（农产品加工及贮藏工程专业论文）大豆异黄酮糖苷的超临界流体萃取及固定化酶转化研究.pdf

摘要 大豆异黄酮是在大豆生长过程中形成的一类具有重要生理功能的次生代谢产物。大豆异 黄酮共有1 2 种异构体，包括染料木素、大豆苷元、黄豆黄素3 种游离型的苷元和各苷元与葡 萄糖基、乙酰葡萄糖基、丙二酰葡萄糖基结合的9 种糖苷。大豆中糖苷的比例可达到9 7 9 8 ， 而菅元只占2 - 3 。大豆异黄酮糖苷须转化成苷元才能被机体吸收，发挥其生理活性作用。 本论文采用超临界c 0 2 流体萃取法对脱脂豆粕中异黄酮糖苷染料木苷进行提取，并通过固定 化p 葡萄糖营酶催化染料木苷转化为染料木素活性苷元进行了研究，主要结果如下： 1 、通过单因素试验和正交试验，获得的超临界c 0 2 流体萃取脱脂豆粕中染料木苷的优 化工艺条件是：乙醇用量3 0 0m l 1 0 0g 脱脂豆粕，萃取温度5 5 ，萃取压力3 0 v l x m a ，静萃 取时间1 2 0m i n ，动萃取时间6 0r a i n 。该工艺条件下染料木苷的萃取率为7 9 4 5o g g 。通过借 鉴固定床吸附脱吸附传质理论，采用b p 神经网络，建立了超临界流体萃取染料木苷的动力 学模型，拟合了实验条件下的超临界萃取动力学曲线，网络训练误差和预测误差分别为1 8 和3 ，7 ，模拟所得k , a 与实验结果值的误差约为9 ：确定参数后的动力学模型可较为精确 地定量描述萃取床层的溶质浓度分布。 2 、通过对豆科蝶形花亚科中异黄酮含量较高的大豆等3 2 种植物萌发种子和黑曲霉等 3 2 株微生物p 。葡萄糖苷酶催化染料木苷转化为染料木素的活性筛选，发现黑曲霉5 - 1 2 的肛 葡萄糖苷酶酶活力最大( 6 3 3 7 6u m g 蛋白) 。分离纯化和酶学性质研究结果表明，该黑曲霉 1 3 葡萄糖苷酶分子量约为1 5 1 7k d a ，含2 个亚基；分子结构由0 c 螺旋7 1 、1 3 折叠4 9 0 、 转角2 1 7 和无规卷曲2 2 2 组成；具有较高的热稳定性、p i - i 稳定性和贮藏稳定性。 3 、正交试验和三因素二次通用旋转组合试验优化出黑曲霉5 1 2 在5 l 发酵罐中发酵生 产1 3 葡萄糖苷酶的适宜培养工艺和培养基，优化培养工艺是：转速4 0 0r r a i n ，温度3 0 ， 接种量1 0 ，优化培养基( g l ) 是：麦麸2 8 4 ，( n h 0 2 s 0 41 2 ，k h 2 p 0 42 0 。黑曲霉5 1 2 在优化的产酶条件下发酵3 天，发酵液中1 3 葡萄糖苷酶的酶活达到1 4 9 3 9 0u m l 。其细胞 生长模型符合m o n o d 方程，产酶动力学符合l u e d e k i n g - p i r e t 方程。利用黑曲霉5 1 2 细胞能 够形成聚集体的特性，建立了黑曲霉5 1 2 无载体固定化发酵1 3 一葡萄糖苷酶的培养体系。 4 、以海藻酸钠为载体，采用交联包埋法，实现了1 3 葡萄糖苷酶的有效固定化。与游 离酶相比，固定化酶最适温度、最适p h 值和翰值分别由5 0 、4 5 和2 9 9p 幼n l 下降到4 0 、 4 0 和2 0 2 t g m l ，具有更强的耐酸性和稳定性。该固定化酶用于催化大豆异黄酮染料木苷转 化活性苷元染料木素，染料木苷转化率达1 0 0 ，重复使用8 次后，转化率保持7 5 以上。 5 、以磁性纳米氮化铝颗粒为载体，以戊二醛为交联剂，在2 0 、p h 5 0 、1 0 0r m i n 下 作用3 5h 后，制备了固定化1 3 葡萄糖苷酶。扫描电镜、红外光谱、差热分析表征了纳米颗 粒固定化酶的结构特征。与游离酶相比，磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶最适温度、最适p h 值和值分别由5 0 、4 5 和2 9 9p g m i , 上升为5 5 、5 0 和6 4 1p g m t , ，具有良好的 贮存稳定性和操作稳定性。该固定化酶用于催化大豆异黄酮染料木苷转化活性苷元染料木 素，染料木苷转化率达8 8 ，重复使用8 次后，转化率保持5 0 以上。与海藻酸钠固定化 酶比较，磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶对底物亲和力和染料木苷转化率稍有降低，但在外加 磁场的作用下，磁性纳米氮化铝颗粒固定化酶可定向移动，有利于酶和产物的快速分离。 关键词：脱脂豆粕；大豆异黄酮；超临界流体萃取；固定化酶；b 葡萄糖苷酶；黑曲 霉；发酵动力学；酶学性质 a b s t r a c t s o e mi s o f l a v o n e s ，w h i c ha r et h es e c o n d a r ym e t a b o h t e s ，h a v ei m p o r t a n tb i o l o g i c a le f f e c t s t od a t e1 2s o y b e a ni s o f l a v o n e sh a v eb e e nr e p o r t e d ，i n c l u d i n gt h r e ea g i y c o n e s ( g e n i s t e i n , d a i d z e i n a n dg l y c e t e i n ) a n dt h e i rn i n eg l y c o s i d e s ( g l u c o s i d e s ，a c e t y l p - g l u c o s i d e sa n dm a l o n y l p g l u c o s i d e s ) i nt o t a ls o y b e a ni s o f l a v o n e st h ec o n t e n to fg l y c o s i d e sr e a c h e st o9 7 t o9 8 ，w h i l et h ec o n t e n to f a g l y c o n e sc o n t e n to n l y2 t o3 i th a sb e e nr e v e a l e dt h a tt h eb i o l o g i c a le f f e c t so fs o y b e a n i s o f l a v o n e sa r en o td u et ot h eg l y c o s i d e si n s t e a dt h e i ra g l y c o n e s ，s u c ha sg e i l i s t e i i la n dd a i d z e i n 啊舱 g l y c o s i d e sc a np l a yt h ef u n c t i o n a lr o l ei nh u m a n s h e a l t hw h e nc o n v e r t e di nt h e i r sa g l y c o n e s i nt h e p r e s e n td i s s e r t a t i o n , e x t r a c t i o nb ys u p e r c r i t i c a lf l u i dt e c h n o l o g ya n dt r a n s f o r m a t i o nb yi m m o b i l i z e d p - g l u c o s i d a s eo fi s o f l a v o n eg l u c o s i d e sf r o mt h ed e f a t t e ds o y b e a nr e s i d u e sw e r es t u d i e d 田他r e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： e f f e c t so ft h es u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gf l o wr a t eo fc 0 2 ，s t a t i ca n d d y n a m i ce x t r a c t i o nt i m e ，e n t r a i n e rd o s a g e ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp r e s s u r e ，o nt h ee x t r a c t i o n r a t eo fi s o f l a v o n e sf r o mt h ed e f a t t e ds o yb e a nr e s i d u e sw e r ei n v e s t i g a t e db yb o t hs i n g l ef a c t o ra n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef l o wr a t eo fc 0 2 ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d p r e s s u r ei nt h es e p a r a t i o nt a n kh a dal i t t l ee f f e c to nt h ee x t r a c t i o ny i e l d t h em a x i m u me x t r a c t i o n y i e l do f7 9 4 5r t e d gw a so b t a i n e du n d e rt h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n s ( f o wr a t eo fc 0 2 ，8l h ； s t a t i ce x t r a c t i o nt i m e ，1 2 0r a i n ；d y n a m i ce x t r a c t i o nt i m e ，6 0r a i n ；e t h a n o ld o s a g e ，3 0 0m l l o o gs o y b e a nr e s i d u e s ；e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ，5 5 ；e x t r a c t i o np r e s s u r e ，3 0m p a ) t h ek i n e t i cm o d e lo f e x t r a c t i o nw a sd e v e l o p e db a s e do na d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nt h e o r ya n dt h em o d e lp a r a m e t e ro f 砌w a sd e t e r m i n e db yb pn e u r a ln e t w o r k t r a i n i n ge r r o ra n dp r e d i c t i o ne r r o rw e r e1 8 a n d3 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ee r r o rv a l u eo f 元獬b e t w e e ns i m u l a t e da n de x p e r i m e n t a ld a t aw a sa b o u t9 t h ek i n e t i cm o d e lw i n ld e t e r m i n e dp a r a m e t e r sc o u l db eu s e dt od e s c r i b et h eg e n i s t i nd i s t r i b u t i o ni n t h ee x t r a c t i o nb e dw i t hh i g h e ra c c u r a c y a c t i v i t i e so fp - g l u c o s i d a s ef r o m3 2p l a n ts p e c i e sw i t hh i l g hc o n t e n to fi s o f l a v o n e sa n d3 2 s t r a i n sf r o md i f f e r e mm i c r o b e sw e r ec o m p a r e d t h e1 3 一g l u c o s i d a s ea c t i v i t y ( 6 3 3 7 6u m gp r o t e i n ) t o w a r dg e n i s t i nw a sf o u n dt ob eh i g h e s tf r o ma s p e r g i l l u sn i g e r5 1 2 1 3 - g l u c o s i d a s ef r o ma s p e r g i l l u s n i g e r5 - 12 ，a f t e ri s o l a t e da n dp u r i f i e dt h r o u g ha m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p r a t i o n , d e a e - c e l l o c u s e - 5 2i o ne x c h a n g ea n ds e p h a d e xg 1 0 0g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h a sam o l e c u l a rm a s so fa b o u t 1 5 1 7k d aa n dc o n t a i n st w os u b u n i t so f7 5 8k d a c d ( c i r c u l a rd i c h r o i s m ) r e v e a l e dt h a tt h e 1 3 - g l u c o s i d a s ec o n s i s t e do f7 1 a - h e l i x e s ，4 9 o d - s h e e t s ，2 1 7 t u r n sa n d2 2 2 r a n d o mc o i l s t h e 1 3 一g l u c o s i d a s eh a d b e t t e rh e a ts t a b i l i t y ，p hs t a b i l i t ya n ds t o r a g es t a b i l i t y t h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yf o r1 3 - g l u c o s i d a s ep r o d u c t i o ni n5lf e r m e n t o rb y a s p e r g i l l u sn i g e r5 - 12w a so p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t sa n dq u a d r a t i cr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o n d e s i g n s t h eo p t i m u mt e c h n o l o g yw a sr o t a r yr a t eo f4 0 0r r a i na n dt e m p e r a t u r eo f3 0 cw i t h i n o c u l u ms i z eo f1 0 t h eo p t i m u mm e d i u mc o m p o s i t i o n sw e r ew h e a tb r a no f 2 8 4g l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 o f1 2g 几a n dk h 2 p 0 4o f2 0g l u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，1 3 - g l u c o s i d a s ea c i t i v i t yr e a c h e d 1 4 9 3 9 0u m la f t e r3d a y so ff e r m e n t a t i o n b a s e do nm o n o de q u a t i o na n dl u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o n , t h ek i n e t i cm o d e l sd e s c r i b i n gc e l lg r o w t ha n dp - g l u c o s i d a s ep r o d u c t i o nw e r ee s t a b l i s h e d d u r i n g t h ep r o c e s so f f e r m e n t a t i o n , a s p e r g i l l u sn i g e r5 1 2h a dat r e n dt of o r mm y c e l i aa g g r e g a t e s b a s e do n t h i sg r o w t hp r o p e r t y ，i m m o b i l i z e df e r m e n t a t i o ns y s t e mo fa s p e r g i l l u sn i g e r5 1 2w i t hn o n - c a r r i e r w a se s t a b l i s h e dt op r o d u c e1 3 - g l u c o s i d a s e w i t hs o d i u ma l g i n a t e 嬲ac a r r i e ra n dg l u t a r a l d e h y d ea st h ec r o s s l i n k i n ga g e n t ，a ni m p r o v e d i m m o b i l i z a t i o nm e t h o do f1 3 - g l u c o s i d a s ef o rp r o d u c t i o no fs o y b e a ng e n i s t e i nf r o mg e n i s t i nw a s d e v e l o p e d w h e nc o m p a r e dt ot h ef r e ee n z y m e ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p hv a l u ea n d o f t h e i m m o b i l i z e dp - g l u c o s i d a s ew e r es h i f t e df r o m5 0 。c t o4 0 ，4 5t o4 0a n d2 9 9i t g m lt o2 0 2 g m l ，r e s p e c t i v e l y t h ei m m o b i l i z e dj 3 - g l u c o s i d a s ew a se m p l o y e dt og e n i g c e i i lp r o d u c t i o n , 7 1 1 o f t h ea c t i v i t ya n d7 6 5 o fc o n v e r s i o nw e r ek e p ta f t e rc o n s e c u t i v eu s eo f8t i m e s 1 3 - g l u c o s i d a s ew a si m m o b i l i z e dw i t hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e so fa l u m i n u mn i t r i d ef o r3 5 h u n d e rt h et e m p e r a t u r eo f2 0 ，p hv a l u eo f5 0a n dr o t a r yr a t eo f1 0 0r m i n t h er e s u l t so fs e m ，i r a n dd s ca n a l y s i sr e v e a l e dt h es t n l c t u r eo fi m m o b i l i z e de n z y m e t h em i c h a e l i sc o n s t a n to f f o r g e n i s t i no ft h ei m m o b i l i z e dp - g l u c o s i d a s e ，w i t hg o o ds t o r a g es t a b u i t ya n do p e r a t i o ns t a b i l i t y , w a s 6 4 1m m o l lu n d e rt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo f5 5 a n dt h eo p t i m a lp hv a l u eo f5 0 a l t h o u g ht h e a f f m i t ya n dc o n v e r s i o no f1 3 - g l u c o s i d a s ei m m o b i l i z e dw i t hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e so fa l u m i n u m n i t r i d ew e r es l i g h t l yl o w e rt h a nt h o s eo fj 3 - g l u c o s i d a s ei m m o b i l i z e dw i t hs o d i u ma l g i n a t e ，t h e m a g n e t i ca l u m i n u mn i t r i d en a n o p a r t i c l e 嬲ag o o ds u p p o r tf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nc o u l dp r o v i d e af a s ta n dc o n v e n i e n ta p p r o a c ht os e p a r a t ee n z y m ea n dp r o d u c t su n d e rt h em a g n e t i cf i e l d k e y w o r d s ：d e f a t t e ds o y b e a nr e s i d u e s ：s o y b e a ni s o f l a v o n e s ：s u p e r c r i t i c a lc 0 2f l u i de x t r a c t i o n ： i m m o b i l i z e de n z y m e ：1 3 - g l u c o s i d a s e ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；f e r m e n t a t i o nk i n e t i c s ；e n z y m ep r o p e r t y 插图清单 图1 - 1 大豆异黄酮类化合物结构2 图1 2 论文研究路线总概1 0 图2 1 超临界c 0 2 萃取装置流程图1 2 图2 2 超临界萃取过程动力学模型求解流程：1 4 图2 - 3c 0 2 平均流量对脱脂豆粕中染料木苷萃取率的影响1 5 图2 4 染料木苷萃取率随静萃取时间的变化1 6 图2 5 染料木苷萃取率随动萃取时间的变化小1 7 图2 6 染料木苷萃取动力学曲线2 1 图2 7 染料木苷萃取动力学曲线2 3 图3 11 3 葡萄糖苷酶硫酸铵盐析饱和率曲线2 9 图3 2p h 值洗脱液对1 3 。葡萄糖苷酶分离的影响3 l 图3 3b 葡萄糖苷酶的d e a e 5 2 离子交换色谱3 1 图3 4s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶色谱图3 2 图3 5s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶色谱图3 3 图3 - 6 黑曲霉p 葡萄糖苷酶变性电泳图3 3 图3 7 黑曲霉b 葡萄糖苷酶圆二光谱分析3 4 图3 8 温度对1 3 葡萄糖苷酶的影响3 5 图3 - 91 3 葡萄糖苷酶i 的热稳定性3 5 图3 1 0p h 对1 3 葡萄糖苷酶的影响3 6 图3 1 1 1 3 葡萄糖苷酶的p h 稳定性3 6 图3 1 21 3 葡萄糖苷酶的1 一l s 】关系曲线3 7 图3 1 3 葡萄糖苷酶的贮藏稳定性3 8 图4 1 转速对产酶的影响4 2 图4 2 温度对产酶的影响4 2 图4 3 接种量对产酶的影响4 3 图4 - 4 预测值与观测值的相关图4 6 图4 5 黑曲霉在麦麸培养基中的培养特性4 9 图4 - 6 无载体固定化黑曲霉产1 3 葡萄糖苷酶的动力学曲线5 2 图4 7 无固定化细胞的操作稳定性5 4 图4 8 黑曲霉液体通气培养形成的聚集体5 5 图4 - 9 无载体固定化黑曲霉细胞的透射电镜图5 5 图5 1c a c l 2 浓度对b 葡萄糖苷酶固定化的影响6 1 图5 2 戊二醛浓度对b 葡萄糖苷酶固定化的影响6 l 图5 3 包埋颗粒直径对1 3 葡萄糖苷酶固定化的影响6 2 图5 - 4 固定化时间对酶固定化效率的影响6 4 图5 5 加酶量对固定化效果的影响6 4 图5 石固定化酶的扫描电镜照片6 5 图5 7 游离酶和固定化酶的红外光谱图6 6 图5 - 8 游离酶和固定化酶的t ( 3 和d s c 曲线6 7 图5 - 9 染料木苷浓度对反应速率的影响”6 7 图5 1 0 酶浓度对反应速率的影响6 8 图5 1 1p h 对反应速率的影响6 9 图5 1 2 温度对反应速率的影响6 9 图5 1 3 温度对游离酶和固定化酶的稳定性影响7 0 图5 1 4 游离酶与固定化酶水解染料木苷的阿累尼乌斯曲线7 1 图5 1 5 固定化酶的操作稳定性7 2 表格清单 表1 1 不同来源的b 葡萄糖苷酶的生化性质6 表1 2 部分不同来源的1 3 葡萄糖苷酶分离纯化7 表1 3 黑曲霉的固定化研究u q 9 表2 1l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计、结果与分析1 8 表2 2 方差分析表1 8 表2 3 染料木苷在超临界二氧化碳中的溶解度2 0 表2 4 染料木苷萃取动力学曲线的关联常数2 2 表2 5 模型拟合的体积传质系数2 2 表3 1 不同植物萌发种子粗酶液中1 3 葡萄糖苷酶的活性比较2 8 表3 2 不同微生物发酵粗酶液中b 葡萄糖苷酶的活性比较2 8 表3 3 黑曲霉5 1 2p 葡萄糖苷酶的提纯3 2 表3 4p 葡萄糖苷酶的等电点3 4 表3 51 3 葡萄糖苷酶的底物特异性3 7 表4 1 因素水平编码表4 0 表4 - 2 正交试验安排、结果及分析4 4 表4 3 方差分析表4 4 表4 4 三因素二次通用旋转组合试验设计及结果4 5 表4 5 试验结果方差分析表4 5 表4 6 培养基组成对曲霉发酵生产b 葡萄糖苷酶的影响4 7 表4 7 无载体固定化黑曲霉产1 3 葡萄糖苷酶的动力学参数5 3 表5 1 不同固定化方法对1 3 葡萄糖苷酶固定化效果的影响6 0 表5 - 2 不同纳米载体对p 葡萄糖苷酶固定化效果的影响6 3 表5 3 戊二醛浓度对p 葡萄糖苷酶固定化效果的影响6 3 表5 - 4 p i - i 值对b 葡萄糖苷酶固定化效果的影响6 5 表5 5 不同反应温度时酶的失活常数及失活动力学方程7 2 表5 - 6 固定化酶i 与固定化酶i i 的特征参数比较7 3 独创性声明 本人声明所星交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得 金胆王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金艘王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金坦 工些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：7 考争j 雩 签字日期：加彳年卢月e l 学位论文作者毕业去向： 工作单位： 通讯地址： 一名莎弩 签字日期山d f 蝴1 日 电话： 邮编： 致谢 本论文是在导师罗建平教授的亲切关怀和悉心指导下完成的，从论文的开题、设计、实 验乃至论文的定稿全过程都得到了导师的精心指导。导师以严谨的治学态度、求实的科学作 风、敏锐的科研思维、渊博的科学理论培育我做人、做学问，为本论文的设计、实施和完成 付出了大量的心血。在四年的学习、生活和工作中，导师给予了我无微不至的关怀和帮助， 使我受益匪浅，终生难忘。在此，特向罗老师表示衷心的感谢! 值此论文完成之际，我由衷地感谢姜绍通教授和潘丽军教授，他们为论文的顺利开展给 予了热情指导和大力支持。他们严谨的治学态度、渊博的专业知识，以及活跃的思维方式， 令人深受启迪和教益。此外，在平时的生活和工作中，两位老师也给予了我很大帮助，在此 表示深深的感谢l 论文实验过程中还得到了院实验中心的余顺火老师、张维标老师、陈晓燕老师、马道荣 老师、韩卓老师和陆军老师给予的大力支持和无私的帮助，为实验的顺利进行提供了许多便 利条件，在此向他们表示深深的谢意! 本实验室的查学强、杨雪飞、王军辉等老师，王瑛、王贵娟、徐学玲、欧杰、曹磊等研 究生，以及宛雯、徐国胜等本科生在工作中也给予了十分友好的帮助和合作。在此，谨向他 们表示最衷心的感谢! 感谢曾在本实验室和仍在本实验室与我一起学习的兄弟姐妹们，大家 的欢声笑语，你们的关心与帮助，为我紧张的学习生活增添了许多乐趣，谢谢你们的陪伴与 鼓励。 感谢生物工程系系主任郑志老师和生工教研室操丽丽等其他老师的关心和帮助。感谢中 国科技大学、合肥工业大学化工学院以及安徽省立医院等在本论文完成过程中提供的帮助和 宝贵建议。 另外，还特别要感谢我的父母和家人，正是他们的关爱、理解、鼓励与支持，使我能坚 持不懈地学习至今，这种温情也将激励我在今后的人生道路上奋勇前进。 本研究得到了安徽省自然科学基金项目( n o 0 5 0 4 1 0 3 0 1 ) 的资助，在此表示衷心感谢! 感谢所有曾经提供过帮助的师长、朋友。本研究是在大家的共同帮助下完成的，它属于 所有为此付出过心血的人! 作者：潘利华 二零零九年五月 第一章绪论 第一章绪论 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物。早期的研究认为，大豆中的异 黄酮化合物是引起大豆食品产生苦涩味的主要因子之一【，因此，人们在加工中都设法将它 除去。直至u 1 9 9 3 年，c o w a r d 指出，大豆异黄酮可能是日本人癌症发病率比美国人低的主要 原因圆，这就使得大豆异黄酮逐渐引起人们的关注。1 9 9 5 年，a d l e r c r e u t z 首次报道，异黄酮 与哺乳动物的雌激素结构相似，故而具备雌激素的多种生理活性p 】，至此，大豆异黄酮成为 学术界乃至全世界关注的焦点。 我国是大豆的故乡，国务院于1 9 9 5 年开始批准实施“大豆行动计划”，其中明确将大豆 异黄酮列为大豆综合开发利用之首。很显然，充分利用我国大豆资源优势，开发大豆异黄酮， 不仅为保健品市场提供新资源，也为人类健康提供一份保障。 1 大豆异黄酮的组成和理化性质 1 1 大豆异黄酮的组成与结构 大豆异黄酮包括游离态的苷元和结合态的葡萄糖苷，共十二种，即由染料木素、大豆苷 元、大豆黄素3 种异黄酮苷元以及它们和葡萄糖、乙酰葡萄糖、丙二酰葡萄糖以b 糖苷键连 接形成的9 种异黄酮糖苷组成 4 1 。各种大豆异黄酮类化合物的结构式见图1 1 【5 】。 1 2 大豆异黄酮的理化性质 大豆异黄酮为淡黄色粉末，具有苦味、收敛性和干涩感觉，是产生大豆苦涩味的因子之 一。大豆异黄酮苷元比糖苷具有更强的不愉快风味。大豆异黄酮易溶于丙酮、甲醇、乙酸乙 酯等极性溶剂中，其水溶性与结构有关，大豆异黄酮苷元的水溶性较差，基本不溶于水。大 豆异黄酮糖苷一般易溶于水，个别难溶于水；水中的溶解度在4 0 - - - - 5 0 没有明显变化，但 在7 0 - - - - 9 0 时，溶解度随着温度的升高而显著增加。因此用水溶液提取大豆异黄酮时，温 度应超过7 0 。大豆异黄酮中丙二酰基异黄酮糖苷不耐热，在加热情况下容易转化为相应 的乙酰基异黄酮糖苷和b 糖基异黄酮，异黄酮糖苷能被水解产生1 分子异黄酮苷元和1 分子 葡萄糖嘲。 1 3 大豆异黄酮的活性组分 研究证明，染料木素、大豆苷元、黄豆黄素3 种异黄酮苷元是大豆异黄酮发挥药理功能 的活性形式，它们是活性苷元，以染料木素活性最强【2 】。但活性苷元含量极低，仅占大豆异 黄酮总量的2 左右【4 】。大豆异黄酮主要是以糖苷形式存在，这些糖苷不具活性，它们需要 经过人体肠道微生物产生的b 葡萄糖苷酶( e c3 2 1 2 1 ) 水解为活性苷元才能被吸收进入 本章部分内容发表于食品科学，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 2 ) ：8 0 3 - 8 0 7 1 合肥工业大学博士学位论文 体内发挥作用【_ 7 1 。研究认为，人体肠道微生物产生的1 3 葡萄糖苷酶的数量有限，因此，大 豆异黄酮在人食用后其糖苷的生物利用度很低【8 。9 1 。尽管大豆异黄酮对人体健康的功效受到 高度关注，但由于活性苷元在大豆异黄酮中所占比例少，分离纯化难度大、产率低、成本高， 所以当前大豆异黄酮加工仍是以从脱脂大豆粕中提取生产4 0 8 0 含量的粗提物用作食品添 加剂为主，加工水平初级，产品附加值不高，因为主要是糖苷形式，常因人群个体差异保健 效果不明显，在医药和化妆品等领域的开发应用受到很大限制。 o h r l h h d a i d z e i 皿( 大豆黄素) o h h g e n i s t e i n ( 金雀异黄素) h o c h 3 g l y d t e i i l ( 黄豆黄素) a 大豆异黄酮苷元d s o y b e a ni s o f l a v o n ea g l y c o n e d a i d z i n ( 大豆苷) g e n i s t i n ( 金雀异黄苷) 8 1 y c i t i n ( 黄豆苷) 6 - o - a c e t y l d a i d z i n ( 6 n d - 乙酰基大豆苷) 6 - o - a e c t y l g e n i s t i n ( 6 ”o 乙酰基金雀异黄苷) 6 - o - a e e t y l g l y c i t i n ( 6 ”- d - 乙酰基黄豆苷) 6 - o - m a l o n y d a i d z i n ( 6 d - 丙二酰基大豆苷) 6 - o - m a l o n y g e n i s t i n ( 6 一d 丙二酰基金雀异黄苷) 6 - o - m a l o n y g l y c i t i n ( 6 ”凸丙二酰基黄豆苷) b 大豆异黄酮糖苷s o y b e a ni s o f l a v o n eg l u c o s i d e s 图1 1 大豆异黄酮类化合物结构 f i g 1 1s t r u c t u r e so f s o y b e a ni s o f l a v o n ec o m p o u n d s 2 大豆异黄酮的生理功能 大豆异黄酮活性组分具有多种生理活性，对此已有较多的文献报道f 1 0 1 1 1 。 2 h h h一一一一一一 b b b h h呱h h蕃h h 呱 j j l h 饼h h 伽h h 伽h 第一章绪论 2 1 大豆异黄酮的植物雌激素功能 研究发现，大豆异黄酮的活性组分染料木素和大豆苷元在结构上与哺乳动物的雌二醇雌 激素相似，都具有雌激素的活性基团二酚羟基【3 1 ，它可与生物体内雌激素受体( e s t r o g e n r e c e p t o r ，e r ) 结合而表现出一定的雌激素功能。由于大豆异黄酮活性组分与e r 的结合力 和甾体雌激素与e r 的结合力相比低近千倍，因此，其结合后的潜在健康效应存在u 型剂量一 一效应关系【1 2 】，即低剂量时由于它与雌激素竞争结合e r 而降低了雌激素活性，因而表现为 抗雌激素作用：而中剂量时可产生一定的雌激素活性；高剂量时，补充的大豆异黄酮则可活 化因雌激素水平限制而未能活化的e r ，产生雌激素增强效应。这种u 型剂量一效应关系使 得大豆异黄酮具有雌激素的多种功能。具体功能包括预防骨质疏松【1 3 。1 4 1 、抗癌作用1 6 l 、预 防心血管疾病【17 1 、缓解更年期综合症等。 2 2 抗氧化功能 大豆异黄酮也是一类很强的抗氧化剂，能有效清除体内和皮肤表面自由基，延缓细胞衰 老和保护皮肤【1 9 。2 1 1 。大豆异黄酮的抗氧化功能在不同氧化体系中有不同的表现，孙克杰等1 2 2 通过体外模拟生物反应实验，对大豆异黄酮抑制猪油氧化、抑制动物细胞溶血及清除活性氧 自由基进行了研究，结果发现，大豆异黄酮具有较强的抗氧化能力，也是良好的自由基清除 剂，它能够形成稳定的自由基中间体从而阻断自由基反应。此外，大豆异黄酮组分还具有抗 溶血功能，它一方面起抗氧化剂的