（环境科学专业论文）广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究.pdf

( 2 2 0 3 ) x 1 0 3 ，( 2 2 0 2 ) x 1 0 3 ，( 1 6 0 1 ) x 1 0 4 。用双层培养基共得到7 个与尾矿酸 化相关的菌株。经过菌株1 6 sr r n a 基因鉴定，确认其中有3 个属于l e p t o s p i r i l l u m f e r r i p h i l u m ，2 个属于a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，1 个属于鼬扣b a c i l l u s m o n t s e r r a t e n s i s ，1 个属于a c i d i p h i l i u mc r y p t u m 。 3 、提取尾矿样品中的总d n a ，经扩增后构建克隆文库。随机挑取文库中 1 4 3 个克隆子，进行限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，共获得了1 5 个不同的r f l p 型。对每一r f l p 型内的代 表进行序列测定和系统发育分析，得到8 个测序型。经过在线程序 c h e c k - c h i m e r a 分析，发现一个测序型为嵌合体，排除于随后的分析中。这 个嵌合体所在的r f l p 型只有一个克隆子代表。在有效的1 4 2 个克隆子中，代表 t h e r m o p l a s m a l e s 目古细菌的克隆子共有1 3 5 个，其中1 3 2 个克隆子( 2 个序列 型，代表分别为c l o n e 9 ，4 4 ) 在系统发育上归为f e r r o p l a s m a 属；2 个克隆子( 2 个序列型，代表分别为c l o n e 4 3 ，6 9 ) 在系统发育上归为d p l a s m a 属；1 个克隆子 ( 1 个序列型，代表为c l o n e 2 8 ) 在系统发育上归为c p l a s m a 属。同时发现少数 细菌存在于该环境中，6 个克隆子( 1 个序列型，代表为c l o n e 6 1 ) 在系统发育 上归为n i t r o s p i r a 纲，1 个克隆子( 1 个序列型，代表为c l o n e 2 2 ) 在系统发育上 归为p r o t e o b a c t e r i a 纲。 4 、乐昌尾矿微生物多样性较低，l f e r r i p h i l u m 、a t f e r r o o x i d a n s 、& m o n t s e r r a t e n s i s 以及f e r r o p l a s m as p 可能是催化乐昌尾矿酸化的主要微生物类 群。 关键词：酸化尾矿，微生物多样性，嗜酸微生物 i i m i c r o b i a ld i v e r s i t yi na c i d i cm i n e r a i l i n g sa t l e c h a n g ，g u a n g d o n gp r o v i n c e m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e s m a s t e r a lc a n d i d a t e ： s u p e r v i s o r ： l if a n g p r o f l a nc h o n g - y u a b s t r a c t m i n et a i l i n g sm a yr e s u l ti ne n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，s u c ha ss e v e r ea c i d i f i c a t i o na n d d i s c h a r g eo fh e a v ym e t a l s a c i d o p h i l i cs u l f u r - a n di r o n - o x i d i z i n gb a c t e r i ap l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nc a t a l y s i n ga c i d - p r o d u c i n gr e a c t i o n s s of a r , h o w e v e r , o u rk n o w l e d g e o f a c i d i p h i l i cm i c r o o r g a n i s m si ne x t r e m e l ya c i d i ce n v i r o n m e n t si sl i m i t e d i no r d e rt o f u l l yu n d e r s t a n dt h em i c r o b e si na c i dm i n et a i l i n g s ，t h ed i v e r s i t yo fm i c r o o r g a n i s m si n a c i d i cm i n e t a i l i n g s a t l e c h a n g ，g u a n g d o n g p r o v i n c ew a se x a m i n e d b y c u l t i v a t i o n d e p e n d e n ta n db i o m o l e c u l a ra p p r o a c h t h em a i nr e s u l t si n c l u d e d ： 1 t h ep ho ft h ea c i d i cm i n et a i l i n g sw a s1 9 4 t h em o s tt h r e ea b u n d a n th e a v y m e t a l sp r e s e n ti nt h i ss i t ew e r ef e ：8 7 4 9 6m g k g ，p b ：3 1 0 9m g k g ，a n dz n ：1 5 8 4 m g k g ，r e s p e c t i v e l y s o ；一c o n c e n t r a t i o ni nt h et a i l i n g sw a s6 7 3 3g k g 2 t h ec l o n ef o r m i n gu n i t s ( c f u ) o no v e r l a ym e d i a ( f e o ，f e s oa n dy e o p l a t e s ， i i i r e s p e c t i v e l y ) w e r e ( 2 2 0 3 ) x 1 0 3 ，( 2 2 0 2 ) x 1 0 3 ，( 1 6 o 1 ) x 1 0 4c f u d r yt a i l i n g s ， r e s p e c t i v e l y o n l y7s t r a i n sw e r eg o tf r o mo v e r l a ym e d i a ( f e o ，f e s oa n dy e o p l a t e s ，r e s p e c t i v e l y ) a m o n gt h e m ，t h r e e i s o l a t i o n sw e r ei d e n t i f i e dt ob e l e p t o s p i r i l l u mf e r r i p h i l u m ，t w oi s o l a t i o n sw e r ei d e n t i f i e dt ob ea c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s t h e r e s tt w or e l a t e dt o s u l f o b a c i l l u s m o n t s e r r a t e n s i sa n d a c i d i p h i l i u mc r y p t u m ，r e s p e c t i v e l y 3 t o t a l - c o m m u n i t yd n a w a se x t r a c t e df r o mt h em i c r o b i a la s s e m b l a g e si nt h em i n e t a i l i n g s a n d 16 sr r n ag e n ew e r ea m p l i f i e dw i t hau n i v e r s a l l yp r i m e r s t h e a m p l i f i c a t i o np r o d u c tw a st h e nu s e dt oc o n s t r u c ta1 6 sr r n ag e n ec l o n el i b r a r y a n d1 4 3c l o n e sw e r eg r o u p e db yr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( r f l p ) a n a l y s i s ，r e s u l t i n gi nat o t a lo f1 5d i f f e r e n tr f l pt y p e s e i g h td i f f e r e n ts e q u e n c e t y p e sw e r eg o tb ys e q u e n c i n ga n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fr e p r e s e n t a t i v e sf r o m e a c hu n i q u er f l pt y p e a m o n gt h e m ，o n es e q u e n c et y p e ( w h i c hc o n t a i n sas i n g l e c l o n e ) w a si d e n t i f i e da sac h i m e r a ，a n dt h e ne l i m i n a t e d o ft h er e s t1 4 2c l o n e s ， 1 3 2 c l o n e s ，i n c l u d i n g t w o s e q u e n c et y p e s ，w e r ep l a c e d i n f e r r o p l a s m a p h y l o g e n e t i c a l l y t w oc l o n e s ，i n c l u d i n gt w os e q u e n c et y p e s ，w e r ep l a c e d i n d p l a s m a o n ec l o n ew a sp l a c e di nc p l a s m a ，w i t ho n l yo n es e q u e n c et y p e s i x c l o n e sw i t ho n es e q u e n c e t y p eb e l o n g e dt on i t r o s p i r a o n ec l o n e s ，w i t ho n e s e q u e n c et y p e ，b e l o n g e dt op r o t r o b a c t e r i a 4 l o wd i v e r s i t yw a sf o u n di nl e c h a n gm i n et a i l i n g s w ec o n c l u d et h a tl i v f e r r i p h i l u m 、a t f e r r o o x i d a n s 、s m o n t s e r r a t e n s i sa n df e r r o p l a s m as p a r e r e s p o n s i b l ef o rt h ea c i d i f i c a t i o no ft h em i n et a i l i n g sa tl e c h a n g k e y w o r d s ：a c i d i cm i n et a i l i n g s ，m i c r o b i a ld i v e r s i t y , a c i d o p h i l i c 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 第1 章前言 土壤微生物是陆地生态系统中重要的生命体。由于土壤微生物种类繁多、数 量巨大，加上其个体微小，给土壤微生物的研究带来很大的困难。目前研究土壤 微生物多样性的常用方法大致上包括以下几类：( 1 ) 传统的微生物平板纯培养 方法； ( 2 ) b i o l o g 微平板分析方法； ( 3 ) 脂肪酸分析方法；( 4 ) 分子生物学 方法；( 5 ) 其他方法，如用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法 ( f u m i g a t i o n i n c u b a t i o n ) 、底物诱导呼吸法( s u b s t r a t e i n d u c e dr e s p i r a t i o n ) 和光 合微生物色素法等( 章家恩等，2 0 0 4 ) 。 这里仅对有关土壤微生物多样性几种主要的实验研究方法加以介绍与评述。 1 1 传统的微生物平板纯培养方法 传统的微生物平板纯培养法需要根据目标微生物选择相应的培养基，然后通 过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。这种方法对于衡 量小群体多样性方面不失为一种快速的方法( k e n n e d y & s m i t h ，1 9 9 5 ) ，却不能 得到环境微生物在环境生态系统中的生活特征及生态功能( m a c u r a ，1 9 7 4 ) 的信 息。这是因为我们人为限定了一些培养条件，无法全面反映微生物生长的自然条 件，常常造成某些微生物富集生长，另一些微生物缺失。迄今为止，只有不到1 的环境微生物能够被培养( p a c ee ta 1 ，1 9 8 6 ) ，只能反映极少数微生物的信息。 显然，这不利于研究土壤微生物多样性状况。因此这种方法只能作为一种辅助手 段，只有与其他先进方法如分子方法结合起来才能较为客观而全面的反映微生物 群落结构的真实信息。但纯培养方法在分离具有一定功能的目标物种时非常有用， 利用这种方法已获得许多很有应用价值的微生物种类，并应用于基因介导及生态 修复等方面( 焦晓丹和吴风芝，2 0 0 4 ) 。 中山大学硕士学位论文 1 2 分子生物学方法 现代分子生物技术的发展使生物学的研究更加深入，并逐渐成为揭示生命科 学规律的有利手段。利用分子技术分析核酸使人们逐渐认识到微生物多样性的复 杂性，因为环境微生物在基因水平上的多样性可以通过微生物中的d n a 组成的 复杂性表现出来。基于d n 斯口r n a 信息，特别是1 6 sr 对妣基因来研究微生物多 样性的分子生物学方法，在环境微生物的研究中显示了极大的应用前景 ( g e l s o m i n oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。其最大的优点是1 6 sr 融w 湛因技术与p c r 、d g g e 等技术结合，不经过分离培养微生物，避免了培养技术的限制，就可以对环境样 品进行客观的分析，得到在原始样品中存在的微生物不同种群的数量和种类分布 信息，较为准确地揭示微生物种类和多样性信息。 1 2 11 6 sr 砌悄基因 1 6 sr r n a 基因是细菌染色体上编码r r n a 的d n a 序列，存在于所有细菌的染 色体基因中。它由保守区及可变区二部分组成，保守区在细菌间无明显差异；可 变区在长期的进化过程中，因不时突变在不同的细菌间存在较大差异。两者互相 交错排列。因此，可以设计不同的引物对所有细菌或特定细菌做p c r 检测。其优 点在于：( 1 ) 细胞中的含量较高，较易提取；( 2 ) 普遍存在于原核生物中；( 3 ) 编码1 6 sr r n a 的基因十分稳定；( 4 ) 相对分子质量适中，信息量大，易于分析。 上万种生物的1 6 sr r n a 基因序列信息已经贮存于核糖体数据库计划里 ( r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o i e c t ，r d p ) ，作为研究微生物多样性的标准工具( m a i d a k ， 1 9 9 9 ) 。但是，操作过程中的多个步骤都会影响到最终的鉴定结果。因此，在操 作中必须充分考虑样品微生物种群总d n a 的提取是否完全，p c r 反应步骤设计是 否科学合理等因素。 2 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 1 2 2d n a 的提取方法研究 关于环境中微生物总d n a 提取方法的研究包括d n a 提取方法建立和比较研 究、d n a 粗样品进一步纯化方法研究等。环境样品中总d n a 直接提取方法是对 样品中的微生物细胞进行直接裂解，释放出d n a ，这样克服了传统微生物培养 技术的局限性，可保证所获得的样品具有一定代表性( 李玉英等，2 0 0 4 ) 。环境 样品总d n a 的间接提取则是先把样品中的微生物细胞分离出来，然后再进行微 生物细胞d n a 的提取( g a b r i e l a ，1 9 9 8 ) 。利用问接法获得的微生物多样性和区系 组成的信息存在一定的不足，这是因为微生物细胞与土壤颗粒、粘土以及有机物 接合紧密，对高效率提取核酸造成了很大的困难( 李玉英等，2 0 0 4 ) 。j a c k 与j a n 比较了两种提取方法所获得的d n a 质量，结果表明间接方法可获得较高纯度的 d n a ，但产量往往较低( j a c k j a n ，2 0 0 0 ) 。在提取环境样品基因组d n a 时， 一些杂质( 腐殖酸、多糖、酚类等物质) 也被提取，这些杂质对后续p c r 过程中 有关酶的活性和实验结果的真实性及稳定性有极大的影响( 滕应等，2 0 0 4 ) ，因 此获得较高纯度的环境营, d n a 是至关重要的( b u r g m a n ne ta 1 ，2 0 0 1 ；r o n d o n ， 2 0 0 0 ) 。目前环境d n a 样品的纯化方法有琼脂糖凝胶电泳纯化法、密度梯度离 心法和凝胶过滤法等。土壤的物理、化学性质是高度异质的，不同的d 僦化 方法只适用于特定的土壤条件，没有通用于所有土壤的方法。土壤d n a 提取、 纯化的方法有待进一步完善( 蔡燕飞和廖宗文，2 0 0 2 ) 。 选择合适的引物对扩增已纯化的总d n a ，扩增产物就可以进行后继分析。 1 2 3r r n a 基因的克隆与测序 对环境样品的1 6 sr i m a 基因文库测序是目前研究环境样品中微生物多样性 最常用的方法之一。这种方法不仅提供了关于种群丰度的知识，还提供了系统发 育方面的信息。该方法的优点在于：( 1 ) 通过p c r 可分析大量的d n a 多态性； ( 2 ) 不必用放射性标记的探针杂交就可观察到结果( 崔雨新和王小明，1 9 9 9 ) 。 分析微生物种群信息与环境参数之间的相互关系，可以让我们了解地化学因素是 3 中山大学硕士学位论文 如何影响微生物群落的( b a k e r b a n f i e l d ，2 0 0 3 ) 。 目前，有多种试剂盒可以用于细菌1 6 sr r n a 基因文库的建立，女n p g e m t 克 隆试剂盒和t a 克隆试剂盒。建立文库之后，采用全细胞p c r 扩增( 菌落p c r ) 或 质粒提取方法获取质粒中的1 6 sr r n a 基因序列。全细胞p c r 扩增是利用先前p c r 的引物对，或是位于插入片段两端的质粒上的引物对，直接挑取克隆单菌落中的 细胞作为模板进行p c r 反应，从而扩增并回收出质粒中插入的1 6 sr r n a 基因片 段。质粒提取法工作量较大，但提取到的质粒质量较好，一般不需进一步纯化就 可以直接用于d 蝴4 序，而全细胞p c r 扩增得到的p c r 产物通常需要纯化后才能 用于测序。 为了使回收的序列具有代表性，通常需要选取至少1 0 0 个单菌落进行序列回 i环境样品 l 总d n a 选择雀 1r 取与纯化 适的扩增引物 l 获取质粒中的1 6 s r 砌忱基因序列 分序列 图1 11 6 sr r n a 基因文库的建立及测序流程图 f i g1 1f l o wc h a r ts h o w i n gc o m p a r a t i v ea n a l y s i so f1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e s 4 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 收。回收的序列最好全部进行测序，以便进行后续微生物分类分析。但有时限于 测序费用，不能将回收的全部序列测序，需要先进行筛选，剔除重复序列，仅将 代表性的、丰度较大的序列测序。序列筛选一般要结合d n a 指纹技术，例如限 制性片段长度多态性技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 法等。 对微生物1 6 sr r n a 基因进行测序时最好进行全长测序，尤其是所测序列将 要用于探针设计和新物种确定。将1 6 sr r n a 基因序列提交到g e n b a n k 采用 b l a s t 程序与已知序列进行相似性分析。g e n b a n k 将按照与测得序列的相似性高 低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精 确的微生物分类还取决于系统发育分析( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 。 系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子( 女1 1 6 sr r n a 基因) 的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采用聚类分析等方法， 将微生物进行分类，并将结果用系统发育树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) 表示。 1 2 4 限制性片段长度多态性技术 除了克隆文库的建立与测序方法外，限制性片段长度多态性技术( r f l p ) 也较为常用。 限制性片段长度多态性技术( r f l p ) 又称扩增的r d n a 限制酶切分析 ( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ，a r d r a ) ，是美国发展起来的一 项现代生物鉴定技术( v a n e e c h o u t t ee t 以正，1 9 9 2 ) 。根据原核生物r r n a 基因序列 的保守性，以及不同生物个体或种群之间d n a 片段酶切位点有所差异的特点， 将扩增的r r n a 基因片段进行酶切，然后通过酶切图谱来分析细菌的多样性，可 在1 6 sr r n a 基因序列水平进一步区分细菌种间的差异。a r d r a 技术区分不同 1 6 sr 砒峪基因片段的精确性主要依赖所选用的限制性内切酶的种类和数量。此 方法对微生物遗传多样性尤其是微生物的种下分类具有重要意义( j u n g ee ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。j o h n s o n 等已将此法用于快速鉴定嗜酸铁氧化细菌( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 其主要特点是：( 1 ) r f l p 可以直接研究微生物种群的d 惝成，而且由于限制 性内切酶识别序列具有专一性，因此r f l p 技术进行多态性分析具有较高的可靠 5 中山大学硕士学位论文 性( k oe ta 1 ，2 0 0 3 ) ；( 2 ) r f l p 结果反映的是整个基因组的遗传信息，区分种 群差异的能力更强( c h o i ，2 0 0 3 ；t a n p i b o o n s a k ，2 0 0 4 ) 。 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 、温度梯 度凝胶电泳( t e m p r e t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 、随机扩增多态性d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 和扩增片段长度多态性 ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 也可用于微生物多样性分析。 d g g e 和t g g e 的原理是根据含有不同序列的d n a 片段在具有变性剂梯度 或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同( m u y z e r ， 1 9 9 9 ) 。这种方法的灵敏度非常高，能将仅有1 个碱基差异的d n a 片段分开。 r a p d 又称随机引物多聚酶链式反应( a p p c r ) ，它应用短的任意序列引 物在非严格的条件下进行p c r ，结果基因组的许多位点同时得以扩增，应用凝胶 电泳分析p c r 产物，并检测基因多个位点的多态性。一些表型上不能反映的遗传 物质的细微变化都可以通过r a p d 技术显示出来。 a f l p 是基于p c r 和r f l p 的一种d n a 指纹技术。其实质是利用两种以上的酶 切割d n a ，形成不同酶切位点的限制酶切片段，在所得的酶切片段上加上双链 人工接头，作为模板进行扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，显示 多态性。a f l p 技术的优点在于：( 1 ) 具有l l r f l p 标记更为可靠、有效的揭示 物种多态性水平的能力( l u c c h i n i ，2 0 0 3 ) ；( 2 ) 具有一定的灵活性，可通过特 异性p c r 引物设计和内切酶组合的选择，来调整a f l p 图谱中限制性片段的适宜 数目( v a n d e n b r a a k e t 口正，2 0 0 4 ) ；( 3 ) 重复性好，分辨率高( 王洪嫒等，2 0 0 4 ) 。 1 2 51 6 sr r n a 基因技术的局限性 但是我们应该清楚的看到：作为一种实验技术手段，1 6 sr 砌峨基因技术并 不是万能的，它同样存在一些不足，在环境科学领域中的应用受到以下因素的限 制： ( 1 ) 需要较高的代价，1 6 sr i 州a 基因技术需要较昂贵的仪器设备和药品配 套，对实验人员要求有较好的分子生物学基础。这一点在一般的环境治理实验室 中可能是无法满足的。 6 李芳 广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 ( 2 ) 1 6 sr 对妣基因技术本身在操作过程中，存在一些缺陷，如可能发生 基因丢失、d n a 提取效率的低下或样品中存在其他干扰物质等情况，都会使实 验结果发生偏差。 ( 3 ) 1 6 sr r n a 基因技术应用在环境保护领域中所面临的最大的问题是，我 们虽然获得了环境中相应微生物存在的信息，却无法得到纯培养。因此，在实际 应用中最好能将分子方法与传统方法结合起来。 1 3 酸性环境微生物多样性的研究现状 极端环境中微生物多样性的研究近年来成为了研究热点。这是因为极端环境 在地球形成早期曾广泛分布，其中的生物种类代表了古老的生命形式。另外在生 物技术和工业操作中，极端环境中的微生物应用范围逐渐扩大。以高酸度为主要 特征的环境即是极端环境的一种( j o h n s o n ，1 9 9 8 ) 。 酸性环境根据形成原因主要可分为两种：( 1 ) 由于人类的采矿活动影响而 形成的酸化尾矿( m i n et a i l i n g s ) 和酸性矿山废水( a c i dm i n ed r a i n a g e ，a m d ) ； ( 2 ) 由于地球自身的活动形成的酸性温泉和火山口附近的酸性湖泊。由于前者 对环境产生了重大的影响，因此成为了研究的热点。 1 3 1 酸性矿水及尾矿中嗜酸微生物多样性研究现状 1 3 1 1 含硫矿物的酸化 含硫矿物在与空气和水隔绝的条件下，其化学性质是稳定的。但是暴露在潮 湿的空气中时，就会发生自发氧化( 以黄铁矿为例) ： f e s ，+ 3 5 0 ，+ h ，o f e “+ 2 s o ：+ 2 h + ( 1 ) 在接近中性的环境中，氧是主要的氧化者( e v a n g e l o u ，1 9 9 5 ) 。当p h 3 时，由f e “ 引起的氧化快于氧引起的氧化( r i t c h i e ，1 9 9 4 ) ，但f e 2 + 氧化为f e 3 + 的速度很慢， 而一些嗜酸的细菌和古细菌在低p h 环境中可以氧化f e “，此时，反应( 2 ) 主要 7 中山大学硕士学位论文 由生物催化( b a k e r & b a n f i e l d ，2 0 0 3 ；j o h n s o n & h a l l b e r g ，2 0 0 3 ) ： 1 4 f e 2 + + 3 5 0 2 + 1 4 h + 一1 4 f e 3 + + 7 h 2 0 ( 2 ) 产生的f e 3 + 作为主要的氧化剂氧化黄铁矿： f e s 2 + 6 f e 3 + + 3 h 2 0 一7 f e 2 + + s 2 0 ；+ 6 h + ( 3 ) 一部分细菌和古细菌还能氧化硫代硫酸盐( s ，0 3 一) 、还原态无机硫化物( r e d u c e d i n o r g a n i cs u l f u rc o m p o u n d s ，r i s c s ) 和硫元素： s 2 0 3 2 + 2 0 2 + h 2 0 _ 2 h + + 2 s 0 2 ( 4 ) 而f e 3 + 的水解进一步加速了酸化： f e “+ 3 h 2 0 呻f e ( o h ) 3 + 3 h + ( 5 ) 因此，矿山废水通常是酸性的，并有较高浓度的重金属。非金属元素砷也可能以 极高的浓度出现( b r u n e e le ta 1 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) 。尾矿酸化过程与此类似。 1 3 1 2a m d 中的微生物多样性 目前大部分关于酸性环境中微生物多样性的研究主要集中在a m d 原核生物 多样性方面。氧化亚铁嗜酸硫杆菌( a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，以前被命名 为氧化亚铁硫杆菌，t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 是最早从a m d 中分离到的微生物。 当时用于培翱丘f e r r o o x i d a n s 的9 k 培养基是最早用于分离纯化酸性微生物的培 养基( s l i v e r m a n & l u n d g r e n ，1 9 5 1 ) ，现在仍在广泛使用。此外，l e a t h e n 培养基 的使用也较为广泛( l e a t h e ne ta 1 ，1 9 5 1 ) 。但这些培养基的成分只反映了a t f e r r o o x i d a n s 的生长要求( 邓恩建等，2 0 0 5 ) ，却忽视了a m d 中其它类群的微生物， 有一定的局限性。 j o h n s o n 等经过多年研究，提出了可培养多种嗜酸微生物的双层培养基 ( o v e r l a yp l a t e s ) ( j o h n s o n ，1 9 9 5 ；h a l l b e r g & j o h n s o n ，2 0 0 3 ) 。双层培养基则包 括：亚铁离子双层培养基( f e o ) ，酵母提取物双层培养基( y e d ) 和亚铁离子 连四硫酸盐双层培养基( f e s o ) 。虽然双层培养基可以培养绝大部分已知的自养 和异养嗜酸菌( j o h n s o n e t a l ，2 0 0 5 ) ，但是由于凝固剂较为昂贵( a g a r o s e ，t y p e i ) ， 限制了它的使用。a m d 中嗜中性的硫酸盐还原菌( s u l p h a t e r e d u c i n gb a c t e r i s ， s r b ) 也得到了培养( l u p t a k o v a & k u s n i e r o v a ，2 0 0 5 ) 。但是铁氧化菌、硫氧化 8 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 菌是引起酸化的主要微生物类群，因此成为目前研究的热点( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ； b r u n e e le ta 1 ，2 0 0 5 ；b r u n e e le ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 值得关注的是，b o n d 等( 2 0 0 0 ) 把l e p t o s p i r i l l u m 分为三类：第一类为三 f e r r o o x i d a n s ( 最适生长温度在2 6 至u 3 0 。c ) ，第二类为l f e r r i p h i l u m ( 最适生长温 度在3 0 至1 j 4 0 。c ) ( g o e b e l s t a c k e b r a n d t ，1 9 9 4 ) ，第三类为当时只在i r o nm o u n t a i n 的文库中检测到、尚未获得培养的菌种( b o n de ta 1 ，2 0 0 0 ) 。而t y s o n 等2 0 0 5 年首 次在i r o nm o u n t a i n 得到了第三类菌株，并将其命名为l f e r r o d i a z o t r o p h u m ( t y s o n 舀a 1 ，2 0 0 5 ) 。表1 1 列出了目前在a m d 中已被分离的原核生物( j o h n s o n h a l l b e r g ，2 0 0 3 ；t y s o n e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 近年来，随着分子生物学实验方法的广泛应用，我们在a m d 中发现了越来 越多种类的克隆子，这些种类大部分还没有得到纯培养，如在i r o nm o u n t a i n 分别 得到- t l e p t o s p i r i l l u m 第一、二、三类未培养菌株的相应克隆子：i ma m dc l o n e b a 3 9 ，b a 2 4 ，a s 9 ；同时也发现tt h e r m o p l a s m a l e s 中a p l a s m a 属、b p l a s m a 属、 d p l a s m a 属中未培养微生物的克隆，如： i ma m dc l o n ea s l 3 2 、a s l 0 、a s 4 等 ( g r e g o r ye ta l ，2 0 0 4 ) 。由于分子方法的介入，使我们对a m d 微生物种群的季 节变化也有了新的认识( b r u n e e le ta 1 ，2 0 0 5 ；b r u n e e le ta l ，2 0 0 6 ) ，为我们更好 的了解酸化机理、评估酸性微生物生态提供了更全面的信息。 关于a m d 中真核生物的报道还比较少( j o h n s o n r a n g ，1 9 9 3 ；l u t ze ta l ， 2 0 0 1 ；z e t t l e re t 口正，2 0 0 2 ；l o p e z a r c h i l l ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。j o h n s o n 等从a m d 中分离得 到的纤毛虫、变形虫以及鞭毛虫等的一些种有捕食嗜酸铁氧化细菌的能力 ( j o h n s o n & r a n g ，1 9 9 3 ) 。l u t z 等在铁山的克隆文库中发现了蒲变虫属 ( v a h l k a m p f i a s p ) 的克隆子( l u t ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而在西班牙的t i n t or i v e r ( p h = 2 ) ， 真核生物在总的生物量中至少占6 0 ( a m a r a l z e t t l e r ，2 0 0 2 ) ，并检测到真核藻类、 原生动物、真菌等的存在( l o p e z a r c h i l l ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 3 1 3酸化尾矿的微生物多样性 目前，尾矿微生物多样性的研究主要集中在传统的培养方面，例如在尾矿( 包 括水下封存的样品) 中已发现有铁氧化硫氧化嗜酸菌存在( s o u t h a m 9 中山大学硕士学位论文 表1 1 极端酸性废水中已分离的原核生物+ t a b l e1 1a c i d o p h i l i cp r o k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m si na m d 注：+ 表中引号所引的部分需确认分类或重新分类； t + 嗜温类指最适生长温度 6 0o c 的微生物种类； 料+ 具有通过产酸、氧化矿物的能力。 1 0 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 b e v e r i d g e ，1 9 9 2 ) 。s c h i p p e r s 等人在铀尾矿中发现了铁氧化和硫氧化细菌 ( s c h i p p e r s ，1 9 9 5 ) 。n o u h o u 等发现智利一个酸性铜尾矿q b l e p t o s p i r i l l u m 属和 s u l f o b a c i l l u s 属微生物的数目最多，a t f e r r o o x i d a n s 的数目非常少( n o u h o ue ta 1 ， u n p u b l i s h e d ) 。同时已有好氧异养嗜酸菌被分离的报道( b e r t h e l o t ，1 9 9 7 ) 。f o r t i n 和b e v e r i d g e 贝, l j 发现s i m 可于存在含氧区及无氧区，以及在酸性及中性p h 的环境 中( f o r t i n & b e v e r i d g e ，1 9 9 7 ) 。 用培养方法只能得到可培养微生物的数量信息，只有通过分子方法才能得 到多样性信息。目前只有s e l e n s k a p o b e n 等( 2 0 0 1 ) 用r e p a p d ，s a 和1 6 srr n a 基因分析等分子方法研究了中性铀尾矿微生物多样性，并首次报道在铀尾矿中发 现了a t f e r r o o x i d a n s ( s e l e n s k a p o b e l l e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。尚无对酸化尾矿微生物多样性 研究的报道。可见，研究酸化尾矿微生物多样性具有较大的新意。 1 3 2 地热酸性区嗜酸微生物多样性的研究 除a m d 、酸化尾矿外，酸性地热区也是被深入研究的样点。j o h n s o n 等从美 国黄石国家公园的六个地热酸性区样品( p h2 7 - 3 7 ，温度3 0 8 3 。c ) 中得到了若 干中度嗜热嗜酸菌，其中包括了f e 2 + 氧化菌，f e 3 + 还原菌( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 对黄石公园地热环境中的嗜热嗜酸菌的研究，让我们对嗜热嗜酸菌的多样性有了 新的认识，也揭示了对极端环境中微生物多样性的认识仍需进一步加强。 1 4 本论文的主要内容及创新 据中国墙材信息网( h t t p ：w w w b r i c k t i l e c o m ) 报道，我国年尾矿排放量达3 亿吨以上，多以自然堆积法储存于尾矿库中。这需要占用大量的耕地，同时引发 了酸化等诸多环境问题，危及到人体健康和矿产业的可持续发展( 李明顺等， 2 0 0 5 ) 。大量研究表明，微生物是尾矿酸化和酸性废水产生的主要原因。了解酸 化尾矿中微生物的多样性对于从源头控制、治理尾矿酸化十分重要。然而，目前 对酸化尾矿的相关研究仍以传统培养方法为主，无法得到关于微生物种群的信 息。有鉴于此，本研究采用先进的双层培养基技术和建立1 6 sr r n a 基因文库并 1 2 李芳广东乐昌酸化尾矿微生物多样性研究 2 1 研究地点 第2 章材料与方法 乐昌铅锌矿位于粤北乐昌市以东4k m 2 ，占地约1 1 5k m 2 ，该地属湿润的亚热 带气候，年降雨量约1 5 0 0m m ，降雨主要集中在夏季的暴雨季节，矿床位于矿区 的东部。矿石主要由黄铁矿、方铅矿、闪锌矿、磁铁矿和小部分的石英、方解石 和白云母等组成。采矿属常规的地下开采，选矿工程产生的尾矿以泥浆形式排入 尾矿库中。该矿山每年的废石和尾矿产生量分别为2 5 0 0 0t 和3 0 0 0 0t ，累计堆存面 积分别为8 3 0 0m s 和6 0