（环境科学专业论文）果蔬中农药残留快速测定方法的研究.pdf

i 摘 要 本文是国家科技部十五科技食品安全重大专项课题的子课题本文针对目 前国内果蔬中农药残留快速检测体系中存在的主要问题从两个方面进行了研 究对原有商品化乙酰胆碱酯酶显色体系的试剂配方进行了优化研究节约了 试剂成本将亚临界水萃取技术应用于农药残留的提取并与其它几种预处理 技术进行了比较主要内容包括 1. 用乙酰胆碱酯酶显色反应体系检测农药残留是一种较理想可靠的方 法但现有试剂配方检测成本较高在保证较高灵敏度的前提下通过对比研 究确定了一个成本较低的配方即酶与底物的用量改为原配方的 3/4显色剂的 用量改为原配方的1/2总体上节约了1/3的试剂成本f检验证明调整后配方 和原配方之间无显著性差异调整后配方对三种农药的定量检出下限分别为 甲胺磷 0.3mg/l敌百虫 0.04mg/l敌敌畏 0.02mg/l与国标快速测量方法一 致 2. 建立了敌百虫农药的 gcecd 分析条件标准曲线的线性相关系数 r=0.998测定范围 10-200 g/l 3. 比较研究了直接振荡萃取超声萃取亚临界水萃取和微波辅助萃取 四种预处理方法对实验室模拟大白菜样品中敌百虫的提取效果气相色谱分析 结果表明对于大白菜中的敌百虫残留农药亚临界水萃取和微波辅助萃取技 术较手动振荡和超声萃取的萃取率更高 4. 试验探讨了一种果蔬中农药残留快速预处理技术亚临界水萃取技 术采用乙酰胆碱酯酶光度法进行检测分析通过模拟样品试验获得亚临界水 对大白菜中甲胺磷农药残留萃取的优化条件为温度 100120时间 2 4min与国标振荡法和超声法相比亚临界水萃取具有提取率高精密度好且 操作简便的特点并对亚临界水快速萃取装置的设计进行了初步的探讨 本研究工作的成果已应用于本课题组开发的多通道食品安全监测仪 上该项技术经湖北省科技厅鉴定为达到国际先进水平 关键词农药残留快速检测乙酰胆碱酯酶亚临界水萃取 ii abstract this paper is the subitem of key project of food safety of the science and technology ministry of china. in order to solve the problems of rapid determination system for pesticide residues in fruits and vegetables, two issues were studied. opitimization on commercial reagent of acetylcholinesterase (ache) reaction system was studied for saving the cost of reagent. subcritical water extraction was used to extract pesticide residues, and compared with other pretreatment methods. the research aspects are as follows: 1. ache reaction system is a reliable method to detect pesticide residues in fruits and vegetables except whose detecting cost of reagent is higher. in promise of higher sensitivity, a new low cost reagent components, whose dosage of enzyme, substrate and chromogenic reagent are 3/4, 3/4 and 1/2 that of original components, respectively, thus saved of 1/3 cost of reagent as a whole, was achieved through contrastive test. f-test proved that there is no significant difference between adjusted components and original components. the lower limit of determination of adjusted components to three pesticides is: methamidophos 0.3mg/l, trichlorphon 0.04mg/l, dichlorvos 0.02mg/l, which is consistent with those of national standard rapid determination method. 2. a gc-ecd analytical method was build to detect trichlorphon residues, whose linear coefficients of standard curve is 0.998 and detecting range is 10200 g/l. 3. a comparison of manual shaking extraction, ultrasonic extraction, subcritical water extraction and microwave assistanted extraction to simulated vegetable samples was studied. analytical results of gc indicated that, to trichlorphon residues in chinese cabbage, the extraction rate of subcritical water extraction and microwave assistanted extraction is higher than that of manual shaking extraction and ultrasonic extraction. 4. a rapid pretreatment technology, subcritical water extraction technology, was researched by ache analytical method. the optimal methamidophos extraction condition i.e. temperature 100 120c, extraction time 2 4min was achieved by iii simulated sample test. compared with shaking extraction and ultrasonic extraction, subcritical water extraction can get higher extraction rate, better precision and simpler operation. we also designed subcritical water extraction device primarily. the fruits has been used to multichanel food safety detection instrument, which is also researched by ourselves, and is authenticated international good performance by science and technology bureau of hubei province. keywords: pesticide residues, rapid determination, acetylcholinesterase, subcritical water extraction 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果尽我所知除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和 借阅 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密在 年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密 请在以上方框内打 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 1 1 绪 论 1 . 1 概论 我国是农业大国同时也是世界上最大的农药生产国2003 年中国农药产 量达75.17万吨农药的广泛应用提高了农作物的产量在农业的发展中起到了 重要作用但对环境也造成了严重的污染在农药的环境污染事故中最重要 的是农药对人体的污染中毒事故在国家质检总局公布的 2001 年第 3 季度全国 蔬菜市场被抽查的 181 种蔬菜中有 86 种蔬菜农药残留量超标12001 年 6 月 13 日发生在广东省中山市的 78 人食物中毒就是食用了含有大量有机磷农药残留 的通心菜引起的据不完全统计2全世界每年有 200 万人中毒其中死亡约 4 万人1981 年我国农药中毒事故高达 28.9 万人死亡 1.87 万人近十年来我 国平均每年发生农药中毒事故 10 万人死亡近 1 万人统计资料显示在我国 农药中毒死亡事故中杀虫剂约占 80%左右的比例而在杀虫剂中又以高 毒有机磷农药为主占 90%以上其主要品种有甲胺磷甲基对硫磷对硫 磷乐果氧乐果内吸磷倍硫磷马拉硫磷杀虫脒呋喃丹西维因及 杀鼠剂等 由于农药污染对人类造成的危害性目前发达国家都严格实行了果蔬出售 前的农药残留的检测我国出口的农副产品均需要进行农药残留的检测日本 2004 年 9 月启动了进口食品农药残留新标准3新增了 11 种农药残留限量标 准修改了 4 种农药残留限量标准至此, 日本已制订了 242 种针对 128 种 农产品的农残标准重新修改的农药残留标准对我国果蔬类产品出口影响较 大 随着广大人民群众环保意识的增强和生活水平的提高我国城乡居民对农 产品卫生质量的要求也越来越高农药残留的检测和控制成为政府部门和广大 群众十分关注的问题gb 47881994 规定蔬菜水果中的甲拌磷杀螟硫 磷倍硫磷最大残留限量标准分别为不得检出0.5 mg/kg0.05 mg/kggb 51271998 规定蔬菜水果中的敌敌畏乐果对硫磷马拉硫磷的限量标 准分别为 0.2 mg/kg0.1 mg/kg 和不得检出为从源头上解决农产品尤其是蔬 2 菜水果茶叶的农药残留超标问题2002 年 5 月 24 日国家农业部发布了第 199号公告公布了国家明令禁止使用的农药和不得在蔬菜水果茶叶中草 药上使用的高毒农药其中包括有机磷农药如甲胺磷甲拌磷对硫磷等为 避免农药对人畜安全农产品卫生质量防治效果和环境安全造成一定程度的 不良影响2002 年 6 月 28 日农业部发布了农业部令第 17 号 农药限制使用管 理规定进一步加强了对农药的管理 2001 年 4 月农业部正式启动了全国无公害食品行动计划 42001 2002 年农业部公布了一系列农业行业标准规定了一系列无公害食品如白菜 类ny50032001速冻绿叶类蔬菜ny 51852002的要求试验方法 检验规则标签包装运输和储存无公害食品计划的实施需要有相应的现 场快速农药残留检测技术目前食品检测常用的方法主要是色谱法虽然灵敏 度高准确度好但操作复杂仪器昂贵需要专业技术人员完成分析工作 不利于基层的广泛应用近年来农药残留快速检测技术得到了快速发展但仍 存在明显的缺陷如准确度不高重现性差仅能用于定性分析本研究的目 的是针对国内果蔬农药残留快速检测方法中存在的问题研究一种操作简便 分析快速成本低廉的果蔬农药残留快速检测方法研究内容包括化学分析体 系的调整改进和前处理方法的研究检测对象为有机磷和氨基甲酸酯类农药 1 . 2 有机磷和氨基甲酸酯类农药的性质 1.2.1 有机磷农药 有机磷农药5organophosphorus pesticides主要用作农业杀虫剂少数品 种用作杀菌剂除草剂和脱叶剂成品剂型有乳剂油剂粉剂喷雾剂和颗 粒剂等该类农药杀虫效果好残效期较短但对温血动物具有一定毒性毒 性与化学结构有关多数属于中毒和低毒少数属于高毒类其化学通式如 下 p (ox或sx) r1o r2o o(s) 式中 r1和 r2多数为甲基和乙基x 为烷氧基芳香基卤素或杂环取代集 团 3 1.2.1.1 有机磷农药的种类 根据其化学结构的不同有机磷农药可分为以下几类6 1. 磷酸酯 phosphate 类其基本化学结构为 p (ro) 2 o ox 杀虫效率高 发挥作用快常用品种有敌敌畏对氧磷等 2. 膦酸酯phosphonate类其基本化学结构为 p cx o (ro) 2 杀虫作用 也较快常用品种有敌百虫 3. 硫代磷酸酯thiophosphate类其基本化学结构为 p o(s)x s(o) (ro)2 常 用的品种有对硫磷内吸磷等 4. 二硫代磷酸酯 phosphorodithioate 类其基本化学结构为 p sx s (ro)2 常用的品种有甲拌磷马拉硫磷等 5. 氟磷酸酯fluorophosphate类其基本化学结构为 p f o (ro)2 此类 化合物对人畜毒性很高其品种有丙氟磷等 6. 焦磷酸酯pyrophosphate类其基本化学结构为 p oo (ro)2 p o (ro)2 杀 虫效果好但极易水解代表化合物为特普其衍生物中主要有八甲磷 其中r绝大多数为烷基x部分的结构是多种多样的 1.2.1.2 有机磷农药的毒性 有机磷杀虫剂大多数为油状体具有类似大蒜样特殊气味遇碱性物质能 迅速分解很容易因呼吸吞服和经皮肤接触吸收进入人体后的有机磷农药 通过血液淋巴可很快运送至全身各个器官以肝脏含量最多肾肺骨次 之肌肉及脑组织含量较少7 4 有机磷的急性毒性主要是归因于对胆碱能神经突触后膜上的乙酰胆碱酯 酶ache的抑制乙酰胆碱酯酶可催化乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸 乙酰胆碱是神经系统中传导冲动刺激的化学介质在昆虫和脊椎动物神经 中存在正常机体在神经兴奋时神经末梢释放出乙酰胆碱传导刺激然后 被胆碱酯酶分解而失去作用由于胆碱酯酶的作用从而调节神经之间的兴奋 刺激但有机磷农药进入动物和人体后由于有机磷的结构与乙酰胆碱类似 因此可作为胆碱酯酶的底物与酶生成共价结合的磷酰化胆碱酯酶磷酰基极 难水解因而对酶的活性起着不可逆的抑制作用使乙酰胆碱在体内大量累 积一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态如抽搐引起 功能失调而导致中毒昆虫就失去知觉而死亡对人畜也有剧毒作用临床中 测定血液的胆碱酯酶的活力可以诊断有机磷农药中毒的程度8 另外有机磷还对其他丝氨酸酶类脂肪酶某些非特异性酯酶都有抑制 作用9还对许多组织的膜酶na+k+atpasemg2atpaseca2 atpase 有毒害也可使其它膜蛋白酶磷酰化磷酰化形成后ro 键或 xr基 团中所含有的 co 键亦可能断裂而脱下烷基后者又往往可能是具有活性的 烷化剂这就可使sh 酶或蛋白质烷基化从而抑制sh 酶 不同的有机磷种类对人畜的毒性大小也不一样这和有机磷的结构及其理 化特性如溶解度挥发性以及溶于脂肪和水之间的分配系数都有一定的关系 根据有机磷农药的毒性大小可将其分为四类10 1. 剧毒类小白鼠口服半数致死量ld50在 10 毫克/公斤体重以上如 甲拌磷内吸磷对硫磷等 2. 强毒类小白鼠口服 ld50在 10100 毫克/公斤体重之间如苯硫磷 谷硫磷敌敌畏等 有机磷 胆碱酯酶 磷酰化胆碱酯酶 乙酰胆碱 胆碱 乙酸 eoh 5 3. 大毒类小白鼠口服 ld50在 1001000 毫克/公斤体重之间如敌百 虫乐果杀螟硫磷等 4. 一般毒性小白鼠口服ld50在10005000毫克/公斤体重之间如马拉 硫磷辛硫磷等 1.2.2 氨基甲酸酯类农药 氨基甲酸酯类农药7carbamate pesticides 大都为结晶固体水中的溶解度 及蒸汽压低在酸性介质中相对稳定在碱性介质中易降解在生物体内易通 过氧化水解和结合三种形式进行代谢降解通常其摄食量的 70%90%可在 24 小时内以代谢产物葡萄糖醛酸酯的形式由尿排出体外 该类农药的通式为 n r2 r1o or3 式中r1通常为 hr2通常为 ch3r3的变化较大但结构中多数包含有 苯基 与有机磷类杀虫剂相似氨基甲酸酯类杀虫剂同为胆碱酯酶抑制剂但又 有不同区别在于氨基甲酸酯类杀虫剂进入生物体内后大多不经代谢而直接抑 制胆碱酯酶即以整个分子与酶形成疏松复合物它与胆碱酯酶的结合是可逆 的逆转后可复活同时氨基甲酰化胆碱酯酶可迅速水解脱氨基甲酰化生成 有活性的酶中毒后如不再继续接触一般 4h 后胆碱酯酶开始复活24h 可完 全恢复正常其中毒症状与有机磷类杀虫剂类似 1 . 3 农药残留分析方法综述 我国的农药和药物残留分析技术始于20世纪50年代那时的农药和药物残 留检测技术仅限于化学法比色法和生物测定法检测方法缺乏专一性灵敏 度也不高气相色谱自 20 世纪 60 年代初应用于农药和药物残留分析推动了 农药和药物残留分析技术的飞速发展大大提高了农药和药物残留量的检测水 平20 世纪 80 年代以来高效液相色谱法开始广泛应用于对热不稳定和离子 型农药和药物及其代谢物的分析高效能的色谱柱可将各组分与杂质分离, 高灵 敏度和专一性强的检测器解决了早期不能检出的微量农药和药物代谢物和降 6 解产物的分析20 世纪 90 年代农药和药物残留分析技术日新月异一些新 技术已进入应用阶段 根据所用试剂及仪器的不同农药残留分析方法可分为以下几类11,12,13 1. 化学分析法14包括间苯二酚反应法偶氮法亚硝酰铁氰化钠法二 氯化钯法靛蓝试验法该法操作简便效果明显但缺点是一次只能测定一 种或相同基团的一类的有机磷农药大多需要加热后才发生显色反应容易受 到干扰灵敏度低因此主要用于定性分析 2. 酶分析法基于有机磷对胆碱酯酶或植物酯酶活性的抑制作用通 过测定水解产物的 ph值吸光度或荧光强度來反映农药对酶的抑制程度包括 ph法电化学法15胆碱酯酶比色法16,17荧光法18植物酯酶比色法19该 法总体灵敏度高操作简便成本较低结果可靠但缺点是试剂不易保存 目前主要用于定性或半定量分析 3. 色谱法根据分析物质在固定相和流动相之间的分配系数的不同达到分 离目的并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号电压电流等然后 送到记录仪记录下来的方法包括气相色谱 gc20,21 ,22高效液相色谱hplc 23 薄层色谱法24毛细管区带电泳cze气相色谱质谱联用25液相 色谱质谱联用26(lc-ms)气相色谱红外光谱联用(gcftir)27超临界 流体色谱28sfc等目前应用于检测有机磷农药的色谱法主要有薄层色谱 法气相色谱法和高效液相色谱法其中气相色谱法是国家标准农药残留分析 方法最小检出量可达纳克级水平色谱法分离效率高所需样品量少检测 灵敏度高选择性好定性定量同时进行结果可靠但色谱法仪器昂贵测 量时间长操作过程复杂需要专门的分析技术人员难以普及和推广 4. 生物毒性检测法有发光菌法和细胞脱氢酶法前者根据有毒污染物对 发光菌发光强度的影响来检测污染物的后者根据水中有毒物质对微生物细胞 脱氢酶活性的抑制来检测的该法测定水质的综合毒性快速灵敏可靠 可用于农药的检测但前者需要特定的荧光检测器后者专一性差准确度不 高限制了它们的应用 5. 其他方法免疫分析法29生物传感器法30前者是基于抗原抗体特 异性识别和结合反应为基础的分析方法其灵敏度高方便快捷容量大成 本低安全可靠但抗体的制备较难特异性强一种试剂盒只能检测一种农 7 药不能测定农药残留总量后者是目前国内外发展很快的一种方法其优点 是响应速度快样品量极少甚至可插入生物组织或细胞内实现超微量在线快 速跟踪分析但其稳定性灵敏度重现性及使用寿命还有待进一步提高 1 . 4 快速测定技术 由于色谱分析法检测灵敏度高选择性好定性定量可同时进行结果准 确可靠因此目前国内外农药残留检测方法应用较多是色谱分析法其中气相 色谱气质联用占了很大比例气相色谱法还被定为中国国家标准农药残留分 析方法但色谱法由于使用实验室昂贵的大型分析仪器需要依靠专业技术人 员完成分析工作从采样样品预处理到分析结果需要一两天时间因而常常 失去了现场测试以便及时检查及控制的意义更不利于该法在基层的推广应 用 而农药残留快速检测技术由于其操作简单快速成本较低等优点已在中 国香港中国台湾韩国泰国越南等国家和地区得到推广使用31香港在 1988 年因内地输港菜发生中毒事件之后在大的批发市场建立了农药残留快速 检测实验室对进入批发市场的蔬菜抽样检测中国台湾在果蔬批发市场重 要蔬菜产区建立了 70 多处农药残留快速检测站泰国在 8 个行政区内分设了 快速检测站韩国也在全国建立了22 处农药快速检测站等我国一些地方如 北京厦门上海温州等市的果蔬批发市场也先后建立了快速检测实验室 对进入批发市场的蔬菜定期抽样检测对上市的蔬菜进行粗筛将一部分农药 残留含量比较大的蔬菜控制在交易市场之外尽量减少农药残留对人们的危 害避免中毒事件的发生 根据反应的原理不同目前国内外已经实现快速测量的技术可大致分为以 下几类 1.4.1 胆碱酯酶比色法 原理在胆碱酯酶的作用下硫代乙酰胆碱可以水解为硫代胆碱和乙酸 硫代胆碱和二硫代二硝基苯甲酸产生显色反应呈现黄色在 412nm 处有最大 吸收峰当有甲胺磷和氨基甲酸酯类农药存在时农药抑制了酶的活性使显 8 色反应速率变慢不同浓度不同毒性的农药对酶的抑制程度不同以此可以 建立农药残留量和酶活性抑制率之间的对应关系 该法是目前国内应用最广泛的快速分析方法已在小型的快速测定仪上得 到了应用国内已有几家商业化的产品如武汉沃特公司的农药残留快速测定仪 和上海电子光学技术研究所的 cl-1 残留农药测定仪国标 gb/t 5009.199 2003 的酶抑制率法也是采用该反应的原理该法优点是显色灵敏测量时间 短可半定量测定结果可靠但目前也存在一些问题如样品预处理大多 采用振荡提取的方法提取效率不高底物显色剂等主要试剂要从国外进 口酶的制备复杂因此试剂消耗成本仍相对较高每测一个样品需要 1 元以 上操作步骤繁琐测量条件苛刻恒温测量显色时间要求准确一致易 受叶绿素植物次生物质的干扰容易产生假阳性结果17酶和底物不易保存 等因此该法在快速化市场化的实现上仍有一定的困难 目前该法所用的胆碱酯酶主要有两种乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶32 这两种酶广泛存在于各种动物的组织中以脑组织中含量最为丰富如市场上 商品化的乙酰胆碱酯酶大多是从果蝇家蝇的头部提取的 1.4.2 靛酚乙酸酯法 原理胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯红色水解为乙酸与靛酚蓝色有 机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用使催化水解变色的过程 发生改变由此可判断出样品中是否含有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的 存在 利用该法制作的纸片操作简单反应快速如浙江后秀生物制品开发有限 公司生产的农残速测卡33就是采用该法原理国标 gb/t 5009.1992003 也将 该法列为快速的筛选测定方法但该法重现性准确性差仅能作为一种定性 方法利用该法测定得到的阳性结果还需用其他方法进一步确定具体农药的 品种和含量 1.4.3 植物酯酶比色法34 基于有机磷对植物酯酶的抑制作用建立的一种定性分析方法植物酯酶促 使底物 26二氯靛酚抑制分解底物水解前后颜色由橙480nm变蓝 610nm当样品溶液依次加入酶和底物后若样品中不含有机磷农药底物 9 迅速分解样品溶液很快变色否则酶受到抑制底物分解变慢或者不分解 导致样品溶液较长时间保持橙色不变或呈浅蓝色通过与对照样比较可确定样 品中是否含有有机磷农药反应方程式如下 n och3 o cl o cl 植物酯酶 ch3cooh + o ncl o cl o oh 二氯靛酚，橙色 靛酚，蓝色 此方法制得的酶片廉价易得且酶片和底物片的保存期长克服了胆碱酯 酶昂贵不易保存的缺点且显色体系简单颜色变化明显无须使用大型仪 器易于在小型仪器上实现现场快速测量但目前只用于定性的分析检测灵 敏度不够高根据本课题组金伟14同学的研究结果可知其灵敏度与乙酰胆碱 酯酶基本上相差一个数量级 植物酯酶的来源有小麦玉米大米等其中豫麦 39 和周麦 9 对农药最敏 感35韩承辉34从面粉中提取面粉酶溶液制成酶片检测水中或蔬菜上有机磷 农药其检测限低于 10mg/kg每次测定只需 58min测定一个样品成本约 0.1 元 另外还可以利用植物酯酶水解 -乙酸萘酯生成的产物之一萘酚和固蓝 b 盐作用形成紫红色的偶氮化合物从而进行显色反应酶被农药抑制的程度与 溶液颜色深浅相关从而测定农药残留 36该法存在的缺点仍然是灵敏度较 低 1.4.4 生物传感器法12,37 生物传感器(biosensor)是由一种生物敏感部件与转换器紧密配合对特定 化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置简单的生物传感 器如温度敏感指示物复杂的如 dnarna 探针传感器的生物敏感层与复 杂样品中特定的目标分析物之间 如酶与底物抗体与抗原外源凝聚素与糖 核酸与其互补片段之间的识别反应会产生一些物理化学信号如光热声 质量颜色电化学等的变化这些变化通过不同原理的转移器如光敏管 压电装置光极热敏电阻离子选择性电极等转换成第二信号通常为电信 号经放大后显示或记录 10 生物传感器可分为酶生物传感器微生物传感器免疫传感器仿生生物 传感器双层脂膜传感器12其中的酶生物传感器一般只能检测对酶有抑制作 用或作为酶底物的一类化合物作为农药残留初步筛检的方法具有简便快 速的优点但所用酶几乎都是从自然界筛选来之不易成本较贵不易保 存难以多次反复使用 该法是近些年发展较快的一种快速检测技术国内外都有很多报道其具 有实时快速的优点但灵敏度稳定性和使用寿命仍需进一步提高nunes 等38用取自果蝇突变型野生型和电鳗的乙酰胆碱酯酶制作生物传感器对甲 胺磷的最低检测浓度分别为1.4g/l4.8g/l 和53g/leldefrawi等39设计 制造了一种纤维光度酶生物传感器它可以用来快速检测乙酰胆碱酯酶抑制 物并能重复利用它是利用多克隆的抗对硫磷抗体具有很强的专一性和敏感 性而制造的然而这种传感器应当先检测高敏感的氧磷乙酰胆碱酯酶抑制物 时再检测低活性的硫代磷时就不再敏感而在其他情况下均可很好地被 重复利用 目前国家正式公布的关于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类残留农药快速检测 的标准方法有 1. 中华人民共和国国家标准 gb/t 5009.1992003果蔬中有机磷及氨基 甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制率法 2003-08-11 发布 2004-01-01 实施乙酰胆碱酯酶检测体系使用分光光度计于 412nm 处通过 检测反应体系显色 3min 后吸光度的变化来计算抑制率进而判断是否有高剂量农 药存在 2. 中华人民共和国国家标准 gb/t 5009.1992003果蔬中有机磷及氨基 甲酸酯农药残留量的简易检验方法速测卡法 2003-08-11 发布2004-01-01 实施 胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯红色水解为乙酸和靛酚蓝色有机 磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用使催化水解变色的过程发 生由此判断出样品中是否有高剂量农药存在 3. 中华人民共和国农业行业标准 ny/t 448-2001果蔬上有机磷和氨基甲 酸酯类农药残毒快速检测方法 2001-06-01 发布2001-10-01 实施丁酰 胆碱酯酶检测体系使用分光光度计于 4103nm 处通过检测反应体系显色 3min 前后吸光度的变化来计算抑制率并判断是否有高剂量农药存在 11 1 . 5 样品预处理方法研究进展 农残测定样品的预处理步骤包括样品的提取和样品的净化和浓缩 提取指使 用适当的溶剂将待测物连同样品基质从固态样品中转移至易于净化和分析的液 态 净化指将待测物与提取液中的干扰物质分离 在现代残留农药检测中 提取 净化可一步完成提取净化的界限已十分模糊目前应用于农药残留的提取方 法主要有11,40 1. 振荡法将样本剪碎之后在盛有样本的容器中加入提取液振荡数分 钟至数小时此法简便并且提取效果好被普遍采用国标快速测定有机磷和氨 基甲酸酯类农药残留的酶抑制率法17即采用该提取技术 2. 漂洗法将完整的样本浸渍在提取液中或用提取液漂洗样本此法适 用于提取附着在样本表面的农药和药物残留在酶抑制率法中一些含有对酶有 抑制作用的次生物质的蔬菜样品如葱蒜萝卜韭菜等 错误未定义书签的农药残留 的提取也可采用本法 3. 消化法41样本中加入氢氧化钠或硝酸等消化剂加热使样本消化再 用溶剂将待测农药和药物提取出此法多用于不易匀浆不易捣碎的动物组织样 本 4. 索氏提取法将样本放在索氏提取器套管中圆底烧瓶中加入提取剂 加热连续提取数小时此法为经典提取法也叫完全提取法为国际上的标准方 法提取效果好但需时间过长干扰物质也较多 5. 匀浆法42将样本放在匀浆杯中加入提取剂快速均质几分钟此法 简便快速效果好已被普遍采用 6. 超声波提取法样本经粉碎或匀浆捣碎后加入提取剂在超声波仪中 提取一定时间 万益群等43以丙酮石油醚混合溶剂为提取剂 超声提取中药中 的有机磷农药用固相吸附层析柱装填 4g 弗罗里硅土和 2g 中性氧化铝净 化采用 gcfpd 法同时测定中药中多种有机磷农药残留量方法检出限为 0. 0110. 015 g/ml回收率为 85. 5 %107. 8 % 7. 超临界流体萃取技术sfe在超临界状态下温度或压力发生轻微改 变就会导致流体密度的较大变化使流体夹带的物料增大或减少从而达到提取 或分离的目的该方法是当前发展最快的分析技术之一国外很多实验室已经用 12 来作为液体和固体样品的前处理技术其优点是基本上避免了使用有机溶剂,简 单快速,能选择性地萃取待测组分并将干扰成分减少到最小程度减少一般提取 方法所占用的玻璃仪器及实现操作自动化目前最常用的超临界流体是 co2为 了改进对极性农药的萃取能力 常在 co2中加入少量极性溶剂如甲醇 stefani44 根据不同的 sfe 操作条件通过掺入适量农药强化苹果基质可同时检测出 92 种农药残留并得到较好的回收率和重现性由于 sfe 需要一定的特殊设备 使目前广泛应用受到限制 但由于它具有许多独特的优点 其应用前景十分光明 8. 固相萃取技术(spe)spe 是同时进行萃取和浓缩的有效方法是一种基 于液相色谱分离机制的样品制备方法在液相色谱中通过使样品在吸附剂与溶 液中溶解度及功能团的相互作用最佳化而达到分离目的在 spe 技术中通过 使这些相互作用达到最佳化状态来影响样品的滞留与洗脱 根据待测农药和药物 性质样品种类等选用合适的微型柱和淋洗剂该方法已经广泛应用于农药和 药物残留检测工作它属于吸附剂萃取法中使用较广泛的一种方法它克服了液 液分配和一般柱层析的缺点具有高效简便快速安全重复性好和便于前 处理自动化等特点rodriguez45利用 spe 与毛细管胶束电动色谱mekc联 用技术同时测定了水果和蔬菜中的 8 种杀菌剂农药残留加标回收率范围为 30%105%delgado 46用轻石油醚和二氯甲烷的混合溶液提取 c8 的 spe 柱 净化富集 然后分别用 gcecd 和 gcnpd 检测马铃薯中的氨基甲酸酯类农 药 9. 固相微萃取技术(spme)该技术是近年来发展起来的一种用溶剂量很少 的新的提取方法 spme 除拥有 spe 的所有优点外 同时消除了 spe 中诸如堵 塞和使用溶剂的缺点并且不需要特殊的热解吸配件任何会使用注射器的人都 能完成微萃取过程,可以人工操作,也可与自动进样器配合使用simplicio 等47 采用 spm e-gc-fpd 联用方法测定水果和果汁中有机磷农药实验表明对于水 果及果汁基体中所有农药 该方法检测限在 2 g/kg 以下 在 25 g/kg 到 250 g/kg 的浓度范围内果汁中每种农药残留的平均回收率在 75.9%和 102.6%之间而 水果中除了吡唑其它农药平均回收率在 70和 99之间correia48用 spm e-gc-ecd 联用方法测定酒中 9 种有机氯和 11 种有机磷农药残留并且讨论了 纤维涂层萃取时间萃取温度以及纤维暴露在样品中的时间等因素对萃取效果 的影响 13 常用的净化方法有液液分配法吸附柱层析法磺化法凝结沉淀法冷冻 法浓缩方法主要有自然挥发法吹气法k-d 浓缩器法真空旋转蒸发法 干热式样品制备仪( 氮吹仪)其中干热式样品制备仪是近几年兴起的一种方法 有加热搅拌和蒸发功能广泛用于样品浓缩高效氮气吹干和衍生化反应等 1 . 6 课题来源 本研究课题来源于国家科技部十五科技食品安全重大专项资助项目 瓜果蔬 菜农药残留快速筛选测定仪项目编号为 2001ba804a40 14 2 乙酰胆碱酯酶检测体系试剂包的优化研究 近年来基于乙酰胆碱酯酶光度法的商品化分析仪器开始陆续面市相应 的乙酰胆碱酯酶检测体系成套试剂包也有商品化产品供应如上海昆虫研究所 提供的乙酰胆碱酯酶成套试剂包其试剂配方和国标gb/t 5009.1992003的大 致相同主要包括底物酶显色剂等每套试剂包售价400元可测量300个 样品每个样品测量仅试剂成本就在1.2元以上如果需要测量大量样品试剂 费用将是一笔不小的开支因此在保证一定的检测灵敏度的前提下对现有 试剂包进行优化降低农药残留检测成本是一项很有现实意义的工作 本章对乙酰胆碱酯酶检测体系商品化成套试剂包做了进一步的优化研究 减少了试剂用量降低了成本进一步完善了该检测体系 2 . 1 主要仪器和试剂 表 2-1 主要实验仪器和试剂 序号 名 称 生 产 厂 商 1 cary 50 probe uv/vis spectrophotometer 美国 varian 公司 2 cs501 型超级恒温器 重庆实验设备厂 3 1cm 玻璃比色皿 上海长征电学元件厂 4 fa2004n 型电子分析天平200g/0.1mg 上海精科天平仪器厂 5 移液枪50-250l 上海求精生化试剂仪器有限公司 6 甲胺磷标准品 国家农药质量监督检验中心 7 敌百虫标准品 国家农药质量监督检验中心 8 敌敌畏标准品 国家农药质量监督检验中心 9 呋喃丹标准品 国家农药质量监督检验中心 10 乙酰胆碱酯酶 上海昆虫研究所 11 硫代乙酰胆碱底物 上海昆虫研究所 12 二硫代二硝基苯甲酸显色剂 上海昆虫研究所 2 . 2 测量方法 2.2.1 测量原理 乙酰胆碱酯酶检测体系测量农药的原理是根据农药对酶的抑制作用大小来 判断农药毒性的在乙酰胆碱酯酶ache的催化作用下硫代乙酰胆碱 15 atch底物可以水解为硫代胆碱和乙酸硫代胆碱和二硫代二硝基苯甲酸 dtnb显色剂产生显色反应黄色在 412nm 处有最大吸收峰在没有 有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时底物在酶的催化作用下水解反应速率可 以用吸光度值随时间的变化率 k0来表示当有农药存在时农药抑制了酶的活 性使体系的反应速率变小此时速率以 kt表示则有机磷和氨基甲酸酯类农 药对酶的活性的抑制率 0t 0 kk y100% k =不同种类不同浓度的农药对应的 抑制率不相同以此可以建立农药残留量和酶活性抑制率之间的对应关系从 而定量测定残留农药毒性 2.2.2 商品化试剂包原配方 由上海提供的乙酰胆碱酯酶检测体系商品化试剂包主要包括乙酰胆碱酯酶 酶硫代乙酰胆碱底物二硫代二硝基苯甲酸显色剂其配制方法 如下 ? 提取液ph=8 的磷酸盐缓冲溶液将两袋粉剂倒入 500ml 试剂瓶内 加入 510ml 蒸馏水摇匀溶解后备用 ? 稀释液将两袋粉剂倒入 250ml 瓶内加入 100ml 蒸馏水摇匀溶解 后备用 ? 酶 液每瓶酶粉加 5.2ml 稀释液摇匀后置于 4备用配制好的酶 液在 4下可使用 7 天浓度以 m1 表示 ? 底 物每瓶底物粉剂中加 5.2ml 蒸馏水摇匀后置于 4备用配制 好的底物液在 4下可使用 3 天浓度以 d1 表示 ? 显色剂将 2 袋显色剂粉剂混合瓶内加入 32ml 稀释液摇匀溶解置 于 4下备用浓度以 x1 表示 操作方法如下 1) 样品预处理选取有代表性的蔬菜样品冲洗掉表面泥土剪成 1cm 左右见方碎片取样品 1g放入烧杯或提取瓶中加入 5ml 缓冲溶液 振荡 12min倒出提取液静置 35min待用 2) 空白溶液测试先于试管中加入 2.5ml 提取液再加入 0.1ml 酶液 0.1ml 显色剂摇匀后于 37放置 15min 以上每批样品的控制时间 16 应一致加入 0.1ml 底物摇匀 此时溶液开始显色反应 立即倒入 1cm 玻璃比色皿中于 412nm 波长下测量记录反应 3min 的吸光度变化值 a0并计算反应速率 00 0 aa k t3min = 3) 样品溶液测试先于试管中加入 2.5ml 样品提取液其他操作与空白 溶液测试相同记录反应 3min 的吸光度变化值at计算反应速率 tt t aa k t3min = 4) 结果计算抑制率 0t 0 aa y100% a = 0t 0 kk 100% k 5) 结果判断当蔬菜样品提取液对酶的抑制率50时表示蔬菜中有高 剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在样品为阳性结果阳性结果的样 品需要重复检验 2 次以上 2 . 3 实验部分 对上海提供的乙酰胆碱酯酶检测体系成套试剂包进行优化研究内容主要 有改变酶显色剂底物的三种主要试剂的用量改变 ph 值等反应条件调 整前后配方的比较调整后配方对三种农药甲胺磷敌百虫敌敌畏的检出 限等即研究各种因素对测量结果的影响寻找一种更廉价优异的配方 2.3.1 吸收曲线 图 2-1 乙酰胆碱酯酶检测体系显色 0246810min 后的吸收曲线由 下至上 使用紫外/可见分光光度计扫描空白显色溶液在 300800nm 区间的吸收曲 线操作方法为在 2.5ml 提取液中加入 0.1ml 酶液和 0.1ml 显色剂混匀 在 37水浴中放置 15min 后加入 0.1ml 底物溶液显色溶液立即变黄且随着 17 时间增加颜色逐渐加深 以蒸馏水为参比分别在体系显色 0min2 min4 min 6 min8 min10 min 时扫描吸收曲线如图 2-1 所示由图可确认该体系的最 大吸收波长为 412nm 2.3.2 配方优化 2.3.2.1 ph 值的影响 实验目的通过比较反应体系在不同 ph 条件下对相同浓度农药的抑制率大 小确定反应的最佳 ph 条件 试剂采用上海试剂原配方农药为 1.04mg/l 甲胺磷溶液使用不同 ph 值 的磷酸盐溶液做溶剂其中磷酸盐溶液的配制方法见表 2-2ph 值以 ph 计的实 测值为准 考虑到有机磷农药在碱性环境中容易分解 错误未定义书签以及酶可能在中 性环境中活性较高由乙酰胆碱酯酶主要从动物组织中提取来推断因此初步 试验条件的 ph 值从 5 变化到 9 左右 表 2-2 不同 ph 值磷酸盐溶液的配制方法 ph 值 配 制 方 法 9.0 1.775g na2hpo4溶于 250ml 蒸馏水中 8.0 提取液见 2.2.2 6.9 0.8505g kh2po4和 0.8874g na2hpo4溶于 250ml 蒸馏水中 5.9 1.7011g kh2po4和 0.1775g na2hpo4溶于 250ml 蒸馏水中 4.8 0.3402g kh2po4溶于 250ml 蒸馏水中 操作方法为分别取 2.5ml 不同 ph 值磷酸盐溶液于试管中再分别加入 0.1ml 酶液0.1ml 显色剂摇匀后于 37水浴中放置 15min 后加入 0.1ml 底 物摇匀立即倒入 1cm 玻璃比色皿中于 412nm 波长下测量记录反应 3min 的吸光度变化值a0并计算空白斜率 k0同样取 2.5ml 不同 ph 值的农药溶 液于试管中以下步骤同空白溶液测定计算农药斜率 kt平行做两组n=2 下同取平均值计算抑制率数据见表 2-3 实验结果表明乙酰胆碱酯酶反应体系在 ph 为 8 时的抑制率最高相同浓 度的农药溶液对酶的抑制率越高说明体系的反应越灵敏因此下面的实验仍采 用 ph8 的磷酸盐缓冲溶液作为提取液 18 表 2-3 不同 ph 值对抑制率的影响n=2 ph 值 4.8 5.9 6.9 8.0 9.0 空白斜率 0.0714 0.0543 0.1162 0.1364 0.0524 农药斜率 0.0536 0.0411 0.0731 0.0549 0.0446 抑制率 25 24 37 61 15 2.3.2.2 酶用量的影响 底物和显色剂的用量不变 比较不同用量的酶液对相同浓度农药的斜率和抑 制率的影响 试剂原配方酶液和底物稀释 2.5 倍显色剂浓度不变农药为 0.928mg/l 的甲胺磷溶液提取液做溶剂 操作方法于试管中加入 2.2ml 提取液或农药溶液然后加入 xml 酶 液和 0.1ml 显色剂37恒温水浴放置 15min 后加入 0.25ml 底物摇匀立即倒 入 1cm 比色皿中于 412nm 处测定 3min 内吸光度数值计算斜率抑制率数据 结果见表 2-4 表 2-4 酶液用量的影响n=2 酶液用量 (x ml) 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 空白斜率 0.0550 0.0811 0.1067 0.1278 0.1523 农药斜率 0.0246 0.0359 0.0471 0