r e n i nn e u r o b l a s t o m 钆a m p l i f i c a t i o no fo n c o g e n em y c ni st h eb e s t c h a r a c t e r i z e d g e n e t i cf a c t o r f o r h i 曲- r i s kt u m o ra n dm e r a p yr e s i s t a n c e r u n x 3 ，w h i c he n c o d e st h er u n t r e l a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，w a si d e n t i f i e d a sat u m o rs u p p r e s s o rg e n e 洫s o l i dt u m o r so fd i v e r s eo r i g i n s ，s u c ha sg a s t r i c c a n c e r ，l u n gc a n c e r c o l o nc a n c e r b u tn e u r o b l a s t o m a w ep r e v i o u s l yf o u l l d m a th i g h e x p r e s s i o no fr u n x 3i s c o r r e l a t e dw i t hb e t t e r p r o g n o s i s 洫 n e u r o b l a s t o m ap a t i e n t si nw h i c hm y c ni s h i g h l ye x p r e s s e d w r e 吐1 e r e f o r e c o n c l u d e dm a tr u n x 3i san o v e lt u m o rs u p p r e s s o ri nn e u r o b l a s t m a ，r e l a t e d t o s u p p r e s s i l l gm eo n c o g e n i ca c t i v i t yo fm y c n t h eo b je c t i v eo ft h i s r e s e a r c hi st 0e l u c i d a t em ep o t e n t i a lm e c h a l l i s mo fri 烈x 3t o i n h i b “ o n c o g e n ep r o d u c tm y c n m e t h o d s ： i nn l i sr e s e a r c h ，w ec h o s em y c n 锄1 p l i 矗e dn e u r o b l a s t o m ac e l l1 i n e s s k - n - b e ，n l fa n dm y c nn o n a m p l i f i e dn e u r o b l a s t o m ac e l ll i n e ss y 5 y s k - n - a sa sw e l la sh 啪a ne m b 巧o n i ck i d n e yc e l l i i n eh e k 2 9 3 1 k m s f e c t i o n w a su s e dt oe n h a l l c er i 肘x 3a 1 1 dm y c n e x p r e s s i o n1 e v e l si na b o v ec e l l1 i n e s c o l o n yf o r m a t i o na s s a y s w e r eu s e dt oc h e c kn l ee 虢c to fr u n x 3 o v e r e x p r e s s i o nm d i 虢r e n tn e u r o b l a s t o m ac e l ll i n e s p c ra n dw e s t e mb 1 0 t w e r eu s e dt 0r e s e a r c hm er n rn aa 1 1 dp r o t e i nl e v e l so fm y c nw i ma n d w i m o u tr l y n x 3 仃a n s f e c t i o n m y a nu b i q u i t i n a t i o na s s a y sw e r ep e r f o 姗e dt o d e t e m i n em y c n d e 肿妇i o np r o c e s sw i ma n dw i t h o u tri 烈x 3t r a n s f e c t i o n i m m u n o p r e c i p i t i o nw e r eu s e dt oi d e n t i 矽m ep h y s i c a li m e r a c t i o n sb e t w e e n r ij | n x 3a n dm y c n 4 i nr e s p o n s et 0r u n x 3o v e r e x p r e s s i o n 2 30 v e r e x p r e s s i o no fr i 心3s h o r t e n e dm eh “f - 1 i f eo fn 【y c np r o t e i n 2 4i m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ys h o w e dt h a tri 小3 觚dm y c n a r e m u t u a u ve x c l u s i v ei 1 1t h en u c l e u s t h e s er e s u l t s s u g g e s t m a tri 爪d ( 3 r e g u l a t e s m y c nt h r o u 曲 p o s t t r m s l a t i o n a lm e c h a n i s m 3 r i 小3 一m e d i a t e dm y c nd e g r a d a t i o nw a si n h i b i t e db yap r o t e a s o m e i r d l i b i t o rm g l 3 2 ，i n d i c a t i n gt h a t 烈肘x 3d e s t a t ) i l i z e sm y c n 恤o u 曲t h e p r o t e a s o m e 凡n “o n 4 p h v s i c a li n t e r a c t i o nb e t w e e n r i ) _ n x 3a 1 1 dn c n 4 1i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a yd e m o n s t r a t e st h a tr u n x 3i n t e r a c t sw i t h c n 觑v 如d 4 2t h eg s tp u l l d o ma s s a ys h o w e dt h a tt h er 1 1 td o m a i no fr i 烈x 3i s r e s p o n s i b l ef o r 血eb i n d i n go f r 【小) ( 3a 1 1 dm y c n 4 3r i 小3a n dm y c nc o 1 0 c a l i z e dmn u c l e u s d e t e c t e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tr m 3a n dm y c n p h y s i c a l l yi n t e r a c t 加v f 抛a n d 加v a 旧 5 o v e r e x p r e s s i o no f 烈n x 3y i e l d e da c c u m u l a t i o no fu b i q u i t i n c o 喝u g a t e d m y c n p r o t e i i l i nt 1 1 ep r e s e n c eo fp r o t e a s o m ei n h i b i t o rm g l32t r e a t m e n t ， s u g g e s t i n g 吐1 a tr i 小3p r o m o t e su b i q u i t i n a t i o no fm y c n ，r e s u l t si nm y c n 5 英文摘要 d e 删a n o n c o c l u s i o n ： ru n x 3i n t e r a c t sw i t l lm ：y c ni nn e u r o b l 弱t o m 钆a n df - a c i l i t a t e sm y c n d e 铲a 捌o n t h i sm o l e c u l a rm e c h a n i s mm a ye x p l a i nt u m o rs u 簟l p r e s s o r a c t i v 时o fr i j n ) ( 3i nn e u r b l a s t o m a c o n c l u d i n gr e m a r k ： a m p l i f i c a t i o no fo n c o g e n em y c ni s a ni m p o r t a n ti n d i c a t o rt op r e d i c t r i s k ，r e s p o n t o l e r a p y l i f c t i m e s u r v i v a l ， a i l do v e r a l l m o r t a l i 够i n n e u r o b l a s t o 嗽p a t i 吣i nt h j s 咖屯ir 印o r t e dt h a tr u n x 3i n v a l i d a t e s o n c o g e n i cm 代n f h n c t i o nb yp r 0 1 n o t i n gd e g r a d a t i o no fm y c n p r o t e i n t 1 1 i s k e y 危砷j 1 1 eo fr 1 孙3m a yh e l pt od e v e l o pan o v e lt h e r a p e u t i ca p p r o a c ht o b l o c km y c ns i g n a l i n gb yi n c r e a s i n gr i j n x 3a c t i v i t yi nn c i u r o b l a s t o m a p a t i e l l t s k e yw b r d s ：m y c n ；r u n x 3 ；n e u r o b l a s t o m a ；t u m o rs u p p r e s s o r ； o n c o g e n e 6 研究论文 抑癌基因r u n x 3 在神经母细胞瘤对癌基因m y c n 的调控作用 研究 - 上i j 一 翮蚕 神经母细胞瘤是来自于原始神经嵴的一种原始母细胞肿瘤，是儿童肿 瘤中比较常见的一种，其发病率仅次于白血病和中枢神经系统肿瘤，占儿 童肿瘤病例的8 1 0 。我国每年新发病例为3 0 0 0 例左右。该病多见于1 0 岁以下儿童，8 0 患者在4 岁以下，中位年龄为2 2 个月，原发病灶主要 来自于肾上腺或交感神经节。在美、英等国家，新生儿的患病率约为 l 7 0 0 0 ，男女患病比例约为1 2 ：1 ，死亡率约为1 5 【1 - 3 】。1 岁以下可自愈， 1 岁以上患儿往往预后较差。神经母细胞瘤在临床上有“两极性”的特点， 即：预后良好( f a v o r a b l e ) 和预后不良( u n f 打o r a b l e ) 4 1 。目前临床上已有多种 指标来预测神经母细胞瘤的预后结果，这些指标包括：诊断时患者的年龄、 肿瘤分期、组织学分级、d n a 倍体、血清铁蛋白和乳酸脱氢酶表达水平， 以及m y c n 扩增等1 5 1 。 癌基因m y c n 异常扩增是神经母细胞瘤预后判断的重要指标之一， m y c n 扩增和肿瘤的恶性分期、进展速度、耐药性等有高度相关性，因 此m y c n 基因被认为是神经母细胞瘤药物及基因治疗的重要靶点。 r i 烈x 3 基因是r u n x 家族中的一员，该基因位于染色体1 p 3 6 ，全长 6 7 k b ，有p 1 和p 2 两个启动子、6 个外显子，并在第2 和第6 外显子起始 部位有2 个大的c p g 剐1 1 】。在哺乳动物中，m u l ) 【基因家族共有3 个成员： r i 帐1 ，在血细胞生成中具有重要作用，是人类白血病中常见的突变基 因；r in x 2 ，在成骨作用中发挥重要功能，并且在体外实验中被证实有 癌基因活性；r i 小3 ，可调控胃上皮细胞的增殖，与胃癌的发生发展有 密切关系【l2 1 。其中，r i n x 3 在胃癌中的抑癌基因活性一直是国内外肿瘤 研究的热点，然而随着研究的不断深入和研究疾病范围的扩大，r u n x 3 的抑癌基因活性在其它肿瘤，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胆管癌、膀胱癌、 胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌等也表现出来【1 3 1 8 】。 我们之前的临床样本分析显示r i 腻x 3 高表达与神经母细胞瘤患者 的良好预后密切相关，表现出了肿瘤抑制基因的活性。本实验目的旨在从 研究论文 生化和分子生物角度验证r i 小3 基因在神经母细胞瘤中的抑癌功能，对 此，我们采用多种实验方法，测定r i 小3 对m y c n 的负向调节作用， 并分析了此调节作用的分子生物学机制。 1 实验仪器 7 5 0 0r e a l - t i m ep c r s y s t e m g e n e 山n pp c rs y s t e m9 7 0 0 9 6 孔r e a l t i m ep c r 反应盘 8 孔p c r 扩增管 e p p e n d o r fr e f e r e n c e 移液器 p i p e t r i l a n 移液器 m u p i d - 2 p l u s 型电泳槽 c 4 0 ns w i n gt y p e 离心机 m i l l i q 纯水机 4 冰箱 g s s 3 0 6 5 f 3 2 0 冰箱 m d f 2 9 2 a t 8 0 冰箱 m r a 3 3 0 微波炉m e d i c 0 0 1 凝胶成像系统a d 6 9 1o 2 主要试剂 材料与方法 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 美国m o l e c u l a rb i o p r o d u c t s 德国e p p e n d o r f 法国g i l s o n 美国a d 蝌c e 日本t o m ys e i k o 美国m i l l i p o r e 日本s a n y 0 日本n 【h o n 日本s a n y o 日本姐t a c m 日本a t t o p o w e rs y b r x g r e e np c rm a s t e rm i x 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 2 5 m mm 峒m s日本t a k a r a 1 0 p c rb u f f e r日本似( a r a r t a q 酶日本t a k 2 u r a t r i s美国n a c a l a it e s q u e e d t a3 n a美国n a c a l a it e s q u e 1 0 0 b pd n a l a d d e r美国n e w e n g l a n db i o l a b s a g a r o s e美国n a c a l a it e s q u e 8 研究论文 6 l o a d i n gd y e b o r i ca c i d e b ( 溴化乙锭) 3 研究对象 日本t o y o b 0 美国n a c a l a it e s q u e 美国b e c k m a nc o u l t e r m y c n 扩增的人类神经母细胞瘤细胞系s k n b e 、n l f ，m y c n 未 扩增的人类神经母细胞瘤细胞系s y 5 y 、s k - n a s ，人胚胎肾上皮细胞 m k 2 9 3 。( 以上细胞均由日本千叶县癌症研究中心生化学实验室提供) 4 细胞培养方法 s k n b e 、n l f 、s y 5 y 、s k n a s 细胞系在r p m n 6 4 0 培养液中培 养。皿k 2 9 3 细胞系在d 姬m 培养液中培养。每4 5 0 m l 培养液中加入已 灭活补体( 5 6 ，3 0 分钟) 的小牛血清5 0 m 1 ，8 n 棚c 0 3 1 5 m l ，最后 加入青霉素和链霉素，使其终浓度分别为1 0 0 i u m l 和l o o 岭m l 。细胞的 培养条件均为3 7 ，5 c 0 2 ，9 5 相对湿度。细胞用o 0 5 胰蛋白酶e d t a 进行消化传代。 5 细胞外源基因的转染 外源基因的转染用脂质体介导的d n a 转染法进行( 转染所用的质粒 除g s t - r i 烈x 3w t 和g s t - r 【臌3m u t a n t s 均由日本千叶县癌症研究中 心生化学实验室提供) ，对照组为等量的空载体质粒。具体转染方法如下： 无血清培养液l o o 山 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( i n v i 们g e n 公司)4 山 在聚酯管中混合后，室温放置5 分钟。 l 质粒d n a2 岭加入聚酯管中，室温放置2 0 分钟。 l 将转染反应液均匀加入细胞生长密度为5 0 7 0 的培养皿中，轻轻 摇匀，细胞培养箱中转染2 4 4 8 小时。 6 克隆形成实验 s k - n b e 、s y 5 y 、s k n a s 细胞接种在6 孔板中( 接种4 个孔) ， 每孔接种2 1 0 5 个细胞，培养2 4 小时使其贴壁。然后用不同的体系进行 转染：第一孔转染2 鹇的空载体作对照；第二孔转染o 5 嵋的r i 小3 质 粒和1 5 岭的空载体；第三孔转染1 鹇的r i 烈x 3 质粒和l 嵋的空载体； 研究论文 第三孔转染2 嵋的r i 烈x 3 质粒。转染4 8 小时后，用g 4 1 8 ( 8 0 0 肛咖1 ) 筛选2 周，用姬姆萨染液对细胞进行染色，然后观察培养皿底的细胞克隆 密度。 7 肝p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r 反转录一 聚合酶链反应) 7 1 细胞总r n a 的提取： 细胞总r n a 用r n e a s ym i n i 姑t 试剂盒( q i a g e ni n c 公司) 进行提取。 具体方法如下： 将培养皿中的细胞培养液彻底吸净，用含o 1 d e p c ( 焦碳酸二乙酯) 的1 p b s ( 8 n a c l ，o 2 k c l ，2 9 n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 ，o 2 k h 2 p 0 4 ) 溶液轻 轻洗2 遍。 l 培养皿中加入6 0 0 山的试剂盒提供的砌+ p 巯基乙醇缓冲液，然后 将细胞从培养皿底充分刮下，收集到1 5 m 1 的e p 管中。 上 加入6 0 0 山的7 0 的乙醇，充分震荡混合。 l 将6 0 0 山的混合液加入试剂盒提供的带过滤柱的离心管中，1 2 0 0 0 转， 15 秒离心。 j ， 弃掉离心后收集的液体，再加入6 0 0 山的混合液，1 2 0 0 0 转，1 5 秒离 心。 上 弃掉离心后收集的液体，加入7 0 0 山试剂盒提供的r 、缓冲液，1 2 0 0 0 转，1 5 秒离心。 上 弃掉离心后收集的液体，加入5 0 0 山试剂盒提供的r p e ( 含7 5 的乙 醇) 缓冲液，1 2 0 0 0 转，1 5 秒离心。 上 弃掉离心后收集的液体，重新加入5 0 0 p l 试剂盒提供的r p e ( 含7 5 的乙醇) 缓冲液，1 2 0 0 0 转，2 分钟离心。 p 管中， d e p c ( 焦碳酸二乙酯) 双蒸水，1 2 0 0 0 转，1 分钟离心。 为细胞的总r n a 。 7 2 反转录： 加入5 0 “l 的 收集的溶液即 用i n v i t r o g e n 公司的反转录试剂盒进行从r n a 到c d n a 的制备。 总i a 5 鹇 自由弓i 物( 1 弘g 弘1 )l “l d e p c 双蒸水至1 2 山 以上反应物加入e p 管后，6 5 ，1 5 分钟变性处理，然后加入以下反 应体系： d e p c 双蒸水 o 5 m 5 f i r s ts t r a n db u 丘- e r 2 5 m md n t p o 1 md t t s u p e rs c r i p t i i 4 2 ，9 0 分钟合成c d n a ， 7 3p c r 7 3 1p c r 总反应体系： 模板c d n a 无菌双蒸水 l o b u 毹r 2 m md m 上游引物( 1 0 州) 下游引物( 1 0 州) r - t a q 酶( 嗽撒公司) 7 3 2p c r 引物序列 r i n 3 ： 6 山 7 5 山 3 p l 1 “l 稀释2 0 倍备用。 l 山 6 山 1 “l 1 山 o 5 山 o 5 山 o 1 山 f w ：c a g a a g c t g g a g g a c c a g a c r - v ：t c g g a g a a t g g g t t c a g t t c c n ： 研究论文 f w ：aaa i ”i 。g a a c a c g c i c g g a c i i 之v ：a a c c g t c a c c a a c g t t t a g c g a p d h ： f w ：a c c t g a c c t g c c g t c t a g a a r v ：t c c a c c a c c c t g t t g c t g t a 7 3 3p c r 反应条件 p c r 的热循环反应条件为：9 5 2 分钟预变性，9 5 1 5 秒变性，5 8 1 5 秒退火，7 2 2 0 秒链延伸，g 谨d h 反应2 0 个循环，m y c n 反应2 8 个循环，r i 腻x 3 反应2 3 个循环，最后7 2 延伸6 分钟。 8w e s t e mb l o t 细胞用1 p b s ( 8 n a c l ，o 2 k c l ，2 9 n a 2 p 0 4 l2 h 2 0 ，o 2 k h 2 p 0 4 ) 溶液轻轻洗两遍收集到1 5 m l 的e p 管中，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂 解液a ( p h 7 5 的2 5 m mt r i s h c l ，1 3 7 m mn a c l ，2 7 m mk c l ，a n d1 x o n x 1 0 0 ) ，冰上放置3 0 分钟，超声裂解细胞，4 1 5 0 0 0 转离心l o 分钟， 收集上清为细胞裂解液，蛋白定量后，用1 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( s d a p a g e ) 将分子量不同的蛋白质分开。s d a p a g e 的凝胶成分如下： 2 0 m l 的l o 分离胶： 无菌水 5 4 m l 3 0 的丙烯酰胺 6 7 m l l m t r i s ( p h 8 8 ) 7 5 m l 1 0 十二烷基硫酸钠( s d s )2 0 0 山 1 0 过硫酸铵( a p s )2 0 0 山 四甲基乙二胺( 踟d ) 8 “l 5 m 1 的浓缩胶： 无菌水 3 4 m 1 3 0 的丙烯酰胺 o 8 3 m l 1 m 强s ( p h 6 8 ) o 6 3 m l 1 0 十二烷基硫酸钠( s d s )5 0 山 l o 过硫酸铵( a p s )5 0 山 四甲基乙二胺( t e 匝d )5 山 电压2 0 伏，电泳缓冲液中泳动3 小时。 1 2 研究论文 电泳缓冲液配置如下： t r i s 3 9 甘氨酸 1 4 4 9 十二烷基硫酸钠( s d s ) 1 9 蒸溜水1 0 0 0 m l 然后将电泳凝胶用半干法转移( 电压1 0 v ，转移1 2 小时) 至p v d f ( 聚偏二氟乙烯) 膜上，用含5 干牛奶的t b s t ( p h 7 6 的5 0 湖 “s h c l ，1 0 0 m m n a c l 和o 1 t w e e n2 0 ) 溶液4 封闭过夜以去除非特 异性结合，一抗( 鼠抗人的m y c n 单克隆抗体a b 1 ，o n c o g e n e 公司；鼠 抗人的h a t a g 单克隆抗体l 公司；鼠抗人的m y c t a g 单克隆抗体， c e l ls i g n a l i n g 公司；兔抗人的a c t i n 多克隆抗体，s i g m a 公司) 室温孵育 1 小时，t b s 。t 冲洗3 次，每次5 分钟，然后加入辣根过氧化物酶标记的 抗鼠或抗兔的二抗( c e l ls i g n a l i n gt e c h l l o l o g i e s 公司) 室温孵育1 小时， t b s t 冲洗3 次，每次5 分钟，最后用e c l 系统( a m e r s h a mp h a m a c i a b i o s c i e n c e s 公司) 检测。 9 免疫沉淀( i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，i p ) 9 1 外源性i p 结合实验 阳三k 2 9 3 细胞共转染m y c n 和r i 瓜34 8 小时。处理后的细胞用 1 p b s ( 8 n a c l ，o 2 k c l ，2 9 n a 2 d 0 4 1 2 h 2 0 ，o 2 k h 2 p 0 4 ) 溶液轻轻洗 两遍收集到1 5 m l 的e p 管中，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液a ( p h 7 5 的2 5 m m1 y i s h c l ，1 3 7 m mn a c l ，2 7 m mk c l ，a n d1 t r i x o nx 1 0 0 ) ， 冰上放置3 0 分钟，超声裂解细胞，4 1 5 0 0 0 转离心l o 分钟，收集上清 为细胞裂解液。蛋白定量后，取含1 m g 蛋白的细胞裂解液，加入5 0 的 g s e p h a u f o s eb e a d s 颗粒( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司) 3 0 山，4 缓慢转动 1 小时，离心取上清，加入5 山鼠抗人的h a t a g 单克隆抗体( l 公司) 或鼠抗人的m y c - t a g 单克隆抗体( c e l ls i g n a l i n g 公司) 。4 缓慢转动2 小时，再加入g s e p h 啪s eb e a d s 颗粒3 0 山，4 缓慢转动1 小时，离心弃 上清，g s e p h a r o s eb e a d s 颗粒用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液a 冲洗3 遍。加入s d s 上样缓冲液，走s d s p a g e ，分离蛋白，然后将凝胶用半 干法转移至p v d f 膜上，用含5 干牛奶的t b s t 缓冲液4 封闭过夜以 去除非特异性结合，加一抗，二抗，最后用e c l 系统检测( 同w | e s t e mb l o t ) 。 研究论文 9 2 内源性i p 结合实验 实验使用m y c n 扩增的神经母细胞瘤s k n b e 。细胞用1 p b s ( 8 n a c l ，o 2 k c l ，2 9 n a 2 口0 4 1 2 h 2 0 ，o 2 k h 2 p 0 4 ) 溶液轻轻洗两遍收 集到1 5 m l 的e p 管中，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液a ( p h 7 5 的 2 5 r 洲碱s h c l ，1 3 7 m mn a c l ，2 7 m mk c l ，a 1 1 d1 t r i x o nx 1 0 0 ) ，冰上 放置3 0 分钟，超声裂解细胞，4 1 5 0 0 0 转离心l o 分钟，收集上清为细 胞裂解液。蛋白定量后，取含1 m g 蛋白的细胞裂解液，加入5 0 的 g s e p h a r o s eb e a d s 颗粒( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司) 3o “l ，4 缓慢转动 l 小时，离心取上清，加入5 “l 鼠抗人的m y c n 单克隆抗体a b 1 ，o n c o g e n e 公司或鼠抗人的r i 小3 单克隆抗体5 g 4 ( a b c a m 公司) 。4 缓慢转动2 小时，再加入g s e p h a r o s eb e a d s 颗粒3 0 山，4 缓慢转动1 小时，离心弃 上清，g s e p h 锄s eb e a d s 颗粒用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液a 冲洗3 遍。加入s d s 上样缓冲液，走s d s p a g e ，分离蛋白，然后将凝胶用半 干法转移至p v d f 膜上，用含5 干牛奶的t b s t 缓冲液4 封闭过夜以 去除非特异性结合，加一抗，二抗，最后用e c l 系统检测( 同w 色s t e mb l o t ) 。 1 0 泛素化实验 s k - n b e 细胞共转染r i 腻x 3 和h i s t a g g e du 啮i q u i t i n 载体4 8 小时。 处理后的细胞用1 p b s ( 8 n a c l ，o 2 k c l ，2 9 n a 2 h p 0 4 l2 h 2 0 ，o 2 k h 2 p 0 4 ) 溶液轻轻洗两遍收集到1 5 m l 的e p 管中，加入含蛋白酶抑制剂 的细胞裂解液a ( p h 7 5 的2 5 m m 而s h c l ，1 3 7 删n a c l ，2 7 砌k c l ， a n d1 嘣x o nx 1 0 0 ) ，冰上放置3 0 分钟，超声裂解细胞，4 1 5 0 0 0 转 离心1 0 分钟，收集上清为细胞裂解液。蛋白定量后，取含1 m g 蛋白的细 胞裂解液，加入n i tb e a d s 颗粒( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司) 3 0 山，4 缓慢转动1 2 小时，离心弃上清，n 汀b e a d s 颗粒用含蛋白酶抑制剂的细胞 裂解液a 冲洗3 遍。加入s d s 上样缓冲液，走