（环境科学专业论文）新型pcr技术检测土壤中的典型病原菌.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t p c rt e c h n i q u eh a sb e e nc o n s t a n t l yd e v e l o p i n ga n di m p r o v i n gs i n c ei tw a s i n v e n t e d b a s e do nc o n v e n t i o n a lp c rt e c h n i q u e ，n e wp c rt e c h n i q u e ss u c ha s m u l t i p l e xp c r ，e m u l s i o np c a s y m m e t r i cp c r ，i s p c rd e r i v e d t h e s en e wp c r t e c h n i q u e sm a d eu pf o rt h es h o r t c o m i n go ft h ec o n v e n t i o n a lp c r a n dp r o m o t e dt h e d e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g ya n do t h e rr e l a t e dd i s c i p l i n e s ，a n dw i l lp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nd e t e c t i o no f t h et y p i c a lp a t h o g e ni nt h es o j l n ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi st od e t e c tt h et y p i c a lp a t h o g e n sf r o mt h es o i lb yt h e n e wp c r a m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g i e s t h et y p i c a lp a t h o g e n sh e r em e n t i o n e di n c l u d e p a t h o g e n i c e s c h e r i c h i a c o l i ，s a l m o n e l l a ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，s h i g e l l a e ， p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，y e 糟i n i ae n t e r ，e t c t h em a i nc o n t e n to ft h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ：( 1 ) s o i ld n ae x t r a c t i o nm e t h o d s w e r es t u d i e d s o i lt o t a ld n aw e r ee x t r a c t e db yu s i n gd i f f e r e n td n ae x t r a c t i o nk i t s a n dt h ee f f e c t i v e so fd i f f e r e n ts o i ld n ae x t r a c t i o nm e t h o d sw e r ec o m p a r e d ；( 2 ) t h e p c rd e t e c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db yu s i n g 影r bg e n ea n dj6 sr d n aa st h e t a r g e t s ，a n dt h e yw e r ea p p l i e dt od e t e c tt h et y p i c a lp a t h o g e ni ns o i l ( 3 ) n l ed e t e c t i o n c o n d i t i o n so fm u l t i p l e xp c r , e m u l s i o np c ra n da s y m m e t r i cp c rw e r eo p t i m i z e d a n dt h e yw e r ea p p l i e dt od e t e c tt h et y p i c a lp a t h o g e ni ns o i l s o i ld n aw e r es u c c e s s f u l l ye x t r a c t e db yu s i n gf a l s t d n a 掣s p i nk i tf o rs o i la n d m i n i b e a d b e a t e r - 1 6 t m t i l em i n i b e a d b e a t e r - 1 护r e p l a c e de x p e n s i v ef a s t p r e p 刑 f p12 0a n dt h i sm i g h ts a v et h ec o s to fb u y i n gi n s t r u m e n t s o i ld n aa l s oe x t r a c t e db y m a n u a lm e t h o de f f i c i e n t l y c o m p a r e dw i t he x t r a c t i o nb yk i t 。t h em a n u a lm e t h o d r e d u c e de x p e r i m e n tp r i c e ，b u tt h e r ea r em o r ei n t e r f e r i n gs u b s t a n c e si nt h ee x t r a c t w h i c hm i g h tr e d u c et h ee f f i c i e n c yo fp c r t h ee x t r a c th a dt ob ed i l u t o db e f o r eu s e d a sp c rt e m p l a t e t h et y p i c a ls u c ha sp a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o i l , s a l m o n e l l a ， s t a p h ) l o e o c c u sa u r e u s ，s h i g e l l a ew e r ed e t e c t e db yp c r f r o ms o i lb a s e do nt a r g e t i n g g y r bg e n ea n d1 6 s 删b yc o m p a r e dt h ed n as e q u e n c eo ft h ep a t h o g e n s ，g y r b g e n ea r ek n o w n t ob em o r es u i t a b l ef o rm a k i n gd i s t i n c t i o nb e t w e e ns i m i l a rp a t h o g e n s s t r a i n st h a nl6 sr d n a m u l t i p l e xp c rw e r es u c c , e s s f u l l yu s e dt os i m u l t a n e o u s l y d e t e c tp a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ae o l i , s a l m o n e l l a s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n ds h i g e l l a i ns o i l s a n do p t i m i z e dm u l t i p l e xp c rd e t e c t i o np a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e d t h e o p t i m i z e dd e t e c t i o np a r a m e t e r sf o rm u l t i p l e xp c ra n da s y m m e t r i cp c rw e r ea l s o o b t a i n e da n du s e dt od e t e c ta b o v em e n t i o n e dt y p i c a lp a t h o g e ni ns o i l k e yw o r d s ：d n ae x t r a c t i o n , m u l t i p l e xp c r ，e m u l s i o np c r ，a s y m m e t r i cp c r ，g y r b g e n e ，p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m 第1 章绪论 第1 章绪论 生物污染是近年来逐渐被国内外所关注的一个新的环境科学的研究领域。 由于人口的增加、城市化的发展和养殖业的集约化，大量的人排泄物、生活废 弃物以及畜禽粪便等被排放到环境中，而这些绝大多数未经处理而排放的废弃 物中含有大量的人畜共患的病原菌，这些病原菌可能造成土壤、水体和食品的 污染，从而引发传染病暴发，影响公共卫生安全。因而对环境和食品中人畜共 患病原菌的快速、灵敏检测就成为国内外亟待解决的技术难题。 本文的主要研究目标是( 1 ) 建立高效土壤d n a 提取方法；( 2 ) 摸索p c r 扩增g y r b 基因检测土壤中典型病原菌的最佳条件；( 3 ) 摸索新型p c r 技术( 多 重p c r 、乳化p c r 和不对称p c r 技术) 检测土壤中典型病原菌的条件，建立 检测方法。本文建立并优化了各种方法和技术参数，提高了检测灵敏度，具有 较大的理论和应用价值。 1 1 土壤病原菌污染及危害 土壤是微生物的大本营，也是病原菌滋生的温床。土壤中的典型病原菌诸 如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等，这些病原菌导致的感 染疾病在临床上主要以腹泻、呕吐等症状，目前已成为当今全球性重要公共卫 生问题之一，各个国家均采取相应的预防、监测措施控制病原微生物的大面积 爆发。近些年，由于人们饮食习惯的变化和生活环境中卫生状况的恶化等原因， 造成了病原微生物的感染几率不段增加【l 】。 大肠杆菌广泛存在自然界中，是一种条件致病菌，在卫生学上常被作为卫 生监督的指示菌【2 】。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5 类：致病 性大肠杆菌( e p e c ) 、肠产毒性大肠杆菌( e t e c ) 、肠侵袭性大肠杆菌( e i e c ) 、肠 出血性大肠杆菌( e h e c ) 、肠黏附性大肠杆菌( e a e c ) ，可引起不同症状的腹泻。 沙门氏菌是土壤中最常见的致病菌，在世界各国的各类细菌性中毒中，沙 门氏菌引起的中毒常居榜首。在英国，就以沙门氏菌为首位，美国则为第二位， 我国内陆地区以沙门氏菌为首位。有报道【3 】，在我国由沙门氏菌引起的中毒病 例占7 0 , - , 8 0 ，而以肉、蛋、奶等畜产品被沙门氏菌污染所引起的中毒可占 9 0 以上。 命黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，该菌主要存在 于皮肤、粘膜，特别是鼻咽部，3 0 8 0 的人群为该病原菌的携带者，因此， 金黄色葡萄球菌污染发生的机率较大。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起中 笙! 童缕堡 毒的主要原因，肠毒素按血清学分型可分为1 4 型( a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、 h 、i 、j 、k 、l 、m 、n 、o t 4 1 ，。该菌肠毒素的特点是耐热性强。据报道，产毒 菌株约占金黄色葡萄球菌菌株的5 0 7 0 5 1 。 志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。按 抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋氏志贺氏菌。志贺氏 菌的感染剂量较小，1 0 个细菌即可产生症状，故环境中志贺氏菌的浓度不高时 亦有可能引起人群感染【6 1 。掘新华社报道，2 0 0 6 年9 月3r 四川成都崇州市实 验小学的3 0 0 多名学生发生志贺氏菌感染，主要病症是恶寒、发热、呕吐、腹 痛、频繁的腹泻，水样便，混有血液和黏液；严重者出现惊厥、昏迷，或手脚 发冷、发绀、脉搏细而弱，血压低等现象。 铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，是一种常见的条件致病菌。 在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，对人有致病力，常引起人皮 肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并 可引起败血症。传统的绿脓杆菌检测主要依据该菌的生物学特征：革兰氏阴性 杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝 酸盐，在4 2 条件下生长等【丌。 小肠结肠耶尔森氏菌是一种重要的人兽共患病病原菌，在自然界中分布广 泛，肉制品等食品易受此菌污染。在5 0 余种菌清型中只有数种对人体有致病 性，可引起爆发性胃肠炎、免疫系统损害、茵血症和中毒性休克掣8 1 。 由于受理论与方法的限制，土壤微生物一直被认为是研究中的黑匣子。如 何打丌这个黑匣子，充分丌发利用丰富的土壤微生物资源，为人类、为社会造 福，是摆在广大微生物学家面前的一个重要课题【9 】。大肠杆菌、沙门氏菌、金 黄色葡萄球菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌和小肠结肠耶尔森氏菌是引起细菌性 中毒的重要土壤病原菌。快速、便捷地检测和鉴定这六种病原茵十分必要。 1 2 土壤中典型病原菌的检测方法 1 2 1 传统方法 经过常规的细菌学培养方法，对生长的菌落进行计数和分离。传统的菌落 计数方法耗时费力，现在已经采取了一些方法将微生物计数阶段自动化，以便 提高效率和降低实验操作时间。目前常用的菌落计数系统有c o l o n y c o u n t 公司 的m a c e 系统、p e r c e p t i v e 器材公司的s o r c e r e r 菌落计数系统、g e n o t e c h 公司 的s c 2 0 1 0 型全自动彩色菌落计数仪等【i0 1 。鉴定系统随着细菌分类学的深入发 展，传统的用于细菌鉴定的试管和平板试验已经远远满足不了实际需求。传统 2 第1 章绪论 检测方法所需时间较长，一般4 - - 7 d ，操作繁琐，费时耗力。 1 2 2 酶联免疫法e l i s a ) 酶联免疫法的中心就是让抗体与抗原结合成为复合物，然后通过显色来检 测复合物。用于检测诸如金黄色葡萄球菌肠毒素】、细胞表面特殊受体、细菌 分泌蛋白等物质，e l i s a 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有3 种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的 底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同 类型的检测方法。免疫学方法虽然能弥补传统方法的一些不足，但也有误差大、 周期长的局限性。 1 2 3 聚合酶链式反应( p o r ) 方法检测病原菌 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应) 又称体外基因扩增技术，它是 由美国c e t u s 公司的m u l l i s 等人在1 9 8 5 年建立起的一套大量快速扩增特异d n a 片段的系统。p c r 技术的发明，极大地推动了生命科学各个领域的发展并因此 获得诺贝尔奖。s a i k i 等首先将其应用于镰状红细胞贫血前诊断，但由于当时操 作方法繁琐未能得到推广应用【1 2 1 。随着耐热菌中耐热d n a 聚合酶的发现和应 用，大大提高了p c r 的效率，并推动了其向p c r 自动化技术的发展【1 3 14 1 。 p c r 技术的基本原型”。6 】是模仿d n a 体内复制的机制，在体外进行扩增 特异的d n a 片段，但p c r 反应体系要简单的多，主要包括d n a 靶序列、引 物、4 种单核苷酸d n t p 、耐热d n a 聚合酶以及合适的缓冲液体系。它主要是 由三个基本步骤组成的循环反应：首先是变性，将反应体系混合物加热到9 4 ， 维持较短时间( 约2 5 s ) ，使目标d n a 双螺旋的氢键断裂，形成单链d n a 作为 反应模板：其次是退火，将反应体系冷却至特定的温度( 引物的t m 值左右或 以下) ，引物与d n a 模板的互补区结合，形成模板引物复合物；最后是延伸， 将反应体系的温度提高到7 2 并维持一段时间，引物在耐热聚合酶的作用下， 以引物为固定起点，以4 种单核苷酸( d n t p ) 作为底物合成新的d n a 链。引 物从3 端进行延伸，合成的方向为5 端( 一条人工合成的引物) 至3 端，从而合 成与模板d n a 结构相同的片段。重复上述三步骤，变性、复性和引物延伸的 过程，经过约3 0 个周期的循环( 每三个步骤为一周期，约需2 - 3 m i n ) ，l 2 h 就 能将所需基因扩增几百力倍，使极微量的所需d n a 达到极易检测的水平。其 扩增效率公式为：y = ( 1 + x ) “，式中y 为扩增数目，x 为放大效率，1 1 为循环次 数【1 18 1 。 p c r 技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛应用。利用 3 第l 章绪论 p c r 技术，人们能在数小时内通过p c r 管中的反应将特定的d n a 片段扩增数 百万倍。p c r 技术作为科学研究的一种重要方法，已广泛应用于医学、遗传学 和考古学等各个领域【i5 1 ，在食品安全和环境检测方面也显示出广阔的应用前景。 近些年来，基于p c r 的基本原理，许多研究者充分发挥创造性思维，对 p c r 技术进行研究和改进，使p c r 技术得到了进一步地完善，衍生出了多重 p c r 、乳化p c r 、不对称p c r 、原位p c r 等。 ， ( 1 ) 多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) - 又称多重引物p c r 或复合p c r ，是在 同一p c r 反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 p c r 反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般p c r 相同。自1 9 8 8 年 c h a m b e r l i a n 1 9 】等首次提出这一概念以来，多重p c r 技术已被广泛应用于核酸 诊断的许多领域，包括病原体鉴别、遗传性疾病诊断、定量分析、r n a 检测、 法医学研究以及基因缺失、突变和多态性分析等。当前多重p c r 在病原微生物 的检测方面应用最为广泛【2 0 】，利用一次多重p c r 反应，可同时检测、鉴别出多 种病原微生物，在针对土壤环境典型病原菌的检测中具有其独特的优势和实用 价值。 多重p c r 具有以下几个特尉2 l 】：可以对病原菌进行全面、系统、准确的 检测与鉴定，且操作简单、快速，具有很高的特异性和灵敏度，适用于成组病 原体的检测，如对肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、无芽孢厌氧菌等的同时 侦检：应用多重p c r 可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本， 具有显著的经济与社会效益。适用于临床检测、卫生防疫及流行病学调查等。 与常规p c r 技术相比，多重p c r 技术涉及了多对引物和多对模板，随着引物 对数的增加，影响因素也更多，增加了得到错配扩增产物的机会【i6 】。 目前多重p c r 方法本身还存在一些普遍问题【2 0 】：某一特定片段的优先扩 增；容易形成引物二聚体等。这些问题需要在不断优化反应条件中逐步解决， 多重p c r 方法的优化主要体现在能同时检测的基因数目增多及方法的敏感性 和特异性提高等几个方面。在设计循环参数时要注意两个原则，一是退火温度 要足够高，提高退火温度可以减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要 尽量少，以利于检测扩增产物【l6 j 。 多重p c r 扩增技术，在分析检测土壤中污染的病原菌方面具有很大优势， 但是在检测过程中必须注意到：土壤中各种影响因子的作用，在实际检测的土 壤样品中致病菌的含量通常较低而抑制p c r 扩增的物质较多，影响p c r 扩增 的结果，导致出现假阴性的结果；还应注意外源性d n a 的污染，极少量的外 源性污染就可能使p c r 扩增结果出现假阳性结果；引物的设计及靶序列的选择 不当等都可能降低其灵敏度和特异性；多对引物同时扩增时，各种实验条件控 4 第1 覃绪论 制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物。 ( 2 ) 乳化p c r ( e m u l s i o np c r ) ：是指特定比例的单链d n a 文库被固定在 特别设计的d n a 捕获磁珠上，使大部分磁珠携带了一个独特的单链d n a 片断。 磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自 己的微反应器罩进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。 整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。因乳化p c r 扩增过程不受其他的竞争性或污染性序列的影响，所以将乳化p c r 扩增技术应 用于多种病原菌的同时检测可以弥补多重p c r 扩增易产生引物二聚体等不足。 目前已有文献报道将乳化p c r 扩增技术与基因芯片的检测技术联用，大大的提 高了检测效率，乳化p c r 扩增技术可为基因芯片检测病原菌提供高质量的核酸 【2 2 】 o ( 3 ) 不对称p c r ( a s y m m e t r i cp c r ) ：反应体系中两条引物的浓度不同， 这样在p c r 扩增的后期，当量少的一条引物被耗尽以后，另一条引物继续以 线性方式扩增而产生大量的单链d n a 扩增产物。成功的关键是限制性引物的 绝对量要少，且与非限制性引物的最佳比例在1 ：5 0 ( 即o 0 1 u r n ：0 5 u r n ) 左右。 由于分子量不同，可以在电泳中分离纯的单链d n a ( s s - - - d n a ) 。可用于制备单 链探针、d n a 序列分析及配合r t - p c r 用于研究真核d n a 外显子。与常规p c r 标记方法相比，采用不对称p c r 技术标记单链样品与寡核苷酸芯片杂交能提高 芯片的杂交效率，有利于检测型寡核苷酸基因芯片的应用】。 目前，基因芯片作为一种新型的检测技术经一次反应即可实现高通量、并 行检测分析，解决了传统核酸印记技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数 量少、低通量等不足。但就基因芯片探针而言，它所存在的一个主要缺陷就是 受竞争杂交的影响巨大。由于p c r 扩增得到的是双链产物，且只有一条链上存 在有分子信标的靶基因结合位点，所以在将分子信标用于p c r 扩增产物检测 时，它必须与扩增产物的一条链相互竞争以结合在相应的靶基因位点上，只有 在竞争中获胜的分子信标探针才能产生荧光 2 4 - 2 5 1 ，这就极大地影响了分子信标 的检测效果，而不对称p c r 扩增技术可以在一定程度上解决这一问题。 ( 4 ) 原位p c r ( i ns i t up c r ) 【i6 】：原位p c r 是一种把p c r 和原位杂交技术 结合起来的可以检测组织细胞中微量d n a 或r n a 且可精确定位的新技术。通 过在单细胞或切片组织上对特异的d n a 或c d n a 进行原位p c r 扩增，然后采用 d n a 分子原位杂交技术、免疫组化或荧光检测技术进行细胞内特定核酸序列检 出及定位的分子技术【2 0 】。该法在不破坏细胞的前提下利用原位的完整的细胞作 为微量反应体系来扩增细胞内的靶片段并进行检测，从而综合t p c r 和原位杂 交的各自优点，既有高度的特异性又可精确的定位【2 6 1 。其大致过程为：首先将 第1 章绪论 样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上，适当预处理后，将细胞核内 的d n a j j l l 热变性形成单链d n a ，对待检测的选定序列设计一对引物，直接将引 物、d n t p 缓冲液及t a qd n a 聚合酶加到载玻片上，在原位p c r 仪内进行扩增， 反应完毕后将p c r 产物固定在载玻片上，用相应的检测信号进行检测。 自1 9 9 0 年，h a a s e 等【2 7 1 首次将p c r 和原位杂交技术相结合的方法检测了羊绒 毛膜络从细胞中的绵羊脱髓鞘脑炎病毒以来，i s p c r 得到了不断改进和快速发 展。与p c r 相比，i s p c r 不需抽提组织细胞中的核酸，形态结构不被破坏，与 探针原位杂交相比，灵敏度一般可提高1 0 0 倍。该法主要应用于病毒检测和定位， 也可用于检测细菌如结核杆菌【2 8 】，检测组织中寄生虫感染【2 9 1 。根据在扩增反应 中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位p c r 技术可分为直接法和间接 法两大判2 0 】：直接法原位p c r 技术是将扩增的产物直接携带标记分子，所以扩 增结果可以直接观察而不需要进行原位杂交，具有操作简便、流程短、省时的 优点，但是该法特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡 切片上，上述缺点更为突出；间接法原位p c r 技术因为在扩增后用杂交来检测 结果，所以克服了引物错配引起的非特异性扩增问题，是目前应用最为广泛的 原位p c r 技术，但该法的缺点是操作步骤繁琐。 ( 5 ) 标记p c r ( 1 a b e l e dp r i m e r sp c 鼬：又称多彩p c r ，是指用同位素、荧 光素等对引物5 端标记后而进行的p c r ，用不同的荧光素标记后，其扩增产物 可带有不同的颜色可用肉眼直接观裂3 0 】。彩色p c r 的基本操作程序是先用不同 的荧光色素来标记引物的5 端，引物参加反应，扩增后的目的基因会分别带有 引物5 端的荧光色素，通过电泳或离心，肉眼就可以按不同荧光色泽，判断目 的基因是否存在，以及扩增基因的类型【3 i l 。一般需两种不同颜色的引物，一种 作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照，即可诊断基因缺失、染色 体易位或感染某种病毒。检测多种点突变时，亦可用更多的色彩。标记p c r 在 肿瘤、代谢失常、基因调控等研究中具有重要意义【1 6 】。 ( 6 ) 实时荧光定量p c r ( r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r ，f q p c r ) ：是美国 p e 公司( p e r k i ne l m e r ) 于1 9 9 5 年研制出的一种新的核酸定性技术，到后来 a p p l i e db i o s y s t e m s ( a b i ) 公司使这项技术同臻成熟。该技术在常规p c r 基础上 运用荧光能最传递( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c e e n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 技术，加入荧光 标记的探针，巧妙地把核酸扩增与杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起， 利用荧光信号来检测p c r 产物。该技术既提高了检测的灵敏度又做到了p c r 每个循环收集一次数据，通过实时扩增曲线，准确地确定c t 值，从而根据建 立的标准曲线利用c t 值确定d n a 起始拷贝数，做到了真j 下意义上的d n a 定 量。 6 第1 章绪论 由于荧光定量p c r 能够精确定量核酸样品，因此被广泛应用于基础科学研 究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域，如病毒的筛选、细菌病原体的检 测。在病毒的检测筛选方面m u m f o r d 等采用定量p c r 技术成功地对大麦黄斑 嵌花病毒进行了检测【3 2 1 。现在医学应用实时荧光定量p c r 已经检测了许多病原 体，比如乙型肝炎病毒d n a 等 3 3 】。目前，用此方法还进行了对人类免疫缺陷 病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、e b 病毒、流感病毒a 、流感病毒b 等病原体 的检测。f q p c r 技术融合了p c r 和d n a 探针杂交技术的优点，具体包括以 下几个方面：具有d n a 杂交的高特异性和光谱技术的高精准性，从而进一 步提高目的基因检测的特异性和灵敏度；光谱技术和计算机技术的联合应用， 具有很好的可视性，同时减少了工作量；在全封闭条件下进行扩增与产物分 析，有效减少了污染且无复杂的后续处理过程；结果重现性比较好，定量动 态范围高达5 个数量级。与传统的p c r 技术相比，f q p c r 的不足之处是【蚓： 由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩 增产物的大小；因为荧光素种类及检测光源的局限性，从而相对限制了实时荧 光定量p c r 的复合式检测的应用能力：目前f q p c r 实验成本比较高，从而也 限制了其广泛应用。 ( 7 ) 免疫p c r ( i m m u n o - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，t m p c 鼬：与传统免疫 学反应类似，1 9 9 2 年s a n o t 3 5 】等利用链亲一蛋白a 嵌合体蛋白作为连接分子，建 立了灵敏度很高的免疫p c r 技术。免疫p c r 是利用抗原抗体反应的特异性和 p c r 扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，将一段已知序列 的d n a 片段标记到抗原抗体复合物上，再用p c r 方法将这段d n a 扩增，然后用 常规方法检i 贝i j p c r 产物。 免疫p c r 是迄止最敏感的一种抗原检测方法，理论上可以检测单个抗原分 子，这使低于常规检测方法极限的痕量抗原的检测成为可能。因此该法主要应 用于检测肿瘤标志物、细胞岗子、神经内分泌活性多肽、病毒抗原、细菌、酶、 支原体等微量抗原【3 6 】。免疫p c r 集p c r 的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性 于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度 低至2 m g l 的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。免疫p c r 还存在 一些缺点：在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附同相，这样固相的均质 性必然对结果有很大影响；同时检测的样品液中其他成分也可以吸咐同相，极 易产生背景过高或精确度下降。有些难于吸咐固相的抗原也就不用免疫p c r 检测，连接分子的特异性和均质性对p c r 影响很大。 本研究主要探索多重p c r 扩增技术、乳化p c r 扩增技术和不对称p c r 扩 增技术在土壤中典型病原菌检测中的应用。 7 第1 章绪论 1 3 土壤d n a 的提取方法 如何高效地从土壤环境中获得高质量的基因组d n a 是p c r 扩增检测土壤 中病原菌要解决的关键问题。由于土壤成分复杂，若提取的总d n a 中存在腐 殖酸就会抑制p c r 扩增中的t a qd n a 聚合酶的活性：不同的土壤类型也会影 响土壤d n a 的提取效果【3 刀。 从土壤中获得微生物的传统方法是富集、培养、分离，但此过程中会造成 微生物多样性丢失，种群构成发生变化。不经过传统培养，直接从土壤提取d n a 并进行分子生物学分析来研究土壤微生物种群情况，是近几年发展起来的全新 的实验手段，能够更直接更可靠的反映土壤微生物的原始组成情况。 d n a 分析技术不仅可以对可培养微生物进行分析，还可以对非可培养状态 的微生物进行研究【3 8 】。但土壤样品含大量理化性质复杂的有机和无机颗粒，微 生物仅为其中的极小的一部分，且微生物细胞通常紧紧吸附于颗粒表面，因此 从土壤样品中高效的获得d n a 具有相当难度。在基因水平上研究未培养微生 物的技术关键之一，是从各种环境样品中高效的获得可进行分子操作的混合基 因组d n a 。有效的从土壤中提取核酸也是用核酸检测技术直接检测目标微生物 的必要前提【3 9 j 。 由于土壤样品种类繁多、组成复杂、物化性质多变，故从土壤样品中提取 出高质量、无偏好的微生物基因组总d n a 具有相当难度。随着微生物生态学 的发展，各种提取土壤样品d n a 的方法陆续建立起来，目前从土壤样品中提 取d n a 的方法大体上分为两类m 】：一类是直接提取法，其直接运用各种化学 和物理方法裂解土壤样品中的微生物细胞，再抽提总d n a ；另一类是间接提 取法，采用差速离心等物理方法将微生物细胞从样品中分离出来，再用较温和 的方法抽提d n a 。一般前者的提取效率较高，而后者的纯度较高，片段较大。 影响土壤d n a 提取的因素较多，如土壤中活性抑制剂的影响，土壤中生 物活性抑制剂的种类很多，常见的包括腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重 金属、不明沉淀物、菌体裂解成分、r n a 和非靶序列d n a 等，其中以腐殖酸 及腐殖酸样物的抑制作用最明显，它们可以干扰裂解、使核酸降解或非特异性 吸附、抑制酶活性；提取过程中避免各种因素的影响所采取的措施裂解细胞时 采用物理和化学的方法联用，即采用玻璃珠振荡和化学物质s d s 联用的方法， 确保细胞的完全裂解。物理方法主要为机械破碎，最初采用石英砂研磨的方法， 经反复实验发现提取物d n a 受破坏较严重；石英砂本身可以吸附提取物，影 响提取物的回收。后来采用不同直径的玻璃珠振荡，效果比较理想。在提取d n a 的不同步骤中，加入p v p p ，它可以和酚基化合物形成氢键，通过离心和过滤， 去掉抑制物，效果较好。 8 第1 荤绪论 总的来说，从土壤样品中提取d n a 没有通用的最佳方案，要根据具体的 土壤特点、实验室条件和实验目的而定。目前较常见的土壤d n a 提取方法有 使用试剂盒提取和不使用试剂盒提取两类方法。典型的提取方法总结如下： f a s t d n a 圆s p i nk i tf o rs o i l 试剂盒提取法：主要步骤为采用f a s t d n a s p i n k i tf o rs o i l 试剂盒和f a s t p r e p t u f p l 2 0 核酸提取仪( b i o1 0 1 ，c a r l s b a d ，c a ，u s a ) 提取和纯化土壤样品总d n a ( 具体步骤参照生产商使用说明书) ，主要过程为 称取5 0 0 m g 新鲜土壤样品到含有陶瓷和硅土微粒的裂解管中，并加入9 7 8 肛l 磷 酸钠缓冲液和1 2 2 1 a l 微管缓冲液，将管子放入f a s t p r 印刑f p l 2 0 核酸提取仪， 设置速度为5 5 并运行3 0 秒，最后用硅胶柱过滤并沈脱总d n a 进行纯化，提 取的总d n a 置于2 0 保存。 g e n m e d 土壤d n a 分离试剂盒提取方法：称取5 0 0 m g 的土壤样品放进 2 m l 锥形离心管中，加入5 0 0 i t lg e n m e d 缓冲液( r e a g e n t a ) ，强力涡旋振荡， 离心机速度为3 0 0 0 r c f 离心3 0 分钟，最后加入2 5 i _ t lg e n m e d 清理液( r e a g e n t h ) 溶解d n a 后，再加入2 5 i - t lg e n m e d 亲和液( r e a g e n ti ) ，5 6 恒温水槽孵 育3 0 r a i n ，放进微型离心机1 6 0 0 0 r c f 下离心5 分钟，提取的总d n a 置于2 0 保存。 s d s 玻璃珠法【4 l 】：主要步骤为称取l og 经过预处理的土壤样品于5 0m l 离心管( 管中加有1 9 直径约l m m 的无菌玻璃珠和5 颗直径约5 m m 的无菌玻 璃珠) ，加入1 3 5i i l l 抽提缓冲液( 1 0 0m mt r i s 2h c l ，1 0 0m me d t a ，1 0 0m m 磷酸盐缓冲液，1 5mn a c l ，1 c t a b ，p h 8 o ) ，涡旋振荡1 0m i n ：加入1 0 0 ul 蛋白酶k ( 1 0m g m 1 ) 以及l m l 溶菌酶( 6 0 m g m 1 ) ，混匀后放入3 7 0 恒温摇 床，2 0 0r p m 摇3 0r a i n ；加1 5m l2 0 s d s ，轻柔混匀，放入6 5 水浴2h ， 每隔1 5 2 0r a i n 轻柔混匀一次：室温离心( 60 0 0 xg ) 1 0m i n ，将上清液转入新的 5 0 m l 离心管待用。在沉淀物中加入4 5m ld n a 抽提缓冲液和0 5m l2 0 s d s ， 混匀后6 5 水浴1 5 m i n ，室温离- b ( 6 0 0 0 xg ) 1 0 m i n ，将上清液与前次的上清液 合并；在上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇，轻柔混匀，6 0 0 0 g 室温离心 1 0 m i n ，收集上清液，重复抽提一次；加入o 1 体积3mn a a c 和0 6 体积的异 丙醇，静置于室温下l h ，1 4 0 0 0 x g2 5 离心2 0m i n ，弃上清；沉淀物用7 0 乙醇清洗两次；加适量t e 溶解沉淀，并收集于1 5m l 的微型离心管中。 s d s g i t c p e g 法【4 2 】：称取1 0 9 经过预处理的土壤于5 0 m l 离心管，加1 6 m l s d s 裂解液( 0 2 5 mn a c l ，0 1 m e d t a ，4 s d s ) ，涡旋混匀，6 8 温育3 0m i n 。 加4 m l5 m 异硫氢酸胍，混匀后6 8 温育l h ，每1 0 m i n 轻轻摇动，1 20 0 0 xg 离心1 0 r n i n ，将上清液移入5 0 m l 干净的离心管。加0 1 2 5 倍体积的5 m 醋酸钾 和o 4 2 倍体积4 0 p e g 8 0 0 0 ，2 0 下沉淀2 4h ，1 40 0 0 g 离心2 0 m i n 。沉淀 9 第1 章绪论 用1 8m l2 x c t a b ( 2 c t a b ，1 4m n a c l ，0 1 m e d t a ) 溶解，6 8 温育1 5 m i n ， 加等体积的氯仿：异戊醇，轻柔混匀，2 0 0 0 x g 离心1 0 r a i n ；加入o 1 体积3 m n a a c 和0 6 体积的异丙醇，静置于室温下l h ，1 4 0 0 0 x g2 5 c 离心2 0 m i n ：沉淀物用 7 0 乙醇清洗两次：加适量t e 溶解沉淀，并收集于1 5m l 的微型离心管中。 n y c o d e n z 法【4 3 】：采用n y c o d e n z 介质密度梯度离心分离土壤微生物细胞， 再裂解细胞提取d n a 。具体步骤：称取5 0 9 土壤样品于2 5 0 m l 无菌三角瓶中， 加入1 4 0 m l 的分离缓冲液( 0 2m n a c l ，5 0m m i r i s h c l ，p h8 0 ) ，涡旋振荡混匀 ( 涡旋振荡l m i n 后置于冰上l m i n ，如此重复三次) 。将匀浆过已灭菌的l m m 孔 径筛，以除去大的沙粒和植物根茎等杂质。吸取9 m ln y c o d e n z 溶液( 1 3 9 m 1 ) 于无菌的5 0 m l 超速离心管中，将2 5 i i l l 已过筛的样品悬浮液小心的移入管内。 1 0 0 0 0 g ，4 c 离心2 0 r a i n 。此时出现分层现象，共分为四层，最上层是水相， 第二层是细胞和一些杂质，第三层是n y c o d e n z 溶液，最下面层是泥土。小心吸 出细胞层，转移至一无菌的离心管中，加入适量无菌水，轻柔混匀，1 2 0 0 0 x g ， 4 离心1 0 m i n ，沉淀即为分离出的细胞。将细胞重悬于8 m lt eb u f f e r ( p h 8 o ) ， 加1 6 0l al 溶菌酶( 5 0 m g m 1 ) 和2 0pl 蛋白酶k ( 2 0 m g m 1 ) ，3 7 c 水浴3 0 r a i n ：加 l m l2 0 s d s ，6 5 水浴2 h ，其间每1 5 2 0 m i n 轻轻颠倒混匀；反应完成后加等 体积氯仿：异戊醇抽提两次；加o 6 倍体积的异丙醇，室温下静置l h ，1 2 0 0 0 x g ，2 0 离心2 0 m i n ，弃上清；沉淀用7 0 冰乙醇洗涤两次，吹干，1 0 0 l al 无菌水溶解d n a 并转入1 5 m l 无菌离心管中，4 保藏。 b l e n d i n g 法【删：采用b l e n d i n g 法从土壤中收集微生物细胞，再裂解细胞提 取d n a 。具体步骤，称取5 0 9 土壤样品于无菌2 5 0 m l 离心管中，加入1 0 0 m l 预冷的b l e n d i n gb u f f e r ( 1o o m mt r i s h c l ，10 0 r a ms o d i a me d t a ，o 1 s d s ，1 c t a b ，p h8 ) ，涡旋振荡混匀( 涡旋振荡l m i n 后置于冰上l m i n ，如此重复三次) ； 低速离心( 10 0 0 x g ，1 0 ，5r a i n ) ，上清液转移至另一无菌的2 5 0 m l 离心管中； 沉淀再用1 0 0 m lb l e n d i n gb u f f e r 沈涤重悬，离心取上清液，与前次合并；所得上 清液1 2 0 0 0x g ，4 c 离心2 0 m i n 以回收菌体细胞；所得细胞依次用8 m lo 1 的 焦磷酸钠和8 m lc h r o m b