（农产品加工及贮藏工程专业论文）仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究.pdf

摘要 腹泻是影响仔猪成活率的主要疾病之一，参考资料报道，因腹泻导致仔猪死亡占 仔猪死亡总数的3 9 - 8 。目前，仔猪腹泻的防治主要使用抗生素，但耐药湍的产生、 抗生素污染等问题己引起人们的商度重视。微生态制剂( 又称益生菌制剂) 在防治肠 道疾病方面，不仅安全无害，无残留，不产生抗药性，还有提高饲料利用率，促进动 物生长，改善产品品质等作用，是国内外研究的热点，但防效低和使用成本较高是推 向实用的瓶颈。本研究旨在从仔猪肠道中筛选防治效果显著、制剂生产性能优良的益 生菌菌株，并对其功能和生物学特性进行研究，为仔猪专用高效益生菌f t 齐t j 的研制提 供材料和技术支持。 对利于乳酸菌和致病性大肠杆菌共同生长培养基进行了筛选研究。以营养肉汤为 基础培养基，对常用的7 种营养因子进行了单因子筛选试验，明确了葡萄糖和吐温两 种物质利于乳酸菌和致病性大肠杆菌的生长，在添加两种物质的肉汤培养基中，乳酸 菌和致病性大肠杆菌的活菌数量均可达到l 1 0 8 c f u m l 以上。采用l 3 4 正交试验， 筛选出适合乳酸菌和致病性大肠卡t 菌生长的最佳培养基组合，其培养基配方为：牛肉 膏0 9 、蛋白胨0 7 、吐温o 1 、葡萄糖l 。 采用平板倾注法，从来自不同地点、不同品种、不同同龄健康仔猪粪便中共分离 获得1 2 8 株乳酸菌。以致病性大肠杆菌k 8 8 、k 9 9 为防治靶标，初筛出具有较强抑菌 活性的菌株2 5 株；通过耐酸、耐胆盐、生长速率等生物学特性比较，确定编号为】一3 的菌株的综合性能最佳。经鉴定1 3 菌抹是一株戊糖乳杆菌( p e n t o , s u m ) 。该菌的 生长温度为1 5 4 2 ，生长州为4 9 ：最遁生长温度3 7 ，最适生长p 为7 。 进行了1 3 活菌制剂防治仔猪腹泻的活体试验。以8 头健康长自母猪所产的9 0 头仔猪为试验材料，随机分组进行了腹泻预防试验，设空白为对照。研究结果为，1 3 活菌制剂预防组的腹泻率为8 5 1 ，对照组为7 8 5 7 ，差别极显著( p 蛋白胨( b ) 葡萄糖( d ) ；最佳配比为a 3 8 2 c 2 d 2 ，即0 9 牛肉膏、0 7 蛋白胨、0 0 5 吐温、1 葡萄糖，乳酸杆菌在组合培养基中经3 7 c 培养1 6 h ，活菌数达7 3 0 1 0 8 e f u m l 。 较0 3 牛肉膏、0 7 蛋白胨、0 1 吐温、1 0 葡萄糖，组成的培养基中活菌数提高了6 5 倍。 图1 可见，活菌数量与牛肉膏的添加量呈正比，考虑经济因素，选择添加0 9 为最佳； 葡萄糖、蛋白胨、吐温8 0 的最佳添加量分别为1 、0 7 、0 0 5 。 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 表3 乳酸杆菌菌及致病性大肠杆菌复合培养基筛选的l 9 ( 3 4 ) 正交实验结果 t a b l e2 t h el 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l t so f s e l e c t i n gc o m p l e x m e d i u m f o r l a b d e sc 矗p r | c h ac 口 实验号牛肉膏蛋白胨吐温葡萄糖! 塑! 堕 竺竺鱼1 1 6 h1 6 h 1 6 h 雌 靼 d 媾 2 2 0 0 1 4 0 0 1 0 0 0 0 图1 牛肉膏、蛋白胨、吐温、葡萄糖与乳酸菌关系示意图 f i g u r e l t h e r e l a t i o no f p r e p t o n ，b e e f e x t t a c t , t u w i na n d g l u c o s ew i t h t h e l i r e c e l lo f l a b 1 9 河北农业大学硕士学f 讧论文 3 1 3 最佳培养基中乳酸菌、大肠杆菌生长曲线的测定 将活化芟f = 的乳酸菌及大肠杆菌以2 ( 约i x l 0 6 c f u m 1 ) 接种于最优复合培养基中每4 h 取样检测活菌数。乳酸菌及大肠杆菌的生长曲线测定结果见图2 乳酸菌一大肠杆菌 0481 21 62 02 4 时间( h t ) 。警裟粼装慧嚣主嚣詈：轰蠹糕m m 图2 结果表明：乳酸菌及大肠杆菌在复合培养基中，起始0 4 h 内大肠杆菌、乳酸菌 处于延滞划：二二者在4 8 h 进入对数期，对数期大肠杆菌较乳酸菌繁殖速度快，在第8 小 时大肠杆菌达1 0 2 x 1 0 8 c f u m l ，乳酸菌达7 7 0 x l o t c f u m l ；在第1 2 h 大肠杆菌及活菌数达最 高，大肠杆菌活菌数最高达2 7 5 x 1 0 8 c f u m l ，乳酸苗活菌数最高达2 o g x l 0 8 c f u m l ：1 2 2 0 h 处于稳定期- 第2 0 h 大肠杆菌活菌数达16 2 1 0 8 c f u m l ，乳酸菌达1 0 2 x 1 0 8 c f u m l ；2 0 h 后 进入衰亡期。 由上述试验得到适合乳酸菌及大肠杆苗同时生长的培养基，可用于以致病性犬肠杆菌 为靶标的目的菌株的筛选。 3 2 目的菌株的分离与筛选 肌不同地点、不同品种、不同日龄的健康仔猪粪便中分离到乳酸菌1 2 8 株。纸片平板 法发现2 5 株对致病性大肠杆菌有抑制作用( 见表3 ) 。 2 0 5 8 5 7 5 6 b 7 6 一一0蛊=糕粗船 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 由表四可见，2 5 株乳酸菌对k 9 9 表现抑菌活性的1 4 株，经多次转代抑菌活性稳定的 共7 株，分别是：1 - 3 、1 - 6 、1 - 7 、1 - 9 、2 - 1 1 、2 - 3 、5 - 1 3 ，且表现出的抑菌活性最稳定，1 3 抑菌活性最强。对b 表现出抑菌活性的共2 0 株，经多次转代抑菌活性稳定的共1 1 株分 别是：1 - 1 、1 - 3 、1 - 6 、1 - 7 、1 - 8 、1 - 9 、2 3 、2 - 1 2 、5 - 8 、6 - 1 、6 - 2 ，其中1 - 3 、1 - 6 、1 - 7 、 1 - 9 、2 - 3 、2 - 1 2 、6 一l 、6 - 2 表现出较稳定的抑菌活性1 - 3 抑菌活性最强。对s 、k 9 9 均表 现出抑菌活性的共5 株菌，分别是：l 一3 、1 - 6 、1 - 7 、1 - 9 、2 - 3 。 袭4 不向乳酸筐对k mk 抑蘑直径( m m ) t a b l e4t h ee o r l t r o ld i a m e t e ro fk 8 8a n dk 9 9b ，l a bs t r a i n s 。墨坚一照 菌株2 一 123 123 1 11 1 01 0 1 01 6 1 51 1 1 21 5 01 21 0 1 61 61 0 1 32 6 02 52 5 2 01 8 1 8 1 61 3 01 31 3 1 8 1 51 5 1 7 1 7 01 41 4 1 7 1 61 4 1 81 4 51 01 0 1 61 5 1 1 1 91 5 01 41 4 1 61 51 5 1 - 1 21 2 01 01 01 0 1 01 0 2 1 11 3 51 21 2 1 01 01 0 2 - 32 0 01 81 8 1 51 51 4 4 - 1 31 3 01 21 0 1 01 01 0 5 21 3 5l o1 01 0 1 01 0 5 - 1 31 3 01 21 21 4 1 01 0 5 - 1 5 21 4 01 01 01 0 1 01 0 2 1 21 0 01 01 0 1 92 01 6 1 - 41 0 01 01 01 41 3 1 0 2 - 11 0 01 01 01 4 1 41 0 3 - 71 0 01 01 01 3 1 01 0 4 - 6 1 0 01 01 0 1 51 01 0 5 - 31 0 01 01 01 4 1 01 0 5 - 8 1 0 01 01 0 1 61 51 1 6 - 11 0 01 01 01 61 s 1 5 6 2 1 0 0 1 01 01 41 31 3 6 - 3 1 0 0 1 01 01 41 31 0 6 51 0 01 01 01 21 11 0 注1 表示传代】0 攻2 表示传代2 0 趺3 表示传代，o 次 由上结果可见，随着转代次数的增加，有些菌株的抑菌活性下降，表现出抑菌特性的 不稳定，可能是相关基因变异，或由于环境的改变影响了抑菌活性物质的代谢表达。部分 河北农业大学硕士学位论文 菌株的平板抑菌效果见图3 围3 部分菌株对致病性大肠杆菌抑制效果 f i g u r e 3t h ec o n t r o lo f ec o l ib yl a bs t r a i n s 3 3 待选菌株生物学特性比较 3 3 1 生长速率测定与比较 试验表明，液体m r s 培养基在6 2 0 r i m 处有最大吸光值，其吸光值与菌体浓度成正比， 本研究即利用这一波长，通过测定m r s 培养液的o d 值，间接测定菌体浓度。不同菌株的 o d 6 2 0 测定值见表5 表5 待选菌株于不同培养时问吸光值变化情况 t a b l e5o dv a l u e so fc a n d i d a t el a bs t r a i n sa td i f f e r e n ti n c u b a t i o nt i m e o 0 4 6 0 0 3 4 0 0 4 1 0 0 2 9 0 0 3 9 0 0 3 2 0 0 3 6 0 0 4 3 0 0 3 8 0 1 0 6 0 0 5 8 0 0 6 3 0 1 0 3 0 ，1 0 5 0 0 7 5 0 0 8 7 0 0 7 7 0 0 9 4 0 3 0 1 0 2 0 4 0 1 9 9 0 2 3 1 0 1 9 8 0 1 6 4 0 1 7 6 o 1 4 3 o 1 5 2 0 4 2 8 0 3 1 4 0 2 9 4 0 3 7 5 0 3 7 0 0 3 2 8 0 3 4 1 0 3 2 7 0 3 7 0 0 6 8 0 0 4 6 1 0 4 5 8 0 6 0 3 o 5 8 1 0 4 2 7 0 5 5 2 0 4 3 5 0 5 8 3 0 8 7 8 0 6 7 8 0 5 6 9 0 7 9 5 0 8 5 7 0 6 2 8 0 ，7 0 5 0 6 7 6 0 6 2 5 1 ：! ! ：! ! ：! ：! 竺! ：型! 翌! ! ：! ：! ：! 竺 比较可见i - 3 、1 - 9 、2 - 3 、2 - 1 2 、6 - 1 生长最快。5 株菌生长速率的直观比较见图4 由图4 可见，在起始的2 h 内5 株菌处于延滞期在第2 h 进入对数期；4 h 至6 h l - 3 的 ”m m似m 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 o d 值最大，剩余4 株菌o d 值相差不大：在第8 h l 一3 的增殖速度仍保持最快，6 - 1 增殖速度 最慢，其余3 株菌增殖速度基本相近。第1 0 h 1 3 的o d 值最高达0 8 7 8 ，其次为2 3 、1 - 9 、 2 1 2 、6 - 1 。综上所述，整体o d 值变化表明1 3 增殖速度最快其次为2 - 3 、1 - 9 、2 - 1 2 ， 增殖速度最慢的是6 - 1 。筛选生长速率快的菌株有利于在同样兼性厌氧条件内占据优势， 凭借足够数量的细菌以建立和维持生态平衡。 _ 1 3 o - 1 9 卜2 3 - - d k - - 2 1 2 o _ 6 1 对间( h t ) 圈4 特选菌株吸光值变化曲线 f i g u r e 4t h e o d r v e o f c a n d i d a t e l a bs w a i n sa t d t f f m a t t i m e 3 3 2 不同p h 条件下菌体存活或增殪比较 有资料报道：出生仔猪胃内的p h 值为5 ，随着乳酸菌的定殖p h 值逐渐下降，数小时 后p h 值降为3 4 左右，而后下降缓慢，5 周时为2 3 ，其后相对稳定1 s 9 , 7 5 1 。又有人认为， 仔猪胃内p h 值下降要缓慢的多，仔猪3 周龄前胃酸的分泌能力较弱，胃内d h 值仍为5 或5 以上i ”】。胃是消除病原微生物进入体内的第一道屏障，胃的酸性环境对进入体内的有 益微生物的活力会产生不利影响。本试验进行了待选菌株在p h 2 0 7 2 的存活或增值试验。 p h 值4 7 2 和p h 值2 3 的试验结果分别汇总于表6 和表7 。 由表6 可见，1 0 株乳酸菌接种于p h 4 的m r s 培养基中，4 h 后菌落计数。除1 7 外， 其余菌株存活率均在9 0 以上。p h 5 、p h 7 2 时1 - 3 、1 - 9 、2 - 1 1 、2 1 2 、5 - 1 3 、6 - 1 、6 - 2 都 有增殖现象，活菌数均达到了1 0 7 c f u m l 以上。 吣 们 叭 帅 叭 。 llon9o 翌j ! 堡些盔兰婴主主垡笙苎 表6 待选菌株在p h 4 7 2 m r s 培养基中活苗数的变化比较 t a b l e6l i v ee e l ! n u r l l b e l o fc a n d i d a t el a bs t r a i r l si np h 4 7 ，2m r s 1 - 32 1 5 x 1 0 62 7 1 x 1 0 66 5 0 x 1 0 64 5 0 x 1 0 72 0 4 x l o 5 1 3 x 1 0 8 2 - 31 6 0 x 1 0 61 7 6 x 1 0 61 3 7 x 1 0 62 , 5 l x l 0 71 5 2 x 1 0 61 7 5 x 1 0 8 1 - 63 8 1 x 1 0 63 5 0 x 1 0 6 3 8 8 x 1 0 61 ，0 1 x 1 0 74 ，2 0 x l o 2 5 3 x 1 0 7 1 73 1 9 x 1 0 59 6 0 x 1 0 55 2 8 x 1 0 66 8 0 x 1 0 63 0 8 1 0 5 3 6 1 x 1 0 7 1 - 918 2 x 1 0 61 5 2 1 0 63 1 7 x 1 0 61 4 7 x 1 0 72 0 1 x 1 0 1 4 5 x 1 0 8 2 - 1 l1 3 8 x l 驴2 9 8 x 1 0 62 5 2 x 1 0 6 1 2 8 x 1 0 71 ，4 4 x 0 61 0 2 x 1 0 8 2 1 22 4 5 x 1 0 6 1 9 2 x 1 0 61 3 1 x 1 0 62 9 0 x 1 0 73 1 4 x 1 0 61 3 1 x 1 0 8 5 1 31 6 5 x 1 0 61 9 3 x 1 0 62 1 0 x 1 0 61 1 l x l 0 71 7 8 x l 驴9 8 0 x 1 0 8 6 - 11 2 1 1 0 61 2 9 x 1 0 63 3 4 1 0 61 5 6 x 1 0 71 ，3 8 1 0 6 1 2 8 x 1 0 a 6 - 27 8 0 x l 旷6 1 1 x 1 0 6 1 2 6 x 1 0 65 2 0 x 1 0 78 ，0 0 x 1 0 66 9 0 x 1 0 8 在p h 2 3 环境中的存活率见表7 衰7 待选茁株在p h 2 3 m r s 培养基中活酋数的变化比较 t a b l e7l i v ec e l ll l u m b e to fc a n d i d a t el a bs t r a i n si np h 2 3m r s p h 值 菌株2 03 0 o h4 h存活率( )0 h4 h存活率( ) 1 - 3 1 2 5 x 1 0 61 9 8 1 0 5 1 5 8 1 1 2 x l o 7 3 0 1 0 5 6 5 2 2 - 3 2 3 2 x 1 0 61 6 1 x 1 0 5 6 9 1 4 6 x 1 0 6 2 1 8 h 1 0 5 1 4 9 1 - 6 2 8 1 x 1 0 6l0 2 x 1 0 3 3 6 3 2 2 1 0 63 8 0 x 1 0 5 1 1 8 1 7 4 6 0 h 1 0 63 2 9 x 1 0 5 7 0 4 8 d x l 0 68 8 3 x 1 0 5 1 8 3 1 - 9 1 5 1 x l o 7i ) o x l o 4 6】5 7 x 1 0 62 2 9 x lo ， 1 4 6 2 1 1 5o x l 0 64 0 1 x 1 0 5 8 0 6 8 x 1 0 638 4 x 1 0 5 5 6 5 2 1 2 2 3 0 x 1 0 6l3 7 x 1 0 5 5 9 2 4 8 x 1 0 1 8 5 x 1 0 6 5 3 2 5 1 3 5 0 1 x 1 0 629 4 x 1 0 5 5 8 l2 5 x 1 0 65 9 t ) 1 0 5 4 7 2 6 1 1 3 4 x 1 0 688 0 x 1 0 56 5 71 4 8 1 ( 1 6l4 0 x 1 0 6 9 4 6 6 2 & l o x l o 1 6 2 x 1 0 52 05 6 0 x 1 ( 1 63 8 1 x 1 0 5 6 8 表7 结果表明，p h 2 处理4 h ，6 - 1 的存活率最高达6 5 7 。其次为1 - 3 ，存活率为1 5 8 ， 2 1 1 的存活率8 ，6 - 2 的存活率晟低2 0 。说明在p h 值2 的酸性环境，对每个菌株都有 一定的抑制作用。p h 3 处理4 h ，6 - 1 的存活率达9 4 6 ，1 - 3 的存活率为6 5 2 ，2 - 1 1 的存活 率5 6 5 ，可见6 - 1 、1 - 3 和2 1 1 菌株的耐酸性最好。 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 3 3 3 耐胆盐特性比较 小肠内胆盐浓度是影响菌株存活的重要因素。本试验对菌株耐胆盐能力进行研究，筛 选出胆盐耐受力强的菌株。不同乳酸菌的胆盐耐受力试验结果见表8 表8 待选菌株在不同浓度胆盐m r s 培养基中活稿数的变化 t a b l e8 “v pc e l ln u m b e ro fl a bs t r a i n si nm r sw i t hd i f f e r e n tb i l es a l tc o n e e n t r a t i o n 表8 结果可见，胆盐浓度0 2 ，3 7 c 恒温培养1 2 h 后，2 1 l 活菌数最高为 1 o l x l 0 9 c f u m l ，其次为6 - 1 、2 - 1 2 ，5 - 1 3 活菌数最低为8 7 1 0 4c f u m l ，其余菌株活菌数 量级均达到了1 0 7 c f u m l 。胆盐浓度0 4 时，2 1 1 、2 1 2 仍能繁殖，活菌数达到了1 0 8 c f u m l ， 其余菌株繁殖能力明显受到抑制，1 - 7 、5 1 3 活菌数最低。胆盐浓度0 6 时，2 1 1 、2 1 2 、 6 - 1 存活能力最强，其次为1 3 、2 - 3 、1 - 6 、1 - 9 、6 - 2 ，与0 4 水平比较，存活率明显下降： 1 7 、5 1 3 己检测不到活菌。在胆盐浓度0 8 时，2 1 l 、2 1 2 、6 - 1 仍表现出较强的耐胆盐 能力，1 3 、6 - 2 可检测到活菌，但数量较少，其它菌株已检测不到活菌。在腮盐浓度1 0 仅2 1 1 、2 1 2 、6 1 存活且能繁殖，6 2 存活率明显下降。在魍盐浓度1 - 2 至1 4 时2 1 1 、 2 1 2 存活且能繁殖，6 - 1 可耐受该胆盐浓度。综上可知，2 1 2 、2 1 1 菌株的耐胆盐能力晟 强，其次为6 - 1 、6 - 2 、1 - 3 。对胆汁的敏感性是筛选益生素菌株重要指标，美国a l t e c h 生物 技术中心规定，用于益生素的细菌对胆盐应有o 7 以上的抵抗力【7 7 j 。本试验，能耐受胆盐 浓度0 7 以上的菌株为2 - 1 2 、2 1 1 、6 - 1 、6 - 2 和1 - 3 。 3 3 4 不同温度处理菌体存活特性比较 温度是影响菌体存活的主要因素之一。为了验证不同乳酸菌对温度的敏感性，本试验 选取最大含菌量培养液，调培养液的p h 值6 0 8 0 ，以排除环境p h 值的影响。不同乳酸 翌! ! 坚些查兰堕主堂竺笙苎 菌在不同培养温度存活试验结果见表9 。 表9 温度对待选菌株存活的影响 t a b l e9t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r eo nt h es u r v i v a lo fc a n d i d a t el a bs t r a i n s 1 32 0 72 0 19 71 9 8 x 1 0 9 5 67 7 x 1 0 53 8 30 1 63 1 52 8 79 19 7 0 x 1 0 “3 0 7 98 3 x 1 0 50 0 30 i 72 1 82 0 19 2 21 6 6 x 1 0 。0 7 6000 1 94 2 03 9 29 3310 1 x 1 0 42 41 8 8 x 1 0 00 0 40 2 31 6 11 5 29 42 7 1 x 1 0 61 7 1000 2 1 16 5 04 1 56 3 81 ，0 2 x 1 0 61 ，6000 2 1 28 1 05 9 87 3 82 4 5 x 1 0 。3 0000 5 1 32 5 72 2 3 8 6 89 2 0 x 1 0 63 5 8000 6 - 19 7 08 99 1 ，78 5 0 x 1 0 9 8 6 6 21 4 6 x 1 0 91 5 51 5 9 x 1 0 4 6 - 21 7 71 6 39 21 4 8 x 1 0 98 3 62 1 8 x 1 0 81 2 36 6 x 1 0 4 耐性较好乳酸菌菌株在不同温度下活菌数变化见图5 1 2 0 1 0 0 8 0 s 粪6 0 悻4 0 2 0 o l 一31 61 96 16 2 菌株 图5 待进菌株在不同温度下活菌数变化情况 t a b l e5 t h e 鲫d v a i m t e o f c a n d i d a t e i a bs t r a i n s a td i f i e f e e t t e m p r e t u r e 由表9 结果可知，处理前1 - 6 、1 - 9 、2 - 1 1 、2 1 2 、6 2 、1 - 3 、1 - 7 、2 - 3 、5 - 1 3 、6 1 活菌数 数量级为1 0 9 ，4 5 c 处理3 0 m i n 后，1 3 、1 - 6 、1 - 7 、1 - 9 、6 - 1 、6 - 2 存活率均在9 0 以上，1 7 、 2 3 、5 1 3 稍差，2 1 1 最差，存活率仅为6 3 8 ；5 0 处理3 0 m i n 后，1 3 、6 - 1 、6 - 2 存活率 2 6 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 在6 0 以上；5 5 处理3 0 m i n 后仅1 - 3 、6 - 1 、6 - 2 活菌数数量级达1 0 7 c f u m l 以上：在6 0 c 处 理3 0 m i n 后，仅6 - 1 、6 - 2 能检测到活菌。 由图5 可知，随着温度的升高，活菌数量均下降，但以1 3 、6 - 1 、6 - 2 的耐受性最好，1 6 和1 9 最差，5 0 c 处理，两菌都没有活菌检出。 3 3 5 小结 为便于比较，对上述生物学特性试验结果汇总丁表1 0 。 表1 0 待选菌株生斗身学特性比较 t a b l e1 0 c o m p a r i s o no fb i o n o m i e so fc a n d i d a t el a b s t r a i n s 指标 菌株 抑菌活性 生长速率 耐酸特性 耐胆盐特性 温度敏感性 1 3 、2 1 2 、l - 6 、1 - 7 、1 8 、6 ，1 1 - 3 、2 - 3 、1 - 9 、2 1 2 、6 ，1 6 - 1 、1 3 、2 - 1 1 2 - 1 2 、2 儿、6 1 、6 2 、1 3 1 - 3 、6 - 1 、6 2 、1 6 、1 9 比较表1 0 结果除耐胆盐特性外，1 - 3 菌株的表现最为突出，特选定1 3 为本研究的 最终目的菌株。 3 4 目的菌株最适生长温度和p h 值测定 3 4 1 最适生长温度测定 将1 - 3 菌株以2 ( 约l x l 0 6 c f u m l ) 接种量接种于m r s 液体培养基中，分别在3 2 、 3 7 、4 1 恒温培养2 4 h ，期间每隔4 h 取样，检测活菌数。结果见图6 。 图6 表明，1 3 菌株接种于m r s 液体培养基中，3 2 c 恒温培养，于第4 h 进入对数期， 对数期菌体生长速率较缓慢，第2 0 h 菌数达到最高，为4 9 0 x l o s c f u m l ；3 7 c 恒温培养于 第4 h 进入对数期，第1 6 h 菌数运到最高，为2 1 0 x 1 0 9 c f u m l ，之后进入稳定期；4 2 c 恒温 培养于第4 h 进入对数期，对数期菌体生长速率较快，第1 2 h 菌数达到最高，为 2 1 4 x 1 0 9 c f u m l ，之后进入稳定期。 河北农业大学硕士学位论文 鲁 苫 量 v 鞋 粗 蝉 _ 3 2 培养时间( h t ) 图61 - 3 菌株在不同培养温度下生长曲线 f i g u r e 6 t h e g r o w t hc u r v eo f t h e l - 3s t r a i na td i f f e r e n t t e m p r a t u r e 上述试验表明，1 3 菌株的最佳培养温度范围为3 7 c 4 1 ，在这一温度范围内在对数 末期活菌数最可达到1 0 9 c f u m l 。 3 4 2 最适p h 值的测定 测定了1 - 3 菌株在起始p h 4 9 的生长曲线( 图7 ) 。起始p h 4 时，自始至终活菌数变 化不明显，说明p h 4 环境中，菌体不能繁殖；起始p h 5 时，菌株生长延滞期很短很快进 入对数生长期，在2 h 1 0 h 时生长速率最快，随后进入稳定期，1 0 h 活菌数达到最高值为 5 1 2 x 1 0 8 c f u m l ，随后菌数开始下降。起始p h 6 时，延滞期稍长，4 h 后很快进入对数生长 期，1 2 h 活菌数达到晟高值为8 3 2 x 1 0 8 c f u m l ，随后进入稳定期。起始p h 7 时，菌株生长延 滞期稍长，4 h 后进入对数生长期，1 2 h 活菌数达到最高值为3 。2 3 x 1 0 9 c f u m l 。起始p h 8 和 p h 9 时延滞期较长，4 h 后进入对数生长期，1 4 h 活菌数达到最高值，分别为2 1 5 x 1 0 9 c f u m l 和1 4 1 1 0 9 c f u m ! 。 比较上述结果可知，当起始p h 值为7 时，最终活茁量蜃高，其它都较低，说明该菌 株的最适生长p h 值为7 。 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 ： 墨 己 岳 0 翱 翘 楚 十p h 4 + p h 5 + p h 6 + p h 7 + p h 8 小p h 9 匿7 卜3 毽株在不同起始p i 值的m r s 培养基中生长盏蟪 f i g u r e 7 t h eg r o w t hc u r v eo f1 - 3s t r a i ni nm r s w i t hd i f f e r e n ti n i t i a lp hv a l u e 3 5 卜3 菌株对抗生素敏感性实验 1 8 菌株是否携带耐药质粒，是环境释放安全与否的重要指标之一，本试验选取了9 种常 用抗生素，采用平扳纸片法，测定了1 3 菌株对抗生素的敏感性。 襄1 11 - 3 菌株对抗生素敏感性试验螭果 t a b l e1 1 s e n s i t i v i t yo f1 - 3s t r a i no na n t i b i o t i c s s 表示高度敏感l 衰示低度敏感，r 表示耐药 表1 1 结果表明1 - 3 对不同抗生素的耐受性有较大差异。对土霉素、链霉素表现出耐受性； 对青霉素、卡那霉素、先锋霉素、环丙沙星表现为低度敏感：对庆大霉素、痢特灵、氯霉素表性 出高度敏感。1 - 3 仅对两种抗生素表现出耐受性，说明菌株安全性较好。 河北农业大学硕士学位论文 3 61 - 3 菌株生理生化特性研究 3 6 1 菌体形态及菌落形态 菌体形态见图8 细胞形态：直杆状，两端钝圆，菌体光滑，单个或成对排列，少数成链状；菌体宽度 0 7 i j t m ，长2 o 胁t 。 菌落形态：在固体m r s 培养基培养2 4 h ，培养基内菌落铁饼状培养基表面菌落圆形， 凸起，边缘接齐，光滑，乳白色，不透明，直径l 2 m m 。 3 6 2 乳酸分析 圈81 - 3 菌株菌体形态图 f i g u r e 8t h ec e l ls h a p eo f1 - 3s t r a i n 采用纸层析法对发酵液进行了乳酸定性比较，以乳酸溶液作为标准试荆。结果见表1 2 表1 2 乳酸与发酵液纸层析的r f 值 t a b l e1 1r fv a l u eo fp a p e rc h r o m a t o g r a p h yo fl a c t i ca c i da n df e r m e n t e dm r s 层析样 r f 值 乳酸 发酵液1 发酵液2 发酵渡3 - k 0 6 8 0 6 7 0 6 8 0 6 8 为i 3 不同批改的发醉漓 由表1 2 可知纯乳酸的r f 值为0 6 8 ，不同批次1 - 3 发酵液的r f 值均等于或接近0 6 8 说明1 3 代谢产生的酸性物质是乳酸。 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 3 6 3 生理生化特性 经测定，1 3 菌株革兰氏染色阳性，接触酶阴性，引哚阴性，不液化明胶，不水解七 时灵，1 5 c 5 0 c 生长，6 0 不生长。 糖醇发酵测定结果见表1 3 表1 31 - 3 菌株糖醇发酵实验结果 t a b l e1 3t h er e s u l t so f1 - 3s t r a i nf e r m e n t a t i n gs u g a ra n ds u g a r y 糖或醇糖结果 糖或醇糖结果 备注：+ 表葫株为阳性 根据糖醇发酵结果，与伯杰氏细菌鉴定手册比较，确定1 3 菌株为戊糖乳杆菡 ( l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u m ) 3 7 活体试验 在石家庄市元氏县李志军猪厂，选定生产性能基本相似，分娩日期相同或相近的8 头 健康长白杂交母猪，所产的9 0 头仔猪进行试验。时间为2 0 0 4 年5 月2 6 日7 月2 6 日。 3 7 1 预防效果 从表1 4 可见，对照组的4 3 头仔猪共出现腹泻3 3 头，发病率为7 8 5 7 ：试验组的4 7 头仔猪，共出现腹泻4 头，发病率仅为8 5 1 。试验中发现，采用乳酸菌预防处理的仔猪 箍体状态明显优于对照组，表现为精神状态好，时常嬉戏打闹，粪便成型，皮毛光滑， 3 1 河北农业大学硕士学位论文 即使个别出现腹泻情况，连续灌服乳酸菌制剂两天( 1 次天) 即可痊愈，而对照腹泻仔 猪，需连续灌服4 天以上才能见效。 襄1 4 乳酸蔺预防仔猪腹泻效果 t a b l e1 4t h er e s u l so fl a l ，p r e v e n tp i g l e t sd i a r r h o e a 汽：升子为腹泻孔技， 母为试验又觳 3 7 2 治疗效果 1 - 3 制剂对仔猪腹泻的治疗效果见袁1 5 。用1 3 制剂治疗组的平均疗程为5 d ，治愈率 7 6 4 7 ，总有效率达1 0 0 。庆大霉素治疗组平均疗程6 d ，治愈率3 1 2 5 。有效率6 2 5 ， 无效率6 2 5 ，总有效率为9 3 7 5 。 寰1 51 - 3 制抒j 聂药物治疗仔猿搜泻的效果( 对照组) t a b l e1 5t h et r e a t m e o tr e s u l t so f1 - 3 a n dd r u g g e r yo nd i a r r h o e ap i g l e t s 本试验采用乳酸菌制剂预防和治疗仔猪腹泻都达到了较为理想的效果，证明用乳酸菌 制荆代替抗生素防治仔猪腹泻是可行的。研究表明，仔猪出生时，肠道是无菌的，出生2 h 后，可在粪便中检测出大肠杆菌和链球菌，乳酸杆菌出现较慢，出生4 8 h 后构成优势菌群， 正常条件卜_ 以乳酸菌占优势的肠道微生物区系有助于维持肠道健康【9 】。所以，仔猪出生灌 服乳酸菌，使乳酸菌很快在仔猪肠道内定殖，与肠粘膜上皮紧密结合形成生物屏障，产生 有机酸、降低肠道p h 值及氧化还原电位抑制有害菌的侵入。从而达到预防腹泻的目的。 3 81 - 3 菌株抑菌机理探讨 3 8 1 非酸性抑菌物质的判断 乳酸菌产生的抑菌物质包括乳酸、细菌素及其它物质，为确定是否有非酸性抑菌物质 的产生，进行了培养滤液与乳酸调制溶液的比较试验。图9 可以看出，与乳酸调制溶液的 3 2 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 对照相比，过滤液的抑菌活性分别比对照提高3 2 5 8 、4 3 2 4 。由此可知，1 - 3 除产生乳 酸等抑菌物质外，还可能产生具有抑菌作用的细苗素。 图1 0 是相同p h 的m r s 与1 - 3 发酵过滤液的抑菌结果照片 艚 致病性大腑杆菌 神 圈9 相同p h 值姗s 乳酸调配液与卜3 旋酵液抑菌活性的比较 f i g u r e 9 t h e c o m p a r i g a u o f e c o l ic o n t r o le f f e o l y b y l a c t i c a c i d w i t h t h a t b y 1 3f e r m e r i t e dm r s 圈1 0 乳酸调制m r s 与发酵过滤液抑蕾活性试验 f i g u r e l 0ec o l ic o m t o lb yl a c t i ca c i da n d1 - 3f e r m e n t e dm r s 3 8 2 不同培养时间抑菌活性的比较 分别测定不同培养时间发酵过滤液的抑菌活性，结果见图1 1 及图1 2 苗i)啦埘瞳钿章 河北农业大学硕士学位论文 2 0 旦1 5 鞲 删 匾 粗l o 章 5 1 ( 8 8 致病性大肠杆菌 9 9 9 图l ll 一3 菌株不同培养时阃发酵液滤液对k 8 8 及k 9 9 抑菌效皋 f i g u r e l lt h e e 枷o o n l r o le f f e c ! o f t i l t e d l i q u i to f l - 3f e r r m m t e d m r sa td i f f e r e n tc u l t i v a t i n gt i m e 1 - 3 菌株的生长曲线见图1 2 看 j 星 v 赫 翘 蜉 1 0 培养时间( h t ) 图1 2 卜3 在蠊s 渣体培养基叶1 活苗数变化曲线 f i g u r e l 2t h eg r o w t hc u r v eo f1 - 3s t r a i ni nm r s 由图1 1 、图1 2 可知，随培养时间延长，菌体数量增多，发酵过滤液抑菌活性逐渐增 强，于1 8 h 小时抑菌活性达到高峰，此时，1 3 处于稳定期，随后抑菌活性开始下降，于 3 4 仔猪肠道益生菌的分离筛选及生物学特性研究 2 4 h 后趋于稳定。在稳定期的抑菌活性高于稳定初期和对数末期。表明，在对数期，菌体 以细胞增殖为主，产生抑菌物质较少，判了稳定期才大量产生抑菌物质，说明1 3 菌株的 抑菌物质是一种次级代谢产物。 3 8 3 抑菌物质热稳定性试验 以3 74 c 作为对照，分别测定发酵过滤液在7 0 。c 、1 0 0 ( 2 、1 2 1 处理2 0 分钟后的抑菌 活性， 表1 61 - 3 菌株所产抑菌物质热稳定性试验结果 t a b l e l 6t h eh e a ts t a b i l i t yo f1 - 3s t r a i nm e t a b o l a t e 售 v 靶 删 匿 酒 曩 k 8 8 致病性大肠杆菌聃9 图1 3 温度对1 3 菌株抑菌物质于抑菌活性的影响 f i g u r e l 3t h ee f f e c to ft e m p r a t u r eo nt h ea n t i b i oa c f i v e r t yo f1 - 3m a t a b o l a t e 由表1 6 及图1 3 可知，3 7 c 时的抑菌圈直径为2 2 r a m ，经7 0 c 、1 0 0 ( 2 、1 2 1 ( 2 处理2 0 r a i n 后对k s 8 、岛9 抑菌圈直径分别为2 1 r a m 、1 9 r a m ，1 9 r a m 、1 7 r a m 和1 9 r a m 、1 7 r a m ，其活性 分别降低0 4 5 、5 ，1 3 6 、1 5 和1 3 6 、1 5 ，表明经7 0 处理活性降低不明显；经 1 0 0 4 c 处理活性降低较明显。7 0 c 保持2 0 r a i n 是巴斯德灭菌温度，可杀死无芽孢的细菌； 河北农业大学硕士学位论文 在1 0 0 保持2 0 r a i n 是煮沸消毒法；在1 2 1 保持2 0 r a i n 是微生物和医学上常用的灭菌温 度。说明1 3 所产的部分抑菌物质对热稳定。资料报道1 7 8 ，7 9 t ”，“8 2 8 3 8 ”，根据细菌素对热 的敏感程度，可分为两大类，一种为热变性大分子蛋白，这种细菌素由于分子量较大，一 般大于3 7 k d a ，含有夫于3 3 4 个氨基酸残基，因而容易受热的影响改变其三维空间结构， 最终导致失活，在一般条件下其失活条件为6 0 1 0 0 c 作用1 0 m i n 1 5 m i n ，另一类为热 稳定性疏水小肽，根据耐热程度不同分为两类，第一类分子量在6 3 k d a 1 3 k d a ，可以经受 1 0 0 3 0 r a i n ；第二类分子量小于6 3 6 3 k d a ，氨基酸残基数小于5 7 ，可以经受1 2 1 1 5 m i n 不失活。本试验所获得郝分细菌素可经受1 2 1 * c 2 0 m i n 而不失活，说明他们可归于热稳定 性疏水小肽类中的第二类。但尚需作进一步研究。 3 9 廉价增殖培养基的筛选 获得适于乳酸蔼大量增殖的廉价培养基是实施产业化开发的基础，为此本试验针对乳 酸菌对营养要求的特点，从供应期较长、能形成批量的蔬菜中进行了筛选。以获得的候选 材料为基础培养基，再行筛选增效因子，最终获得增殖培养基。 3 9 1 基础培养基的选择 经查阅资料，结合微生物工程研究室的研究经验，选择胡萝h 汁和番茄汁为待选基础 培养基。以m r s 液体培养基为对照培养基，进行了培养试验。菌体增殖和液体p h 值的变 化见图1 4 、图1 5 。 1 0 9 5 9 8 5 兽 s 巅 絮7 5 7 6 5 6 + m r s - o - - 番茄汁+ 胡萝卜汁 02468 1 01 21 41 6 1 8 时间( h t ) 圈1 4 卜3 菌株在不同基础培养基中的生长曲线 f i g u r e l 4 t h e g r o w t h 。u r v e o f1 - 3s t r a i n i nd i f f e r e n t m e d i u m 仔猪肠道益生菌的分离筛