（农产品加工及贮藏工程专业论文）姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究.pdf

摘要 姬松茸( a g a r i c u sb l a z e im u r r i l l ) 属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、 蘑菇属，是一种珍稀的食药兼用菌。姬松茸具有丰富的营养价值以及特殊的药用 保健功效。本项目研究了姬松茸酚类物质的提取工艺，研究姬松茸酚类物质的抗 氧化能力及其抑菌活性；并且通过高效液相法对姬松茸酚类物质有效成分进行化 学成分分析。研究成果为开发利用姬松茸酚类物质提供了理论依据。 ( 1 ) 以姬松茸干品为原料，研究溶剂提取姬松茸酚的最佳工艺。分别以水 和乙醇为提取溶剂，考虑不同因素对提取效率的影响，如溶剂浓度、浸提温度、 料液比、浸提时间和浸提次数等；并在单因素实验的基础上进行正交实验，对提 取工艺进行了优化。试验结果表明，水提法提取姬松茸酚类物质的最佳工艺参数 为：以1 ：3 0 的料液比，在9 0 水浴中浸提3 次，每次处理3 小时，姬松茸酚提 取率为1 5 8 4 ；醇提法提取姬松茸酚类物质的最佳工艺参数为：8 0 的乙醇一 水混合溶液以1 ：2 5 的料液比，在6 0 水浴中浸提3 次，每次处理2 小时，姬松 茸酚提取率为2 1 3 8 。乙醇法提取率较水提法提取率高出3 5 。组织定位实验 结果表明，姬松茸菌伞部位酚含量较菌柄部位酚含量高出3 6 。此外，研究了超 声波强化提取对姬松茸酚提取率的影响以及微波在姬松茸酚提取中的应用，结果 显示超声波能够提高姬松茸酚的水提取得率。 ( 2 ) 采用超临界c 0 2 流体萃取技术，研究超临界萃取姬松茸酚的最佳工艺。 对影响超临界c 0 2 萃取酚类物质的各种因素进行了单因素试验研究，并优选指 标进行正交试验研究，得到较适宜的萃取工艺条件为：夹带剂为6 0 乙醇，萃取 温度7 5 、萃取压力4 0 m p a 、c 0 2 流量为2 0 l h 、夹带剂用量1 2 0 m l 。然后再进 行了动态萃取与静态萃取的比较，得出先静态萃取1 h 后再动态萃取1 h ，萃取率 最高，酚类物质的得率达2 4 3 1 。超临界流体c 0 2 萃取较优化后的乙醇浸提法 姬松茸酚得率高出1 4 ，且夹带剂用量少，萃取时间短，萃取效率高。 ( 3 ) 以茶多酚为对照，采用f e n t o n 反应研究姬松茸酚对o h 的清除作用； 采用邻苯三酚自氧化法研究姬松茸酚对0 2 的清除作用。结果显示：在试验浓 度范围内，姬松茸酚对o h 自由基和0 2 自由基具有一定的清除能力；在浓度 相同的情况下，姬松茸酚对0 2 自由基的清除能力比对照组茶多酚强，但对o h 的清除能力却比茶多酚弱。同时，对姬松茸酚抗油脂自动氧化的能力进行初步研 究，结果显示，姬松茸酚具有一定的抗油脂氧化活性。 ( 4 ) 以茶多酚为对照，研究了姬松茸酚的抑菌作用。结果表明：姬松茸酚 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌种均有抑制作用，但对试验 用的绿木霉和黑霉两种真菌抑制作用不明显。在一定温度内处理不影响姬松茸酚 的抑菌活性。姬松茸酚对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为6 m g m l ，对大肠杆 菌的最低抑菌浓度为3 m g m l ，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为4 m g m l 。 ( 5 ) 利用高效液相法对姬松茸酚有效成分进行化学成分分析，在色谱条件 为柱温3 0 ；反相c 1 8 柱；运行1 3 0 m i n ；流速l m l m i n ；检测波长2 6 0 n t o 下， 进行甲醇一水变梯度洗脱；可较好地分析姬松茸酚类物质中的各成分，并从中分 离出绿原酸。 关键词：姬松茸；酚；提取工艺；超临界c 0 2 萃取；抗氧化；抑茵；高效 液相 a b s t r a c t a g a r i c u sb l a z e im u r r i l l ( h b m ) b e l o n g st ob a s i d i o m y c o t i n a , h y m e n o m y c e t e s ， a g a r i c a l e s ，a g a r i c a c e a e ，a n da g a r i c e a c e a b mi sa k i n do f p r e c i o u sf u n g u su s e df o r f o o da n dm e d i c i n e ，w h i c hh a sr i c hn u t r i t i o na n ds p e c i a lh e a l t hv a l u e e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y ，t h e a n t i o x i d a n t i v ee f f e c ta n dt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fa b m p o l y p h e n o l sw e r es t u d i e di n t h i sp a p e r a n dt h e nt h ea c t i v ec o m p o n e n t so fa b m p o l y p h e n o l sw e r ea n a l y z e db yw a t e r s 2 6 9 5h p l c t h e r e f o r e ，a l li m p o r t a n t r e c o m m e d a t i o nf o rd e v e l o p i n gd e e p - p r o c e s s i n gp r o d u c t so fa b m p o l y p h e n o l sw e r e o f f e r e d ( 1 ) a ne x t r a c t i o np r o c e s so fp o l y p h e n o lf r o md r i e da b m w a ss t u d i e di n t h i s p a p e r w a t e ra n de t h a n o lw a su s e da st h es o l v e n t sa n dt h em a t e r i a ls t u d i e dc o n s i s t e d o fd r i e da b m d i f f e r e n tf a c t o r sw e r ec o n s i d e r e d ，s u c ha st h ec o n c e n t r a t i o no fs o l v e n t ， e x t r a c tt e m p e r a t u r e ，m a t e r i a l - w a t e rr a t i o ，e x t r a c tt i m e ，a n df r e q u e n c y a n do r t h o g o n a l t e s t sw e r ea l s od o n eb a s e do nt h es i n g l ef a c t o rt e s t s i tw a si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i o n a l c o n d i t i o n sf o ro r g a n i cr e a g e n t sw a t e re x t r a c t i o nw a s ：t h es o l i d l i q u i dr a t i ow a s1 ：3 0 ， e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r ew a s9 0 c ，e x t r a c t i n gt i m e3h o u r sa n dt h ef r e q u e n c yw a s3 t i m e s ，t h ee x t r a c t i o nr a t ec o u l dr e a c ht oi 5 8 4 a n dt h eo p t i o n a lc o n d i t i o n sf o r o r g a n i cr e a g e n t se t h a n o le x t r a c t i o nw e r e ：8 0 e t h a n o ls o l v e n tw a su s e dt o e x t r a c t p o l y p h e n o l sf r o mt h ed r i e da b mb y1 ：2 5u n d e r6 0 ct h r e et i m e sa n d2h o u r sf o r e a c ht i m e ，t h ee x t r a c t i o nr a t ec o u l d r e a c ht o2 138 c o m p a r e dt ot h ew a t e r e x t r a c t i o nr a t e ，t h ee t h a n o le x t r a c t i o nr a t ea b o v et h em e t h o do f3 5 i tw a si n d i c a t e d t h a tt h ea b m p o l y p h e n o l sc o n t e n t e di nt h ep o s i t i o no fh u tw a s3 6 m o r et h a ni t c o n t e n t e di nt h es t i p e i na d d i t i o n , u l t r a s o n i ca n dm i c r o w a v eo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo f a b m p o l y p h e n o l sw e r es t u d i e d , t h er e s u l ts h o w e du l t r a s o n i cc o u l di m p r o v et h e e x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h e n o l s ( 2 ) t h ee x t r a c t i o na n di s o l a t i o nc o n d i t i o n so fa b mp o l y p h e n o l sb ys u p e r c r i t i c a l c 0 2p r o c e s sw e r es t u d i e di nt h i se x p e r i m e n t i n f l u e n c e so fi n d e x sw h i c hw e r ea b o u t e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ，e x t r a c t i o np r e s s u r e ，e x t r a c t i o nt i m ew e r ei n v e s t i g a t e d ，a n d s u i t a b l ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db a s e do nt h es i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t a lt e s t s t h eb e s t e x t r a c t i o nt e c h n o l o g yw e r e ：6 0 e t h a n o l ，e x t r a c t i o n m t e m p e r a t u r e7 5 ，e x t r a c t i o np r e s s u r e4 0m p a , c 0 2c u r r e n tc a p a c i t y2 0 l h ，t h e a m o u n to fe n t r a i n e r12 0 m l a n dt h e nc o m p a r e d 、祈t 1 1s t a t i cs t a t ee x t r a c t i o na n d d y n a m i ce x t r a c t i o n , s t a t i cs t a t ee x t r a c t i o n1h o u r ，a n dt h e nd y n a m i ce x t r a c t i o n1h o u r w a sb e s t ，t h ee x t r a c t i o nr a t ec o u l dr e a c ht o2 4 31 ( 3 ) t h ee f f e c to ns c a v e n g i n g o ha n d 0 2 o fa b mp o l y p h e n o l sw e r es t u d i e d b yf e n t o nr e a c t i o na n dp y r o g a l l o la u t o x i d a t i o nm e t h o dr e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r e c o m p a r e d 、加mt h e e f f e c to ft e ap o l y p h e n o l s t h er e s u l ts h o w e dt h a ta b m p o l y p h e n o l sc o u l de f f e c t i v e l ys c a v e n g eo ha n d0 2 。i nt h ee x p e r i m e n t a lr a n g e ，a n d t h ea b m p o l y p h e n o l sh a ds t r o n g e rs c a v e n g i n ga b i l i t yo n 0 2 a n dl o w e ra b i l i t yo n o hc o m p a r e dw i t l lt e a p o l y p h e n o l s i na d d i t i o n ，t h ea n t i - o x i d a t i o no fa b m p o l y p h e n o l sw a ss t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ta b mp o l y p h e n o l sw e r ee f f e c t i v ei n l e n g t h e n i n gt h eo i lt og u a r a n t e et h eq u a l i t y ( 4 ) t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fa b mp o l y p h e n o l sw a ss t u d i e d ，w h i c hw a s c o m p a r e d 、砘mt h ee f f e c to ft e ap o l y p h e n o l s i ts h o w e dt h a ta b mp o l y p h e n o l sh a da s i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s , e s c h e r i c h i a c o l i , a n db a c i l l u ss u b t i l i s b u ta b mp o l y p h e n o l sh a dn oa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s t t r i c h o d e n n av i r i d ea n ds t a c h y b o t r y sc h a r t a r u m m e a n w h i l e ，t e m p e r a t u r ec h a n g i n g c o u l dn o ta f f e c tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fa b m p o l y p h e n o l sw i t h i nl i m i t s ，a n d a n t i b a c t e r i a le f f e c tw a sn o to b v i o u sd i f f e r e n ta f t e rc h a n g i n gp hv a l u e i na d d i t i o n , t h e m i cf o rt h r e ek i n d so fb a c t e r i aw e r er e s p e c t i v e l ya sf o l l o w ：s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s , 6 m g m l ；e s c h e r i c h i ac o i l3 m g m la n db a c i l l u ss u b t i l i s 。4 m g m l ( 5 ) t h ea c t i v ec o m p o n e n t so fa b mp o l y p h e n o l sw e r ea n a l y z e db yw a t e r s2 6 9 5 h p l c t h ec o n d i t i o n so f c h r o m a t o g r a p h y w e r e ： r e v e r s e d - p h a s e c 一18 c h r o m a t o g r a p h yc o l u m n , c o l u m nt e m p e r a t u r ew a s3 0 c ，r u n - t i m ew a s13 0 m i n ，f l o w r a t ew a sl m l m i n ，d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 6 0 n m ，m o b i l ep h a s ew a sa d a p t e d v a r i a b l eg r a d i e mw i t hm e t h a n o l w a t e rs o l u t i o n a n dt h ea b m p o l y p h e n o l sc o u l db e a n a l y z e da n dt h ec h l o r o g e n i ca c i dc o u l db es e p a r a t e do nt h e s ec o n d i t i o n s k e yw o r d s ：a g a r i c u s b l a z e lm u r r i l l ；p o l y p h e n o l ；e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ； s u p e r c r i t i c a lc 0 2f l u i de x t r a c t i o n ；a n t i o x i d a t i o n ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i 够；h p l c i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是我个人在导师的指导下，进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外， 论文中不包含其它人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志， 都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本 人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：赵扬巾弋 日期：溯、莎学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：赵杨忏日期：溯、6 、莎 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即：学校 有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。一 日期：寥、6 膨 日期：2 d 及乡。彩 1 、 ji 上甲 扬匙 孙葛 警彦 标钐 作 ： 文名论签，笔业亲毕师0 教位导学指 福建农林大学硕士学位论文 姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 第一章文献综述 1 酚类物质功能活性的研究进展及开发利用现状 酚类物质是植物体内的复杂酚类次生代谢产物，主要存在于植物体的皮、根、 叶、壳和果肉中，在植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。由于具有 独特的功能活性，目前酚类物质已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相 关领域，并发挥着不可替代的作用。同时，随着天然产物开发利用的逐渐兴起， 国内外科研工作者纷纷从各个领域和角度对其开展了广泛深入的研究工作，因此 酚类物质已成为当今天然产物和有机化学研究的热点。 当前科学界对酚类物质的研究越来越深入细致，越来越多的试验研究资料显 示，酚类物质具有较强的抗氧化作用，以及明显的抑菌、抗癌、抗老化和抑制胆 固醇上升等功效，摄取一定量的酚能够有效地预防和抑制疾病的发生【1 1 。 i i酚类物质的功能活性 1 1 1抗氧化和抗心脑血管疾病 现代医学研究证明，很多疾病如组织器官老化等都与过剩的自由基有关【2 】。 酚具有出色的抗氧化能力，能够有效地清除人体内的过剩自由基。因此，利用这 一性质，就能减缓人体组织器官的衰老，并且可以对自由基诱发的生物大分子损 伤起保护作用。 血液流变性降低，血脂浓度增高，血小板功能异常是诱发心脑血管疾病的重 要原因【3 】o 据报道【4 】，酚类物质能够抑制血小板的聚集粘连，诱导血管舒张，并 抑制脂新陈代谢中的酶作用，有助于防止冠心病、动脉粥样硬化和中风等常见心 脑血管疾病的发生。 1 1 2 解酒护肝 醉酒与脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化、急慢性胰腺炎、胃炎和胃溃疡等消化道 等疾病均有密切关系【5 】。醉酒是因血液中乙醇浓度过高所致中枢神经系统传递障 碍的一种现象，在日常生活中时常发生。肝脏是体内酒精代谢的主要场所，少量 的酒精在肝细胞浆的乙醇脱氢酶作用下经双电子还原为乙醛，乙醛的化学性质非 常活泼，它可干扰蛋白质分子( 尤其是酶) 的修饰与激活。乙醇还可经复杂的单电 子链式反应还原为羟乙基，继而攻击膜上的多不饱和脂肪酸而引起膜脂质过氧 化。酚类物质既可抑制乙醇氧化为乙醛，也可清除机体内由乙醇介导的氧化应激 1 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 产生的自由基，这对减缓酒精性肝病患者症状的护肝作用，具有临床应用价值【6 】。 1 1 3抗癌 。 大量的流行病学研究以及动物试验都证明酚类物质可以阻止和抑制癌症的 发病。酚类物质的抗癌作用是多个方面的，可以对癌变的不同阶段进行相应抑制。 酚作为一种抗诱变剂，能够有效减少诱变剂的致癌作用，并提高染色体精确修复 能力，从而达到提高细胞免疫力和抑制肿瘤细胞生长的目的网。 1 1 4抑菌消炎和抗病毒 酚类物质对多种细菌都有明显的抑制作用，尤其对霍乱菌、金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌等常见致病细菌有很强的抑制能力，并且不影响生物体本身的生长发 育。另外，酚类物质也可用于抗爱滋病的研究，低分子量的水解单宁已被发现可 用作口服剂来抑制爱滋病，延长潜伏期 7 8 1 。 1 1 5 美白防晒，延缓衰老 酚类物质在2 0 0 - - 3 0 0 n t o 之间有着很强的紫外吸收能力，尤其是对能量高、 破坏力大的远紫外区有更强的吸收作用。酚类物质还能够有效阻止皮肤黑色素的 生成，起到美白防晒的作用 9 1 。另外，酚类物质能够促进皮肤新陈代谢，延缓皮 肤衰老。因此酚可以作为许多含抗老化剂和防晒剂的化妆品的有效成分。 1 2 酚类物质的开发利用现状 酚类物质是清洁化生产的重要原料，作为一类储量丰富的可再生绿色资源， 越来越多地受到人们的重视，是人类可重复利用的宝贵资源。 目前，酚类物质被大量应用于制革、石油、木材和化工工业领域。在石油开 采工业中酚类物质可用作泥浆处理剂和高温堵剂。木材加工工业中，则主要用酚 类物质生产木材胶粘剂和聚氨酯涂料，其制备方法相当成熟j 发展潜力巨大。酚 还可作为水稳剂、絮凝剂、离子交换与吸附树脂等在水处理方面广泛应用。酚还 可以用于生产化妆品、染发剂和调理剂、除臭剂和牙膏等产品，是良好的日用品 添加剂，这是当前植物酚类物质深加工产品的主要研究方向之一。 酚类物质由于其特殊的功能活性，也被广泛应用于医药行业领域。另外，在 食品工业领域，酚类物质可以用于饮料和酒类的澄清，或作为食品的抗氧化剂， 还能够改善食品风味色泽。酚类物质作为一种天然、安全、有效的食品添加剂， 在食品工业中广泛应用，发挥着不可替代的作用【1 0 1 。 2 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 2酚类物质提取分离的研究现状 溶剂提取法、超声波强化法、微波提取法是当前应用较为广泛的酚类物质提 取法。 目前，国内外众多学者研究的酚类物质的浸提方法主要是溶剂提取法。溶剂 提取法首先要考虑溶剂的选择。一般都应遵循相似相溶的原则，即极性强的有效 成分选用极性强的溶剂，极性弱的有效成分选用极性弱的溶剂。酚属于极性大分 子化合物，应当选用极性较强的水，醇等溶剂。溶剂法提取酚正是利用酚易溶或 可溶于水和有机溶剂的性质，以水或有机溶剂将酚从样品中分离出来。常用的提 取试剂主要有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等【1 1 15 1 。溶剂提取法的不足在于其 提取率和有效成分含量均较低，在提取过程中需要长时间加热，酚类物质容易氧 化。且有机溶剂用量大、回收困难；工序多，工艺烦琐复杂，生产成本偏高。 超声波具有频率高、方向性好、穿透力强、能量集中等特性。超声波强化法 常用于辅助传统的溶剂提取法，以提高有效成分的提取率，缩短提取时间。超声 波强化法应用超声波强化提取植物中的有效成分，是一种物理破碎过程。超声波 能在溶液体系中产生空化过程，使液体中形成空腔，振荡、收缩直至崩溃。在这 种特殊的物理环境下，处于空化附近的细胞受到严重损伤破坏，从而使细胞中的 有效成分得以释放，直接于溶剂接触并溶解其中，提高酚的提取率。经过超声波 处理的浸提物，其结构和性质不会发生变化【1 6 】。将超声波应用于辅助溶剂提取法， 具有时间短，效率高，节省溶剂，对有效成分影响小等特点，具有广阔的应用前 景。 微波是频率界于3 0 0 m h z 3 0 0 g i z 的电磁波。微波加热是利用微波场中介质 的偶极子转向极化和界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促使介质转动能级 跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。从细胞破碎的微观角度看，微波加热导 致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量，使细胞内温 度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞； 进一步加热导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞和 裂纹使细胞外溶剂容易进入细胞内部，溶解并释放出细胞内产物。这种方法具有 快捷、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等优点，是酚类物质提取的一种 非常有发展潜力的新型技术【l 刀。 超临界流体萃取是一种正处于积极开发阶段的新型分离技术，它是利用温度 和压力略超过或靠近临界的介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液 3 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 体中萃取某种高沸点和热敏性成分，以达到分离和提纯的目的。由于其介质通常 为无毒的二氧化碳，特别适合于医药、食品添加剂等产品的提取。超临界流体萃 取过程中酚类物质不被氧化，所得产品纯度很高，粗品只要经过简单精制即可得 到高纯度酚，这是其他工艺所不能达到的。 3酚类物质抑菌效应的研究进展 近年来，国外科学工作者对植物天然活性物质的抑菌作用做了大量研究。作 为一类重要的植物天然活性物质，酚的抑茵活性也是当前科学界的研究热点。酚 类物质的抑菌活性的研究目前多集中于对茶多酚、葡萄籽多酚和苹果多酚的研 究。许多研究表明，酚类物质对微生物有较强的抑制作用【1 8 2 0 】。戚向阳等( 2 0 0 2 ) 的研究表明，苹果多酚对芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌均有很强的 抑制作用，且对革兰氏阴性菌的抑菌效果强于革兰氏阳性菌【2 1 1 。彭慧勤等( 2 0 0 3 ) 用流感病毒a 3 感染狗肾传代细胞( m d c k ) ，发现茶多酚对流感病毒a 3 具有直 接的灭活作用。病毒感染后再给予茶多酚治疗能提高m d c k 细胞存活数量，说 明茶多酚对流感病毒a 3 具有治疗作用【2 2 】。唐裕芳等( 2 0 0 5 ) 研究发现，茶多酚 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌和蜡状芽孢 杆菌有较为明显的抑制作用】。但这些研究表明，植物酚类物质对实验用霉菌和 酵母等真菌的抑制作用不明显【2 1 2 3 1 。 有关于食用菌酚抑茵活性的研究则未见报道。 4酚类物质抗氧化功能的研究进展 近年来的研究表明，许多疾病的发生发展都与自由基有密切联系。自由基是 生物体中生化反应的普遍中间介质或称非特异性调节剂，在正常生理情况下，活 性氧的产生与清除可维持在一个有利无害的极低水平，但在衰老、应激和疾病的 情况下却发生活性氧对重要生物分子的损伤渊。当人体内的自由基产生过多或清 除过慢，就会攻击各种细胞、器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并且诱 发，引起人体衰老和心脏病、动脉粥样硬化、癌症、糖尿病等各种疾病。羟自由 基( o h ) 和超氧阴离子自由基( 0 2 ) 是生物体内主要的活性氧自由基，由 它所引起的体内脂质过氧化是人类疾病发生和衰老的重要原因。 油脂氧化是食品工业中经常遇到、且严重影响食品品质的主要问题之一。在 油脂化学领域里，关于延缓油脂的自动氧化及光氧化反应的研究是一项重要而艰 4 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 巨的课题。目前，一般仍是采用加入药剂予以抑制的方法。多年来，世界卫生组 织( w h o ) 批准的合成抗氧化剂只有十多种，由于毒性、溶解度、变色及价格等问 题，使用上越来越受到限制。因此天然抗氧化剂的开发利用正日益受到关注和重 视。 陈海霞( 2 0 0 0 ) 等的研究表明，茶多酚具有很强的抗氧化效力，对油脂的氧 化抑制率达9 6 以上【2 5 1 。王洋( 2 0 0 5 ) 【2 q 和刘杰超等( 2 0 0 5 ) 2 7 1 的试验研究结 果均表明，苹果多酚提取物具有较强的还原能力和抗脂质过氧化功能。金莹( 2 0 0 6 ) 等采用2 脱氧d 核糖法产生o h ，测定不同浓度苹果提取物对o h 的清除作 用，结果表明，在一定浓度范围内，苹果提取物有很强的清除o h 的效果【2 8 1 。 李莉( 2 0 0 6 ) 等研究表明苹果多酚对植物油和动物油均有较明显的抗氧化作用【2 9 1 。 吕禹泽( 2 0 0 6 ) 等试验研究表明，葡萄籽多酚对d p p h 自由基、羟自由基和超氧 阴离子自由基都有良好的清除能力【3 0 】。 有关于食用菌酚清除自由基活性、抗油脂自动氧化活性的研究则未见报道。 5 姬松茸的营养保健功效及开发 姬松茸( a g a r i c u sb l a z e im u r r i l l ) 又称巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇、小松菇、 a b m 菇，原产于巴西、秘鲁，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇 属。姬松茸是当今世界上可栽培的珍稀食药兼用菌之一，是联合国粮农组织向全 世界推荐发展的食用菌主要品种，已有多年的栽培历史【3 1 1 。 姬松茸具有独特的杏仁香味，脆嫩爽口，味道鲜美。姬松茸含有非常丰富的 碳水化合物和蛋白质。其新鲜子实体含水分8 5 - 8 7 。每1 0 0 9 干菇中含粗蛋 白4 0 4 5 ，碳水化合物3 8 - - - 4 5 ，纤维素6 8 ，粗灰分5 7 ，粗脂 肪3 - - - 4 。干菇含v b l l 0 3 、v b 2 2 3 2 、烟酸4 9 2 。矿质元素的组成：总 灰分( 干菇) p7 8 4 6 m g k g 、m g5 2 8 m g k g 、c a15 7 m g k g 、n a118 m g k g 、c ul4 m g k g 、 b 9 m g k g 、z n9 m g k g 、f e6 m g k g 、m n0 1 m g k g 、c r2 8 m g k g t 3 复。并含有人体生 长发育所必需的1 7 种氨基酸。 姬松茸亦有着很高的药用价值。其含有的1 3 ( 1 ，3 ) 葡聚糖、1 3 - ( 1 ，6 ) d 葡 聚糖蛋白质复合体有良好的抗肿瘤效果；1 3 d 葡聚糖、异多糖、凡丁质等能吸 附和帮助排泄致癌物质，有防癌的效果；r n a 复合体、多糖蛋白质复合体有降 血糖作用，能改善糖尿病症状；亚油酸等不饱和脂肪酸能降血压、降胆固醇、还 能阻遏动脉硬化【3 3 1 。日本、美国、巴西等国生产的大量与姬松茸有关的保健食品， 5 福建农林大学硕士学位论文 姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 如从姬松茸子实体中提取的多糖制成的胶囊和将子实体进行粉碎后制成的袋泡 茶冲泡饮料等，在国际市场销路都很好，供不应求，价格昂贵。由于姬松茸的子 实体培养很困难，产量非常有限，远不能满足市场的需求。所以用液体深层培养 的方法大规模生产姬松茸的菌丝体及其发酵液，并做成各种口服液，具有很大的 市场潜力，成为产品开发的另一个热点。 6本项目研究的目的、意义与创新之处 姬松茸在我省栽培面积广，是当前我省发展最快的食药用菌之一，也是我省 出口创汇的重要菌类农产品。但由于我国对姬松茸的研究起步很晚，大多限于固 体栽培条件探索，因此姬松茸产品品种单一。 本项目拟通过溶剂提取法、超声波强化提取法、微波提取法和超临界二氧化 碳流体提取法提取分离姬松茸中的酚类物质，了解不同提取方法对酚得率的影 响，探讨较优的姬松茸酚类物质提取工艺；通过高效液相法对姬松茸酚类物质有 效成分进行化学成分分析；并以茶多酚为对比，研究姬松茸酚类物质的抑菌效果、 以及清除o h 自由基、0 2 。自由基和抗油脂氧化的功效。 本项目的研究成果将有利于开拓姬松茸市场，打破我国姬松茸产品形态单一 的局面。 6 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 第二章溶剂提取法提取姬松茸酚类物质的研究 摘要：本文以姬松茸干品为原料，分别以水和乙醇为提取溶剂，考虑不同因素对提取效率的 影响，如溶剂浓度、浸提温度、料液比、浸提时间和浸提次数等；并在单因素实验的基础上 进行正交实验，对提取工艺进行了优化。试验结果表明，水提法提取姬松茸酚类物质的最佳 工艺参数为：以1 ：3 0 的料液比，在9 0 c 水浴中浸提3 次，每次处理3 小时，姬松茸酚提取 率为1 5 8 4 ；醇提法提取姬松茸酚类物质的最佳工艺参数为：8 0 的乙醇一水混合溶液以 1 ：2 5 的料液比，在6 0 c 水浴中浸提3 次，每次处理2 小时，姬松茸酚得率为2 1 3 8 。乙醇 法提取率较水提法提取率高出3 5 。组织定位实验结果表明，姬松茸菌伞部位酚含量较菌柄 部位酚含量高出3 6 。此外，研究表明，超声波对姬松茸酚的水提取具有强化效果，微波对 姬松茸酚的提取具有很好的辅助作用。 关键词：姬松茸；酚；提取；超声波：微波 酚类物质被称作人类健康的“第七营养素。许多研究均表明食用富含酚类 物质的食品或果汁可以预防癌症、心脏病以及各种炎症。酚在植物体内通常与蛋 白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，提取酚的溶剂需要对酚 具有很好的溶解性，而且须具有氢键断裂的作用。研究表明，有机溶剂和水的复 合体系具有氢键断裂的作用，适合酚类物质的提取。 本文对溶剂法提取姬松茸酚的工艺进行研究，以期为姬松茸的进一步开发提 供理论依据。 1 材料与仪器 1 1试验原料 姬松茸干品：产自福建省永泰县； 无水乙醇，单宁酸，盐酸，六氰合铁三酸钾，氯化高铁等试剂均为分析纯 ( a r ) 。 1 2 主要仪器 u v 2 0 0 0 型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司； t d l 5 大容量低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂； p l 2 0 2 $ 1 0 0 型精密分析天平，美国梅特勒托利多仪器有限公司； r e 5 2 a 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂； s h z d 循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司； 。 7 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 2 0 0 4 型恒温水浴锅，国华电器有限公司； j y 9 2 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司； m 7 0 0 微波炉，广东美的微波炉制造有限公司； 及其他一些常规的实验设备。 2试验方法 2 1原料预处理 姬松茸干品破碎并过4 0 目筛。将预处理后的姬松茸干品颗粒包装置于干燥 皿中，待用。 2 2姬松茸酚类物质的定量方法 本试验中采用普鲁士蓝法( f b ) 作为姬松茸酚的定量方法。 标准曲线的建立【3 4 】： 称取0 2 9 单宁酸溶解并定容至2 5 m l 作为母液，配制浓度为2 ，4 ，6 ，8 ， 1 0 ，4 0 u g m l 的单宁酸溶液。取不同标样单宁酸溶液l m l ，分别加入0 5 m l 0 1 m o u l 氯化高铁溶液、0 5 m l0 0 0 8 m o l l 六氰合铁三酸钾溶液、0 5 m lo 1 m o l l 盐酸溶液，定容至2 5 m l ，待反应完全。用紫外可见分光光度计测定各溶液在 6 9 5 n m 处吸光值。用d p s 软件处理各数据，建立标准曲线，得标准回归方程。 2 3 溶剂法提取姬松茸酚类物质的工艺流程 称取1 0 9 预处理后的姬松茸干品颗粒一分别加入乙醇一水混合溶液或蒸馏 水一水浴回流浸提一过滤一离心( 4 0 0 0 r m i n ) 2 0 m i n - - - 上清液旋转蒸发浓缩一提 取液酚含量测定。 2 4溶剂法提取姬松茸酚类物质的试验设计 2 4 1单因素试验 为研究不同乙醇浓度、浸提温度、料液比、浸提时间和浸提次数等因素对姬 松茸酚提取得率的影响，分别进行单因素实验。 乙醇浓度采用3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 5 、1 0 0 八个水平： 浸提温度采用3 0 、4 0 、5 0 、6 0 。c 、7 0 c 、8 0 、9 0 。c 、1 0 0 八个水平； 料液比采用5 0 m l 、1 0 0 m l 、1 5 0 m l 、2 0 0 m l 、2 5 0 m l 、3 0 0 m l 、3 5 0 m l 、4 0 0 m l 八个水平；浸提时间采用1 h 、2 h 、3 h 、4 h 四个水平；浸提次数采用1 、2 、3 、4 四个水平。 8 福建农林大学硕士学位论文姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 2 4 2正交试验 根据单因素实验结果确定正交试验因素，选取l 9 ( 3 4 ) 正交表探讨水提法和 醇提法提取姬松茸酚的最佳工艺条件。 2 5姬松茸菌体不同部位酚类物质含量对比实验 各取破碎并过4 0 目筛后的姬松茸茵伞和菌柄部位干品颗粒1 0 9 ，采用优化 后的乙醇提取法工艺提取两个部位的姬松茸酚，比较两个部位的姬松茸酚含量。 2 6超声波强化提取姬松茸酚类物质的研究 称取1 0 9 预处理后的姬松茸干品颗粒，按一定比例加入蒸馏水，在超声波处 理器( 功率为4 0 0 w ) 中分别处理2 、4 、6 、8 、1 0 r a i n 后，再用优化后的水提法 工艺提取姬松茸酚。 2 7微波在姬松茸酚类物质提取中的应用 称取1 0 9 预处理后的姬松茸干品颗粒，按一定比例加入蒸馏水，用微波( 功 率在中火) 间歇处理2 、4 、6 、8 、1 0 r a i n ，每隔1 分钟停止一次，用蒸馏水补充 料液比，使料液比始终保持在一定量。冷却后过滤，离心( 4 0 0 0 r m i n ) 2 0 m i n ， 取上清液旋转蒸发浓缩后待测。 2 8数据分析 应用d p s 数据处理系统进行数据分析。 3结果与分析 3 1姬松茸酚类物质的含量测定 测定姬松茸酚的标准曲线回归方程为： 为y = 0 0 0 6 x + 0 0 1 ，r 2 = o 9 9 9 7 ，呈良好的线性关系。 式中：y 为在6 9 5 n m 波长处测定的姬松茸酚吸光值；x 为标准溶液的姬松 茸酚含量( pg m l ) 。 3 2不同乙醇浓度对姬松茸酚类物质提取效果的影响 称取1 0 9 姬松茸干品颗粒，加入1 0 0 m l 不同浓度乙醇溶液，在6 0 * ( 2 下水浴 回流浸提1 h ，过滤浓缩后测定提取液中的姬松茸酚得率见图2 1 。如图2 1 所示， 随着乙醇浓度增大，酚的提取率呈上升趋势。当乙醇浓度为7 0 时，提取液中的 酚含量最高，其次是8 0 和6 0 。而继续增大乙醇浓度至9 5 时，提取得率直 线下降，无水乙醇的浸提效果则更差。由图中数据可见，乙醇一水混合液的提取 9 福建农林大学硕士学位论文 姬松茸酚类物质的提取及其功能学的研究 率比无水乙醇提取率高，这可能是由于无水乙醇难以将水溶性酚浸提出来，导致 酚提取量较乙醇一水混合溶液的提取量低。 余 、- 一 嘲 钿