（材料学专业论文）树脂填充乙烯乙烯醇共聚物中空纤维膜吸附剂的制备与性能表征.pdf

摘要 为了避免料液对膜吸附剂的污染，降低聚合物基质材料对蛋白质的吸附量， 本研究使用亲水性的乙烯一乙烯醇共聚物( e 虬) 为基质材料，采用干湿法， 制备了两种离子交换树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂，并对其性能进行了表 征。采用膜色谱技术，对特定蛋白质进行选择性吸附，达到分离纯化蛋白质的目 的。 以乙烯一乙烯醇共聚物( e 让) 为中空纤维膜吸附剂的基质材料，微米级 大孔型苯乙烯系阳离子交换树脂d 0 6 1 为功能性颗粒，二甲基亚砜( d m s o ) 和 辛醇( c p ) 分别为溶剂和添加剂，制备了阳离子交换树脂填充e v a l 中空纤维 膜吸附剂。研究了这种膜吸附剂对牛血清白蛋白( b s a ) 和牛血红蛋白( h b ) 的静态吸附性能；考察了树脂填充量、蛋白质缓冲溶液的p h 和吸附时i b j 对蛋白 质静态吸附性能的影响；探讨了缓冲溶液的不同p h 下膜吸附剂对b s a 和h b 混 合物的吸附分离状况。研究结果表明，随着树脂填充量的增加，膜吸附剂对蛋白 质的吸附容量增加；并且随着吸附时间的增加膜吸附剂对蛋白质的吸附量也增 大。当树脂填充量为6 5 时，b s a 的缓冲溶液p h 为4 5 时膜吸附剂对b s a 的 吸附容量可以达到7 7 1 4 m g b s a g 膜吸附剂，而h b 的缓冲溶液p h 为2 0 时膜吸 附剂对h b 的吸附容量可以达到5 4 8 4 m g h b g 膜吸附剂。缓冲溶液的p h 在7 0 时对b s a 和h b 分离效果较好，其分离系数为1 0 左右。研究结果对蛋白质的分 离纯化具有重要的参考价值。 以乙烯一乙烯醇共聚物( e w 儿) 为中空纤维膜吸附剂的基质材料，微米级 弱碱性阴离子交换树脂d 3 0 1 r 为功能性颗粒，二甲基亚砜( d m s o ) 和辛醇分 别为溶剂和添加剂，制备了阴离子交换树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂。研 究了树脂填充量对中空纤维膜吸附剂结构和性能的影响。结果表明，该膜吸附剂 随着树脂填充量增加，膜结构越来越致密，纯水通量减小，对蛋白质的截留率增 大。 关键词：乙烯一乙烯醇共聚物；离子交换树脂；中空纤维膜吸附剂；牛血清蛋白； 牛血红蛋白：静态吸附容量 a b s t r a c t i no r d e rt os o l v et h ep o l l u t i o no fm e m b r a n ea d s o r b e n t sa n dr e d u c en o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o nc a u s e db yp o l y m e rs u b s t r a t e ，e v a lh o l l o wf i b e rm e m b r a n ea d s o r b e n t s f i l l e dw i t ht w ok i n d so fr e s i n sw e r ep r e p a r e dt h r o u g hd r y w e ts p i n n i n gp r o c e s s ，b y u s i n gh y d r o p h i l i cc o p o l y m e re v a la s t h ef i b e rs u b s t r a t ea n d s t u d yt h e i r c h a r a c t e r i z a t i o n c a t i o ne x c h a n g er e s i n ( d 0 6 1 ) f i l l e de t h y l e n ev i n y la l c o h o lc o p o l y m e r ( e v a l ) h o l l o wf i b e rm e m b r a n ea d s o r b e n t sw e r ep r e p a r e db yu s i n ge v a lf i t sm e m b r a n e m a t r i xm a t e r i a l ，d 0 61 嬲f u n c t i o n a lp a r t i c l e s ，d m s oa ss o l v e n t ，a n dc pa sa d d i t i v e t h em e m b r a n ea d s o r b e n t sc h o o s et oa d s o r ba i mp r o t e i n u s i n g m e m b r a n e c h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g ya n ds e p a r a t ep r o t e i n n 圯m e m b r a n ea d s o r b e n tw a s d e v e l o p e dt os t u d yi t sa d s o r p t i o nb e h a v i o rw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n d b o v i n eh e m o g l o b i n ( h b ) t h ee f f e c to ft h er e s i n f i l l e dc o n t e n t , t h ep hv a l u eo fb u f f e r s o l u t i o na n dt h et i m eo fa d s o r p t i o no np r o t e i ns t a t i ca d s o r p t i o np e r f o r m a n c ew a s d i s c u s s e d t h em e m b r a n ea d s o r b e n tf o rb s a - h bm i x t u r ew a ss t u d i e da td i f f e r e n tp h v a l u eo fb u f f e rs o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t a t i cp r o t e i na b s o r p t i o nc a p a c i t y i n c r e a s e sw i t hi o n e x c h a n g er e s i n sl o a d i n ga n da d s o r p t i o nt i m e t h es t a t i cb s a a d s o r p t i o nc a p a c i t yw a s7 7 14 m gb s a gm e m b r a n ea d s o r b e n t sa tp h4 5a n dt h e s t a t i ch ba d s o r p t i o nc a p a c i t yw a s5 4 8 4 m g h b gm e m b r a n ea d s o r b e n t sa tp h 2 0 w h e n d 0 61r e s i nl o a d i n gc o n t e n tw a s6 5 t h eb s a - h bs e p a r a t i o ne f f i c i e n c yw a sb e t t e r w h e nt h ep hv a l u eo fb u f f e r s o l u t i o nw a sa t7 0f o rb s a h bm i x t u r e ，i nw h i c h s e p a r a t i o nf a c t o rw a sa b o u t10 a n i o ne x c h a n g er e s i n ( d 3 01r ) f i l l e de t h y l e n ev i n y la l c o h o lc o p o l y m e r ( e v a l ) h o l l o wf i b e rm e m b r a n ea d s o r b e n t sw e r ep r e p a r e db yap h a s es e p a r a t i o nm e t h o d ，u s i n g e v a la sm e m b r a n em a t r i xm a t e r i a l ，d 3 01ra sf u n c t i o n a lp a r t i c l e s ，d m s oa s s o l v e n t ，a n dc pa sa d d i t i v e t h ee f f e c to ft h er e s i n f i l l e dc o n t e n to nt h ef o r m a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fm e m b r m t ea d s o r b e n t sw a ss t u d i e d ：t h er e s u l t ss h o w nt h a tt h e h o l l o wf i b e rm e m b r a n ea d s o r b e n t sb e c a m ed e n s e r ，t h ep u r ew a t e rf l u xd e c r e a s e da n d b s ar e j e c t i o nr a t ei n c r e a s e dw i t hr e s i nl o a d i n g k e yw o r d s ：e v a l ；i o ne x c h a n g er e s i n ；h o l l o wf i b e rm e m b r a n ea d s o r b e n t s ；b s a ；h b ； s t a t i ca d s o r p t i o nc a p a c i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究jj ：作和取得的研究成果， 除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得云鎏至些太堂或其他教育机构的学位或证j 拈而使用过的材料。与我一同工作 的同忠对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 滟论文作者签名：咎国勺 签字醐“7 月心日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权丞 洼三些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采川影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有犬部fj 或机构送交论文 的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密币适川本授权说明) 学位论文作者签名： 盈刁 签字日期：弘吁年月厂日 导师签名： ；艺易缸 签字眺呻年渊d 自 | 学位论文的主要创新点 为了避免料液对膜吸附剂的污染，降低聚合物基质材料对蛋 白质的吸附，采用了亲水性的乙烯一乙烯醇共聚物( e 址) 为膜吸附剂的基质材料，为制备非特异性吸附低的中空纤维 膜吸附剂提供了一条新途径。 制备了离子交换树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂，这种膜 吸附剂能将分子量相近的蛋白质混合物进行有效的分离纯 化，为中空纤维膜吸附剂的研究开发提供了一条可行之路。 本研究制备的离子交换树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂结 合了e v a l 的亲水性能、中空纤维膜表面积大的特点以及离 子交换树脂的吸附功能，这种膜吸附剂作为膜色谱介质具有 重要意义。 第一章引言 1 1 论文的选题依据 第一章引言 膜色谱是膜分离技术和色谱技术二者之间有机结合的产物，是近期发展起来 的一种新型生物分离技术。膜色谱介质是通过选择制备合适的膜，将对生物大分 子有特异性和选择性的基团连接到膜的表面及孔壁中去制备而成。 膜色谱是一种新型的分离方法，是目前分离技术研究的热点之一。随着膜技 术的发展，膜色谱在大规模蛋白质( 特别是基因工程蛋白质) 分离纯化方面必将 发挥越来越大的作用。采用膜色谱技术分离纯化蛋白质有很多优点，例如，料液 流动快、溶质停留时间短、膜色谱柱的跨膜压差较低、具有较高蛋白质吸附容量、 膜色谱可以线性规模放大以及可以就地清洗操作等等i l - 5 l 。 膜色谱作为一种有竞争力的分离方法在生物制品的分离纯化中应用明显增 加。它主要用于蛋白质及单克隆抗体等生物大分子的分离纯化以及热原等污染物 的去除。有人称该方法是蛋白质下游处理的完整性技术i 。 鉴于以上原因，本文制备了离子交换树脂乙烯乙烯醇共聚物( e l ) 中 空纤维膜吸附剂，弥补了单纯膜分离技术在蛋白质分离中的缺陷，希望能够克服 颗粒填充色谱的缺点。 1 2 论文的研究思路 对于离子交换树脂填充乙烯乙烯醇共聚物( e w 山) 中空纤维膜吸附剂，本 文的研究思路为：以杂化中空纤维膜为研究平台，选用对蛋白质吸附较弱的高分 子材料e v a l 作为基质材料，微米级离子交换树脂作为功能性颗粒，采用相转化 方法，制备了具有吸附功能的树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂。以牛血清白蛋 白( b s a ) 和牛血红蛋白( h b ) 作为模型物，对树脂填充e v a l 中空纤维膜吸 附剂的纯水通量、孔隙率、蛋白质截留率、蛋白质的静态吸附容量和脱附性能进 行了研究，以确认树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂作为膜色谱介质的可行性与 有效性，以期用于生物制品的分离纯化。 1 3 论文的研究目的 本课题研究目的是制备树脂填充e v a l 中空纤维膜吸附剂，使膜吸附剂内 天津t 业人学硕士学位论文 部结构比较疏松均一、具有较大的蛋白吸附容量；课题通过改变离子交换树脂的 填充量对蛋白质的静态吸附性能进行研究。 第二章文献综述 2 1 膜色谱技术 第二章文献综述 近年来，生命科学和生物工程得到了迅速发展，分离过程占蛋白、酶、多肽 及疫苗等生物制品成本的3 0 - - 6 0 。分离过程的成效己成为生物技术发展的一个 重要方面。生物技术的迅速发展和生物大分子的潜在医用价值都迫切的要求可 靠、高效地分离纯化蛋白质、多肽和核酸的方法。生物分子的分离纯化有它们独 特的性质，大量的制备生物产品有很多特殊要求。选择纯化方法时除了考虑主体 细胞白、d n a 、内毒素、病毒等因素外，必须消除潜在的有害变异。一般对重 组d n a 的分离制备需要很高的分辨率，药物的前期制备中若酶蛋白出现了一个 氨基酸的变异或污染水平超过l p p m 都是不允许的。 蛋白质的生产过程可分为上、下游过程。上游过程是运用基因工程等现代生 物技术生产目标蛋白质，下游过程是分离、纯化、加工目标蛋白质。目前，蛋白 质生产中的上游过程发展很快，但下游蛋白质的分离纯化技术却没有得到相应进 展，从而难以适应蛋白质生产商品化的要求，使得下游技术成为蛋白质生产过程 中的“瓶颈”技术。一般说来，现代生物工程产品的分离纯化费用约占总投资的 8 0 9 0 。有些重要蛋白质在实验室规模已经获得成功，但却因无法走向工业化 生产而难以取得很大的经济效益和社会效益。 蛋白质分离是生物工程的一个重要领域，与通常的化学物质相比，蛋白质的 生物活性易受周围环境的影响，高温、有机溶剂、剪切力、溶液的p h 值、离子 强度的变化，往往导致蛋白质分子的变性失活。特别是用于临床的生物医药产品， 不仅要达到很高的纯度，而且还要在分离过程中最大限度地保持其生物活性。大 规模制备蛋白的分离纯化技术已成为生物技术发展的一个限制因烈6 l 。能从成千 上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原理是不同蛋白质在它们的许多物 理和化学性质有着极大的不同1 7 j 蛋白质的这些特点，决定了用于常规化学物质和生物小分子( 如抗生素) 分离 的方法在蛋白质分离上不再适用。为了加速生物技术的产业化，必须开发适用于 蛋白质分离的快速高效的分离方法和分离设备。蛋白质纯化分离的方法有很多 种，例如层析分离技术、电泳技术、膜分离技术、色谱法、膜色谱技术等。 膜分离技术具备低温操作、保活性好、设备较为简单、处理量大、操作方便、 易于实现自动化等特点，作为生物大分子纯化分离的有力工具己得到迅速发展， 天津工业人学硕士学位论文 尤其适用于工业规模对目标产品的纯化分离。然而，膜分离技术是利用膜的孔径 大小对目标物进行分离，分离产物的纯度相对较低。例如，采用超滤技术分离生 物大分子时，一般相对分子质量要相差十倍以上才能有效分离，而对于那些相对 分子质量仅相差几倍的体系则分离效果较差。 色谱技术是蛋白质分离的一种有效方法。最初，色谱法是一种制备分离技术。 六十年代，由于仪器技术的重大进展，出现了分析型高效液相色谱，进入八十年 代，由于生物技术和基因重组技术的发展，需要开发非传统的分离技术，以分离 纯化那些用常规分离技术难以处理的物质，如多肽、核酸等生物大分子。因而， 制备高效液相色谱同益受到人们的重视。但高效液相色谱成本昂贵，高压操作也 给实际生产带来了一系列问题。 自2 0 世纪8 0 年代中期就有人试图将膜分离和色谱这两种技术有机的结合起 来，发挥各自的长处，即选择制备合适的膜，将对生物大分子有特异性和选择性 的基团连接到膜的表面及孔壁中去，从而制备一种新型的色谱介质即膜色谱介 质，这种分离技术称为膜色谱1 1 。5 1 。八十年代后期，出现了膜色谱分离技术，为 蛋白质的分离纯化丌辟了新途径。 膜色谱技术是一种高效的分离方法，是液相色谱和膜分离相结合的一种新技 术，融合了二者之长，具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，能满足生 物大分子高效分离与纯化的需要，在生物大分子的分离与纯化中已日益受到人们 的重视，必将得到广泛的应用。 2 1 1 膜色谱的工作原理 膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质，连接配基，利用膜配基与蛋白质之 问的相互作用进行分离纯化。其作用原理如下图2 1 ： - 0 配基v 0 杂蛋白 b目标蛋白 图2 1 膜色谱分离示意图 4 第二章文献综述 当料液以一定流速流过膜的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异 性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下 来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍1 8 1 ，可见其分离选择性很高。 2 1 2 膜色谱的特点 膜色谱是目前生物大分子分离中最为有效的方法之一，其特点为： ( 1 ) 色谱填料柱中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层，膜厚相当于 床层高度，当床层体积一定时，这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速， 从而提高了分离速度和处理量； ( 2 ) 与液相色谱技术相比，膜多孔基质上配基与液流主体间的扩散路径极短， 膜介质只受表面液膜扩散及吸附动力学的影响1 9 1 ，消除了传统色谱中占主要地位 的孔扩散阻力，大大改善了传质效果，所以传质极快，提高了配基的利用率和总 的分离速度，分离时问显著缩短，一次循环操作时问一般只是普通填料柱的十分 之一，分离效率提高，并有利于保持配基和目标蛋白的生物活性； ( 3 ) 由于采用了膜介质，膜的孔隙率大，孔表面积就大，所以膜的厚度很薄 就能满足分离要求，整个床层的压降就大为降低，一般只用低压蠕动泵即可满足 分离要求。这样既降低了设备投资和运行费用，也避免了液流与泵体直接接触， 便于无菌操作和防止蛋白质失活； ( 4 ) 配基修饰过的膜介质选择性与填充柱相当，在采用足够的膜堆和梯度沈 脱技术之后，可以获得较高的分离纯化效果； ( 5 ) 膜介质具有良好的刚性，能够承受较高的压力，且易于放大，便于实现 大规模连续分离和自动操作； ( 6 ) 与普通的膜技术相比，用膜色谱分离时，不单是利用孔的大小，更主要 是利用膜吸附剂的吸附性和选择性，所以不易受分子量大小的限制。 2 1 3 膜色谱介质材料 吸附膜介质的选择是影响膜色谱分离效果的重要因素之一，要取得成功的膜 色谱分离过程，必须选择合适的膜介质。理想的膜介质应具备以下几个特点：( 1 ) 应是亲水性，不对蛋白质等生物大分子产生非特异性吸附作用，对杂蛋白的吸附 尽可能的小，以提高产品纯度；( 2 ) 有大量适当大小的孔及较窄的孔径分布，膜 孔大小必须能够使得目标蛋白和膜孔表面的配基自由的接触，以便偶联尽可能多 的配基，并为配基与目标蛋白的相互作用提供场所；( 3 ) 膜基质上含有可与配基 进行共价键合的官能团，如环氧基、氨基、羟基和羧基等，这样的膜材料往往可 由带有上述官能团的单体进行共聚或均聚，然后用所合成的高分子材料经过特殊 天津工业大学硕士学位论文 工艺成型而得：( 4 ) 膜基质材料应具有一定的物理与化学稳定性，能承受液流穿 过膜孔时产生的剪切力，可进行反复的吸附、洗脱、再生和灭菌过程；( 5 ) 所选 膜材料应易于成膜，能够进行高压灭菌，且来源广泛，成本较低，适合于工业化 生产。 目前，常用作膜色谱介质的材料可分为天然高分子材料、人工合成高分子材 料、复合膜等三类。天然高分子材料有纤维素、壳聚糖等，这些材料与配基的结 合较为方便，且具有较好的化学稳定性；人工合成高分子材料如聚砜、聚酰胺等， 具有优良的成膜性能及良好的机械和热稳定性，经活化处理后其性质变化也不大， 非常适合作为膜介质；复合材料如纤维素丙烯酸接枝共聚物、聚醚砜( p e s ) 聚乙烯氧化物( p e o ) 羟基乙基纤维素( h e c ) 等，若以定孔径的惰性基质 为底膜，在其上覆盖这类共聚物膜，可作为配基的支撑膜。 现在比较成功的用于微滤和超滤的膜材料大多是疏水性的，如聚乙烯，聚丙 烯，聚偏氟乙烯，聚砜等i l o l 。它们有良好的热稳定性及耐化学腐蚀性。然而疏 水性膜在使用过程中由于溶质吸附和孔堵塞而使得通量易于下降。引。尤其在蛋 白质分离时，由于蛋白质和膜表面之问的疏水性相互作用，在膜表面产生了蛋白 质非选择性不可逆吸附后，疏水性膜的通量衰减就异常明显。解决膜污染问题中 一个很重要的途径就是膜材料的选择，亲水性膜材料可以弥补此缺点：亲水性好 且孔径分布均匀的膜具有较强的抗污染能力。 乙烯一乙烯醇共聚物( e v a l ) 是美国杜邦公司在2 0 世纪5 0 年代研制丌发 的一种材料，它具有良好的亲水性能和较好的机械性能等特点，其化学式见下图： 七( c 吼一c h 2 冰c 弛1 h 丹一 i c i h 图2 - 2 乙烯一乙烯醇共聚物结构式 是通过乙烯与醋酸乙烯共聚、醇解制备，制备过程如下： ( 1 ) 聚合反应 妃：h + 妒h ，c o o c h = = c h 2 _ 电c h 2 c h 2hc h 2 车hb 斗 1 o c o c h ， ( 2 ) 醇解反应 黾c h 2 c h 2 取c h 2 车h 丹。_ 最c i i z c h z ) 7 ( c h 2 1 lh 抖。 l i o c o c h 3 o h 6 第二章文献综述 e v a l 是由亲水性乙烯醇单元和疏水性乙烯单元组成的结晶性无规聚合物， 聚合物链上带有一定比例的羟基，故具有一定的亲水性，接触角 1 4 , 1 5 1 1 拘实验也证 明其为亲水性材料；且c h 2 单元赋予了它较好的机械强度i l 引。它不溶于水，但 与血液有较好的相容性。因此，在湿态下，e v a l 表现出好的机械强度，高的热稳 定性和抗化学和抗生物性，并且易于用于杀菌，如y 射线杀菌。因此，e v a l 中 空纤维膜被广泛的应用于各种血液纯化装置包括血浆分离和人工肾。它是一种非 常有前途的生物医学材料【1 7 l ，正在成为新的热点研究领域。 2 1 3 1 基于e v a l 多孔分离膜的制备方法 常用的制备e v a i 微孔膜的方法是相转化法。相转化1 1 8 l 是一种以某种控制方 式使聚合物从液态转变为固体的过程，这种固化过程通常是由于一个均相液态转 变成两个液态( 液液分层) 而引发的。在分层达到一定程度时，其中一个液相 ( 聚合物浓度高的相) 固化，结果形成了固体本体。通过控制相转化的初始阶段， 可以控制膜的结构形态。 非溶剂引发相转化：非溶剂引发相转化过程成为从均匀的聚合物溶液制各聚 合物膜的一种标准的方法。在该过程中，通过溶剂和非溶剂的交换，富聚合物相 固化成为膜，贫聚合物相形成孔。溶剂和非溶剂的交换速率的快慢对产生的膜结 构有决定性影响，交换速率快时发生液一液分层，慢时发生固一液分层( 延迟分 层) 或者结晶。液一液分层产生非对称结构，表面是致密的皮层，亚层是指状大 空腔。固一液分层产生粒状结构，粒子之问互相相通，没有致密皮层，表层是开 孔结构。 发生何种分层是由溶剂和非溶剂之问的相互作用力决定的。当溶剂和非溶剂 之间的相互作用较弱时，发生延迟分层，也就是固一液分层；反之则发生瞬间分 层，即液一液分层1 1 9 l 。固一液分层先于液一液分层发生，但是由于固一液分层产 生的聚合物结晶需要聚合物链段重新排列到品格中去，所以结晶时聚合物品体的 成核速率慢于液一液分层中的成核速率。结晶相对于液一液分层来说是一个较慢 的过程，所以只有当液一液分层被充分抑制之后，结晶过程才会发生，膜才能形 成粒状结构形态l 驯。 基于溶剂和非溶剂的相互作用的强弱来决定膜的结构性能，t h y o u n 9 1 2 1 l 等研究了e v a i 和d m s o 体系的平衡相行为，找到很多的方法制得粒子状亲水性 e 虬微孔膜。在水一溶剂一聚合物体系中，由于溶剂d m s o 和非溶剂( 凝固浴) 水之问的相互作用力很强，所以会产生很快的交换速率，发生液一液分层，形成 非对称的膜结构。 为了降低溶剂和非溶剂之间的相互作用，l p c h e n g 等选用了与溶剂作用较 夫律t 业 掌硕士学位论文 弱的异丙醇f i ：j , j 凝同浴也能很好的阻止液一液分层的发生，促进固一液分层，形 成粒子状微孔膜1 2 2 , 1 9 j 。 给凝删浴中加入一定量的溶剂后，能使凝固洛变“软衅，与溶剂的作用 力变弱，降低了溶剂与非溶剂的变换速率，抑制了液一液分层，促进固一液分 层发生，生成具有均一结构的微孔膜i “纠。t hy o u n g l 2 0 1 还发现当凝固浴中加 入 定量的溶剂后，凝固浴的温度也对能吾发乍固一渡分层有晕要的影响。在较 低的温度，受聚合物结品机理的控制，且温度低时镕剂扩散速率较低，有利于发 牛同液分屡，胰溶液榭固为均匀的粒子状形态的微孔膜( 如图2 3 ) ；然而a 高温 下，交换进率快，液一液分层控制着凝固过程，形成细胞状的不对称膜结构( 如 罔2 - 4 1 。 圈噩 幽2 4 凝州浴中包含7 5 d m s o _ 1 2 5 水，温度为6 5 时幢的电镜 ! 片，蓖中e v a l 浓度为 2 0 ，a 和j b 分别山j ，表面目i 横断面唧i 第二章文献综述 水蒸气分相凝胶：t h y o u n g 在铸膜液浸入到凝固浴之前加入吸收水蒸气 的过程也能制得粒状微f f l e v 舢l 膜【z 4 1 。加入吸收水蒸气过程后，膜形成的结构是 表层为开孔状结构，且表层被均匀的互相结合在一起的粒子所形成的亚层所支 撑。这主要是因为水蒸气与溶剂之问的交换速率较慢，因而相分离速率慢，相分 离经历固一液分离，形成粒子状结构。吸收水蒸气的时间对膜结构也有影响【2 5 】。 时间短时，膜的形态结构就有可能包含固一液分层和液一液分层这两种相分离过 程。 溶剂蒸发：在进入凝固浴前增加蒸发溶剂过程后，由于溶剂的蒸发，制膜液 的组成发生变化，当溶剂蒸发到一定量后，制膜液将由均相的溶液产生微观相分 离。膜结构就由致密表层和指状大空腔的亚层所组成的非对称结构变为由互相结 合在一起的连续粒子所组成的对称结构1 2 6 l 。这是因为应用蒸发过程时，相分离 经由固一液分层而在慢慢进行，产生了延迟分层。因此在膜中形成了粒状形态， 蒸发过程使聚合物分子从铸膜液中结晶出来，从而阻止了大孔的形成。而且，蒸 发过程的连续性对膜结构中能否出现粒子有很强的影响力。蒸发温度【2 7 l 也对膜 结构有同样的影响。在低温下，所有的铸膜液受聚合物结晶机理控制而形成粒子 形态。而当蒸发温度升高时，e v a i 膜结构由粒子状形态结构变成致密表层形态。 改变铸膜液体系降低溶剂非溶剂之问的作用：t h y o u n g 泌2 9 】研究发现用 非溶剂非溶剂聚合物体系能代替传统的非溶剂溶剂聚合物体系来制取粒状 e v 蝴离膜。在传统的非溶剂一溶剂聚合物体系中，需要找合适的溶剂来溶解 聚合物，然后选用的非溶剂( 凝固浴) 必须能和溶剂很好的混溶。所形成的膜的 结构主要是由溶剂和非溶剂的相互作用控制。相互作用强时，它们之间的扩散速 率快，相分离经历液液分层，形成表皮致密，亚层具有指状空腔的非对称结构。 相互作用弱时，扩散速率慢，相分离经历固一液分层或者结晶过程，形成具有连 续的，互相结合在一起的球粒所形成的均质膜。在非溶剂非溶剂一聚合物体系中， 非溶剂水和异丙醇组成的助溶剂系统能代替传统的溶剂d m s o 。虽然水和异丙醇 都是e v a l 的非溶剂，可是一定比例的混合物在一定温度下却能够作为溶剂代替 d m s o 溶解e v a l 。用异丙醇作为凝固浴时，由于助溶剂( c o s o l v e n t ) 中包含一 定量的非溶剂异丙醇，所以助溶剂( 水与异丙醇的混和物) 和凝固浴( 异丙醇) 之问的相互作用很弱，可以形成由延迟分层( 固液分层) 或者结晶引发的粒子 形态结构膜。故当凝固浴为异丙醇时得到粒状微孔膜。而且m j s h i e h l 3 0 j 也用一 定比例的乙醇( e t h a n 0 1 ) 和水的混合物作为e v a l 的溶剂制膜。这样就避免了传 统的为制得粒状微孔膜而在凝固浴里加入大量的溶剂d m s o ，省去了处理凝固浴 的后续工作，节约了生产成本。 天津_ t 业人学硕士学位论文 热致相分离法( t i p s ) 是一种制备微孔膜的方法1 3 1 侧。热致相分离法是将聚 合物在较高温度下溶解在溶剂中，在铸膜液冷却过程中产生相分离，除去稀释剂 后，产生可渗透的多孔结构。对于热稳定性好，且有合适溶剂的高分子材料，大 多可用这种方法制成微孔膜。这种方法的特点是空隙率调节范围宽，孔径较均匀。 y o u n g 等人1 3 7 娜】采用热致相分离法研究了蒸发温度对微孔膜形态的影响，发 现在低温时，形成粒子结构的膜主要由结晶机理控制；升高温度时，结晶受到限 制，从粒子结构转化成密集形态的膜。并且还研究了蒸发时间对膜形态的影响， 蒸发时间小于1 5 分钟时将形成大孔；3 0 分钟时大孔消失形成海绵状结构；蒸发 时问在4 5 分钟和6 0 分钟时，形成几乎等粒径的粒子状对称结构膜。 郭行蓬等人1 3 9 j 比较了两种羟基不同的e v a i 和p e g 相图的差异。在此基础上， 以p e g 为稀释剂，t i p s 法制备了e v a l 中空纤维膜。结果表明，纺丝时的冷却水浴 温度、稀释剂的抽提温度以及e v a l 含量对中空纤维的透气性有明显的影响。 2 1 3 2e v a l 分离膜结构与性能 形成的e v a l 膜的结构主要有两种：( 1 ) 表面是致密皮层，亚层是指状空腔的 不对称结构；( 2 ) 表皮开孔状，亚层由互相结合在一起的粒子所组成的对称结构。 不对称结构起过滤性能的主要是表皮皮层，这样的结构通量较小，但是对目标物 质的过滤性能较好。表皮丌孑l 的对称结构的膜通量较大，料液通过阻力较小，但 是脱除率较低。 l p c h e n g l 2 2 l 发现不同结构的e v a l 膜在过滤葡聚糖时有很特殊的性能。 非对称结构的e v 雠能脱除大分子的葡聚糖，让小分子的葡聚糖通过；然而粒 状形态的均质e v a l 膜却表现出不同寻常的过滤性能：它能脱除小分子量的葡聚 糖，丽透过大分子量的。t h y o u n 删用大分子葡聚糖( d e x t r a n ) ( 分子量为 6 k ，1 1 5 k ，, 4 1 k ，7 0 k ，5 0 5 k ) ，聚乙二醇( p e g ) ( 分子量为2 k ，6 k ，2 0 l ，3 5 k ，7 0 k ) 和聚丙 稀酸纳( s p a ) ( 分子量为2 1 k , 5 1 k ，, 2 0 l ，6 0 k ) 分别研究非对称结构的和均质的粒状 e v a l 膜的性能，得到了同样的结果。 非对称膜主要是由致密层起脱除作用。只要小分子葡聚糖通过致密表层后， 就可以直接通过下面的多孔层。因此，非对称膜对于小分子的葡聚糖具有低的脱 除率。随着目标物质分子量增大，脱除率增大。对称结构的膜过滤葡聚糖时，小 分子的葡聚糖易陷入到e v 黼子的纳米孔中，而大分子的葡聚糖却能穿过粒子 外曲折的通道，透过膜。因此，对称结构的e v a l 膜能截留小分子量的葡聚糖， 而透过大分子量的葡聚糖。 1 0 第二章文献综述 2 1 3 3e v a l 膜的应用 医学上的应用：( 1 ) 药物释放：将药物、d m s o 和e v a l 的混合物在正辛醇 中凝固成膜，形成粒状结构。药物分布在球粒之间或者陷入到球粒中。药物释放 时，球粒之问的药物立即释放出来，陷入到球粒中的药物较慢的释放，达到延迟 功效。这样能使药效长时问保持1 5 7 1 。( 2 ) 改善药效：y o u n g 等发现通过在e v a l 膜表面共价键合赖氨酸能提高人- i - 1 1 , 脑神经的存活”，而且粒状结构的e v 腆 适用于神经的修复【明。m j s h i e h l 4 3 l 给e v a l 膜上固定氨基乙酸后能显著增强 阿司匹林的渗透性能，有利于治疗溃疡性结肠炎，而且该方法使用无毒的乙醇合 水的混合物作为e v a l 的溶剂来制膜，采用蒸干溶剂的方法来使膜固化。采用这 种方法制得的膜在医药上很有应用价值。( 3 ) 在人工肾中的应用：早先供人体 医用的材料主要是金属( 不锈钢、钛合金等) 和陶瓷，然而这些材料坚硬有余而挠 性和弹性不足，对人体组织的某些部位不能代用和修补。近2 0 多年来，许多高分 子材料的涌现为人体医用材料丌辟了新的来源。 e v a l 由于具有好的亲水性，一定的机械强度，与血液有较好相容性，故其 中空纤维膜应用于人工肾中。聚乙烯醇( e v al ) 膜中空纤维透析器具有较好生物 相容性，是可不用抗凝剂透析的一种新型透析器j 。该透析器使患者可以不用 或少用肝素，从而避免了患者进行血液透析治疗中由于长期使用肝素而致的骨质 疏松、凝血性能低下等疾病1 4 引。 蛋白分离：e v a l 膜通过血浆流出在水合有机介质中进行化学官能团反应， 或者通过截留活性粒子来物理性活化，以此来得到结合牛血清蛋白的活性点，使 e v a l 膜成为转移胆红素的吸附膜l 。 m e a v r a m e s c u l 47 l 用戊二醛或者环氧乙烷反应e v a l 中乙烯醇链段中的羟 基，产生牛血清蛋白的固化点，把e v a 蛾滤膜进行功能化用于牛血清蛋白的分 离。 2 1 4 膜色谱的功能性颗粒：离子交换树脂 离子交换法是应用合成的离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的物质依靠库 伦力吸附在树脂上，然后用合适的洗脱液将吸附的蛋白质从树脂上洗脱下来，达 到分离、浓缩、提纯的目的。离子交换法广泛用于氨基酸、抗生素等生物物质的 分离，尤其是在工业上产品的回收和废水的处理。具有不同活性基团的生物物质 会具有不同的电荷强度，离子交换法非常适合于带有电荷的物质的分离，纯化效 率高，从而成为生物工程中最广泛应用的技术之一1 4 8 ，4 9 l 。因此，随着新树脂的出 现，应用技术的进步，树脂法已广泛渗透到水处理、蛋白质分离、金属冶炼、原 天津t 业人学硕士学位论文 子能科学技术、海洋资源开发、化工生产、糖类精制、食品加工、医药卫生、分 析化学及环境保护领域。 离子交换法应用过程中，离子交换树脂是一个很关键的因素。它的单元结构 由三部分组成：交联的具有三维空间立体结构的网络骨架( 通常以r 表示) 、联 结在骨架上的功能基( 活性基，如s o 。广- n ( c h 3 ) 3 + ) 以及和活性基所带的相反 电荷的活性离子( 即可交换离子，如h + 、o h ) 。惰性不溶的网络骨架和活性基 是联成一体的，不能自由移动。活性离子则可以在网络骨架和溶液问自由迁移。 当树脂处在溶液中时，其上的活性离子可以与溶液中的同性离子，按与树脂功能 基的化学亲和力不同产生交换过程。高分子活性基团是决定离子交换树脂主要性 能的因素。如果活性基释放的活性离子是阳离子，这种离子交换树脂和溶液中的 其他阳离子发生交换，称为阳离子交换树脂：如果释放的活性离子是阴离子，则 这种离子交换树脂能交换溶液中的阴离子，称为阴离子交换树脂l 删。 离子交换材料中离子交换树脂工艺成熟，成本低，并且有着较好的力学强度， 一直备受青睐。在生物工程中，离子交换树脂被广泛的用于提取抗生素、氨基酸、 有机酸等小分子产物，特别是在抗生素和氨基酸工业中、但离子交换树脂存在消 耗量大、放大困难、再生后方可使用等缺点，人们一直努力在材料方面做进一步 的改进。另外，膜技术的产生和发展为离子交换技术的应用提供了更为广阔的平 台。膜分离技术的出现和快速发展，对生物分子的分离纯化是个极大的推动1 5 l j 。 离子交换树脂颗粒有机杂化膜综合了膜技术和离子交换技术的优点，它具有 很大的比表面积和丰富的表面官能团，从而显示出更快的吸附或沈脱速度和高的 选择性。并克服了离子交换树脂放大困难，工业化差的缺点，成为未来主要的研 究热点之一。 本研究中所使用的离子交换树脂为大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 ( d 0 6 1 ) 和大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂( d 3 0 1 r ) ，这两种离子交换树脂 的性能如2 1 表所示： 第二章文献综述 表2 - 1 离子交换树脂( d 0 6 1 ) 和( d 3 0 1 r ) 性能 2 1 5 膜色谱组件一中空纤维膜组件的特点 目前，在膜色谱中已使用的膜组件类型按膜外观形状的不同可分为平板膜、 管式膜( 有内压式和外压式之分) 、螺旋卷膜、折叠式膜以及中空纤维膜。各种类 型的膜组件都有其优缺点，在本研究中我们制备的膜采用中空纤维形式，与其它 膜组件相比，中空纤维膜组件具有如下特点： ( 1 ) 单位体积的膜面积很大，使设备小型化，同时可减少厂房面积； ( 2 ) 耐压性较高，不需要任何支撑体，使装置体积明显减少； ( 3 ) 密封结构简单，使装置大为简化，并降低成本； ( 4 ) 被处理的溶液可在中空纤维内快速流动，因剪切速率较大，可减少浓差 极化现象，防止膜的堵塞； ( 5 ) 实现工业化生产有良好的重复性。 2 1 6 膜色谱的分类 按照膜色谱中膜与蛋白质结合机理的不同，膜色谱可分为亲和膜色谱、离子 交换膜色谱、疏水相互作用膜色谱等几种类型。膜色谱主要应用于以下几个方面： 1 ) 蛋白质、病毒以及基因等生物活性物质的分离纯化；2 ) 中草药有效成分的提 取；3 ) 血液净化；4 ) 含生物活性物质的除杂及澄清过滤。 2 1 6 1 亲和膜色谱( 舢c ) 亲和膜的分离原理与亲和色谱基本相同。主要是基于欲分离物质和键合在膜 上的亲和配位基之间的生物特异性相互作用。这种分离方式的优点是膜具有双重 分离功能，不仅目标生物大分子可以和其他分子获得分离，而且同时可去除部分 溶剂，达到浓缩目的。蛋白质亲和分离中常用的作用体系有抗原一单克隆抗体、 天津t 业人学硕士学位论文 激素一受体蛋白、核酸一核酸结合蛋白、酶一底物产物抑制剂辅酶、免疫球蛋 白一蛋白蛋8 g 、蛋白质一肝素活性染料过渡金属离子肽段等。 已报道的亲和膜应用实例有很多。1 1 m 1 3 r5 2 l 例如，美国p a l l 公司对聚酸胺微孔 滤膜( 孔径o 犁m ) 进行了化学改性，在膜上键合了含氨基的活性染料配基，并固 载了单克隆或多克隆i g g 免疫球蛋白，所获得的l g g 纯度更高些。m i l l i p o r e 公司已 研制成功含蛋白a 的中空纤维膜分离器，可用作单克隆抗体的纯化a m e r a c e 公司 研制了一种聚乙烯醇和硅胶共混的亲和膜，在直径为4 7 m m 的碟式膜上可结合2 0 m g 的牛血清白蛋白。 魏桂林等1 5 3 l 以纤维素膜为亲和基质，接枝后分别以聚赖氨酸和季铵盐为配 基。制备了两种亲和膜介质，用于去除磷酸缓冲液( p a7 4 ) 及人血白蛋白( h s a ) 溶液中的胆红素。实验结果表明，该方法对磷酸缓冲液中胆红素的去除率能达到 7 0 以上；对h 5 a 溶液中的胆红素，其去除率稍低，但在较低浓度的h s a 溶液中， 也能获得高于5 0 的去除率。并对亲和膜与胆红素问的亲和作用进行了研究，考 察了温度、流速、h s a 浓度及胆红素初始浓度等相关条件对去除效果的影响。结 果表明，在较高的温度条件下，去除效果较佳；在较高的初始浓度情况下，胆红 素的吸附速率较大。 p l a t o n o v a 等 l l j 以特制的肽段为配基，经环氧基团活化，将配基的氨基端偶 联在g m a e d m a 基质膜上，获得了免疫亲和膜介质。由于采用与抗原结合位点 结构相同的肽段代替了传统的蛋白配基( 抗原) ，成本大为降低，可以有效地从血 清中鉴定和分离免疫球蛋白抗体。所用十五肽和十六肽配基的饱和吸附量可达 0 4 2 m g m l 和1 5 m g m l 。 2 1 6 2 疏水膜色谱( m c ) 由于疏水配基结构简单，通用性好且成本较低，故疏水色谱已成为蛋白质分 离纯化的常用技术之一。但是，目前常用的疏水色谱大多采用琼脂糖凝胶、葡聚 糖等“软”基质，分离速度不够理想，且不易放大，疏水膜色谱就是在此基础上发 展起来的。 疏水膜色谱上的配基，常用的有甲基、丁基、苯基、辛基、己二胺、聚乙二 醇等，通过目标物质与这些配基之间疏水作用的不同而实现分离。影响疏水膜色 谱性能的主要因素有：盐离子的种类、离子强度、p h 、柱温等。 已报道的疏水色谱应用实例有：杨利等以纤维素膜为介质，